全 文 ：书西北植物学报!
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!
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"
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#$
#%"(#%#"
!"#$%&#%&()$*+,""-.)/#0-/
!!
文章编号$
#""")$"!
"
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#
"&)#%")"*
!!!!!!!!!!!!!!!
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$
#"+&*"*
%
,
+-../+#""")$"!+!"#$+"&+#%"
收稿日期$
!"#$)"%)"
&修改稿收到日期$
!"#$)")"%
基金项目$国家青年自然科学基金"
%#%""0%
#&浙江省花卉新品种选育重大科技专项"
!"#!1#!2"2)#"
#&林业公益性行业科研专项
"
!"#%"$##&
#
作者简介$贾春蕾"
#2&%(
#!女!硕士!讲师!主要从事花卉教学与研究
3)45-6
$
,
76)#2&%
!
#*%+784
"
通信作者$孙崇波!研究员!主要从事花卉遗传育种和生物技术方面研究
3)45-6
$
798/
:;
8#!%"
!
.-/5+784
春兰
1
2
034$
基因的克隆和表达分析
贾春蕾#!!向
!
林!!秦德辉!!李小白!!吴
!
超!!孙崇波!"
"
#
金华职业技术学院!浙江金华
%!#"#&
&
!
浙江省农业科学院园艺所!杭州
%#""!#
#
摘
!
要$该研究采用
<=)>1<
和
技术从春兰"
!
"
#$%&%#
(
)*+%,
(
%%
#中分离到
#
个
-./011020%
"
-./%
#
基因序列分析表明!该基因含有
#
个
&%!@
;
的开放阅读框"
A#!共编码
!$%
个氨基酸系统进化树分析显示!
该基因是
C?DE)@8F
基因家族
?>#
%
?GH2
组
-./
的同源基因!其编码蛋白与其它植物
E3>%
类蛋白具有较高的
一致性!命名为
!
(
-./%
"登录号为
IB2!$!&!
#实时荧光定量分析表明!
!
(
-./%
在春兰花器官中均有表达!其
中在唇瓣(侧瓣和萼片中的表达量较高!在子房和蕊柱中的表达量较低&而且
!
(
-./%
在花发育各个时期都有表
达!在
#
"
!74
的花芽中表达量最高!在盛开的花中的表达量最低研究认为!
(
-./%
基因可能在春兰花瓣和萼
片的形成过程中具有重要作用
关键词$春兰&
-./%
基因&实时荧光定量表达&花发育
中图分类号$
J&0
&
J&02
文献标志码$
?
%&"#
(
)!*+
,
-.//#"0)&
1
/#/"21
2
034$3..
2-"41
5
67-.-86
2
&)(-/
2
-
KL?19M/6N-
#
!
!
OL?PGH-/
!
!
JLPDN9M-
!
!
HLO-58@5-
!
!
QR1958
!
!
ERP198/
:
@8
!
"
"
#K-/9M5>86
S
TN79/-7
!
K-/9M5
!
U9N
,
-5/
:
%!#"#&
!
19-/5
&
!L/.T-TMTN8VW8XT-7M6TMXN
!
U9N
,
-5/
:
?75YN4
S
8V?
:
X-7M6TMX56E7-N/7N.
!
W5/
:
Z98M
!
U9N
,
-5/
:
%#""!#
!
19-/5
#
05/6-)76
$
L/T9-.XN.N5X79
!
5/8[N6-./%
:
N/N
!
/54NY!
(
-./%
"
GN/\5/]577N..-8//M4@NXIB2!$!&!
#!
5^.
-.865TNYVX84!
"
#$%&%#
(
)*+%,
(
%%@
S
<=)>1<5/Y1_
MN.+EN
_
MN/7N5/56
S
.-..98^ NYT95T
T9-.
:
N/N78/T5-/.5/8
;
N/XN5Y-/
:
VX54N8V&%!@
;
N/78Y-/
:
5
;
MT5T-[N
;
X8TN-/8V!$%54-/857-Y.+=9NYN)
YM7NY
;
X8TN-/.98^ NY9-
:
9-YN/T-T
S
-^T98T9NXE3>%
;
X8TN-/.VX84Y-VVNXN/T.
;
N7-N.
!
;
9
S
68
:
N/NT-7TXNN5/56)
S
.-.56.8-/Y-75TNYT95T!
(
-./%@N68/
:
.T8E3>765YN8V?>#
%
?GH2.M@V54-6
S
+_
M5/T-T5T-[N>1<
YN48/.TX5TNYT95T!
(
-./% 5^.NF
;
XN..NY-/56V68^ NX8X
:
5/.
!
9-
:
96
S
NF
;
XN..NY-/6-
;
.
!
65TNX56
;
NT56.5/Y
.N
;
56.
!
5/YT9N68^ N.T-/
S
8M/
:
8[5X
S
5/Y786M4/.+L/5YY-T-8/
!
(
-./% 5^.NF
;
XN..NY-/Y-VVNXN/TYN[N6)
8
;
4N/T.T5
:
N.8VV68^ NX
!
-^T9T9N9-
:
9N.TNF
;
XN..-8/-/V68^ NX@MY.
"
#)!74
#!
5/YT9N68^ N.T-/8
;
N/NY
V68^ NX+=9N.NXN.M6T.Y-.
;
65
S
NYT95T!
(
-./%45
S
XN
:
M65TNT9N
;
NT56.5/Y.N
;
56.V8X45T-8/8V!3
(
)*+%,
(
%%+
8.
1
9"-!/
$
!
"
#$%&%#
(
)*+%,
(
%%
&
-./%
:
N/N
&
XN56)T-4N
_
M5/T-T5T-[N>1<
&
V8X56YN[N68
;
4N/T
!!
在高等植物的生命进程中!花的形成是一个重
要的发育阶段继植物花器官发育的
?\1
模型)#*
提出之后!
=9N-..N/
等)!)%*于
!""#
年又提出了
?\)
1D3
模型!并认为
?
(
(
1
(
D
(
3
等

类功能基因共
同作用控制植物花器官的形成因为这些基因中的
多数所编码的蛋白质
P
端都包含一个
DP?
结合保
守区!因此又被称为
C?DE)@8F
基因)$*
-./011020%
"
-./%
#及其同源基因属于
C?DE)@8F
家族
3
类基因的
?>#
%
?GH2
组目前
已从拟南芥(鸽石斛"
4*,&+)$%#5+#*,67#
#(金
钗石斛"
4*,&+)$%#,)$%8*
#(石刁柏"
09
:
6+6
(
9
)
;;
%5%,68%9
#(文心兰"
<,5%&%#..
;
+
#等植物中得
以克隆!并进行了功能验证))2*对兰科植物花发育
相关基因的研究多集中在蝴蝶兰"
/=686*,)
:
9%9
..
;
+
#(文心兰及石斛兰"
4*,&+)$%#..
;
+
#等国外
的兰花种类上)*!2)#"*!而对中国兰的研究较少春兰
"
!
"
#$%&%#
(
)*+%,
(
%%
#是中国兰的主要种之一!花
具有典型的轮状结构!基本与双子叶植物花的结构
组成一致!而且又具有高度特化的唇瓣!为研究花发
育基因在单子叶植物中的功能提供了理想的材料
本研究以春兰为材料!利用
<=)>1<
结合
7DP?
末
端快速扩增"
#技术获得了
#
个与花发育相关
的
-./%
基因!并对其进行了表达分析为揭示
3
类基因在春兰花发育过程中的作用机理奠定基础
#
!
材料和方法
:+:
!
材
!
料
以种植于浙江省农业科学院园艺所花卉中心大
棚内的春兰品种+苍岩素,为实验材料花发育分为

个时期$
#
+
花芽长度
#
"+74
&
$
$
"+74
$
花芽
长度
#
#74
&
%
$
#74
$
花芽长度
#
!74
&
&
$
!74
$
花芽长度
#
%74
&

$花朵开放采集各时期的花芽
和时期
&
的侧瓣(萼片(唇瓣(蕊柱(子房!立即置液
氮中!带回实验室保存在
(&"`
冰箱中备用
:;<
!
总
=>0
提取和基因克隆
采用北京天恩泽基因公司
试剂盒
提取总花芽
!用美国
168/TN79
公司
EC?<=)
NX
=C
;
6-V-75T-8/I-T
合成
7DP?
第
#
链!以反转录模板直接进行
>1<
反应
根据
-./011020
"
-./
#基因的保守区域设
计引物进行
>1<
扩增!上游引物
a)1G111==?=)
1?=1==1=11?)%a
!下游引物
a)GGG?=111?)
G?===G==G=G)%a

>1<
扩增条件为
2$`
预变
性
$4-/
&
2$`
变性
%".
!
$
"
$$`
退火
%".
!每

个循环退火温度下降
!`
!
&!`
延伸
#4-/
!共进行
%
个循环&
!`
延伸
04-/

#b
琼脂糖凝胶电泳后回收
>1<
产物!连接到
;
CD#0)=
载体上!热激转化大肠杆菌
DW
(
感受态
细胞!通过
?4
;
抗性筛选和
O)
:
56
%
L>=G
蓝白斑筛
选选取白色菌落进行液体培养!
>1<
检测阳性克
隆!送上海英骏生物技术公司测序
根据扩增产物的测序结果设计
引物!
-./
基因
%a)引物
E3>)%
"
a)G1?G?11=?)
1?G1G??GGG?G1)%a
#!巢式引物
E3>)$
"
a)G?)
G=??11?GG1???111?1??1?)%a
#&
a)引物
E3>)
"
a)1??GGGG=GG=?G??GG1G=)
1?)%a
#!巢式引物
E3>)*
"
a)G1=111==1G1=G)
=?GG=1=G1)%a
#以反转录
7DP?
为模板!采用
168/TN79
公司
EC?<=NX
=C
;
6-V-)
75T-8/I-T
试剂盒进行
%a
和
a
端
扩增将
%a
和
a
端
反应产物分别回收!连接至
;
CD#0)
=
载体!测序后拼接获得全长基因
:+$
!
序列分析
对获得的全长
7DP?
序列!先在
9TT
;
$%%
5M+NF)
;
5.
S
+8X
:
%
T886.
%
Y/5+9T4H
进行开放阅读框的分
析&用
>X8T>5X54
软件分析各蛋白的基本性质!用
16M.T56O#+0%
软件进行氨基酸序列比对!用
\8F)
.95YN%+!#
软件进行分析运用
\65.T
搜索同源基
因!用
16M.T56O#+0%
软件对搜索得到的
7DP?
序列
进行多重序列比对!用
C3G?$
软件中的邻位相连法
进行系统发生树构建!并进行
\88T.TX5
;
检测)##*
:;?
!
034$
基因表达分析
分别取
"+#
:
花瓣(萼片(唇瓣(蕊柱和幼嫩子
房以及各时期的花芽!按照北京天恩泽基因公司
试剂盒说明书提取总
以
!""/
:
为模板!按照天根生化科技"北京#有限公司的
JM5/T.7X-
;
T<=I-T
说明书进行反转录!反转录后
的
7DP?
储存于
(!"`
备用根据春兰已有的
#0EX序列和克隆基因序列!结合实时荧光定
量
>1<
原理设计引物!用
#0-+>?0
基因作为内
标
#0-+>?0
基因上游引物
a)=G11G===111=)
G==G?==1)%a
!下游引物
a)=G1=G11==11=)
=GG?=G=G)%a

-./%
基因上游引物
E3>&
"
a)
?G?G=??11?GG1???111?1??)%a
#!下游引
物
E3>0
"
a)?1?===GG?G1?G11?=1GG=)%a
#
反应程序为
2`
预变性
%4-/
!然后
2`
变性
.
!
*"`
退火
%#.
!循环
$"
次!每个处理重复
%
次!整
个过程在
ETN
;
8/N
;
6M.
荧光定量
>1<
仪"
?\L
公
司#上进行数据通过
ETN
;
8/N
软件输出!并转换
为
3F7N6
格式再分析!按相对定量法计算基因的表
达量目的基因相对表达量
c!
(
))
!
_
!其中
)
!
_
c!
_
"
1
:
E3>%
#
(!
_
"
#0.#!
))
!
_
c
"各植物组织或
各时期
)
!
_
#
(
"蕊柱或时期
#
)
!
_
#
!
!
结果与分析
<;:
!
春兰
034$
基因全长
7@>0
的克隆
以春兰花芽
为模板进行反转录!再以反
转录产物为模板进行
>1<
扩增!获得部分片段!测
*"%#
西
!
北
!
植
!
物
!
学
!
报
!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
%$
卷
序后通过
\65.T
同源比对分析表明!获得了
-./%
的部分序列根据所得序列设计
%a)和
a)
特异引物!按照
EC?<=NX
=C
?4
;
6-V-75T-8/I-T
的说明书进行
7DP?
末端扩增!
测序后将两端拼接在一起得到全长
7DP?
序列
结果显示!全长
7DP?
与其它兰科植物
-./%
的同
源基因具有高度一致性!因此!将基因命名为
!
(
@
-./%
!基因登录号为
IB2!$!&!

!
(
-./%
含有
&%!@
;
长的开放阅读框"图
#
#!编码
!$%
个氨基酸!
分子量为
!&+2]D
!预测等电点为
0+2&

<;<
!
春兰
034$
氨基酸序列分析
氨基酸序列比对结果"图
!
#显示!
!
(
-./%
与
拟南芥(文心兰(苹果"
A689&)#*97%56
#(鸽石斛等
的
-./%
基因有
*#b
"
20b
的一致性!说明
!
(
@
-./
为拟南芥
-./%
的同源基因!在
1
:
E3>%
蛋白
1
端含有典型的
E3>
%
?GH*
结构域
进化树分析显示
?>#
%
?GH2
亚族分为
?GH*
(
图
#
!
春兰
-./%
基因的克隆
B-
:
+#
!
168/-/
:
8V-./%
:
N/NVX84!3
(
)*+%,
(
%%
C+DH!"""DP?45X]NX
&
!+E3>%
图
!
!
1
:
E3>%
与其它植物
E3>
类氨基酸序列同源比较
P.C?DE%
"
??D%2"%$
#
+
美花烟草&
CYC?DE
"
?DH%*&$"
#
+
苹果&
?TE3>%
"
?33%""$
#
+
拟南芥&
1
:
E3>%
"
?WK0"0$%
#
+
春兰&
1NE3>
"
?BW**&0
#
+
建兰&
AC?DE*
"
?DK*&!%0
#
+
文心兰&
D7E3>#
"
??U2!!
#
+
鸽石斛&
1.E3>%
"
?1\*2#"
#
+
番红花&
?8C?DE
"
??J0%0%$
#
+
石刁柏&
3
;
E3>%
"
?D1&2&"*
#
+
领春木&
?TE3>#
"
P>
-
*0%!!
#
+
拟南芥黑框表示保守的
E3>
%
?GH*48T-V
B-
:
+!
!
184
;
5X-.8/.8VT9N1
:
E3>%54-/857-Y.N
_
MN/7N.5/YE3>
:
X8M
;;
X8TN-/.
P.C?DE%
"
??D%2"%$
#
+?%5)7%6,696,&*+6*
&
CYC?DE
"
?DH%*&$"
#
+A689&)#*97%56
&
?TE3>%
"
?33%""$
#
+0+6$%&)
:
9%97=68%6,6
&
1
:
E3>%
"
?WK0"0$%
#
+!3
(
)*+%,
(
%%
&
1NE3>
"
?BW**&0
#
+!
"
#$%&%#*,9%
;
)8%#
&
AC?DE*
"
?DK*&!%0
#
+<,5%&%#G8^ NX<54.N
S
&
D7E3>#
"
??U2!!
#
+4*,&+)$%#5+#*,67#
&
1.E3>%
"
?1\*2#"
#
+!+)59967%B9
&
?8C?DE
"
??J0%0%$
#
+09
:
6+6
(
9)
;;
%5%,68%9
&
3
;
E3>%
"
?D1&2&"*
#
+.
:
7*8*6
:
8*%)9
:
*+##
&
?TE3>#
"
P>
-
*0%!!
#
+037=68%6,6+
=9N9-
:
96
S
78/.NX[NYE3>
%
?GH*48T-V8VE3>984868
:
.-.-/Y-75TNY-/@657]786M4/
&"%#
&
期
!!!!!!!!!!!!!!!
贾春蕾!等$春兰
!
(
-./%
基因的克隆和表达分析
图
%
!
1
:
E3>%
及其他
?>#
%
?GH2
组蛋白的进化树分析
各节点处数字表示
\88T.TX5
;
值"重复
#"""
次#
B-
:
+%
!
>9
S
68
:
N/NT-7TXNN5/56
S
.-.8V?>#
%
?GH2)6-]N
;
X8TN-/.-/76MY-/
:
1
:
E3>%
=9N/M4@NX.5T/8YNXN
;
XN.N/TT9N@88T.TX5
;
[56MN.
"
-^T9#"""XN
;
6-75TN.
#
图
$
!
春兰
!
(
-./%
在各花器官中的表达情况
B-
:
+$
!
!
(
-./%NF
;
XN..-8/-/T9N6-
;
.
!
;
NT56.
!
.N
;
56.
!
8[5X
S
5/Y786M4/8V!3
(
)*+%,
(
%%
E3>
和
?>#
等
%
个分支!其中
?GH*
与
E3>
分支
为姊妹关系
1
:
E3>%
属于
?>#
%
?GH2
亚族的
E3>
分支"图
%
#
!
(
-./%
与同属的建兰
-./%
基
因关系最近
<;$
!
1
2
034$
在春兰中的时空表达分析
为了确定春兰
!
(
-./%
基因在不同部位的表
达差异!分别提取侧瓣(萼片(唇瓣(蕊柱和子房的
!以
#0EX为对照!进行实时荧光定量表
达分析结果表明"图
$
#!
!
(
-./%
基因在子房和
蕊柱中的表达量最低!在唇瓣中的表达量较高!约为
蕊 柱表达量的
$+*
倍!在萼片和侧瓣中的表达量最
图

!
春兰
!
(
-./%
在花发育不同时期的表达情况
#
+
花芽长度
#
"+74
&
$
+"+74
$
花芽长度
#
#74
&
%
+#74
$
花芽长度
#
!74
&
&
+!74
$
花芽长度
#
%74
&

+
花朵开放
B-
:
+
!
!
(
-./%NF
;
XN..-8/-/Y-VVNXN/T.T5
:
N.
8VV68^ NXYN[N68
;
4N/T8V!3
(
)*+%,
(
%%
#
+\MY6N/
:
T9
#
"+74
&
$
+"+74
$
@MY6N/
:
T9
#
#74
&
%
+#74
$
@MY6N/
:
T9
#
!74
&
&
+!74
$
@MY6N/
:
T9
#
%74
&

+A
;
N/NYV68^ NX
高!约为蕊柱表达量的
&
倍
为了确定
!
(
-./%
在春兰花发育不同时期的
表达情况!提取了春兰

个花发育时期的花芽
实时荧光定量表达分析表明"图

#!
!
(
@
-./%
在时期
#
的表达量最低!随着花芽的发育表
达量逐渐上升!在时期
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表达量最高!约为时期
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表
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西
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北
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植
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物
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学
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卷
达量的
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后!
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(
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表达量逐渐下
降!在时期

盛开的花中表达量最低
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!
讨
!
论
为了研究
3
类
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基因对春兰花被形
成的调控作用!本研究从春兰中分离了
#
个
3
类基
因!序列同源分析以及系统进化分析表明!该基因属
于兰科植物
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类基因!命名为
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#和加利福尼亚罂粟的
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#等
一般只在花的内三轮中"花瓣(雄蕊和雌蕊#表达!在
萼片中不表达)#!)#*而对
!
(
-./%
基因的表达分
析显示!
(
-./%
在萼片(花瓣(雄蕊以及雌蕊四轮
花被片中都有表达)2*!这种表达模式明显不同于矮
牵牛(西红柿等植物中的
-./%
类基因!而类似于文
心兰中的
-./%
类基因
和百合"
1%8%#
8),
(
%
;
8)+#
#中的
-./%
类基因
1A04-%
)
2
!
#*
*

这可能是因为在拟南芥(矮牵牛等植物中!萼片和花
瓣是完全不同的!所以
-./%
类基因在萼片中不表
达!但在春兰(文心兰和百合中萼片和花瓣是极其相
似的!因此!控制花瓣形成的
-./%
基因在萼片也会
表达!这说明
-./%
基因可能在植物花瓣和萼片的
分化过程中扮演着重要角色
对双子叶模式植物拟南芥的研究认为!
3
类功
能基因在花发育
?\1D3
模型中具有十分重要的作
用!
3
和
?
(
功能基因调控花瓣的发育!
3
和
(
1
功能基因调控雄蕊的发育!
3
和
1
功能基因调控心
皮的发育)#)!!!#&*之前对春兰
类基因
I1<
和
3
类基因
0I1*
的研究表明!这些基因在花瓣和萼片
中都有较高的表达)#0)#2*!本研究表明!
!
(
-./%
在
萼片(侧瓣和唇瓣的表达最高!说明
!
(
-./%
基因
在春兰中的功能可能主要是与
I1<
和
0I1*
以及
其它
?
(
类基因一起控制萼片和花瓣的形成另
外!
(
-./%
在子房和蕊柱中少量表达!这与拟南
芥(矮牵牛等植物中
-./%
类基因的表达模式一致!
说明
!
(
-./%
也可能与其它
1
类基因一起控制春
兰子房和蕊柱的形成
!
(
-./%
基因在春兰中如何
行使其复杂的功能有待进一步研究
参考文献!
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年刊载论文第一作者信息统计
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年第
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篇"含英文论文
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篇#从刊载论文第一作者信息
统计看!具有博士和硕士学位"含在读博士#的共
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人!占
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!具有中级以上职称
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人!占
%+#b
!其
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人!占
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&从论文研究单位看!主要来源于大学"
!22
篇!占
0"+0b
#和研究所
"
&"
篇!占
#0+2b
!其中中国科学院系统
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篇!占
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#&从年龄方面看!第一作者中
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岁以上的占
$!+$b
由此可以看出!.西北植物学报/
!"#%
年度刊发的论文作者具有厚实的学术研究底蕴!研究单位也
具有可靠的条件支持!为保证研究论文的质量和水平以及创新性奠定了良好的基础具体统计结果如下$
:+
第一作者学位状况
博士
2%
人"其中博士后
!
人#!占
!+#b
&在读博士
$2
人!占
#%+!b
&硕士
*
人!占
#+#b
&在读硕士
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人!占
%0+2b

<+
第一作者职称状况
正高
#$
人!占
%+0b
&副高
0
人!占
#+&b
&中级
0
人!占
#+&b
&具有副高以上职称的通信作者共
#2%
人第一作者中在读博士和硕士研究生的导师"通信作者#承担着对论文选题(实验设计(实验条件"包
括经费#保障(具体实验指导等一系列工作!并对论文负有全部解释的责任!所以这部分论文的实质性作者应
为研究生导师000通信作者
$+
第一作者单位分布状况
大学
!22
人!占
0"+0b
&研究所
&"
人!占
#0+2b
"其中中科院研究所
#0
人!占
$+2b
#
?+
第一作者年龄结构
%"
岁以下的
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人!占
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%"
"
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岁的有
##0
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岁以上的
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人!占
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第一作者地区分布状况
西北地区
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篇!占
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&西南地区

篇!占
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&华北(东北地区
0!
篇!点
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&华东(华中(
华南地区
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篇!点
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!裴阿卫
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供稿"
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西
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北
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