全 文 ：植物病理学报
ACTA PHYTOPATHOLOGICA SINICA　 43(2): 113-119(2013)
收稿日期: 2012-05-15; 修回日期: 2012-12-30
基金项目: 番茄黄化曲叶病毒病调查监测及防控技术试验示范(PXM2011-036203-113507); 北京市大学生科学研究与创业行动计划项
目; 公益性行业(农业)科研专项(201003065)
通讯作者: 周 涛,副教授,主要从事植物病毒学研究; Tel:010-62732771, E-mail: taozhoucau@cau. edu. cn
第一作者: 宋 晰,女,山东淄博人,在读本科生; E-mail: song-xi. 1990@163. com。
北京地区番茄黄化曲叶病病毒
分离物测定及株系的初步鉴定
宋 晰1, 师迎春2, 张世晨1, 梁 彦1, 王 廿1, 陈善义1, 周 涛1
( 1中国农业大学植物病理学系,农业部植物病理学重点实验室, 北京 100193; 2 北京市植物保护站, 北京 100029)
摘要:番茄黄化曲叶病毒病是番茄生产中的一种毁灭性病毒病害,2009 年传入北京。 利用烟粉虱传双生病毒简并引物 PA /
PB对 2010 年 ~ 2011 年采集自北京市 5 个区县的 53 个番茄样品进行检测,30 个表现典型黄化曲叶病症状的样品均扩增得
到约 500 bp的特异条带,测定了其中 7 个样品的部分序列,经序列比对分析表明其为番茄黄化曲叶病毒(Tomato yellow leaf
curl virus, TYLCV)。 利用 TYLCV 特异引物 TJ-F / TJ-R、TY-F / TY-R 对样品 BJDXXY、BJFS02、BJFS03、BJMY2231 进行
TYLCV基因组克隆和序列测定,经分析 4 个样品携带的 TYLCV基因组长度均为 2 781 碱基,编码 6 个蛋白。 基因组序列
比较发现,这 4 个分离物与 TYLCV-Israel株系同源性达到 98%以上;通过建立系统发育树,发现 BJDXXY、BJFS02、BJFS03
与河北分离物(HBLF4)、山东分离物(SDSG)亲缘关系较近,BJMY2231 与上海分离物(TYLCV-Israel)、江苏分离物
(JSNJ1)亲缘关系较近。
关键词:番茄黄化曲叶病毒; TYLCV-Israel; 全基因组; 全序列分析; 系统发育分析
Detection and preliminary strain identification of the pathogen induing Tomato
yellow leaf curl disease in Beijing 　 SONG Xi1, SHI Ying-chun2, ZHANG Shi-chen1, LIANG
Yan1, WANG Nian1, CHEN Shan-yi1, ZHOU Tao1 　 ( 1Department of Plant Pathology and Key Laboratory of Plant
Pathology, Ministry of Agriculture, China Agricultural University, Beijing 100193, China; 2Beijing Plant Protection Station,
Beijing 100029, China)
Abstract: Tomato yellow leaf curl virus (TYLCV) induces severe disease on tomato and was found in Bei-
jing in 2009. In 2010 and 2011,53 tomato samples from 5 counties were collected and detected using a pair of
primers PA / PB designed according to the specific sequence of the whitefly-transmitted geminiviruses. The
results showed that target fragment (about 500 bp) could be detected in 30 samples with typical yellow leaf
curl symptom. Sequence analysis of the fragments of seven typical samples confirmed that those samples were
infected by TYLCV. Complete genomic sequences of 4 TYLCV isolates (BJDXXY,BJFS02,BJFS03 and
BJMY2231)were obtained with two pairs of TYLCV-specific primers,TJ-F / TJ-R and TY-F / TY-R. Their ge-
nomes all contained 2 781 bp nucleotides encoding six potential proteins and was most closely related to TYL-
CV-Israel strain (higher than 98% sequence identity) . Phylogenetic analysis based on the DNA genome se-
quence showed that BJDXXY,BJFS02 and BJFS03 were more related to reported isolates of TYLCV-Israel in
Hebei Province (TYLCV-HBLF4) and Shandong Province (TYLCV-SDSG) in China, and BJMY2231 is
more closely related to the isolates in Shanghai and Jiangsu Province (TYLCV-JSNJ1) .
Key words: Tomato yellow leaf curl virus; TYLCV-Israel; genome; full sequence analysis; phylogenetic
analysis
　
植物病理学报 43 卷
中图分类号: S432. 41　 　 　 　 　 文献标识码: A　 　 　 　 　 文章编号: 0412-0914(2013)02-0113-07
　 　 番茄黄化曲叶病毒病是世界范围内严重威胁
番茄生产的一种毁灭性病害,其典型病症为植株矮
化,顶部叶片黄化变小,叶片边缘向上或向下卷曲。
生长发育早期染病植株无法正常开花结果,后期染
病植株其上部新叶表现症状,结果减少,果实变小,
失去市场价值[1]。
引起世界各地番茄黄化曲叶病的双生病毒比
较复杂,而危害我国番茄的双生病毒目前发现的至
少有 6 种,包括番茄黄化曲叶病毒(Tomato yellow
leaf curl virus,TYLCV)、中国番茄黄化曲叶病毒
(Tomato yellow leaf curl China virus,TYLCCNV)、
台湾番茄曲叶病毒(Tomato leaf curl Taiwan virus,
ToLCTWV)、广东番茄黄化曲叶病毒 ( Tomato
yellow leaf curl Guangdong virus,TYLCGuV)、泰国
番茄黄化曲叶病毒(Tomato yellow leaf curl Thai-
land virus, TYLCTHV)和中国番木瓜曲叶病毒
(Papaya leaf curl China virus,PaLCuCNV) [2 ~ 6]。
以上病毒均为双生病毒科(Geminiviridae)菜豆金
色花叶病毒属(Begomovirus)成员。 该属的大多数
病毒由 2 个组分(DNA-A和 DNA-B)组成,为 2 条
闭合环状单链 DNA分子,长度相似,每条为 2. 5 ~
2. 8 kb[7];少数病毒,如 TYLCV,为单个 DNA 组
分,相当于双组分病毒的 DNA-A,约 2. 8 kb[8]。
TYLCV于 1939 年在以色列首次发现,目前在
中东地区、非洲、亚洲、欧洲、美洲等世界各地都有
发生[9]。 在中国,TYLCV 于 2006 年首先在上海
发现[10],之后在浙江、江苏、山东、安徽、河北、天
津、北京等地发现,危害严重[11 ~ 16]。 TYLCV 的主
要传毒介体是烟粉虱(Bemisia tabaci),也可以通
过嫁接传播,但不通过种子、机械摩擦传播。 TYL-
CV寄主广泛,可以侵染茄科、豆科等多种植物,超
过 20 种植物易受其影响,包括番茄、曼陀罗、辣椒、
菜豆、烟草等[17]。
番茄是北京市保护地主栽蔬菜之一,2009 年 9
月北京发生番茄黄化曲叶病毒病[14],其病原初步
鉴定为番茄黄化曲叶病毒[18],随后在北京市所有
郊区县普遍发生。 为明确北京地区番茄黄化曲叶
病毒病病原株系、基因组变异及可能来源,2010 年
~ 2011 年在北京市郊区县采集番茄黄化曲叶病毒
病疑似病株,进行病毒检测和部分样品的病毒基因
组克隆及分析。
1　 材料与方法
1. 1　 样品采集
2010 年 ~ 2011 年在北京郊区县房山、海淀、顺
义、密云、大兴的日光温室和大棚中采集表现典型
植株矮缩、顶叶卷曲黄化的番茄植株叶片和疑似植
株叶片,整理后放在 4℃冰箱,一周内提取番茄样
品总 DNA。
1. 2　 叶片总 DNA提取
利用改良的 CTAB 法精提番茄叶片总
DNA[19]。 取 0. 1 g嫩的组织,用蒸馏水洗净,液氮
研磨至粉末状,转移至 2 mL 离心管中,加入 65℃
水浴预热的 500 μL 的 2% CTAB 抽提缓冲液(用
时加 20 μL β-巯基乙醇),65℃水浴保温 30 min,
期间颠倒混匀数次,经 600 μL 氯仿 /异戊醇
(24∶ 1)抽提 2 次,上清液中加入 0. 7 倍体积的异
丙醇,取沉淀用 70%乙醇清洗 2 次,干燥后溶于
ddH2O中, -20℃保存。
1. 3　 PCR扩增、克隆和序列测定
根据 Xie等[20]报道的检测粉虱传双生病毒的
简并引物 PA 和 PB 进行 PCR,扩增双生病毒基因
间隔区和部分外壳蛋白基因 541 bp 的特异片段,
并进行克隆和序列测定。 根据测序和序列分析结
果,参考 Jin等[13]设计的 TYLCV特异性引物 TJ-F
( 5′-GGAACATCAGGGCTTCGATA-3′) 和 TJ-R
( 5′-CCCTCTGGAATGAAGGAACA-3′) 扩 增 约
2． 4 kb的近全长序列。 PCR 产物经 1%琼脂糖凝
胶电泳分离后,用凝胶回收试剂盒回收纯化,克隆
到 pMD18-T载体(TaKaRa)上,送北京三博远志生
物技术有限公司测序。 为获得病毒基因组其余序
列,根据 2. 4 kb片段测序结果设计引物 TY-F(5′-
AACTTCGACAGCCCATACAGCAGC-3′)、 TY-R
(5′-ACACTGGATTAGAGGCATGCGTA-3′),获得
约 660 bp 基因组部分片段,利用 DNAMAN 软件
(DNAMAN Version 6. 0)拼接全基因组序列。 上
述各引物均由北京三博远志公司合成,以健康植株
为阴性对照。
411
　
　 2 期 　 　 宋 晰,等:北京地区番茄黄化曲叶病病毒分离物测定及株系的初步鉴定
1. 4　 序列分析
DNA序列用 DNAMAN Version 6. 0 进行处理
和分析。 序列比对采用 NCBI 序列比对工具
BLAST程序 nucleotide blast,多序列比较分析采用
Clustal W,进化树构建采用 MEGA 5. 05 的邻近相
邻法(Neighbor-joining)。 用于 DNA 序列比较和
进化分析的其他序列见表 1。
2　 结果与分析
2. 1　 样品检测
以提取的番茄叶片总 DNA 为模板,利用粉虱
传双生病毒通用引物 PA / PB 对采集的 53 个样品
进行 PCR检测,其中 30 个样品扩增得到约 500 bp
特异条带,检出率为 56. 6% (表 2)
对房山样品(BJFS03、BJFS06、BJFS201)、大兴
样品 (BJDXXY)、海淀样品 (BJHD06、 BJHD07、
BJHD09)的 541 bp PCR 扩增产物进行测序,比对
发现这 7 个样品序列之间相似性达 97% ,推测是
同一种病毒的不同分离物。 将所获序列在 NCBI 上
进行比对发现,BJHD06、BJHD09 与 TYLCV浙江分
离物 (GenBank 登录号为 AM698123. 1)同源性最
高,为 99% ; BJHD07、 BJDXXY、 BJFS03、 BJFS06、
BJFS201与 TYLCV 安徽分离物 (GenBank 登录号
为 FN650801. 1)同源性最高,均高于 98% 。
2. 2　 DNA全序列特征及北京地区优势株系初步
分析
选择检测结果为阳性的 BJFS02、 BJFS03、
BJMY2231、BJDXXY样品进行病毒全基因组序列
克隆和测定,通过 PCR扩增,得到 2 405 bp的近全
长特异条带和 664 bp 特异片段(图 1、图 2),经过
拼接,获得了 TYLCV全长序列。 这 4 个分离物基
因组大小均为 2 781 bp。
Table 1　 Tomato yellow leaf curl virus isolates used in phylogenetic analysis
No. Isolate Year Source GenBank accession No.
1 Tomato yellow leaf curl virus- HBLF4 2011 Hebei,China HM208334. 1
2 Tomato yellow leaf curl virus-SDSG 2011 Shandong,China HQ702862. 1
3 Tomato yellow leaf curl virus -Israel 2011 Shanghai,China GU434143. 1
4 Tomato yellow leaf curl virus- JSNJ1 2009 Jiangsu,China FN256259. 1
5 Tomato yellow leaf curl virus-ZJHZ12 2009 Zhejiang,China FN256256. 1
6 Tomato yellow leaf curl China virus 2004 Guangxi,China AF311734. 1
7 Tomato leaf curl Taiwan virus 2002 Taiwan,China U88692. 1
8 Tomato yellow leaf curl Guangdong virus 2006 Guangdong,China AY602166. 1
9 Tomato yellow leaf curl virus - Israel 2011 Grenada Island FR851298. 1
10 Tomato yellow leaf curl virus -KISR 2011 Kuwait JF451352. 1
11 Tomato yellow leaf curl virus -Mild 2006 Jordan EF054894. 1
12 Tomato yellow leaf curl virus- Mild 2004 Portugal AF105975. 1
13 Tomato yellow leaf curl virus - Israel 2010 Australia GU178820. 1
14 Tomato yellow leaf curl virus-Baja California 2010 Mexico HM459851. 1
15 Tomato yellow leaf curl virus- Wailuku 2010 USA GU322424. 2
16 Tomato yellow leaf curl virus-Israel 2010 Japan AB192966. 1
17 Tomato leaf curl virus - Vietnam 2002 Vietnam AF264063. 1
18 Tomato yellow leaf curl virus 2010 Netherlands FJ439569. 1
19 Tomato yellow leaf curl virus-Cuba 2005 Cuba AJ223505. 1
20 Tomato yellow leaf curl Thailand virus 2005 Thailand AY514632. 1
21 Tomato yellow leaf curl virus-Iran 2009 Iran AJ132711. 1
511
　
植物病理学报 43 卷
Table 2　 Location, collection time and detection results of the tomato samples
Location Time Sample No. Detection result
Positive sample
number
Fangshan, Beijing 2011. 8 BJFS01,BJFS02,BJFS03,BJFS05,BJFS06,BJFS201 Positive 6
BJFS04 Negative
Haidian, Beijing 2011. 7 BJHD01,BJHD02,BJHD03 Positive 6
2011. 8 BJHD06,BJHD07,BJHD09 Positive
BJHD04,BJHD05,BJHD08 Negative
Daxing, Beijing 2011. 8 BJDXXY Positive 1
BJDX804,BJDX1005,BJDX2001 Negative
2010. 4 BJDXDZ101,BJDXDZ102,BJDXDZ103,
BJDXDZ104,BJDXDZ106,BJDXQC107,
BJDXDZ118,BJDXDZ119,BJDXXG122,
BJDXDZ128
Positive 10
BJDXDZ49,BJDXDZ 107,BJDXDZ108,
BJDXDZ109,BJDXDZ114,BJDXDZ115,
BJDXDZ117,BJDXXG103,BJDXXG119,
BJDXXG118
Negative
Shunyi, Beijing 2010. 4 BJSY10-2,BJSY10-1-2,BJSY146,BJSY151,BJSY712 Positive 5
2011. 8 BJSY103,BJSY105 Negative
Miyun, Beijing 2011. 8 BJMY211,BJMY2231 Positive 2
BJMY151,BJMY181,BJMY11307,BJMY2201 Negative
Total 30
Fig. 1 　 PCR amplification of DNA extracted
from Beijing samples with primer TJ-
F / TJ-R
Lane M: DNA Marker; Lane 1: Negative control; Lane 2-5:
Tomato samples BJHD06, BJHD09, BJFS01and BJFS03.
Fig. 2 　 PCR amplification of DNA extracted
from Beijing samples with primer TY-
F / TY-R
Lane M: DNA Marker; Lane 1-4: Tomato samples BJFS02,
BJFS03, BJMY2231and BJDXXY.
　 　 4 个分离物的全长序列均有 Begomovirus病毒
的基因组典型特征,为闭合单链环状 DNA,有 6 个
ORFs,分别是位于病毒链上的 AV1 基因(308 ~
1 084 nt,编码 CP)、AV2 基因(148 ~ 498 nt,编码与
病毒移动相关基因),位于病毒互补链上的 AC1 基
因(1 542 ~ 2 615 nt,编码复制酶)、 AC2 基因
(1 226 ~ 1 633 nt,编码转录激活蛋白)、AC3 基因
(1 081 ~ 1 485 nt,编码复制增强蛋白)和 AC4 基因
(2 171 ~ 2 464 nt,编码复制或转录调控因子);在
基因 AC1 与 AV2 之间有 313 nt的基因间隔区( In-
tergenic region,IR),该区含有保守序列 TAATAT-
TAC,TATA box,正向重复序列 GGTGTCT。
611
　
　 2 期 　 　 宋 晰,等:北京地区番茄黄化曲叶病病毒分离物测定及株系的初步鉴定
　 　 将所得的 4 个分离物全序列与 NCBI 上登录
的世界各地 TYLCV 不同株系代表分离物进行了
同源性比对 (表 3 ), 发现 BJDXXY、 BJFS02、
BJFS03、BJMY2231 与 TYLCV-Israel 株系基因组
序列同源性非常高(均为 98%以上),与 TYLCV-
Mild株系、TYLCV-Iran株系基因组序列同源性较
低(均为 92%以下)。 因此认为,北京市的 4 个分
离物(BJDXXY、BJFS02、BJFS03、BJMY2231)属于
TYLCV-Israel株系,初步推断北京地区 TYLCV 优
势株系为 TYLCV-Israel株系。
另外,通过比较 4 个分离物的序列同源性可以
发现,样品 BJDXXY、BJFS02 和 BJFS03 两两之间
同源性均在 99%以上,BJDXXY 和 BJMY2231 的
样品同源性相对较低,为 98. 99% ,但是差异不显
著。
2. 3　 北京 TYLCV分离物与其他双生病毒的分子
进化分析
为了进一步了解病毒分离物的分类地位和可
能来源,选择了中国和世界其他地区已经报道的引
起番茄曲叶病毒病的代表性病毒株系建立系统进
化关系树(图 3)。
Table 3　 Genomic identity between isolates in Beijing and the reported TYLCV strains
TYLCV isolate
Identity (TYLCV Beijing isolate)
BJDXXY BJFS02 BJFS03 BJMY2231
BJDXXY 100%
BJFS02 99. 75% 100%
BJFS03 99. 78% 99. 82% 100%
BJMY2231 98. 99% 99. 03% 99. 07% 100%
TYLCV-Israel(GU434143. 1) 98. 92% 99. 03% 98. 99% 99. 50%
TYLCV-Mild(EF054894. 1) 91. 51% 91. 69% 91. 59% 91. 69%
TYLCV-Iran(AJ132711. 1) 90. 73% 90. 84% 90. 77% 91. 09%
Fig. 3　 Phylogenetic tree of genomic sequences of TYLCV Beijing isolates BJFS02,BJFS03,
BJMY2231,BJDXXY and 21 Begomovirues using the MEGA version 5. 05 software
711
　
植物病理学报 43 卷
　 　 经分析发现:北京大兴分离物(BJDXXY)与
北京房山分离物(BJFS03)亲缘关系最近,形成一
个独立分支, 这 2 个分离物与河北分离物
(HBLF4)、房山分离物(BJFS02)、山东寿光分离物
(SDSG)等形成一个大的分支。 北京密云分离物
(BJMY2231)与大兴分离物、房山分离物亲缘关系
较远,与 TYLCV-Israel 上海分离物(China Shang-
hai)和江苏分离物 TYLCV-JSNJ1(China Jiangsu)
亲缘关系较近,形成一个大的分支。
3　 讨论
据报道,多种双生病毒可以侵染番茄引起黄化
曲叶病毒病[2 ~ 6],其中以 TYLCV 为主要毒源。 本
文利用烟粉虱传双生病毒通用引物,对北京市郊区
发生的番茄黄化曲叶病样品进行检测,经过对
PCR获得的约 500 bp 片段进行克隆、序列测定和
分析,北京地区分离物的部分序列与 NCBI 上已经
登录的 TYLCV分离物同源性均在 98%以上,初步
判断北京市番茄黄化曲叶病毒病由 TYLCV 侵染
引起。
TYLCV 的株系有 TYLCV-Israel、 TYLCV-
Mild、TYLCV-Iran 等。 经过对北京市郊区采集的
TYLCV 的 4 个 分 离 物 BJFS02、 BJFS03、
BJMY2231、BJDXXY基因组全序列克隆测序和同
源性比对,发现 4 种分离物与 TYLCV-Israel 株系
同源性均高于 98% ,远高于与其他株系的同源性
(92%以下)。 依据同种双生病毒基因组序列同源
性大于 94%被认为是同一株系的不同变种[21],因
此认 为 北 京 地 区 4 个 分 离 物 BJMY2231、
BJDXXY、BJFS02、 BJFS03 均属于 TYLCV-Israel
株系,初步推测北京地区番茄黄化曲叶病毒病的优
势株系是 TYLCV-Israel株系。
根据北京分离物与其他地区分离物的系统发
育树可以看出,房山分离物(BJFS02、BJFS03)、大
兴分离物(BJDXXY)、山东寿光分离物(SDSG)、
河北廊坊分离物(HBLF4)、TYLCV-Israel 澳大利
亚分离物(Australia)及日本分离物( Japan)的亲缘
关系较近,形成一个大的分支; 密云分离物
(BJMY2231)与 TYLCV-Israel 上海分离物、江苏
南京分离物(JSNJ1)亲缘关系较近,形成另外一个
大的分支。 基于上述分析,推测房山和大兴的病毒
毒源可能由山东和河北传入,密云的病毒毒源可能
由江苏、上海等地传入。 从地理位置上看,房山和
大兴靠近河北廊坊,可能通过蔬菜调运或烟粉虱迁
徙传入;密云位于北京北部,离河北廊坊地区较远,
可能由南方远距离调运种苗传入。 TYLCV 可以
随种苗、接穗等传播,建议调种前进行必要的检测,
避免在生产中使用带毒幼苗,以免病毒传入无病
区。
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责任编辑:于金枝
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