全 文 ：书西北植物学报!
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文章编号$
#""")&"!$
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*-../*#""")&"!$*!"#$*"%*"&&
收稿日期$
!"#&)##)#!
&修改稿收到日期$
!"#$)"#)#+
基金项目$国家科技支撑计划"
!"#!012"!0"$
#&内蒙古自然科学基金重大项目"
!"#%32"%
#&内蒙古农牧业科学院科技创新项目"
!"##)
45667"#)&
#
作者简介$聂利珍"
#8(
#!女!在读博士研究生!助理研究员!主要从事马铃薯遗传育种研究
9):;-<
$
#%%&#!&"
!
#+%*=>:
"
通信作者$于
!
卓!博士!教授!博士生导师!主要从事马铃薯及饲用作物遗传育种研究
9):;-<
$
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@AB@>$C
!
.-/;*=>:
拟南芥
!#1234$
基因克隆与转化马铃薯的研究
聂利珍#!于肖夏#!李国婧#!鞠天华!!孙瑞芬%!崔阔澍#!于
!
卓#"
"
#
内蒙古农业大学!呼和浩特
"#""#8
&
!
赤峰天泽生物科技有限公司!内蒙古赤峰
"!$&$
&
%
内蒙古农牧业科学院 生物技术研
究中心!呼和浩特
"#""%#
#
摘
!
要$以野生拟南芥生态型"
4><)"
#为材料!利用
D4E
和
2F1
重组技术!克隆了拟南芥钙依赖蛋白激酶基因
"
!"#$%&#
#
!"#$%&#
基因全长为
!!+8G
H
!碱基序列与已知基因
!"#

#CC8"
完全一致构建
!"#$%&#
基因
的植物表达载体
H
4IJ%)42DK#
!并利用农杆菌介导法将
H
4IJ%)42DK#
转入马铃薯品种(费乌瑞它)的脱毒试管
微型薯中!经筛选与植株再生!共获得
$"
个抗性再生植株
D4E
检测显示!有
%+
个植株基因组中含有
!"#$%&#
基因
EL)D4E
分析证实!
!"#$%&#
基因在这些马铃薯植株的基因组中均能正常转录表达这一结果为进一步
开展
!"#$%&#
基因功能分析及转基因抗旱马铃薯新品种选育研究奠定了基础
关键词$拟南芥&
!"#$%&#
&基因克隆&马铃薯&遗传转化&转录表达
中图分类号$
MC8
文献标志码$
1
%&"()!*+),-"+.)/#"#/"0"/)/""-!#1234$
1((-+".!($5-.&
6
7-7#8$*-$/$
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P
#
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H
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H
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U
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H
<;/YPS
H
XP..->/ZP=Y>X
H
4IJ%)42DK#>W!"#$%&#
U
P/P
!
;/\YX;/.W>X:PH
4IJ%)42DK#
-/Y>Z-X@.)WXPP:-/-;Y@XP>W
H
>Y;Y>=@(
J;Z>X-Y;
)
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U
!

(-*)3"4(+56):P\-;YP\:PYB>\*1WYPX
H
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P/PX;YPH
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H
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U
P/P
!
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H
X>ZPYB;YYBP!"#$%&#
U
P/P-/YX;/.
U
P/-=
H
>Y;Y>
H
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Y->/;/\PS
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U
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U
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U
P/-=
H
>Y;Y>*
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6
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&
U
P/P=<>/P
&
H
>Y;Y>
&
U
P/PY-=YX;/.W>X:;Y->/
&
YX;/.=X-
H
Y->/;/PS
H
XP..->/
!!
马铃薯"
7-1)256"5*4(-/56
#是一种粮*菜及工
业原料等多种用途的经济作物!是世界上仅次于小
麦*水稻*玉米的四大粮食作物之一内蒙古是中国
马铃薯的种薯和商品薯重要产地之一+#,!但干旱缺
水一直是马铃薯生产的主要限制因子!特别是内蒙
古中西部地区几乎连年干旱!使得马铃薯产量低下!
严重影响着当地农民的经济收入因此培育抗旱*
高产*优质的马铃薯新品种实属必要利用转基因
技术开展农作物育种是农业科技的发展方向和必然
趋势+!,国外
QP>
等+%,从酵母中克隆出海藻糖
)+)
磷酸合成酶基因"
8%79
#!通过农杆菌介导转入马
铃薯中!获得的转基因马铃薯抗旱能力明显提高
国内姜丽丽等+&,将来自耐旱物种厚叶旋蒴苣苔
"
:-4)3()//+
;
-1
;
+)
#的蓝铜蛋白类似基因
:3:#%9
导入马铃薯!经干旱处理后发现转基因马铃薯植株
的抗旱能力显著提高&张宁+$,从菠菜中克隆甜菜碱
醛脱氢酶"
:!$<
#基因!转化马铃薯获得了转基因
植株!对其进行干旱和
F;4<
胁迫处理研究显示!转
基因马铃薯的抗旱耐盐能力均显著提高
42DK.
"
=;<=-@:)\P
H
P/\P/Y
H
X>YP-/ -^/;.P.
!也
称
4DK.
#是一类依赖钙离子而不依赖钙调素的蛋
白激酶!其广泛存在于植物*藻类和部分原生生物
中+)C,在植物体内
42DK.
是主要的初级钙离子
感受器之一!并受生物和非生物胁迫诱导激活!在植
物参与非生物胁迫反应*光周期调节和激素信号转
导中具有非常重要的作用+8,
42DK.
首先在豌豆
中发现+#",!它与细胞
4;
!` 信号传递有密切关系!是
植物中研究较多*了解较清楚的一类蛋白激酶
VBPP/
等+##,利用效应基因和报告基因共表达的方
法!研究发现在玉米原生质体中转化
!"#$%&#
和
!"#$%&#)
能激活受干旱和高盐胁迫诱导的启动
子!去除
!"#$%&#
激酶区的突变体对干旱和盐胁
迫以及
101
刺激没有反应&过表达
!"#$%&#
的
拟南芥在低温*高盐和
101
胁迫下!其耐受能力明
显比野生型强+#!,&拟南芥
L)2F1
插入突变体
3,=
.
>#
对干旱胁迫比野生型拟南芥敏感!过表达
!"#$%&#
拟南芥可提高其对干旱胁迫的耐受能
力+#%,从冰叶日中"
?4/46*(
@
)2(046563(
@
/")11+=
256
#花中分离得到的
?3#%&#
能响应盐害和脱水
的胁迫作用+#&,
!"#%&!%
敲除突变体提高了对干
旱和盐胁迫的耐受性!而过表达
!"#%&!%
的拟南
芥对干旱和盐胁迫更敏感+#$,这些结果都证实
42DK.
参与了逆境信息的传递
本试验拟从拟南芥中克隆抗旱基因
!"#$=
%&#
!构建植物表达载体
H
4IJ%)42DK
!并利用农
杆菌介导法将
!"#$%&#
基因导入目前内蒙古地区
种植较多的抗旱性较弱的马铃薯品种(费乌瑞它)
"
J;Z>X-Y;
#基因组!通过
D4E
检测
!"#$%&#
基因
在马铃薯的基因组中的整合情况!并用
EL)D4E
检
测
!"#$%&#
在马铃薯中的表达情况!旨在为选育
抗旱性强的转基因马铃薯新品种奠定基础
#
!
材料和方法
$*$
!
材
!
料
转基因受体材料为马铃薯品种(费乌瑞它)"
J;)
Z>X-Y;
#!由本课题提供野生型拟南芥"
!()*+,-
.
=
/+/"0)1+)2)
#
4><@:G-;
生 态 型 "
4><)"
#种 子 及
H
4IJ%
植物表达载体由内蒙古农业大学李国婧教
授馈赠农杆菌
O01&&"&
由本课题组保存
$*8
!
马铃薯无菌苗的扩繁和试管薯诱导
将马铃薯无菌苗在无菌条件下剪成
#*$=:
小
段!每节茎段带
#
"
!
个腋芽!接种于
7V
培养基!在
光强
!"""
勒克斯"
#*光照时间
#+B
%
*温度"
!!
a!
#
b
条件下进行扩繁培养无菌苗生长约
#&时!在无菌条件下加入微型薯诱导培养基"
7V
液体
培养基
`Cc
蔗糖
`&*":
U
%
O+)01`"*"!:
U
%
O
F11 $`"":
U
%
O444
#!使其在黑暗条件下生长!
大约
%"左右长出微型薯
$9:
!
!#1234$
基因克隆
根据
F40N
数据库中
!"#

#CC8"
基因序列!利
用
DX-:PX%
和
dP=Y>XFLN##*"
软件!设计带有
&
.
2
#
与
A*)
#
双酶切位点的特异性引物
42DK#)D$
"
T11444TTT1LTTTL114LTL114T44LT
#
和
42DK#)D%
"
T44L4L1T1LL11141TT11)
41TLLLTL4
#&以野生型拟南芥基因组
2F1
为
模板进行
D4E
扩增!扩增片段总长度为
!!+8G
H
!
反应程序为$
8Cb
预变性
%:-/
!
8Cb
变性
%".
!
$%
b
退火
%".
!
!b
延伸
%:-/
!
%"
个循环!
!b
延伸
$:-/
对
D4E
产物经
"*Cc
琼脂糖凝胶电泳!利用
2F1
纯化回收试剂盒"
L;K;E;
#胶回收回收产物
进行加核苷酸
1
反应!
2F1
片段利用
L
&
2F1
连
接酶"
F90
#与
H
72#C)L dP=Y>X
"
L;K;E;
#连接
用热激法将连接产物转化大肠杆菌
LX;/.#)L#
!经
蓝白斑筛选*
D4E
和酶切鉴定!鉴定正确后送上海
生工有限公司测序!测序正确的保种备用
$*;
!
植物表达载体的构建
经测序正确的含有
!"#$%&#
基因的
L)42)
DK#
重组载体!用
&
.
2
#
与
A*)
#
双酶切!回收目
C&&
西
!
北
!
植
!
物
!
学
!
报
!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
%$
卷
的基因片段再将植物表达载体
H
4IJ%
用
&
.
2
#
"
F90
#与
A*)
#
"
F90
#双酶切!回收大片段将二
者回收的目的片段进行连接转化大肠杆菌
LX;/.#)
L#
!
D4E
和酶切鉴定重组载体!阳性克隆提取质粒!
采用冻融法导入农杆菌
O01&&"&
!经
D4E
鉴定正
确后保种!构建成植物表达载体
H
4IJ%)42DK#

$*<
!
农杆菌介导法转化马铃薯
$*<*$
!
重组菌株的培养与活化
!
从
(C"b
冰箱取
出保存的含有
H
4IJ%)42DK#
载体的菌种!在相应
抗生素平板上划线挑取农杆菌单菌落接种到
$
:OO0
液体培养基"抗生素
E-W%":
U
%
O
!
V
H
P=Y#""
:
U
%
O
!
VYX!$:
U
%
O
#中!
Cb
条件下震荡培养
#+
"
!"B
!取
#:O
接种到
$":OO0
液体培养基中"加
抗生素同上#!继续震荡培养到
e2
+""
为
"*$
"
"*C

将其转至
$":O
离心管!
$"""X
%
:-/
离心
#":-/
!
弃上清!菌体用
7V
培养基重悬
$*<*8
!
马铃薯转化方法
!
选择直径在
!=:
左右的
微型薯!去掉芽眼和薯皮!切成
!::
厚的薯片!放
入农杆菌重悬液中浸泡
#":-/
!期间不断摇动菌液
使其充分接触!取出后用无菌滤纸吸去薯片表面菌
液!转入筛选出的分化培养基"
7V`!:
U
%
O3L`
"*$:
U
%
O+)01`#:
U
%
ON11`"*!:
U
%
OT1
%
#
上!于
!Cb
黑暗下共培养
!!使农杆菌的
L)2F1
有效转移共培养后将薯片转移到附加
$":
U
%
O
K;/` %"":
U
%
O4PW
的分化培养基上!在"
!!a!
#
b
*
!"""连续光照条件下诱导芽分化每隔
#$
更换
#
次培养基!并淘汰褐化和死亡的薯片待
抗性芽长至
#*"
"
#*$=:
时!切下转入附加
$"
:
U
%
OK;/
和
!"":
U
%
O4PW
的
7V
培养基上!在
"
!!a!
#
b
*
!"""连续光照下诱导生根!获得完
整抗性植株
$*=
!
马铃薯转化植株的分子检测
剪取生根培养基上生长至
#"=:
左右的马铃薯
幼苗叶片提取
2F1
!以
42DK)EL)J
%
E
为引物!以
含有该基因的质粒为阳性对照!非转基因马铃薯(费
乌瑞它)无菌苗的基因组
2F1
为阴性对照!对转基
因植株进行
D4E
鉴定采用
LENA><
"
N/Z-YX>
U
P
#试
剂提取转基因马铃薯植株叶片总
EF1
!用
#c
的琼
脂糖凝胶电泳检测
EF1
质量!选出条带完整且清
晰的
EF1
!去除
2F1
后!采用
=2F1
合成试剂盒
"天根#进行转基因植株的
EL)D4E
检测
EL)D4E
的 引物
42DK)EL)J
"
44LTLTL11TT441T)
14L411
#和
42DK)EL)E
"
1L11L114L44TT)
414L4414
#!扩增片段跨
!"#$%&#
基因
#
个内
含子!扩增
=2F1
片段长度为
&!G
H
!扩增基因组
2F1
的片段为
C$G
H
马铃薯内参基因引物为
9J)#
$
)J
"
4L411T11TTL1TT1L14114
#和
9J)#
$
)E
"
T11T1T4LL4TLTTLT41L
#
!
!
结果与分析
89$
!
!#1234$
基因的克隆
以拟南芥基因组
2F1
为模板!用特异引物
42DK#)D$
%
D%
进行扩增期结果显示!扩增产物大
小与预期片段一致!长度为
!!+8G
H
"图
#
!
1
#将
目的产物回收后进行加核苷酸
1
反应!获得回收片
段末端带有碱基
1
!利于目的片段与
L
载体连接!
将纯化回收的目的片段连接到
H
72#C)L
克隆载体
上!转化大肠杆菌
LX;/.#)L#
!从转化的平板上挑取
图
#
!
!"#$%&#
基因克隆及阳性克隆的鉴定
7*2O%"""
&
1*
全长
!"#$%&#
基因
D4E
扩增&
0*
重组载体
L)42DK#
菌落
D4E
鉴定$
4K*
阳性对照"拟南芥基因组
2F1
#&
#
"
+*
随机
单菌落&
4*
重组载体
L)42DK#D4E
和酶切鉴定$
#
*
!*
分别用
42DK#)D$
%
D%
和
42DK)EL)J
%
E
为引物的
D4E
扩增片段&
%*
酶切鉴定
J-
U
*#
!
4<>/-/
U
>W!"#$%&#;/\-\P/Y-W-=;Y->/>W
H
<;.:-\.XP=>:G-/;/Y
7*2O%"""
&
1*1:
H
<-W-=;Y->/>W!"#$%&#G
?
D4E
&
0*N\P/Y-W-=;Y->/>WXP=>:G-/;/YL)42DK#G
?
=><>/
?
D4E
$
4K*D>.-Y-ZP=>/YX><
"
!()*+,-
.
/+/
U
P/>:-=2F1
#&
#(+
$
E;/\>:.-/
U
<>/
?
&
4*N\P/Y-W-=;Y->/>WXP=>:G-/;/Y
L)42DK#G
?
XP.YX-=Y->/P/A
?
:P\-
U
P.YP\;/\G
?
D4E;:
H
<-W-=;Y->/
$
#
!
*1:
H
<-W-=;Y->/>W!"#$%&#G
?H
X-:PX.>W
4DK#)D$
%
D%;/\42DK)EL)J
%
E
&
%*N\P/Y-W-=;Y->/>WL)42DK#\-
U
P.YP\G
?
XP.YX-=Y->/P/A
?
:P
8&&
%
期
!!!!!!!!!!!!
聂利珍!等$拟南芥
!"#$%&#
基因克隆与转化马铃薯的研究
白色克隆进行菌落
D4E
!经检测扩增出大小约为
C$G
H
的条带"图
#
!
0
#对阳性克隆进行菌液培养
提取质粒
2F1
!然后做
D4E
和酶切鉴定!酶切后获
得长度为
!!+8G
H
的条带"图
#
!
4
#对质粒进行
D4E
鉴定表明!引物
42DK#)D$
%
D%
和
42DK)EL)
J
%
E
分别扩增出
!!+8G
H
和
C$G
H
的条带"图
#
!
4
#阳性克隆测序结果利用
2F1VY;X
软件分析!
其
2F1
序列与已知基因序列"
1Y#
U
#CC8"
#完全相
同"图
!
#这表明拟南芥
!"#$%&#
基因全长克隆
成功
8*8
!
植物表达载体的构建与鉴定
重组载体
L)42DK#
和植物表达载体
H
4IJ%
分别用
&
.
2
#
与
A*)
#
双酶切"图
%
!
1
#!回收目的
片段后用
L
&
2F1
连接酶"
F90
#将目的基因片段
与植物表达载体片段连接!连接产物转化大肠杆菌
LX;/.#)L#
!然后进行菌落
D4E
鉴定!随机挑选
+
个
单菌落进行
D4E
!结果显示!每一个单菌落都能扩
增出
#
条
C$G
H
的条带"图
%
!
0
#随机选
D4E
鉴
定正确的
!
个菌落提取质粒进行相应位点的双酶
切!结果显示! 个质粒都获得一条约
!!+8G
H
的条
带"图
%
!
4
#
D4E
产物和酶切产物的目的条带与
预期结果一致!这表明植物表达载体
H
4IJ%)42)
DK#
是
4;7d%$V
启动子驱动
!"#$%&#
基因的
植物表达载体"图
%
!
2
#将构建好的植物表达载体
采用冻融法转入农杆菌
O01&&"&
菌株中用于转化
马铃薯
89:
!
!#1234$
基因农杆菌介导转化马铃薯
!"#$%&#
基因农杆菌介导转化马铃薯!结果
"图
&
#表明!无菌苗经过暗培养后!形成微型薯"图
&
!
1
#!微型薯去皮和芽眼后切成
!::
左右的薄片!
薯片经共培养和诱导培养后长出再生芽"图
&
!
0
#!将
芽进行生根培养后长成完整植株"图
&
!
4
*
2
#
89;
!
转化马铃薯的
0%>
检测
对获得的
$"
株抗性再生植株进行
D4E
检测!
提取抗性植株叶片的基因组
2F1
!利用
!"#$%&#
基因特异引物
42DK)EL)J
%
E
进行
D4E
检测结
果显示!在检测的
$"
个植株中有
%+
株呈阳性!这些
阳性转基因植株能扩增出约
C$G
H
的目的条带!部
分检测的电泳结果见图
$
!非转基因植株没有相应
的条带!这表明
!"#$%&#
基因可能被成功导入马
铃薯基因组中
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!
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在转基因马铃薯中的表达
为验证
D4E
鉴定为阳性的转基因马铃薯中
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基因转录水平!随机挑选
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代转基
因株系!利用
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的特异引物
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!
作为内参基因!进
行
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鉴定!检测
!"#$%&#
在转基因马铃薯
中的表达从图
+
可以看出!
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基因在转
基因马铃薯中都有一定量的表达!且各个株系的表
达量也不同其中
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!
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和
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表达量较高!
+
和
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表达量较低!
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和
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表达量中等这表明
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基因在转基因马铃薯中得到了正常表达
图
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抗性再生芽生根培养&
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形成完整的抗性植株
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基因克隆与转化马铃薯的研究
图
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阳性对照"
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!
讨
!
论
全球面临水资源日益短缺的境况!由干旱造成
的农作物减产并因此带来的经济损失逐渐加剧与
传统的抗逆育种工作相比!基因工程育种以其特有
的优势!如不受种属间的限制*周期短*效率高等特
点!正得到越来越广泛的关注干旱等非生物胁迫
严重影响植物的生长发育+#+,!而植物在生长过程中
有很多基因参与了植物响应逆境胁迫的过程+#)#C,!
其中也包括
42DK.
+
#8)!"
,

42DK.
是一类依赖钙
离子而不依赖钙调素的蛋白激酶!它的酶活性是由
4;
!` 直接激活!不需要外源的
4;7
激活
42DK.
与细胞
4;
!` 信号进一步传递有密切关系!是植物中
与逆境信号传递关系最密切的蛋白之一其种类也
较多!目前已知的拟南芥基因组至少能编码
%&
种不
同亚型的
42DK.
+
!#)!!
,
有研究+!%)!$,表明
42DK.
介
导了非生物胁迫的信号传递!在不同植物中都观察
到非生物逆境可诱导不同
42DK.
转录活性和激酶
活性的升高我们前期研究+!+,表明!
!"#$%&#
基
因受干旱*高盐等逆境胁迫诱导表达!并在拟南芥抗
非生物胁迫介导的信号转导中具有正向调节作用
因此!推测拟南芥对干旱等非生物胁迫的抗性与
!"#$%&#
的表达有一定的正相关性本试验以野
生型拟南芥为供体材料克隆了
!"#$%&#
基因!并
以抗旱性弱的马铃薯品种(费乌瑞它)为基因受体材
料进行了遗传转化研究!在获得的转基因植株中
!"#$%&#
基因能正常转录表达!这在
EF1
水平上
证实了目的基因在转基因马铃薯中正常表达!但转
基因马铃薯对干旱等逆境胁迫的抗性如何还有待进
一步研究验证
马铃薯的遗传转化外植体常用叶片*茎段和薯
块本试验选用了脱毒试管微型薯薯片!观察发现
因其不经过愈伤组织分化可直接由胚性细胞诱导产
生再生植株!使得农杆菌侵染后易于转化另外!脱
毒试管微型薯薯片的污染率低!操作过程相对简单!
可明显缩短植株再生时间!是马铃薯遗传转化研究
的首选外植体材料研究发现
!"#$%&#
基因在转
基因马铃薯的各株系中表达量有所不同!这可能是
由于不同株系转入基因的拷贝数不同!也可能是实
验操作误差造成!此有待于利用
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杂交和
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进一步验证
参考文献!
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基因克隆与转化马铃薯的研究