全 文 ：植物病理学报
ACTA PHYTOPATHOLOGICA SINICA 41(1): 57-63(2011)
收稿日期: 2010-04-30; 修回日期: 2010-12-01
基金项目: 国家甘薯产业技术体系建设项目资助(nycytx-16-B-7)
通讯作者: 张振臣,研究员,主要从事植物病毒学研究; Tel: 0371-65711547, E-mail: zhangzhenchen@126. com
第一作者: 张业辉(1981 - ),女, 河南沁阳人,硕士研究生,主要从事植物病毒学研究。
甘薯脉花叶病毒外壳蛋白基因在
大肠杆菌中的表达及其抗血清的制备
张业辉, 秦艳红, 乔 奇, 张德胜, 田雨婷, 王永江, 张振臣*
(河南省农业科学院植物保护研究所, 郑州 450002)
摘要: 根据已报道的甘薯脉花叶病毒(Sweet potato vein mosaic virus,SPVMV)外壳蛋白(CP)基因的核苷酸序列合成引物,
利用 RT-PCR方法克隆了 SPVMV河南分离物(SPVMV-HN)基因组 3′端 1. 8 kb的基因片段,包括部分 NIb 基因序列和完
整的 CP基因及 3′端非编码区序列(3′UTR)。 序列分析表明,SPVMV-HN的 CP基因由 996 个核苷酸组成(GenBank 登录
号为 FJ687211),编码 332 个氨基酸残基。 与已发表的 SPVMV其他分离物相比,其推导的氨基酸序列一致性为 95. 2% ~
98. 5% ,与 SPVMV广东分离物的氨基酸序列一致性为 97. 9% 。 将 CP 基因克隆到原核表达载体 pET-28a( + )上,SDS-
PAGE分析表明,经 IPTG诱导,CP基因在大肠杆菌 BL21(DE3) pLysS中得到了高效表达。 以表达的蛋白为抗原,免疫家
兔,制备了 SPVMV外壳蛋白的特异性抗血清。 ACP-ELISA检测结果表明,制备的抗血清可用于田间甘薯样品的检测。 利
用 SPVMV的抗血清,对采自全国 14 个省(市)的田间甘薯样品以及嫁接的巴西牵牛样品进行了检测,结果表明,SPVMV
在我国甘薯上普遍存在。
关键词: 甘薯脉花叶病毒; 外壳蛋白基因; 序列分析; 原核表达; 抗血清
Cloning and expression of coat protein gene of Sweet potato vein mosaic virus in
E. coli and preparation of antiserum ZHANG Ye-hui, QIN Yan-hong, QIAO Qi, ZHANG
De-sheng, TIAN Yu-ting, WANG Yong-jiang, ZHANG Zhen-chen ( Institute of Plant Protection, Henan Acade-
my of Agricultural Sciences, Zhengzhou 450002 , China)
Abstract: According to published nucleotide sequence, the primers were designed. The region of 3′-terminal
1 800 nts encompassing the part of NIb gene, coat protein (CP) gene and 3′ untranslated region (UTR) of
Sweet potato vein mosaic virus (SPVMV) isolated from Henan Province was cloned and sequenced by RT-
PCR. The sequencing showed that the CP gene was consisted of 996 nt and encoded 332 amino acid residues
(FJ687211) . The deduced amino acid sequence of CP gene was 95. 2% - 98. 5% identical to other isolates
published before, and was 97. 9% identical to SPVMV-GD (AY459611) isolate. The CP gene was cloned in-
to expression vector pET-28a( + ) for over-expression in prokaryotic cells. The SDS-PAGE showed that about
41 kDa specific fusion protein was produced after induction by IPTG. The expressed protein was purified from
SDS-PAGE and the antiserum against the protein was raised in rabbit. The antiserum could be used for specific
detection of SPVMV from field samples of sweet potato with ACP-ELISA. This antiserum was used for detec-
ting the samples of Ipomoea batatas and I. setosa inoculated with the field specimens from 14 provinces. The
results indicated that the SPVMV was common in China.
Key words: Sweet potato vein mosaic virus ( SPVMV); coat protein gene; sequencing; prokaryotic
expression; antiserum
植物病理学报 41 卷
中图分类号: S432. 41 文献标识码: A 文章编号: 0412-0914(2011)01-0057-07
甘薯脉花叶病毒(Sweet potato vein mosaic vi-
rus,SPVMV) 是马铃薯 Y 病毒属(Potyvirus)一个
新的暂定种[1],SPVMV也称甘薯病毒 2(Sweet po-
tato virus 2,SPV2) [2]和甘薯病毒 Y(Sweet potato
virus Y,SPVY) [1]。 20 世纪 80 年代,Rossel 等[3]
首先从台湾和尼日利亚甘薯上分离到该病毒。
SPVY病毒粒体丝状,长 850 nm,侵染细胞产生风
轮状、卷轴状内含物和由非结构蛋白构成的晶状
物[1],常与其他甘薯病毒混合侵染,在寄主上产生
明脉、花叶、畸形、褪绿等症状。 靠桃蚜 (Myzus
persicae)以非持久方式传播,也可机械传播,但以
机械传播方式系统侵染甘薯时,必须先在甘薯上预
先接种甘薯褪绿矮缩病毒( Sweet potato chlorotic
stunt virus,SPCSV) [1]。 Ateka 等[4]克隆了 12 个
来自中国、葡萄牙、南非和赞比亚等国家和地区
SPVMV分离物的 CP 基因及 3′端非编码区序列,
这 12 个分离物的 CP 基因核苷酸序列一致性为
81% ~ 99% ,推导的氨基酸序列一致性为 86% ~
99% ,说明不同地区分离物的 CP 基因存在较大的
变异性。
目前国内有关 SPVMV 的研究还很少。 Ateka
等[4]利用中国广东的病毒材料克隆了 SPVMV 的
CP基因及 3′端非编码区序列,但该病毒在中国的
发生和分布还不清楚,特别是缺乏对该病毒有效的
检测技术。 甘薯上马铃薯 Y 病毒属病毒种类多,
常混合发生,病毒含量低,纯化困难[5],难以制备
特异性抗血清。 因此,有必要在大肠杆菌中表达该
病毒的 CP 并制备特异性抗体,以利于查清我国
SPVMV的发生和分布,为该病毒的防治提供重要
的依据。 本试验利用 RT-PCR 方法, 克隆了
SPVMV 河南分离物(SPVMV-HN)的 CP 基因及
部分 3′末端非编码区序列,完成了序列测定,首次
在大肠杆菌中高效表达了 CP 基因并制备了特异
性抗体,建立了血清学检测技术,可为进一步的研
究提供参考。
1 材料与方法
1. 1 菌株和质粒
大肠杆菌 DH5α、BL21(DE3)pLysS 和原核表
达载体 pET-28a( + )由本实验室保存。 pMD18-T
载体购自 TaKaRa公司。
1. 2 酶及试剂(盒)
UNIQ-10 柱式总 RNA 抽提试剂盒、UNIQ-10
柱式 DNA 胶回收试剂盒、 IPTG、氨苄青霉素
(Amp)、卡那霉素(Kan)、丙烯酰胺、三羟甲基氨基
甲烷(Tris)、十二烷基磺酸钠(SDS)、甘氨酸等均
购自上海生工生物工程有限公司。 限制性内切酶、
T4 DNA 连接酶、反转录试剂盒购自 TaKaRa 公
司。 碱性磷酸酯酶标记的羊抗兔 IgG 为 Sigma 产
品。 其他常用试剂为国产分析纯。
1. 3 SPVMV CP 基因及 3′末端非编码区的克隆
和序列测定
1. 3. 1 引物设计 根据 GenBank 中已报道的
SPVMV 的核苷酸序列(AY178992 和 AY178989)
设计正向引物 SPVMVF(5′-GTGGTGGACAACA-
CACTTATG-3′),引物由 TaKaRa公司合成。
1. 3. 2 RT-PCR 扩增 取田间显症甘薯苗的茎
尖,嫁接到巴西牵牛( Ipomoea setosa)上,待巴西牵
牛出现系统花叶症状后,取其叶片利用上海生工生
物工程公司的 Flash UNIQ 柱式总 RNA 抽提试剂
盒,并按其说明书方法,提取感病叶片的总 RNA。
以提取的病叶总 RNA 为模板,以 Olig dT-
Adaptor Primer 为反向引物,利用 TaKaRa 公司的
RT-PCR 试剂盒 ( TaKaRa RNA PCR Kit, AMV
Ver. 3. 0)进行反转录和 PCR,扩增获得 SPVMV
基因组 3′末端。 在 10 μL 反应体系中加入 1 μL
10 × RT buffer、2 μL MgCl2 (25 mmol / L)、1 μL
dNTP 混合物(10 mmol / L)、0. 5 μL Olig dT-Adap-
tor Primer(2. 5 mmol / L)、 0. 25 μL RNase 抑制剂
(40 U / μL)、0. 5 μL AMV 反转录酶(5 U / μL)、
4. 75 μL总 RNA,于 42℃条件下反应 30 min,99℃
处理 5 min终止反应后, 取反转录产物作为模板,
加入 1 μL SPVMVF引物(10 μmol / L)、10 μL 5 ×
PCR buffer、0. 25 μL TaqHS(5 U / μL),28. 75 μL
ddH2O,进行 PCR扩增。 扩增条件为: 94℃预变性
2 min,94℃变性 30 s,56℃退火 30 s,72℃延伸
2 min,共 30 个循环,PCR 结束后,经 0. 8%琼脂糖
凝胶电泳,利用 UNIQ-10 柱式 DNA胶回收试剂盒
回收目的 DNA片段。
85
1 期 张业辉,等:甘薯脉花叶病毒外壳蛋白基因在大肠杆菌中的表达及其抗血清的制备
1. 3. 3 序列测定 将纯化后的 PCR 产物与
pMD18-T 载体连接,并转化大肠杆菌 DH5α,经蓝
白斑筛选和 PCR扩增鉴定获得阳性克隆。 核苷酸
序列测定由 TaKaRa 公司完成。 利用 DNAMAN
和 BLAST对所测序列进行比较分析。
1. 4 CP基因原核表达载体的构建
根据测定的 SPVMV-HN CP 基因序列设计正
向引物 5′ primer ( 5′-GCGAATTCTCAAGCACT-
GAAGAAAC-3′, 对应于 CP基因的 1 ~ 25nt,并引
入 EcoRⅠ位点)和反向引物 3′primer(5′-CTCTC-
GAGCTACTGCACACCTCTCATT-3′,与 CP 基因
终止密码子下游序列互补,并引入 XhoⅠ位点)。
以 1. 3. 3 中获得的质粒为模板进行 PCR 扩增,将
纯化后的 PCR 产物经 EcoRⅠ和 XhoⅠ双酶切处
理,再与经同样酶处理的载体 pET-28a( + )连接。
转化大肠杆菌 DH5α,碱解法提取质粒 DNA,利用
PCR和酶切鉴定筛选阳性克隆。
1. 5 CP基因的诱导表达和 SDS-PAGE 分析
将含有原核表达载体的 BL21(DE3)pLysS 于
37℃活化过夜后,按 1∶ 100 稀释到 10 mL LB 培养
基中(含 Kan 100 μg / mL),振荡培养至对数生长
中期,加入 IPTG 至终浓度为 0. 4 mmol / L,继续诱
导 3 ~ 4 h,培养液经 10 000 r / min离心 1 min,收集
菌体,加入 300 μL 样品缓冲液(40 mmol / L Tris-
HCl、pH 6. 8、10% 甘油、2% SDS、5% 巯基乙醇、
0. 1%溴酚蓝),煮沸 10 min,离心后取上清,用
12. 5%的胶进行 SDS-PAGE分析。
1. 6 抗血清制备及其效价测定
参照 Hager等[6]的方法回收表达产物,表达产
物经 12. 5%的 SDS-PAGE 电泳后,将凝胶用预冷
的 0. 25 mmol / L KCl,1 mmol / L DTT 溶液浸泡 5
min,重蒸水冲洗,再置于预冷的重蒸水中 (含 1
mmol / L DTT)1 h,切下含目的条带的凝胶,按 1∶ 1
比例(w / v) 加入 PBS 缓冲液(0. 14 mol / L NaCl、
2. 7 mmol / L KCl、 1. 5 mmol / L KH2PO4、 8. 1
mmol / L Na2HPO4),于冰浴中研磨。 用 PBS 缓冲
液适当稀释后,加入等体积的福氏不完全佐剂
(1. 5 g羊毛脂 +8 mL石蜡油)进行乳化。 采用肌
肉注射的方法免疫家兔,共免疫 6 次,免疫家兔的
工作由郑州博赛生物技术公司协助完成。
以感病甘薯叶片的汁液作为抗原包被 ELISA
板,将抗血清进行一系列倍比稀释后作为一抗,碱
性磷酸酯酶标记的羊抗兔 IgG 为二抗,用 ACP-
ELISA测定抗血清的效价[7]。
1. 7 抗血清的初步应用
利用制备的 SPVMV 抗血清,对采自全国 14
个省(市)的 14 份田间甘薯样品以及嫁接的巴西
牵牛样品进行了检测。 取甘薯或牵牛叶片用 PBS-
Tween缓冲液按 1 ∶ 10(w∶ v)用量研磨,杂质自然
沉淀后取上清进行 ACP-ELISA检测。 用甘薯脱毒
茎尖试管苗叶片或健康巴西牵牛叶片的汁液作为
阴性对照。 抗血清工作浓度为 1∶ 1 000 倍。 检测
样品的吸光值 /阴性对照的吸光值≥ 2 为阳性。
2 结果
2. 1 SPVMV CP 基因及 3′末端非编码区的克隆
和序列测定
以感染 SPVMV河南分离物(SPVMV-HN)的
巴西牵牛叶片总 RNA为模板,经反转录和 PCR扩
增,得到一特异性片段,长度约为 1. 8 kb,与设计相
符(图 1)。 将扩增出的特异性片段克隆到 pMD18-
T 载体上进行序列测定,结果表明所克隆的片段全
长 1 845 bp,包括整个 CP 基因和 3′UTR。 CP基因
由996个核苷酸组成(GenBank登录号为 FJ687211),
Fig. 1 RT-PCR products of SPVMV CP gene
and 3′UTR
Lane 1: DNA marker DL 2 000; Lane 2: PCR product.
95
植物病理学报 41 卷
共编码 332 个氨基酸残基。 利用 DNAMAN 和
BLAST软件进行序列比较分析(表 1),对不同的
SPVMV分离物 CP基因推导的氨基酸序列进行比
较分析发现,SPVMV-HN 的 CP 基因与已发表的
其他分离物 CP 基因的氨基酸序列一致性为
95. 2% ~ 98. 5% ,其中与广东分离物(AY459611)、
葡萄 牙 分 离 物 ( AY459604 ) 和 南 非 分 离 物
(AY459608 ) 的氨基酸一致性分别为 97. 9% 、
98. 2%和 95. 2% 。 氨基酸序列的差异主要位于
CP的 N 末端区域,例如,SPVMV-HN 与 MD2 共
有 14 个氨基酸的差异,其中 12 个位于 CP 的 N
端。 与其他分离物相同,SPVMV-HN CP 的 N 端
也存在着 Potyvirus 属病毒蚜传所特有的 DAG 基
序(图 2);3′UTR与其他分离物的核苷酸序列一致
性在89. 2% ~ 99. 1% 之间,其中与广东分离物
(AY459611)和南非分离物(AY459608)的核苷酸
序列一致性分别为 99. 1%和 89. 3% ,与其他分离
物的核苷酸序列一致性均在 97%以上。
2. 2 SPVMV CP基因原核表达载体的构建
以重组质粒为模板,用正向引物 5′primer 和反
向引物 3′primer进行 PCR 扩增,得到 996 bp 左右
的条带,将其与载体 pET-28a( + )连接,转化大肠
杆菌 DH5α,提取质粒,经 PCR及 EcoRⅠ和 XhoⅠ
双酶切鉴定,得到 SPVMV CP 基因的原核表达载
体 pETSPVMVCP 。
2. 3 表达产物的 SDS-PAGE分析
将 pETSPVMVCP转入大肠杆菌 BL21(DE3)
pLysS中,含有重组质粒的工程菌经 IPTG诱导后,
样品经 SDS-PAGE分离,可产生约 41 kDa 的特异
蛋白质条带(图 3),与预期的大小相符,未经诱导
的含重组质粒的工程菌则没有相应的条带,说明
SPVMV CP基因得到了正确表达。
2. 4 抗血清制备及效价测定
利用回收的特异性表达的 41 kDa蛋白免疫家
兔。 6 次注射后 10 d取血获得 SPVMV的抗血清。
以感病甘薯叶片的汁液为抗原,进行 ACP-ELISA
检测,结果表明抗血清稀释 4 096 倍后仍能明显检
测出病毒,而且抗血清与甘薯脱毒茎尖试管苗叶片
的汁液没有明显的免疫反应,说明抗血清的专化性
较强。
2. 5 抗血清的初步应用
利用制备的 SPVMV 抗血清,对采自全国 14
个省(市)的 14 份田间甘薯样品以及嫁接的巴西
牵牛样品进行了 ACP-ELISA 检测。 结果发现,采
自四川、安徽和江苏的 3 份甘薯样品呈阳性反应,
阳性率为 21. 4% 。 嫁接到巴西牵牛上的 14 份样
品中有 8 份呈阳性反应,阳性率为 57. 1% ,这些样
品分别采自四川、海南、山东、山西、江苏、安徽、甘
肃和广东,说明我国甘薯上普遍存在 SPVMV(表 2)。
Fig. 2 Comparision of the partial amino acid sequence of CP gene in different SPVMV isolates
06
1 期 张业辉,等:甘薯脉花叶病毒外壳蛋白基因在大肠杆菌中的表达及其抗血清的制备 16
植物病理学报 41 卷
Fig. 3 SDS-PAGE analysis of expression
products of pETSPVMVCP
Lane 1: Protein marker; Lane 2: pETSPVMVCP induced
with IPTG; Lane 3: pETSPVMVCP without induction; Lane
4: BL21(DE3)pLysS with pET-28a( + ) .
3 讨论
侵染甘薯的病毒种类复杂,目前已报道侵染甘
薯的病毒有 20 余种[8 ~ 10],其中属于马铃薯 Y病毒
属的主要有甘薯羽状斑驳病毒( Sweet potato fea-
thery mottle virus,SPFMV)、甘薯潜隐病毒( Sweet
potato latent virus,SPLV)、甘薯病毒 G(Sweet po-
tato virus G,SPVG)、SPVMV 和甘薯轻斑点病毒
(Sweet potato mild speckling virus,SPMSV)等。 这
些病毒的寄主范围、粒子形态非常相似,在田间常
常混合侵染,单一病毒的分离和提纯及其抗血清的
制备比较困难[5]。
自 1988 年 Rossel 等[4]首先从台湾和尼日利
亚甘薯上分离到 SPVMV以来,我国的广东和葡萄
牙、南非、赞比亚等国家和地区的甘薯样品上也检
测到该病毒的存在,说明 SPVMV 是甘薯上较重要
的病毒之一,在世界上分布比较普遍。 我国
SPVMV的分布还不是特别清楚,本研究利用制备
的抗血清对采自全国 14 个省(市)的甘薯样品进
行检测,初步明确了该病毒的分布情况。 2006 年
Kokkinos等[11]发现 SPVMV与甘薯褪绿矮缩病毒
(Sweet potato chlorotic stunt virus,SPCSV)具有协
生作用, 当 SPVMV 与 SPCSV 共同侵染时,
SPVMV含量增加,需重视 SPVMV 与其他病毒互
作加重危害甘薯的情况。
目前甘薯病毒病最有效的防治方法是种植脱
毒甘薯,而建立高效、简便的病毒检测技术是获得
脱毒甘薯的重要环节。 本研究首次在大肠杆菌中
高效表达了 SPVMV的外壳蛋白,以表达产物作为
抗原,不仅可以大量制备抗血清,而且由于表达产
物中不含植物组织成分,所以用血清学方法检测病
毒时特异性较强。 SPVMV 抗血清的获得和检测
技术的建立,为脱毒甘薯的培育奠定了良好基础。
目前对 SPVMV的分子生物学研究还比较少,
NCBI GenBank 中登录的该病毒的基因组序列只
有部分 NIb 基因序列、CP 基因以及 3′UTR。 本试
验克隆了 SPVMV 河南分离物基因组 3′末端约
1. 8 kb的目的片段,此片段包括部分 NIb 基因序
列和完整的 CP 基因及 3′UTR 序列。 通过与不同
的 SPVMV分离物进行序列比对分析发现,本试验
克隆的 SPVMV-HN CP基因与已发表的其他分离
物 CP 基因的氨基酸序列一致性在 95. 2% ~
98. 5%之间,说明不同地区的分离物之间存在一定
的差异。 对不同的 SPVMV分离物 CP基因氨基酸
序列进行比较分析发现,氨基酸序列的差异主要位
于 CP 的 N 末端区域[4]。 与其他分离物相同,
SPVMV-HN CP的 N端也存在着 Potyvirus属病毒
蚜传所特有的 DAG 基序[12],表明 SPVMV-HN 可
能通过蚜虫传播。
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100.
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于金枝
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