全 文 ：植物病理学报
ACTA PHYTOPATHOLOGICA SINICA摇 41(4): 421鄄427(2011)
收稿日期: 2010鄄02鄄01; 修回日期: 2011鄄04鄄15
基金项目: 陕西省农业攻关项目陕西主要果树病害发生规律及控制技术研究(2010K01鄄11); 高等学校学科创新引智计划(B07049)
通讯作者: 吴云锋,教授,博士,主要从事植物病毒学研究; E鄄mail: wuyf@nwsuaf. edu. cn
第一作者: 杨 燕(1984 - ),女,新疆昌吉人,硕士研究生,主要从事植物病毒学研究。
植物提取物多羟基双萘醛对苹果
腐烂病菌的抑制作用研究
杨 燕1, 魏海娟1, 赵 震2, 刘 萍1, 吴云锋1*
( 1西北农林科技大学植保学院与旱区作物逆境生物学国家重点实验室,植保资源与病虫害治理教育部重点实验室, 杨凌 712100;
2西北农林科技大学生命学院, 杨凌 712100)
摘要: 研究了植物提取物多羟基双萘醛(WCT)对苹果腐烂病菌的抑制作用。 平板对峙试验表明 WCT对苹果腐烂病菌有
较强的抑菌活性,而且随着浓度提高抑制作用增强,当浓度为 50 mg·mL -1时抑菌效果较好,EC50为 25. 04 mg·mL -1;在
果园WCT对苹果腐烂病也有很好的防治效果,苹果树在刮除病疤再涂抹 WCT 后能促进病疤部位形成较厚的愈合层。 苹
果树苗在涂抹WCT后,PPO、POD酶活性和叶绿素含量开始升高,明显高于健康对照;并且在叶片中诱导一种分子量约为
59 kD蛋白大量表达, WCT处理后该蛋白的表达量比健康对照显著增加。 通过基体辅助激光解析电离飞行时间质谱
(MALD I鄄TOF MS) 分析该蛋白, 将所得的肽指纹图谱(peptide mass fingerprint,PMF) 在 SWISSPROT蛋白质数据库中比
对发现该蛋白是 RUBP羧化酶大亚基。 以上研究结果表明WCT对苹果腐烂病菌具有一定的抑制作用和诱导寄主产生抗
性的作用。
关键词: 多羟基双萘醛; 苹果腐烂病菌; 抑制作用
Effect of polyhydroxy dinaphthaldehyde extracts from plant against Valsa mali in
apple tree摇 YANG Yan1, WEI Hai鄄juan1, ZHAO Zhen2, Liu Ping, WU Yun鄄feng1 摇 ( 1College of Plant
Protection and State Key Laboratory of Crop Stress Biology in Arid Areas, Key Laboratory of Plant Protection Resources and Pest
Management, Ministry of Education, Northwest A&F University, Yangling 712100, China; 2College of Life Science and North鄄
west A&F University, Yangling 712100, China)
Abstract: The antifungal activity of polyhydroxy dinaphthaldehyde (WCT)extracts from plant against Valsa
mali was investigated. The results of dual culture on PDA plate showed that WCT was capable of antagonism
against V. mali and the activity was significantly increased when concentration was higher. While the concen鄄
tration was 50 mg·mL -1, the inhibitory effect was better and EC50 was 25. 04 mg·mL -1 . WCT treatment
in orchard showed better control effects and it could improve apple tree忆s wound to form thicker healing layer.
The activities of PPO and POD and the contents of chlorophyll in apple leaf with WCT treatment were in鄄
creased more than check. WCT induced an increase in specific acid鄄soluble protein about 59 kD expressed
more than check. This protein was analyzed by MALD I鄄TOF MS,the obtained peptide mass fingerprinting
(PMF) was searched in the protein data bank: SWISSPROT, indicating that it was ribulose bisphosphate car鄄
boxylase large chain. All these results suggested that WCT had antifungal activity and exerted a potent impact
on inducing resistance of apple to V. mali.
Key words: polyhydroxy dinaphthaldehyde; Valsa mali; inhibition
摇
植物病理学报 41 卷
中图分类号: S436. 6摇 摇 摇 摇 摇 文献标识码: A摇 摇 摇 摇 摇 文章编号: 0412鄄0914(2011)04鄄0421鄄07
摇 摇 苹果腐烂病病原是苹果黑腐皮壳菌 (Valsa
mali Miyabe et Yamade)子囊菌亚门核菌纲球壳菌
目,无性世代为半知菌亚门壳囊孢 ( Cytospora
sp. ),引发果树表皮病害,有苹果树 “癌症冶之
称[1]。 苹果腐烂病发生危害极其严重,果园病株
率平均达 40%左右,部分重病区病株率达 70%以
上,甚至导致毁园,该病害已成为制约苹果生产和
果品出口的重要因素。 目前对腐烂病的防治使用
最多的是用化学药剂,但是合成的化学农药如福美
砷等使用会有残留,造成环境污染[2]。 多羟基双
萘醛(Polyhydroxy dinaphthalde)提取物(WCT)是
西北农林科技大学植物病毒室 1986 年分离得到的
一种植物源抗病毒复制抑制剂,具有抗病毒生物活
性,对动植物低毒,对环境无污染等优点。 Zhou
等[3]报道了多羟基双萘醛可以防治黄瓜霜霉病。
本试验研究了 WCT 对苹果腐烂病病原菌菌丝生
长的抑制作用以及对苹果腐烂病的防治效果,以期
为开发新的防治苹果腐烂病的植物源新农药奠定
理论基础。
1摇 材料与方法
1. 1摇 试验材料
植物提取物多羟基双萘醛(WCT)由西北农林
科技大学植物保护学院病毒实验室制备,水杨酸
(salicylic acid, SA)由北京化学试剂厂生产。 菌种
为苹果黑腐皮壳菌(V. mali)由西北农林科技大学
植物保护学院黄丽丽教授提供,采自杨凌苹果园。
接种孢子悬浮液浓度为 1 伊106 个 / mL[4]。
1. 2摇 室内毒力测定
生长速率法:在超净工作台上,将 WCT 稀释
成不同浓度,用灭菌吸管吸取 1 mL 配制好的药液
加入灭菌后稍冷却的 9 mL PDA培养基中,混匀后
制成不同浓度的培养基平板。 用打孔器打菌饼,接
种到培养基平板中央。 每个处理重复 3 次。 25益
培养 72 h,十字交叉测量各皿菌落直径,计算药液
对菌丝生长的抑制率和该药剂的有效中量 EC50的
值[5]。
1. 3摇 田间药效试验
试验在陕西杨凌东卜村果园进行,果园面积
0. 39 公顷,品种为红富士。 树龄 13 年生,行距 3
m,株距 2. 6 m,共计 540 株,发生腐烂病 135 株。
划分为 A、B、C和 D共 4 个小区,处理方法是刮除
病疤后涂抹 WCT 和以刮除病斑不涂药为对照。
对每棵树涂药前选定 1 ~ 2 处病斑,采用随机排列。
每个处理 10 个病斑,重复 3 次。 2008 年 3 月 24 日
涂药处理。 分别在 2008 年 9 月 18 日和 2009 年 3
月 17 日进行调查病斑愈合情况,计算防效[6]。
1. 4摇 WCT 处理对苹果叶片 PPO、POD 与叶绿素
含量的影响
品种选用矮化富士,树龄 5 年生,长势均匀。
试验设 4 个处理。 (1)WCT 涂抹, (2)5 mmol / L
杨酸涂抹,(3)清水处理,(4)清水处理,24 h 后再
接种病菌。 每处理 3 株,重复 3 次。 PPO酶液制备
与活性测定参照 Zhang 等的方法[7],POD 酶液制
备与活性测定参照 Li等的方法[8]。 叶绿素制备与
含量测定参照 Zhang等的方法[9], 用 Beckman DU
800 分光光度计测定数据。
1. 5摇 诱导蛋白的提取与 SDS鄄PAGE电泳分析
叶片匀浆蛋白提取参照 Che 等的方法[10]。
SDS鄄PAGE电泳方法参照 Laemmli 的方法[11],分
离胶浓度 15% ,浓缩胶浓度 8% ,每孔上样量为
10 滋L。
1. 6摇 诱导蛋白的 MALD I鄄TOF MS 质谱测定和
数据分析
将切胶回收目的蛋白送至北京大学进行
MALD I鄄TOF MS 分析, 得到肽段的肽指纹 (
PMF) 。 然后在 SWISSPROT 蛋白质数据库中进
行比对分析。 诱导蛋白的 PMF在数据库检索的参
数设置如下。 Database: SWISSPROT 20090218
[Taxonomy: Viridiplantae (Green Plants)] ; En鄄
zyme: Trypsin; Fixed modifications: Carbamidom鄄
ethyl (C);Variable modifications: Oxidation (M);
Peptide Mass Tolerance : 依 100 ppm; Peptide
Charge State: 1 + ;Max Missed Cleavages : 0。
224
摇
摇 4 期 摇 摇 杨 燕,等:植物提取物多羟基双萘醛对苹果腐烂病菌的抑制作用研究
2摇 结果与分析
2. 1摇 WCT对苹果腐烂病菌生长的抑制作用
不同浓度 WCT 对苹果腐烂病菌表现出不同
程度的生长抑制作用。 WCT不同处理间的作用差
异显著(P <0. 05),随着WCT浓度的升高,对病原
菌的抑制作用也随着增强。 当浓度为 10、20、30、
50 mg·mL -1时,抑菌率分别为 25. 6% 、36. 5% 、
49. 7% 、77. 4% 。 WCT 浓度对数和病原菌的生长
抑制率几率值之间表现为线性相关,线性方程 y =
2. 231 5 + 0. 859 7x,相关系数为 0. 923 8,差异显
著。 EC50为 25. 04 mg·mL -1。 从菌落形态来看,
WCT处理后的菌落生长量减少,菌丝向上直立生
长而不扩大蔓延,菌丝生长受到抑制所致,而对照
组菌落生长均匀,菌丝密集(图 1)。
2. 2摇 WCT对苹果腐烂病的防治效果
涂抹WCT药物的苹果腐烂病的病疤部位,1
年后表现出明显的伤口愈合,大多数形成了较厚的
愈合层,病疤愈合效率为 40. 7% ,防治效果达到
66. 1% 。 清水对照处理的病株,伤口愈合率达到
24. 5% ,只是在伤口周围表现出干枯,未见有愈合
层出现。
2. 3摇 WCT 处理对苹果叶片 PPO 和 POD 活性及
叶绿素含量的影响
WCT和 SA处理都能诱导苹果叶片 PPO活性
升高。 第 1 d 所有处理 PPO 活性水平基本保持一
致,第 2 d WCT、 SA和接菌处理的 PPO 活性都达
到最高值,其中 PPO活性高低依次为WCT处理 >
SA处理 >接菌处理 > CK,WCT 处理高于 SA 和
CK处理分别为 54. 6%和 127% 。 第 4 d 各处理都
有不同程度的下降,WCT 处理下降速度最快。 第
7 d后各处理的 PPO 活性基本恢复到第 1 d 的水
平,并不断缓慢降低,并保持大致相似的活性水平
(图 2)。
摇 摇 所有处理 POD活性变化在第 1 d 均保持在相
似的较低水平,第 2 d略有下降后,WCT 和接菌处
理的 POD活性第 4 d逐渐上升至第 7 d 仍保持较
高水平,其中接菌处理的 POD 活性上升速度明显
快于WCT处理的结果。 SA 和 CK处理的 POD活
性从第 2 d缓慢上升,第 4 d 后开始较快增加,第
7 d达到最高值。 在第 7 d,POD 活性高低依次为
接菌处理 >WCT处理 > SA处理 > CK 处理,WCT
处理高于 SA和 CK处理分别为 5. 34%和 78. 0% 。
随后各处理的 POD活性开始下降,在第 12 d 降低
至相同水平(图 3)。
Fig. 1摇 Inhibitory effects of different WCT concentrations on Valsa mali
A鄄D: WCT concentration was 50 mg·mL -1, 30 mg·mL -1, 20 mg·mL -1 and 10 mg·mL -1 respectively, E: CK.
Table 1摇 Effect of WCT against apple canker in the field
Treatment
Heal percentage / %
A B C D
Average heal percentage
/ %
Average efficiency
/ %
WCT 42. 1 38. 9 40. 1 41. 5 40. 7 66. 1
CK 25. 3 24. 3 23. 5 24. 8 24. 5
324
摇
植物病理学报 41 卷
Fig. 2 摇 Change of PPO activity with different
treatments in apple leaves
Fig. 3 摇 Change of POD activity with different
treatments in apple leaves
摇 摇 所有处理叶绿素含量在第 1d水平保持基本一
致,第 2 d WCT处理,接菌处理和 CK 的叶绿素含
量开始上升。 第 4 d 接菌处理的叶绿素含量显著
高于 CK, WCT 处理的叶绿素含量略微下降,第 7
d WCT处理的叶绿素含量显著高于 SA 和 CK 处
理,其值分别为 32. 7%和 118% ,第 12 d WCT 处
理的叶绿素含量继续增长,并且显著高于其他处
理,达到整个处理过程的最高值,其他处理开始保
持相似的水平,且高于第 1 d 的起始叶绿素含量
(图 4)。
2. 6摇 WCT对苹果叶片蛋白的影响
苹果叶片提取匀浆蛋白经 SDS鄄PAGE 电泳结
果表明, WCT、SA和病原菌诱导处理后均有约 59
KD的蛋白诱导表达,而且表达量随时间发生变
化,第 7 d 出现了表达最高峰值。 其中,在第 7
dWCT和 SA 处理后蛋白的表达量明显比接菌对
照高(图 5,图 6)。 已有研究表明在高等植物中,
1,5鄄二磷酸核酮糖羧化酶 /加氧酶(Rubisco)参与
了光合作用[12]。 当病原菌或诱导剂处理后的植
株,其叶片内 Rubisco蛋白水平会发生变化[13]。
Fig. 4 摇 Change of chlorophyll contents with
different treatments in apple leaves
Fig. 5摇 The protein bands of SDS鄄PAGE from
intercellular fluids of the leaves after
WCT treatment
1: Healthy plant; 2鄄5: The leaves of 1, 2, 4 and 7 d after
treatment with WCT; 6鄄9: The leaves of 1, 2, 4 and 7 d af鄄
ter treatment with SA; M: Protein marker. The arrow repre鄄
sents the 59 kD protein.
2. 7摇 诱导蛋白的鉴定
对苹果叶片胞间隙液中纯化的 59 kD 蛋白做
MALDI鄄TOF MS测定, 分析结果见图 7 所示。 将
424
摇
摇 4 期 摇 摇 杨 燕,等:植物提取物多羟基双萘醛对苹果腐烂病菌的抑制作用研究
Fig. 6摇 The protein bands of SDS鄄PAGE from
intercellular fluids of the leaves after
inoculation with Valsa mali
1鄄5: The leaves of 1, 2, 4, 7 and 12 d inoculated with V.
mali after treatment with water The arrow represents the 59
kD protein
59 kD 诱导蛋白的肽指纹图谱 ( PMF)在 SWIS鄄
SPROT数据库进行查询, 发现此蛋白是 1,5鄄二磷
酸核酮糖羧化酶的大亚基(Ribulose bisphosphate
carboxylase large chain ) ,在 SWISSPROT数据库
的检索号为 P28435,等电点为 6. 13,理论分子量为
51 kD, 共有 459 个氨基酸组成(图 8)。 在 SWIS鄄
SPROT数据库显示 1,5鄄二磷酸核酮糖羧化酶由 8
个大亚基和 8 个小亚基组成,1,5鄄二磷酸核酮糖羧
化酶的大亚基属于 RuBisCO large chain family.
Type I subfamily。
3摇 讨论
植物源农药具有对哺乳动物选择性毒性微弱,
在环境中无持久性的残留,病虫害不易产生抗性等
的优点,正成为人类寻求的一种新型无公害农
药[14]。 本试验通过皿内试验得出 WCT 对苹果腐
烂病病原菌菌丝生长有抑制作用,果园试验结果表
明WCT对苹果腐烂病有一定的防治效果,果树在
涂抹 WCT 后能形成一层较厚的愈合层。 本研究
为防治苹果腐烂病提供了一种新的途径并奠定了
一定的理论基础,关于 WCT 防治苹果腐烂病的作
用,主要表现为对腐烂病菌菌丝生长的抑制作用,
在果树涂药后引起的诱导抗病性的作用。
Fig. 7摇 MALDI鄄TOF mass spectrogram of 59 kD protein from intercellular fluid of apple leaves
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摇
植物病理学报 41 卷
Fig. 8摇 Searching result of RBL鄄NYSOG sequence in SWISSPROT
database(Matched sequences are underlined)
摇 摇 诱导抗性是利用致病菌或用化学物质激发植
物的防卫基因而达到防病的效果,在实践上已有很
多成功的例子[15,16],但在苹果腐烂病诱导抗性方
面的研究尚少。 选用合适的诱导剂诱导苹果对腐
烂病的抗性在实践中具有重大意义。 水杨酸是一
种极具代表性的植物抗病蛋白诱导剂[17],是植物
体内普遍存在的一种酚类化合物, 已经证实它在
植物体内具有多种生理调节作用, 例如它能诱导
植物提高抗病性,抑制乙烯的生物合成, 调节某些
植物的光周期, 影响黄瓜的性别分化等。 SA 不仅
是植物产生过敏反应 ( hypersensitive response,
HR) 和系统获得性抗性( systemic acquired resist鄄
ance , SAR) 所必需, 而且也是病原物侵染植物后
活化一系列防卫反应的信号传递过程中的重要组
成成分[18]。 关于 WCT 和水杨酸能否诱导苹果树
对腐烂病产生抗性尚未见到相关文献报道。
已有研究结果表明过氧化物酶(POD)和多酚
氧化酶(PPO)与苹果抗病性密切相关[19],POD 与
植物的生长、发育、防御反应等有关, 直接参与了
细胞壁的木质化和角质化、生长素代谢、受伤组织
的栓化愈合及对病原的防御[20]。 在本试验中
WCT能引起 POD活性的升高,而且随天数的变化
趋势和蛋白表达量变化趋势一致,说明 WCT 诱导
了苹果树对腐烂病的抗性反应。 多酚氧化酶
(PPO) 是含有铜的酶,当细胞受轻微破坏组织衰
老时, 有些细胞结构解体时, 多酚氧化酶(PPO)
和底物接触发生反应, 将酚氧化成棕褐色的醌。
醌对微生物有毒, 可防止植物感染。 因此, 一般
认为 PPO活性的增加与抗病性呈正相关。 叶片中
叶绿素含量与光合强度密切相关。 测定结果显示
WCT诱导处理使植物叶绿素含量增加。
对WCT处理后苹果叶片胞间隙液的蛋白进
行 SDS鄄PAGE电泳,结果表明,在 WCT 处理的苹
果苗上分子量为 59 kD的蛋白大量表达,我们推测
苹果树在涂抹WCT后会增强苹果树的抗病性,有
一定的诱导抗性的作用。
致谢: 感谢西北农林科技大学植保学院黄丽丽教
授提供的实验菌种和谢芳琴农艺师给予的
帮助。
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