全 文 ：书西北植物学报!
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文章编号$
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-
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收稿日期$
!"#%(##(!#
&修改稿收到日期$
!"#$("#(!$
基金项目$中南林业科技大学青年基金"
12!"##"$,3
#&中南林业科技大学人才引进项目"
#"$("#!
#&国家自然科学基金青年基金
"
%#!"")#,
#&湖南省教育厅优秀青年基金"
#%3#)"
#
作者简介$周
!
波"
#4"&
#!男!博士!讲师!主要从事林业生物技术方面的教学与科研工作
5(67.8
$
9:;<=;,$"4
!
#,%*>;6
"
通信作者$谭晓风!教授!博士生导师!主要从事林业生物技术研究!
5(67.8
$
%%))4)%"
!??
*>;6
乌桕
010!2
基因的原核表达与纯化研究
周
!
波#!!%!彭
!
丹#!!%!张
!
琳!!%!谭晓风!!%"!刘选明$
"
#
中南林业科技大学 生命科学与技术学院!长沙
$#"""$
&
!
中南林业科技大学 经济林培育与保护省部共建教育部重点实验室!
长沙
$#"""$
&
%
中南林业科技大学 经济林培育与利用湖南省协同创新中心!长沙
$#"""$
&
$
湖南大学 植物功能基因组学与发育
调控湖南省重点实验室!长沙
$#""!
#
摘
!
要$乌桕是一种重要的木本油料树种
@AB
"
/CD7E;
F
8(7>
F
8AGHID/7C#是油料植物中将饱和脂肪酸转变成
不饱和脂肪酸的一种关键脱氢酶为了进一步揭示乌桕
@/@AB
的功能!该研究在大肠杆菌中表达了该蛋白结
果表明$"
#
#通过
JK(HGJ
的方法从乌桕种子中克隆出了
!"!#$
基因编码区全长序列!并将其克隆到低温诱导的
原核表达载体
L
G;8IKM
上!构建原核重组表达载体
L
G;8IKM
%
@/@AB
!转化大肠杆菌
3N!#/C7E
"
B5%
#并获得原核
表达工程菌株"
!
#通过
OHKP
法低温诱导表达融合蛋白该重组质粒在大肠杆菌中得到了高效表达!融合蛋白分
子质量约为
#"#QB
!且在上清液和包涵体中均有表达!可溶性部分经亲和层析纯化和
RD/CDE0=8;CC.0
S
检测证实获
得了重组蛋白!上述结果为进一步研究乌桕
@/@AB
的结构和功能奠定了基础
关键词$
!"!#$
基因&
L
G;8IKM
&原核表达&融合蛋白&纯化
中图分类号$
1+)
&
1+,
文献标志码$
A
$%"&%
(
")#*+,
-
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3.0.2%"40$
3
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)(45
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H5XPB70
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S
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S
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SF
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GD0CDE@;F
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F
70IKD>:0;8;
SF
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G:70
S
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G:.07
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N7=;E7C;E
F
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!
GD0CE78@;F
;ZM;ED/CE
F
70IKD>:0;8;
SF
!
G:70(
S
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!
G:.07
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!
@;F
;ZM;ED/CE
F
70IKD>:0;8;
SF
!
G:70
S
/:7$#"""$
!
G:.07
&
$U<070HE;[.0>D\D
F
N7=;E7C;E
F
;ZH870CM<0>C.;078
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L
6D0C7870IJD
S
<87C.;0
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U<070W0.[DE/.C
F
!
G:70
S
/:7$#""!
!
G:.07
#
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$
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,
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L
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"
/CD7E;
F
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F
8AGHID/7C#
L
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F
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S
D07/D
!
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F
Z7>C;EZ;ECE70/Z;E6.0
S
/7CF
7>.IC;<0/7CF
7>.I.0;.8
L
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L
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L
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,
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S
7CD.C/
Z<0>C.;0*K:DED/<8C/<
SS
D/CDIC:7C
$"
#
#
K:DZ<88D0
S
C:>BXAD0>;I.0
S
@/@AB]7/76
L
8.Z.DI=
F
JK(HGJ
ZE;6!%
&
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,
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L
ED//.;0[D>C;E
L
G;8IKM*K:DED>;6=.070C
L
E;Q7E
F
;C.>D^
L
ED//.;0
L
87/6.I]7/CE70/Z;E6DI.0C;./0123N!#/C7E
"
B5%
#
/CE7.0Z;E
S
7.0.0
S
;ZC:D
S
D(
0DC.>D0
S
.0DDE.0
S
/CE7.0*
"
!
#
K:DCE70/Z;E6DI/CE7.0]7/.0I<>DI].C:OHKP
"
./;
L
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S
787>C;/.ID
#
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L
ED//.0
S
ZL
E;CD.07C8;]CD6
L
DE7C;6=.070C
L
E;CD.0].C:76;(
8D><87E67//#"#QB]7/:.
S
:8
F
D^
L
ED//DI.0./01270I
L
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L
DE07C70C70IC:D
L
D8DC
L
7EC
;Z./0128
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L
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F
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L
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S
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S
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<78.C
F
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L
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C.;0Z;E.0[D/C.
S
7C.;0;0C:D/CE<>CC.;0;Z@/@AB*
7.
(
8"%!/
$
!"!#$
"
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()"*+
,
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F
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S
D0D
&
L
G;8IKM
&
L
E;Q7E
F
;C.>D^
L
ED//.;0
&
ZL
E;CD.0
&
L
7C.;0
!!
乌桕"
!%
&
()"*+
,
*-()
#属大戟科乌桕属多年
生高大落叶乔木!与油茶(油桐(核桃合称为中国四
大木本油料树种其果仁含油率高达
,)*+,_
)
#
*

乌桕梓油中富含油酸(亚油酸和亚麻酸等不饱和脂
肪酸!含量在
4"_
左右)!*!是制造生物柴油的理想
原料)%*因此!乌桕曾被日本科学家誉为+绿色原
子弹,
前人研究结果表明$硬脂酰
AGH
脱氢酶
@AB
是高等植物中脂肪酸合成代谢的关键酶它催化硬
脂酰
AGH
在
G4
和
G#"
之间引进一个双键形成油
酰
(AGH
硬脂酰
AGH
脱氢酶在植物脂肪酸从头合
成途径的最后一步发挥作用!它的脱氢产物是形成
许多多不饱和脂肪酸的前体
@AB
基因在农作物
的土豆)$*(水稻)*(油菜),*(芝麻)+*(大豆)*和花生)4*
等植物中都已经被克隆!有了较深入的功能研究&在
木本植物蓖麻)#"*(油棕)##*(麻疯树)#!*(油茶)#%*(油
樟)#$*(油桐)#)*和银杏)#,*中都已经有
@AB
基因克隆
和初步功能分析对于乌桕!在分子水平上的研究
相对甚少!在
XG3O
中可以检索到的乌桕基因序列
总共只有
%!
条!但乌桕的
!"!#$
基因已经被四川
大学陈放教授课题组克隆乌桕果仁中不饱和脂肪
酸含量高达
4"_
左右的原因以及
@AB
的蛋白表达
模式与不饱和脂肪酸积累存在何种关系至今还未见
相关报道为了搞清楚
@AB
蛋白的表达模式与不
饱和脂肪酸积累之间的关系!本实验采用
JK(HGJ
方法克隆乌桕
!"!#$
基因!构建了该基因的原核
表达载体并在大肠杆菌中表达了该蛋白!通过镍柱
纯化了该蛋白!本研究结果为乌桕
@/@AB
的抗体制
备和蛋白表达模式研究奠定了基础
#
!
材料和方法
9*9
!
实验材料
乌桕种子于
!"#!
年
#"
月采自湖南怀化&大肠
杆菌菌株
BU)
"
和
3N!#/C7E
"
B5%
#(原核表达载
体均为本实验室保存
9*:
!
实验方法
9;:;9
!
010!2
基因的克隆
!
从
XG3O
中检索到乌
桕
!"!#$
基因的
GB@
全长序列!共
#"4#=
L
采
用
HE.6DE)*"
引物设计软件设计出扩增
!"!#$
全
长
GB@
的引物序列$
M
$
)`(<<3GKGPAPAKPPGK(
GKGAAPKKGAAKGGKKKGA(%`
和
J
$
)`(=3KAPA(GAPKKKGAGKKPKGKAKGPKAAAKG(
GAAGK(%`
"下划线序列为酶切位点序列!加粗部分
为保护碱基序列#!送上海生工生物工程有限公司
合成该引物用
JXA
提取试剂盒"
O0[.CE;
S
D0
#提
取乌桕种子的总
JXA
!用逆转录试剂盒"
K:DE6;
#
进行逆转录获得
>BXA
!以
>BXA
为模板!进行
HGJ
扩增!
#_
琼脂糖凝胶电泳观察结果
HGJ
反
应体系为$
)aH@3#
N
!
!*)66;8
%
N
IXKH/
"含
b
S
!c
#
*"
#
N
!引物
M
和
J
各
$*"
#
N
!
)
W
%
#
NBXA
聚合酶
HE.6DE/C7E!*"
#
N
!
>BXA!*"
#
N
!总体积
!""
#
N

HGJ
产物经胶回收后用
341
$
和
3+%
$
两种酶进行双酶切!同时将
L
G;8I
载体
用
341
$
和
3+%
$
两种酶进行双酶切酶切后用磁
珠回收试剂盒"
KVdV3V
#纯化!将纯化后得到的
L
G;8I
和
HGJ
产物用
K
$
BXA
连接酶
$e
连接过
夜!将连接产物通过热激的转化方法转化
BU)
"
感
受态细胞!将转化后的细胞加上
#6NN3
培养基在
%+e
振荡培养箱中
#)"E
%
6.0
摇
$"6.0
!
,"""E
%
6.0
离心
#6.0
后!倒掉上清!取
!""
#
N
菌液涂在
含
#""
#
S
%
6N
的
N3
固体培养基上!
%+ e
培养
过夜
9;:;:
!
010!2
原核表达工程菌的获得
!
挑出阳性
克隆菌斑!接种于含氨苄青霉素
#""6
S
%
N
的
N3
液
体培养基中!
%+e
振荡过夜培养抽提质粒!将该
质粒转化宿主菌
3N!#/C7E
"
B5%
#!涂布于含
#""
6
S
%
N
氨苄青霉素的
N3
固体平板培养基上!
%+e
倒置过夜培养随机挑取单菌落!进行菌落
HGJ
鉴
定!最后获得工程菌并命名为
L
G;8I(@/@AB

9*:*>
!
重组蛋白的原核表达及诱导表达条件优化
!
将阳性工程菌在含氨苄青霉素"
A6
L
#""6
S
%
N
#
的
N3
液体培养基中培养至
VB
,""
值达
"*,
左右时!
加入终浓度
#66;8
%
NOHKP
!在
#)e
下诱导
!$:
!
超声处理后!分别收集上清和沉淀进行
@B@(HAP5
电泳鉴定表达情况
!
#
"
OHKP
浓度的优化
!
选定诱导时间为
!":
&
诱导温度为
#)e
加入终浓度分别为
"*!
(
"*$
(
"*,
(
"*
和
#*"66;8
%
NOHKP
诱导表达!
@B@(
HAP5
电泳鉴定表达情况
!"诱导时间的优化
!
选定诱导
OHKP
浓度为
)$$
%
期
!!!!!!!!!!!!!
周
!
波!等$乌桕
!"!#$
基因的原核表达与纯化研究
"*66;8
%
N
&诱导温度为
#)e
&诱导
#!
(
#,
(
#
和
!$:
后!进行
@B@(HAP5
电泳鉴定表达情况
9*:*?
!
融合蛋白的纯化
!
根据
X.@D
L
:7E;/D,
M7/CM8;]
纯化试剂盒"
/.
S
67
#说明书进行目的蛋
白的纯化!收集洗脱峰的蛋白溶液!
@B@(HAP5
分
析鉴定采用
3E7IZ;EI
法对蛋白进行定量!保存于
&"e
冰箱
9;:;@
!
A./).%06B"))#0
C
鉴定
!
先对纯化后的目的
蛋白进行
@B@(HAP5
电泳!然后用
@K(O
型半干式
转移电泳槽将目的蛋白转到
XG
膜上用
)_
脱脂
奶粉封闭
#:
后!用辣根过氧化物酶"
UJH
#标记的
小鼠单抗
O
S
P
"
#f#""""
#"
/.
S
67
#
%+e
孵育
#:
!洗
膜后进行
BA3
显影
!
!
结果与分析
:;9
!
010!2
基因克隆与原核表达工程菌构建
提取乌桕种子的总
JXA
!以其反转录后的
>B(
XA
为模板!经
HGJ
扩增和电泳检测!得到大小约
为
#"""=
L
左右的特异性条带"图
#
!
3
#采用酶切
连接的方法将
!"!#$
基因构建在
L
G;8I(@/@AB
载
体上形成重组质粒"图
#
!
A
#第
!
天将连接产物转
化大肠杆菌感受态
BU)
"
!涂布
#""6
S
%
6N
氨苄青
霉素的
N3
平板
%+e
培养过夜对长出的菌斑进
行菌落
HGJ
鉴定!琼脂糖凝胶电泳检测发现!存在
能够扩增出大小约为
#"""=
L
左右的目的基因片
段的菌斑"图
#
!
G
#!即为阳性克隆的菌斑挑选
%
个阳性克隆送上海生工生物工程公司测序!测序结
果与
XG3O
网站上提供的
@/@AB
的
GB@
序列完全
匹配!说明已成功构建了
L
G;8I(@/@AB
原核表达重
组载体对测序正确的菌株扩大培养!抽提质粒!转
化大肠杆
3N!#/C7E
"
B5%
#菌株的感受态细胞!涂
布
#""6
S
%
6N
的氨苄青霉素的
N3
平板!
%+e
培养
过夜!对长出的菌斑进行菌落
HGJ
检测!从图
#
!
G
中可看出
HGJ
产物条带清晰!片段大小约为
#"""
=
L
!说明
L
G;8I(@/@AB
重组质粒已经成功转入了原
核表达菌株
3N!#/C7E
"
B5%
#中
:;:
!
010!2
基因的原核表达
通过优化后确定了
OHKP
的最佳浓度为
"*,
66;8
%
N
!诱导温度为
#)e
!诱导时间为
!$:
于
是!将含有
L
G;8I(@/@AB
的
3N!#/C7E
"
B5%
#工程
菌在
#)e
条件下经过
"*,66;8
%
N
的
OHKP
诱导
后!收集菌体进行超声破碎细胞后进行
@B@(HAP5
电泳检测!结果显示!细胞破碎后的液体中含有大量
的目的蛋白!与
L
G;8I
空载体对照相比!沉淀中在分
子质量约为
#""QB
的地方出现明显的蛋白富集区!
图
!
中箭头标注的位置就是目的蛋白
@/@AB

:*>
!
原核表达蛋白的纯化和鉴定
根据
X.@D
L
:7E;/D,M7/CM8;]
试剂盒说明书
进行目的蛋白的纯化!分别用
!""
(
$""
(
,""
和
""
66;8
%
N
的咪唑逐步洗脱!收集洗脱液!测吸光度
A
)4)
的值!结果显示
$""66;8
%
N
咪唑足以将目的蛋
白洗脱
@/@AB
蛋白分子量为
$)*!+QB
!在
X
端
有一个
))*""QB
的分子伴侣
KM
!在
X
端加入的
,
个组氨酸标签的分子量为
%*+#QB
!因此融合蛋白
的分子量为
#""*""QB

@B@(HAP5
显示$纯化后
的目的蛋白分子量与预测分子量一致!目的蛋白已
经得到了较好的纯化"图
%
#用
3E7IZ;EI
法测定蛋
白浓度为
"*!
S
%
N

为了进一步检测纯化后的蛋白是否为目的蛋白!
将转化
L
G;8I
空载体的
3N!#/C7E
"
B5%
#
/CE7.0/
的诱
导物(
L
G;8I
空载体的
3N!#/C7E
"
B5%
#
/CE7.0/
的
诱导物和含
L
G;8I(@/@AB
质粒的
3N!#/C7E
"
B5%
#
图
#
!L
G;8I(@/@AB
原核表达载体的构建
A*
L
G;8I(@/@AB
原核表达载体结构示意图&
3*!"!#$
基因的克隆$
b*b7EQDE
&
G*#
%
,
为
,
个不同的单克隆$
b*b7EQDE
&
G\*
对照
M.
S
*#
!
G;0/CE<>CDIC:D
L
E;Q7E
F
;C.>D^
L
ED//.;0[D>C;E;Z
L
G;8I(@/@AB
A*K:D67
L
;Z
L
G;8I(@/@AB
L
E;Q7E
F
;C.>D^
L
ED//.;0[D>C;E
&
3*G8;0DIC:D!"!#$
S
D0D
$
b*b7EQDE
&
G*#
%
,
!
/.^ I.ZZDED0C6;0;>8;078
$
b*b7EQDE
&
G\*G;0CE;8
,$$
西
!
北
!
植
!
物
!
学
!
报
!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
%$
卷
/CE7.0/
菌株诱导物分别用含有
U./
的柱子进行纯
化!纯化后的结果如图
$
!
A
所示纯化后的产物用
UJH
标记的
U./
抗体进行
RD/CDE0
杂交检测用
未转化
L
G;8I
空载体的
3N!#/C7E
"
B5%
#
/CE7.0/
的
诱导且纯化后的蛋白做阴性对照!以转化了
L
G;8I
空载体的
3N!#/C7E
"
B5%
#
/CE7.0/
的诱导且纯化的
图
!
!
@/@AB
蛋白的诱导表达
b*b7EQDE
&
#
%
%*
不同浓度的
OHKP
诱导含
L
>;8I
空载体的
3N!#/C7E
"
B5%
#菌株&
$
%
,*
不同浓度的
OHKP
含
L
>;8I(@/@AB
载体的
3N!#/C7E
"
B5%
#菌株&箭头所在的位置代表目的蛋白
M.
S
*!
!
5^
L
ED//.;0;Z@/@AB
L
E;CD.0
b*b7EQDE
&
#
%
%*K:D3N!#/C7E
"
B5%
#
/CE7.0/>;0C7.0/C:D
L
>;8I
D6
L
C
F
[D>C;E.0I<>DI=
F
I.ZZDED0C>;0CD0C/;ZOHKP
&
$
%
,*K:D
3N!#/C7E
"
B5%
#
/CE7.0>7EE.DIC:D
L
>;8I(@/@AB[D>C;E
.0I<>DI=
F
I.ZZDED0C>;0CD0C/;ZOHKP
&
JDI7EE;]
.0I.>7CDI./;0=D:78Z;ZC:DC7E
S
DC
L
E;CD.0
蛋白做阳性对照
RD/CDE0
杂交显示!含
L
G;8I
空
载质粒的菌株的诱导且纯化的蛋白和含
L
G;8I(@/(
@AB
质粒的菌株诱导且纯化的蛋白都能杂交出一
条很亮的带!条带大小分别在
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和
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左
图
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电泳检测不同浓度梯度
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融合蛋白
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!
讨
!
论
本试验通过原核表达的方法在大肠杆菌中表达
了该蛋白!该蛋白的分子质量为
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目的蛋
白在宿主细胞中的表达量受到多种因素的影响!为
确保外源基因得到最佳的表达!我们对目的蛋白的
表达条件进行了优化实验结果表明
@/@AB
在大
肠杆菌中的表达!大量的是可溶性蛋白!少量的是以
包涵体的形式存在与
3.;CD>:
推测该表达蛋白
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是不可溶的理论不完全一致出现此情况的
主要原因是$
@/@AB
蛋白是一真核蛋白!但是在原
核生物大肠杆菌中异源表达!由于缺乏真核生物中
翻译后修饰所需酶类!致使有中间体的积累!形成了
包涵体沉淀为了尽量避免包涵体的形成!选择
L
G;8I
表达载体!在这个载体上有一段
KM
的共表
达分子伴侣!可以增加可溶蛋白的比例!从而使可溶
性的目的蛋白含量增加)#+*
实验结果表明不同浓度的
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诱导对目标蛋
白的表达影响较明显!本实验最佳
OHKP
诱导浓度
为
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属镍螯合琼脂糖凝胶"
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氨酸和咪唑竞争性地与
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不同梯度的咪唑缓冲液洗脱!通过亲和层析的方法
最终获得目的蛋白实验结果表明该蛋白纯化的最
佳咪唑浓度为
$""66;8
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N
对纯化过程中各个组
分进行
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电泳分析!结果表明纯化的目的
蛋白没有产生非特异性条带!纯化效果良好
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法测定了纯化蛋白的含量!浓度为
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进一步鉴定纯化的蛋白为我们所
表达的目的蛋白纯化后的蛋白可用于
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抗体的制备和蛋白的表达模式研究!为
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的功
能研究奠定基础
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