全 文 ：植物病理学报
ＡＣＴＡ ＰＨＹＴＯＰＡＴＨＯＬＯＧＩＣＡ ＳＩＮＩＣＡ　 ４４(２): １２９￣１３８(２０１４)
收稿日期: ２０１３￣０３￣２５ꎻ 修回日期: ２０１３￣１０￣２４
基金项目: 国家自然科学基金项目(３０８７１６６４)ꎻ国家重点实验室专项经费(２０６０２０４)
通讯作者: 王伟ꎬ教授ꎬ博士ꎬ主要从事植物病害生物防治及微生物农药创制研究ꎻＥ￣ｍａｉｌ:ｗｅｉｗａｎｇ＠ｅｃｕｓｔ.ｅｄｕ.ｃｎ
第一作者: 王楠ꎬ硕士ꎬ助教ꎬ主要从事植物病害生物防治研究ꎻＥ￣ｍａｉｌ:ｗａｎｇｎａｎ＠ｚｚｕｌｉ.ｅｄｕ.ｃｎꎮ
三重 ＰＣＲ检测黄瓜炭疽病菌、菌核病菌
和细菌性萎蔫病菌
王 楠１ꎬ ２ꎬ 王 伟２∗
( １郑州轻工业学院食品与生物工程学院 郑州 ４５０００１ꎻ ２华东理工大学生物工程学院 /生物反应器工程国家重点实验室ꎬ上海 ２００２３７)
摘要:本试验建立一种可同时检测黄瓜炭疽病(Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ ｏｒｂｉｃｕｌａｒｅ)、黄瓜菌核病(Ｓｃｌｅｒｏｔｉｎｉａ ｓｃｌｅｒｏｔｉｏｒｕｍ(Ｌｉｂ.)ｄｅ Ｂａｒｙ)
和黄瓜细菌性萎蔫病(Ｅｒｗｉｎｉａ ｔｒａｃｈｅｉｐｈｉｌａ)等黄瓜主要病害病原菌的三重 ＰＣＲ 检测体系ꎮ 采用正交试验设计方法ꎬ对三重
ＰＣＲ的影响因素分析研究ꎬ进行退火温度优化ꎬ并以 ３个引物组、Ｔａｑ ＤＮＡ聚合酶、ｄＮＴＰ 和 Ｍｇ２＋共 ６因素 ３水平进行多重
ＰＣＲ体系优化ꎬ成功建立了适合黄瓜主要病害的三重 ＰＣＲ最佳检测体系ꎬ即 ２５ μＬ的反应体系中含有 ０.２４ μｍｏｌ􀅰Ｌ－１ ＣＹ１ /
ＣＹ２ꎻ０.７２ μｍｏｌ􀅰Ｌ－１ ＳＳＦＷＤ/ ＳＳＲＥＶꎻ０.３３６ μｍｏｌ􀅰Ｌ－１ ＥＴ－Ｐ１ / ＥＴ－Ｐ２ꎻ１ Ｕ Ｔａｑ聚合酶ꎻ０.１５ ｍｍｏｌ􀅰Ｌ－１ ｄＮＴＰꎻ１ ｍｍｏｌ􀅰Ｌ－１
ＭｇＣｌ２ꎬ最适退火温度为 ６３℃ꎮ 该方法能够快速从田间黄瓜发病植株和根围土壤中将黄瓜炭疽病菌、黄瓜菌核病菌和黄瓜细
菌性萎蔫病菌检测出来ꎬ灵敏度可以达到 １０ ｐｇ􀅰μＬ－１ꎮ
关键词:黄瓜炭疽病菌ꎻ黄瓜菌核病菌ꎻ黄瓜细菌性萎蔫病菌ꎻ分子检测ꎻ三重 ＰＣＲ
Ｔｒｉｐｌｅｘ ＰＣＲ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ ｏｒｂｉｃｕｌａｒｅꎬ Ｓｃｌｅｒｏｔｉｎｉａ ｓｃｌｅｒｏｔｉｏｒｕｍ ａｎｄ Ｅｒ￣
ｗｉｎｉａ ｔｒａｃｈｅｉｐｈｉｌａ ｉｎ ｉｎｆｅｃｔｅｄ ｃｕｃｕｍｂｅｒ ｔｉｓｓｕｅｓ　 ＷＡＮＧ Ｎａｎ１ꎬ２ꎬ ＷＡＮＧ Ｗｅｉ２ 　 ( １Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｆｏｏｄ
ａｎｄ ＢｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇꎬＺｈｅｎｇｚｈｏｕ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｌｉｇｈｔ ＩｎｄｕｓｔｒｙꎬＺｈｅｎｇｚｈｏｕ ４５０００１ꎬ Ｃｈｉｎａꎻ ２Ｓｔａｔｅ Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒ
Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇꎬ Ｅａｓｔ Ｃｈｉｎａ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙꎬ Ｓｈａｎｇｈａｉ ２００２３７ꎬ Ｃｈｉｎａ)
Ａｂｓｔｒａｃｔ: Ａ ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ ＰＣＲ－ｂａｓｅｄ ｍｅｔｈｏｄ ｗａｓ ｄｅｓｉｇｎｅｄ ｆｏｒ ａｃｃｕｒａｔｅ ａｎｄ ｒａｐｉｄ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ
ｏｒｂｉｃｕｌａｒｅꎬ Ｓｃｌｅｒｏｔｉｎｉａ ｓｃｌｅｒｏｔｉｏｒｕｍ (Ｌｉｂ.) ｄｅ Ｂａｒｙ ａｎｄ Ｅｒｗｉｎｉａ ｔｒａｃｈｅｉｐｈｉｌａ ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓｌｙ ｉｎ ｔｈｅ ｅａｒｌｙ ｓｔａｇｅｓ
ｏｆ ｔｈｅ ｄｉｓｅａｓｅｓ. Ｔｈｒｅｅ－ｌｅｖｅｌ ｄｅｓｉｇｎｓ ｆｏｒ ｓｉｘ ｆａｃｔｏｒｓ ( ｔｈｒｅｅ ｐｒｉｍｅｒｓꎬ Ｔａｑ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅꎬ ｄＮＴＰ ａｎｄ Ｍｇ２＋)
ｗｅｒｅ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ ｔｏ ｏｐｔｉｍｉｚｅ ｔｈｅ ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ ＰＣＲ ｓｙｓｔｅｍ ｂｙ ｕｓｉｎｇ ｔｈｅ ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ ｄｅｓｉｇｎ ｍｅｔｈｏｄ. Ｔｈｅ ａｎｎｅａｌｉｎｇ
ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｏｆ ｔｈｅ ＰＣＲ ｒｅａｃｔｉｏｎｓ ｗａｓ ａｌｓｏ ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ. Ａ ｔｒｉｐｌｅｘ ＰＣＲ ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅｓｅ
ｔｈｒｅｅ ｐａｔｈｏｇｅｎｓ ｏｆ ｃｕｃｕｍｂｅｒ ｗａｓ ｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｌｙ ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ. Ｔｈｅ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｖｏｌｕｍｅ ｗａｓ ２５ μＬ ａｎｄ ｔｈｅ ａｎｎｅａｌｉｎｇ
ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｗａｓ ６３ｏＣ. Ｔｈｅ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｓｏｌｕｔｉｏｎ ｃｏｎｔａｉｎｅｄ ０.２４ μｍｏｌ􀅰Ｌ－１ ＣＹ１ / ＣＹ２ꎬ ０.７２ μｍｏｌ􀅰Ｌ－１ ＳＳＦＷＤ/
ＳＳＲＥＶꎬ ０.３３６ μｍｏｌ􀅰Ｌ－１ ＥＴ－Ｐ１ / ＥＴ－Ｐ２ꎬ １ Ｕ Ｔａｑ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅꎬ ０.１５ ｍｍｏｌ􀅰Ｌ－１ ｄＮＴＰ ａｎｄ １ ｍｍｏｌ􀅰
Ｌ－１ Ｍｇ２＋ . Ｔｈｅ ｔｒｉｐｌｅｘ ＰＣＲ ｓｙｓｔｅｍ ｃｏｕｌｄ ｄｅｔｅｃｔ Ｃ. ｏｒｂｉｃｕｌａｒｅꎬ Ｓ. ｓｃｌｅｒｏｔｉｏｒｕｍ ａｎｄ Ｅ. ｔｒａｃｈｅｉｐｈｉｌａ ｉｎ ｉｎｆｅｃｔｅｄ
ｐｌａｎｔ ｓａｍｐｌｅｓ ａｎｄ ｓｏｉｌｓ ｒａｐｉｄｌｙ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ａｔ １０ ｐｇ ＤＮＡ􀅰μＬ－１ .
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ: Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ ｏｒｂｉｃｕｌａｒｅꎻ Ｓｃｌｅｒｏｔｉｎｉａ ｓｃｌｅｒｏｔｉｏｒｕｍꎻ Ｅｒｗｉｎｉａ ｔｒａｃｈｅｉｐｈｉｌａꎻ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎꎻ
ｔｒｉｐｌｅｘ ＰＣＲ
中图分类号: Ｓ４３６.４２１.１　 　 　 　 　 文献标识码: Ａ　 　 　 　 　 文章编号: ０４１２￣０９１４(２０１４)０２￣０１２９￣１０
　 　 黄瓜炭疽病(Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ ｏｒｂｉｃｕｌａｒｅ)、黄瓜菌
核病(Ｓｃｌｅｒｏｔｉｎｉａ ｓｃｌｅｒｏｔｉｏｒｕｍ (Ｌｉｂ.) ｄｅ Ｂａｒｙ)和黄
瓜细菌性萎蔫病(Ｅｒｗｉｎｉａ ｔｒａｃｈｅｉｐｈｉｌａ)是黄瓜上的
重要病害ꎮ 黄瓜炭疽病和黄瓜菌核病为土传病害ꎬ
　
植物病理学报 ４４卷
而黄瓜细菌性萎蔫病菌是在两种危害黄瓜的害虫
(黄瓜色条叶甲虫和十一星根萤叶甲虫)的肠道中
存活越冬ꎬ当携带病原菌的黄瓜色条叶甲虫危害植
株时ꎬ会损伤植株组织并排出粪便ꎬ病原菌则通过损
伤植株的组织液侵入维管束ꎮ 这 ３种病原菌侵入后
迅速引起植物组织坏死ꎮ 典型症状是茎、果实、花序
等腐烂ꎬ有时叶部呈坏死斑点ꎬ其发病时期和初期症
状类似ꎬ难以区分ꎬ给黄瓜病害的早期鉴定和防治带
来极大困难ꎮ 而针对该 ３种病害的防治方法却差异
很大ꎬ很有必要在病害潜伏期或者发病初期进行准
确诊断ꎬ以便及时采取具有针对性的防治措施ꎬ减少
损失[１ ꎬ ２]ꎮ 目前的病害诊断大多采用传统方法ꎬ即
观察病害症状或分离病原菌鉴定[３ ~ ６]ꎮ 如采用观察
病害症状的方法ꎬ就需要完全显症ꎬ待典型症状出现
后才可准确判断ꎮ 病原菌分离的方法是通过病原菌
形态学观察和柯赫法则来判断ꎬ要经过镜检、分离培
养等一系列工作ꎬ操作复杂ꎬ耗时长ꎬ这样会耽搁病
害的最佳防治期ꎮ
　 　 近年来ꎬ随着生物科技的飞速发展ꎬ尤其是分子
生物学的巨大进步ꎬ已有许多成熟的分子生物学技术
用于植物病害的检测ꎬ解决了这一重大难题[７ ~ １１]ꎮ 针
对瓜类病害的研究也有很多报道ꎬ２００６年Ｗａｎｇ等[１２]
采用分子技术开发了检测瓜类炭疽病(Ｃ.ｏｒｂｉｃｕｌａｒｅ)
的试剂盒ꎬ实现了对瓜炭疽病的早期检测ꎮ ２００７ 年
Ｗａｎｇ[１３]等建立了哈密瓜细菌性果斑病(Ａｃｉｄｏｖｏｒａｘ
ａｖｅｎａｅ ｓｕｂｓｐ. ｃｉｔｒｕｌｌｉ)的快速分子检测方法ꎮ Ｊａｃｑｕｅ￣
ｌｉｎｅ[１４]等针对菌核病菌(Ｓ.ｓｃｌｅｒｏｔｉｏｒｕｍ)的特异序列设
计了引物ꎬ可用于该病原菌的鉴定ꎮ 我们也通过分析
研究ꎬ设计了黄瓜细菌性萎蔫病(Ｅ.ｔｒａｃｈｅｉｐｈｉｌａ)的特
异引物ꎬ可以用于该病害的检测分析[１５]ꎮ 黄瓜炭疽病
菌和菌核病菌能分别以菌丝体和菌核形式存在于根
围土壤及发病组织中ꎬ黄瓜细菌性萎蔫病菌在侵染植
株时可以存在于昆虫粪便中ꎬ分布在根围土壤和发病
组织中ꎬ因此可通过监测植株组织和根围土壤中的病
原菌实现病害检测ꎮ
　 　 黄瓜炭疽病、菌核病和细菌性萎蔫病都是黄瓜
上发病较广、危害较重的病害ꎬ目前国内外针对黄
瓜病害的检测多为单个病害ꎬ单一检测工作量大、
成本高ꎬ难以在短时间内实现病害的迅速诊
断[１ ６ ꎬ １ ７ ]ꎮ 本试验拟开发出同时检测以上 ３ 种病
害的多重 ＰＣＲ 检测方法ꎬ可大大提高病害检测效
率[１ ８ ~ ２０ ]ꎮ 目前ꎬ常规优化多重 ＰＣＲ 的方法都是
先进行单因素优化ꎬ再选取单因素的最优水平进行
组合ꎬ但是这样就会忽略了 ＰＣＲ 反应因素之间的
相互作用ꎬ本试验采用正交设计[２ １ ]的方法快速优
化多重 ＰＣＲ检测体系ꎬ实现最佳检测水平ꎮ
１　 材料及方法
１.１　 供试菌株
本研究供试菌株种名、来源及数量见表 １ꎮ
Ｔａｂｌｅ １　 Ｆｕｎｇａｌ ａｎｄ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｉｓｏｌａｔｅｓ ｕｓｅｄ ｆｏｒ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｓｐｅｃｉｅｓ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐｒｉｍｅｒｓ
Ｓｐｅｃｉｅｓ Ｈｏｓｔ Ｌｏｃａｌｉｔｙ Ｎｕｍｂｅｒ
Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｐｒｉｍｅｒｓ
ＣＹ１ / ＣＹ２ ＳＳＦＷＤ/ ＳＳＲＥＶ ＥＴ￣Ｐ１ / ＥＴ￣Ｐ２
Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ ｏｒｂｉｃｕｌａｒｅ Ｃｕｃｕｍｂｅｒ Ｚｈｅｎｇｚｈｏｕ ４ ＋ － －
Ｃ. ｏｒｂｉｃｕｌａｒｅ Ｃｕｃｕｍｂｅｒ Ｓｈａｎｄｏｎｇ ４ ＋ － －
Ｃ. ｏｒｂｉｃｕｌａｒｅ Ｃｕｃｕｍｂｅｒ Ｂａｏｄｉｎｇ ３ ＋ － －
Ｃ. ｏｒｂｉｃｕｌａｒｅ Ｃｕｃｕｍｂｅｒ Ｓｈａｎｇｈａｉ ２ ＋ － －
Ｓｃｌｅｒｏｔｉｎｉａ ｓｃｌｅｒｏｔｉｏｒｕｍ Ｃｕｃｕｍｂｅｒ ＳＪＴＵ ２ － ＋ －
Ｓ. ｓｃｌｅｒｏｔｉｏｒｕｍ Ｃｕｃｕｍｂｅｒ ＳＡＴＥＳＣ ２ － ＋ －
Ｓ. ｓｃｌｅｒｏｔｉｏｒｕｍ Ｗａｔｅｒｍｅｌｏｎ Ｓｈａｎｇｈａｉ ２ － ＋ －
Ｓ. ｓｃｌｅｒｏｔｉｏｒｕｍ Ｗａｔｅｒｍｅｌｏｎ Ｎａｎｊｉｎｇ ２ － ＋ －
Ｓ. ｓｃｌｅｒｏｔｉｏｒｕｍ Ｔｏｍａｔｏ Ｓｈａｎｇｈａｉ ４ － ＋ －
Ｓ. ｓｃｌｅｒｏｔｉｏｒｕｍ Ｅｇｇｐｌａｎｔ Ｈｅｂｅｉ ２ － ＋ －
Ｃ. ｏｒｂｉｃｕｌａｒｅ Ｗａｔｅｒｍｅｌｏｎ Ｚｈｅｎｇｚｈｏｕ ４ ＋ － －
Ｃ. ｏｒｂｉｃｕｌａｒｅ Ｗａｔｅｒｍｅｌｏｎ Ｓｈａｎｄｏｎｇ ４ ＋ － －
Ｃ. ｏｒｂｉｃｕｌａｒｅ Ｗａｔｅｒｍｅｌｏｎ Ｂａｏｄｉｎｇ ３ ＋ － －
Ｃ. ｏｒｂｉｃｕｌａｒｅ Ｗａｔｅｒｍｅｌｏｎ Ｓｈａｎｇｈａｉ ２ ＋ － －
０３１
　
　 ２期 王楠ꎬ等:三重 ＰＣＲ检测黄瓜炭疽病菌、菌核病菌和细菌性萎蔫病菌
Ｔａｂｌｅ １　 Ｆｕｎｇａｌ ａｎｄ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｉｓｏｌａｔｅｓ ｕｓｅｄ ｆｏｒ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｓｐｅｃｉｅｓ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐｒｉｍｅｒｓ 　 (Ｃｏｎｔｉｎｕｅｄ)
Ｓｐｅｃｉｅｓ Ｈｏｓｔ Ｌｏｃａｌｉｔｙ Ｎｕｍｂｅｒ
Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｐｒｉｍｅｒｓ
ＣＹ１ / ＣＹ２ ＳＳＦＷＤ/ ＳＳＲＥＶ ＥＴ￣Ｐ１ / ＥＴ￣Ｐ２
Ｅｒｗｉｎｉａ ｔｒａｃｈｅｉｐｈｉｌａ Ｃｕｃｕｍｂｅｒ Ｓｈａｎｇｈａｉ ３ － － ＋
Ｅ. ｔｒａｃｈｅｉｐｈｉｌａ Ｃｕｃｕｍｂｅｒ Ｂｅｉｊｉｎｇ ２ － － ＋
Ｅ. ｔｒａｃｈｅｉｐｈｉｌａ Ｃｕｃｕｍｂｅｒ Ｈａｉｎａｎ ２ － － ＋
Ｅ. ｃａｒｏｔｏｖｏｒａ Ｃａｒｒｏｔ Ｓｈａｎｇｈａｉ ２ － － －
Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍ Ｔｏｍａｔｏ Ｓｈａｎｇｈａｉ ４ － － －
Ａｃｉｄｏｖｏｒａｘ ａｖｅｎａｅ Ｃｕｃｕｍｂｅｒ Ｓｈａｎｇｈａｉ ３ － － －
Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ Ｃｕｃｕｍｂｅｒ Ｂｅｉｊｉｎｇ ２ － － －
Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ Ｓｏｉｌ Ｓｈａｎｇｈａｉ ３ － － －
Ａ. ｌａｒｒｙｍｏｏｒｅｉ Ｓｏｉｌ Ｓｈａｎｇｈａｉ ３ － － －
Ｐ. ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ Ｕｎｋｎｏｗｎ Ｓｈａｎｇｈａｉ ４ － － －
Ｐ. ｓｙｒｉｎｇａｅ ｐｖ. ｌａｃｈｒｙｍａｎｓ Ｃｕｃｕｍｂｅｒ Ｂｅｉｊｉｎｇ １ － － －
Ｐ. ｓｙｒｉｎｇａｅ ｐｖ. ｓｙｒｉｎｇａｅ Ｓｙｒｉｎｇａｅ Ａｍｅｒｉｃａｎａ １ － － －
Ｐ. ｓｙｒｉｎｇａｅ ｐｖ. ｔｏｍａｔｏ Ｔｏｍａｔｏ Ａｍｅｒｉｃａｎａ １ － － －
Ｐ. ｓｙｒｉｎｇａｅ ｐｖ. ａｐｔａｔａ Ａｐｔａｔａ Ａｍｅｒｉｃａｎａ １ － － －
Ｐ. ｓｙｒｉｎｇａｅ ｐｖ. ｔａｇｅｔｉｓ Ｔａｇｅｔｉｓ Ａｍｅｒｉｃａｎａ １ － － －
Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ ｄａｈｌｉａｅ Ｓｔｒａｗｂｅｒｒｙ ＡＴＣＣ １ － － －
Ｖ. ｄａｈｌｉａｅ Ｓｔｒａｗｂｅｒｒｙ Ｓｈａｎｇｈａｉ ２ － － －
Ｖ. ｄａｈｌｉａｅ Ｃｏｔｔｏｎ Ｎａｎｊｉｎｇ ２ － － －
Ｖ. ｄａｈｌｉａｅ Ｅｇｇｐｌａｎｔ Ｈｅｂｅｉ １ － － －
Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ. ｇｌｏｅｏｓｐｏｒｉｏｉｄｅｓ Ｓｔｒａｗｂｅｒｒｙ Ｓｈａｎｇｈａｉ ５ － － －
Ｃ. ｇｌｏｅｏｓｐｏｒｉｏｉｄｅｓ Ｓｔｒａｗｂｅｒｒｙ Ｈａｉｎａｎ １ － － －
Ｃ. ｓａｎｓｅｖｉｅｒｉａｅ Ｓｔｒａｗｂｅｒｒｙ Ｊａｐａｎｂ ３ － － －
Ｖ. ａｌｂｏ－ａｔｒｕｍ Ｕｎｋｎｏｗｎ Ｓｈａｎｇｈａｉ ２ － － －
Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ ｃａｃｔｏｒｕｍ Ｓｔｒａｗｂｅｒｒｙ Ｓｈａｎｇｈａｉ ２ － － －
Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ ｓｏｌａｎｉ Ｓｔｒａｗｂｅｒｒｙ Ｓｈａｎｇｈａｉ １ － － －
Ｒ. ｓｏｌａｎｉ Ｔｏｍａｔｏ Ｈｅｂｅｉ ２ － － －
Ｐｙｔｈｉｕｍ ａｐｈａｎｉｄｅｒｍａｔｕｍ Ｔｏｍａｔｏ Ｈｅｎａｎ ２ － － －
Ｃｏｒｙｎｅｓｐｏｒａ ｃａｓｓｉｉｃｏｌａ Ｃｕｃｕｍｂｅｒ Ｓｈｅｎｙａｎｇ ４ － － －
Ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍ ｃｕｃｕｍｅｒｉｎｕｍ Ｃｕｃｕｍｂｅｒ Ｓｈａｎｇｘｉ ２ － － －
Ｃ. ｆｕｌｖｕｍ Ｔｏｍａｔｏ Ｈｅｂｅｉ ４ － － －
Ｃ. ｆｕｌｖｕｍ Ｃｕｃｕｍｂｅｒ Ｓｈｅｎｙａｎｇ ２ － － －
Ｃ. ｆｕｌｖｕｍ Ｗａｔｅｒｍｅｌｏｎ Ｓｈａｎｇｈａｉ ２ － － －
Ｆ. ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ Ｓｃｈｌ.ｆ.ｓｐ.ｆｒａｇａｒｉａｅ Ｓｔｒａｗｂｅｒｒｙ Ｓｈａｎｇｈａｉ １ － － －
Ｆ. ｇｒａｍｉｎｅａｒｕ Ｗｈｅａｔ ＳＪＴＵ ４ － － －
Ｄｉｄｙｍｅｌｌａ ｂｒｙｏｎｉａｅ Ｗａｔｅｒｍｅｌｏｎ ＳＡＡＳ ２ － － －
Ｂｏｔｒｙｔｉｓ ｃｉｎｅｒｅａ Ｐｅｒｓ. Ｓｔｒａｗｂｅｒｒｙ Ｎｅｉｍｅｎｇｇｕ ２ － － －
Ｂ.ｃｉｎｅｒｅａ Ｓｔｒａｗｂｅｒｒｙ Ｃａｎａｄａｃ ３ － － －
Ｂ.ｃｉｎｅｒｅａ Ｔｏｍａｔｏ Ｓｈａｎｇｈａｉ ４ － － －
Ｂ.ｃｉｎｅｒｅａ Ｃｕｃｕｍｂｅｒ Ｓｈａｎｇｈａｉ ３ － － －
Ｂ.ｃｉｎｅｒｅａ Ｃｕｃｕｍｂｅｒ Ｈｅｎａｎ ２ － － －
Ｎｏｔｅ: “＋”: Ａ ｓｉｎｇｌｅ ＰＣＲ ｂａｎｄꎻ “－”: Ｎｏ ＰＣＲ ｂａｎｄꎻ ＳＡＡＳ: Ｓｈａｎｇｈａｉ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓꎻ ＳＡＴＥＳＣ: Ｓｈａｎｇｈａｉ
Ａｇｒｏ－Ｔｅｃｈ Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ ａｎｄ Ｓｅｒｖｉｃｅ Ｃｅｎｔｅｒꎻ ＨＡＡＦＳ: Ｈｅｂｅｉ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ ａｎｄ Ｆｏｒｅｓｔｒｙ Ｓｃｉｅｎｃｅｓꎻ ＳＪＴＵ: Ｓｈａｎｇｈａｉ Ｊｉａｏ
Ｔｏｎｇ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙꎻ ａ: Ｐ. ｓｙｒｉｎｇａｅ ｗａｓ ａ ｇｉｆｔ ｆｒｏｍ Ｊｏｈｎ Ｌｙｄｏｎꎬ Ｓｕｓｔａｉｎａｂｌｅ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙꎬ ＵＳＤＡ/ ＡＲＳꎬ Ａｍｅｒｉ￣
ｃａｎꎻ ｂ: Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ ｓａｎｓｅｖｉｅｒｉａｅ ｗａｓ ａ ｇｉｆｔ ｆｒｏｍ Ｎａｋａｍｕｒａ Ｍａｓａｙｕｋｉꎬ Ｆａｃｕｌｔｙ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅꎬ Ｋａｇｏｓｈｉｍａ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙꎬ Ｊａｐａｎꎻ ｃ:
Ｂｏｔｒｙｔｉｓ ｃｉｎｅｒｅａ ｗａｓ ａ ｇｉｆｔ ｆｒｏｍ Ｊｏｓｅｐｈ Ａｒｕｌꎬ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｆｏｏｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ ａｎｄ Ｈｏｒｔｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｒｅꎬ Ｃａｎａｄａ.
１３１
　
植物病理学报 ４４卷
１.２　 基因组 ＤＮＡ的提取
１.２.１　 病原细菌基因组 ＤＮＡ 的提取 　 挑取黄瓜
细菌性萎蔫病菌单菌落于液体 ＬＢ 培养基ꎬ３７℃震
荡培养过夜ꎬ吸取 １.５ ｍＬ 培养物 １２ ０００ ｒｐｍ 离心
２ ｍｉｎꎻ沉淀中加入 ５６７ μＬ ＴＥ 缓冲液ꎬ３０ μＬ １０％
ＳＤＳ于 ３７℃水浴 １ ｈꎻ加入 １００ μＬ ５ ｍｏｌ􀅰Ｌ－１
ＮａＣｌ溶液ꎬ８０ μＬ ＣＴＡＢ / ＮａＣｌ 溶液ꎬ６５℃水浴 １０
ｍｉｎꎻ等体积的苯酚 /氯仿 /异戊醇抽提ꎬ１２ ０００ ｒｐｍ
离心 ５ ｍｉｎꎻ上清液转移至无菌 ＥＰ管ꎬ等体积的氯
仿 /异戊醇抽提ꎬ１２０００ ｒｐｍ 离心 ５ ｍｉｎꎻ上清液转
移至无菌 ＥＰ 管ꎬ加入 １ / １０ 体积的 ３ ｍｏｌ􀅰Ｌ－１
ＮａＡｃ(ｐＨ ５.２)和等体积的异丙醇ꎬ－２０℃下沉淀ꎬ
１２ ０００ ｒｐｍ离心 ５ ｍｉｎꎻ７０％乙醇洗涤ꎬ离心ꎬ风干ꎮ
加入 １００ μＬ ＴＥ溶解 ＤＮＡꎬ加入终浓度为 ２０ μｇ􀅰
ｍＬ－１ ＲＮａｓｅＡꎬ－２０℃保存备用ꎮ
１.２.２　 病原真菌基因组 ＤＮＡ 的提取取适量冷冻
抽干的菌丝粉样品ꎬ采用尿素提取法[２ ２ ]提取病原
真菌基因组 ＤＮＡꎬ－２０℃保存备用ꎮ
１.２.３　 发病组织 ＤＮＡ 的快速提取 　 采集黄瓜炭
疽病、黄瓜菌核病和黄瓜细菌性萎蔫病害新鲜发病
组织(叶片、茎或果实)ꎬ采用 Ｗａｎｇ 等[ ２ ３ ]的方法ꎬ
每克发病组织加入 ２０ μＬ ０.５ Ｍ ＮａＯＨꎬ充分研磨ꎬ
转移至 １.５ ｍＬ的 ＥＰ管中ꎬ１２ ０００ ｒｐｍ离心 ５ ｍｉｎꎬ
取 ５ μＬ上清液加入 ４９５ μＬ ０.１ ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ (ｐＨ
８.０)ꎬ充分混匀ꎬ取 １ μＬ直接用于 ＰＣＲ反应ꎮ
１.２. ４ 　 土壤 ＤＮＡ 的提取 　 收集距黄瓜根围 ２
ｍｍꎬ深 ５~１０ ｃｍ 的土壤ꎬ装入无菌密封袋带回实
验室ꎮ 土壤样品先除去根系ꎬ石块等杂物ꎬ过 ２
ｍｍ筛ꎬ称取 ５００ ｍｇ 土壤样品ꎬ研磨后加 ３ ｍＬ
ＴＥＮＰ 缓冲液(５０ ｍｍｏｌ􀅰Ｌ－１ Ｔｒｉｓꎬ２０ ｍｍｏｌ􀅰Ｌ－１
ＥＤＴＡꎬ１００ ｍｍｏｌ􀅰Ｌ－１ ＮａＣ１ꎬ０.０１ ｇ􀅰ｍＬ－１ ＰＶＰꎬ
ｐＨ ８.５)ꎬ旋涡振荡ꎬ１２ ０００ ｒｐｍ 离心 ５ ｍｉｎꎬ弃上
清ꎬ３ ｍＬ ＰＢＳ 缓冲液(１３７ ｍｍｏｌ􀅰Ｌ－１ ＮａＣｌꎬ２.７
ｍｍｏｌ􀅰 Ｌ－１ ＫＣｌꎬ ４. ３ ｍｍｏｌ􀅰 Ｌ－１ Ｎａ２ ＨＰＯ４ꎬ １. ４
ｍｍｏｌ􀅰 Ｌ－１ ＫＨ２ ＰＯ４ꎬ ｐＨ ７. ４) 洗涤 １ 次ꎬ采用
ＬａＭｏｎｔａｇｎｅ方法[ １１ ]提取土壤微生物基因组 ＤＮＡꎮ
１.３　 多重 ＰＣＲ引物组合
　 　 检索国内外关于黄瓜炭疽病、黄瓜菌核病及黄
瓜细菌性萎蔫病的分子检测报道ꎬ选取可能组合的
引物ꎮ 黄瓜炭疽病菌采用 Ｗａｎｇ 等[１２ ] 开发的
Ｃ􀆰 ｏｒｂｉｃｕｌａｒ特异引物 ＣＹ１ / ＣＹ２ꎻ黄瓜菌核病菌采
用 Ｊａｃｑｕｅｌｉｎｅ等[１４]针对 Ｓ. ｓｃｌｅｒｏｔｉｏｒｕｍ设计的特异
引物 ＳＳＦＷＤ / ＳＳＲＥＶꎻ黄瓜细菌性萎蔫病菌采用
本实验室设计的 Ｅ. ｔｒａｃｈｅｉｐｈｉｌａ 特异引物 ＥＴ－Ｐ１ /
ＥＴ－Ｐ２[１５]ꎮ 通过 ＤＮＡＳｔａｒ 软件进行引物组比对ꎬ
确定这 ３ 对引物之间相似度较低ꎬ符合组成多重
ＰＣＲ的其它条件ꎬ设计试验进一步组合验证ꎮ 供
试引物组合见表 ２ꎮ
１.４　 多重 ＰＣＲ反应体系优化
１.４.１　 退火温度对三重 ＰＣＲ 反应的影响 退火温
度影响模板与引物的特异性结合ꎬ既要保证引物与
目的序列的有效结合ꎬ又尽量减少非特异性结合ꎮ
多重 ＰＣＲ要对不同引物组进行退火温度的摸索ꎬ
根据该三重 ＰＣＲ 引物组退火温度特点ꎬ选择在
５５℃到 ６７℃之间设计 １２ 个温度梯度摸索最佳退
火温度ꎮ
１.４.２　 正交试验优化三重 ＰＣＲ 反应条件 根据预
试验确定的影响该多重 ＰＣＲ体系的重要因素ꎬ按 ６
因素 ３水平 Ｌ１８(３６)正交试验设计正交表(表 ３ꎬ表
４)ꎮ 反应总体积 ２５ μＬ:包括 １０×ＰＣＲ ｂｕｆｆｅｒ ２.５
μＬꎬ模板各 １０ ｎｇꎬ其它各成分按照表 ４添加ꎬ双蒸
Ｔａｂｌｅ ２　 Ｔｈｅ Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ ＰＣＲ ｐｒｉｍｅｒｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｒｅｌａｔｅｄ ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ
Ｐｒｉｍｅｒ Ｐｒｏｄｕｃｔ / ｂｐ Ａｎｎｅａｌｉｎｇ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ / ℃ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ
ＣＹ１: ５′￣ＣＴＴＴＧＴＧＡＡＣＡＴＡＣＣＴＡＡＣＣ￣３′
ＣＹ２: ５′￣ＧＧＴＴＴＴＡＣＧＧＣＡＧＧＡＧＴＧ￣３′
４４２ ６２ [１２]
ＳＳＦＷＤ:５′￣ＧＣＴＧＣＴＣＴＴＣＧＧＧＧＣＣＴＴＧＴＡＴＧＣ￣３′
ＳＳＲＥＶ:５′￣ＴＧＡＣＡＴＧＧＡＣＴＣＡＡＴＡＣＣＡＡＧＣＴＧ￣３′
２７８ ６５ [１４]
ＥＴ￣Ｐ１: ５′￣ＡＡＧＴＣＧＡＧＣＧＧＴＡＧＣＡＣＡＧＧＧＴＡＧ￣３′
ＥＴ－Ｐ２: ５￣ ＡＣＡＣＧＣＧＴＣＡＡＧＧＧＣＡＣＡＡＣ￣３′
７９４ ６３ [１５]
　
２３１
　
　 ２期 王楠ꎬ等:三重 ＰＣＲ检测黄瓜炭疽病菌、菌核病菌和细菌性萎蔫病菌
Ｔａｂｌｅ ３　 Ｔｈｒｅｅ－ｌｅｖｅｌ ｄｅｓｉｇｎｓ ｆｏｒ ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ ＰＣＲ ｆａｃｔｏｒｓ ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ
Ｌｅｖｅｌ
Ｆａｃｔｏｒｓ
ＣＹ１ / ＣＹ２
/ μｍｏｌ􀅰Ｌ－１
ＳＳＦＷＤ / ＳＳＲＥＶ
/ μｍｏｌ􀅰Ｌ－１
ＥＴ－Ｐ１ / ＥＴ－Ｐ２
/ μｍｏｌ􀅰Ｌ－１
Ｔａｑ ＤＮＡ
Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ / Ｕ
ｄＮＴＰ
/ ｍｍｏｌ􀅰Ｌ－１
ＭｇＣｌ２
/ ｍｍｏｌ􀅰Ｌ－１
１ ０.２４ ０.４８ ０.１４４ ０.５ ０.１５ １.０
２ ０.４８ ０.７２ ０.２４ １.０ ０.３５ １.２５
３ ０.７２ ０.９６ ０.３３６ １.５ ０.５５ １.５
Ｔａｂｌｅ ４　 Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ ＰＣＲ ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ ｄｅｓｉｇｎ Ｌ１８(３６)
Ｌｅｖｅｌ
Ｆａｃｔｏｒｓ
ＣＹ１ / ＣＹ２
/ μｍｏｌ􀅰Ｌ－１
ＳＳＦＷＤ / ＳＳＲＥＶ
/ μｍｏｌ􀅰Ｌ－１
ＥＴ－Ｐ１ / ＥＴ－Ｐ２
/ μｍｏｌ􀅰Ｌ－１
Ｔａｑ ＤＮＡ
Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ / Ｕ
ｄＮＴＰ
/ ｍｍｏｌ􀅰Ｌ－１
ＭｇＣｌ２
/ ｍｍｏｌ􀅰Ｌ－１
１ ０.２４ ０.４８ ０.１４４ ０.５ ０.１５ １.０
２ ０.４８ ０.７２ ０.１４４ １.０ ０.３５ １.２５
３ ０.７２ ０.９６ ０.１４４ １.５ ０.５５ １.５
４ ０.２４ ０.４８ ０.２４ １.０ ０.３５ １.５
５ ０.４８ ０.７２ ０.２４ １.５ ０.５５ １.０
６ ０.７２ ０.９６ ０.２４ ０.５ ０.１５ １.２５
７ ０.２４ ０.７２ ０.３３６ ０.５ ０.５５ １.２５
８ ０.４８ ０.９６ ０.３３６ １.０ ０.１５ １.５
９ ０.７２ ０.４８ ０.３３６ １.５ ０.３５ １.０
１０ ０.２４ ０.９６ ０.１４４ １.５ ０.３５ １.２５
１１ ０.４８ ０.４８ ０.１４４ ０.５ ０.５５ １.５
１２ ０.７２ ０.７２ ０.１４４ １.０ ０.１５ １.０
１３ ０.２４ ０.７２ ０.２４ １.５ ０.１５ １.５
１４ ０.４８ ０.９６ ０.２４ ０.５ ０.３５ １.０
１５ ０.７２ ０.４８ ０.２４ １.０ ０.５５ １.２５
１６ ０.２４ ０.９６ ０.３３６ １.０ ０.５５ １.０
１７ ０.４８ ０.４８ ０.３３６ １.５ ０.１５ １.２５
１８ ０.７２ ０.７２ ０.３３６ ０.５ ０.３５ １.５
　
水补足ꎬ在 ＰＣＲ 仪上扩增ꎮ 反应结束后ꎬ取 ５ μＬ
样品进行琼脂糖凝胶电泳ꎬＵＶＰ 凝胶成像系统观
察、照相ꎮ 成像结果按照各病原菌扩增的特异性和
敏感度ꎬ即 ３个特异条带的强弱和杂带的有无各自
打分ꎬ分数越高表示扩增效果越好ꎬ扩增特异性及
敏感度要综合评价ꎮ
１.５　 黄瓜病害三重 ＰＣＲ特异性检测
　 　 选取黄瓜软腐病菌、黄瓜细菌性角斑病菌、黄
瓜青枯病菌、黄瓜枯萎病菌等 ２０ 余株瓜类和蔬菜
的常见病原菌基因组 ＤＮＡ 为模板ꎬ进行三重 ＰＣＲ
检测ꎬ检验该三重 ＰＣＲ体系的特异性ꎮ
１.６　 黄瓜病害三重 ＰＣＲ灵敏度检测
　 　 分别调整黄瓜炭疽病菌、菌核病菌及细菌性萎
蔫病菌基因组 ＤＮＡ至不同浓度ꎬ进行该三重 ＰＣＲ
体系程序下扩增ꎬ取 ５ μＬ 扩增产物琼脂糖凝胶电
泳ꎬＵＶＰ凝胶成像系统观察、照相ꎮ 分别检测单一
３３１
　
植物病理学报 ４４卷
及三重 ＰＣＲ灵敏度ꎮ
１.７　 黄瓜病害的植株组织和田间土壤检测
　 　 田间采集黄瓜炭疽病、菌核病及细菌性萎蔫病
病害叶片、果实和根围土壤样品ꎬ依照 １.２ 中的基
因组 ＤＮＡ 提取方法ꎬ提取病组织和根围土壤
ＤＮＡꎬ并采用该优化后的三重 ＰＣＲ 体系进行病害
检测ꎬ验证该三重 ＰＣＲ检测体系ꎮ
２　 结果与分析
２.１　 黄瓜病害三重 ＰＣＲ反应体系的建立
２.１.１　 黄瓜病害三重 ＰＣＲ反应退火温度优化　 通
过对 ５５℃到 ６７℃之间选择 １２ 个温度梯度的摸索ꎬ
发现最佳退火温度为 ６３℃ꎬ因而确定最佳扩增程序
为:预变性 ９５℃ꎬ５ ｍｉｎꎻ９４℃变性 １ ｍｉｎꎬ６３℃退火 １
ｍｉｎꎬ７２℃延伸 １.５ ｍｉｎꎬ３０个循环ꎻ７２℃延伸 １０ ｍｉｎꎮ
２.１.２　 正交优化黄瓜三重 ＰＣＲ反应体系　 正交试
验结果见图 １ꎮ 依照特异扩增条带的清晰程度和
丰富程度依次打分ꎬ最优组合为 ９分ꎬ其次为 ８ 分ꎬ
依次减少ꎬ扩增效果最差的记为 １分ꎮ 不仅仅是只
考察其中的某个特异条带ꎬ而是综合评判条带清晰
度和丰富度ꎬ这样就将正交试验设计的思路引进了
多重 ＰＣＲ的优化方法中ꎬ但是其打分方法和其它
的正交试验是有区别的ꎬ这也是多重 ＰＣＲ 正交设
计的特别之处ꎮ
　 　 图 １中 １－１８ 个处理的打分依次为:８ꎬ８ꎬ６ꎬ９ꎬ
８ꎬ６ꎬ８ꎬ９ꎬ８ꎬ９ꎬ６ꎬ８ꎬ７ꎬ５ꎬ５ꎬ８ꎬ８ꎬ６ꎮ 用正交设计直观
分析结果如表 ５ꎮ
　 　 由正交试验结果分析得到的最佳多重 ＰＣＲ 反
应条件:ＣＹ１ / ＣＹ２浓度为 ０.２４ μｍｏｌ􀅰Ｌ－１ꎬＳＳＦＷＤ/
ＳＳＲＥＶ浓度为 ０.７２ μｍｏｌ􀅰Ｌ－１ꎬＥＴ－Ｐ１ / ＥＴ－Ｐ２ 浓
度为 ０.３３６ μｍｏｌ􀅰Ｌ－１ꎬＴａｑ ＤＮＡ 聚合酶１ ＵꎬｄＮＴＰ
浓度为 ０.１５ ｍｍｏｌ􀅰Ｌ－１ꎬＭｇＣｌ２浓度为１ ｍｍｏｌ􀅰Ｌ
－１ꎮ
　 　 优化得到的最佳水平进行多次重复试验ꎬ均能
得到清晰的 ３ 个特异条带ꎬ也验证了该多重 ＰＣＲ
体系的稳定性ꎮ
２.２　 黄瓜病害三重 ＰＣＲ反应特异性检测
　 　 按照正交试验优化后的方法ꎬ引物 ＣＹ１ / ＣＹ２ꎬ
ＳＳＦＷＤ / ＳＳＲＥＶꎬＥＴ－Ｐ１ / ＥＴ－Ｐ２ 同时扩增黄瓜炭
疽病菌、黄瓜菌核病菌和黄瓜细菌性萎蔫病菌ꎬ能
够扩增出 ４４２、２７８ 和 ７９４ ｂｐ 的特异条带ꎬ而黄瓜
其它病害或其它蔬菜病原菌都没有特异条带ꎬ扩增
结果如图 ２所示ꎮ
Ｆｉｇ. １　 Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔ ｏｆ ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ ＰＣＲ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｂｙ ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ ｄｅｓｉｇｎ
Ｍ: ＤＬ２０００ Ｍａｒｋｅｒꎻ １~１８: Ｔｈｅ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ Ｎｏ. ｏｆ Ｌａｎｅ １－１８ ａｒｅ ｓｈｏｗｅｄ ｉｎ ｔａｂｌｅ ４.
.
Ｔａｂｌｅ ５　 Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｆａｃｔｏｒｓ ｉｎ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ＰＣＲ
Ｖａｒｉａｎｃｅ
ＣＹ１ / ＣＹ２
(Ｆａｃｔｏｒ Ａ)
ＳＳＦＷＤ/ ＳＳＲＥＶ
(Ｆａｃｔｏｒ Ｂ)
ＥＴ￣Ｐ１/ ＥＴ￣Ｐ２
(Ｆａｃｔｏｒ Ｃ)
Ｔａｑ ＤＮＡ
(Ｆａｃｔｏｒ Ｄ)
ｄＮＴＰ
(Ｆａｃｔｏｒ Ｅ)
ＭｇＣｌ２
(Ｆａｃｔｏｒ Ｆ)
ｋ１ ７.５００ ８.１６７ ７.３３３ ６.５００ ７.６６７ ７.５００
ｋ２ ６.６６７ ７.３３３ ７.５００ ７.８３３ ７.５００ ７.３３３
ｋ３ ７.８３３ ６.５００ ７.１６７ ７.６６７ ６.８３３ ７.１６７
Ｐｏｏｒ １.１６６ １.６６７ ０.３３３ １.３３３ ０.８３４ ０.３３３
Ｐｒｉｍａｒｙ ａｎｄ ｓｅｃｏｎｄａｒｙ ｏｒｄｅｒ Ｂ>Ｄ>Ａ>Ｅ>Ｃ＝Ｆ
Ｅｘｃｅｌｌｅｎｔ ｌｅｖｅｌ Ａ３ Ｂ１ Ｃ２ Ｄ２ Ｅ１ Ｆ１
Ｅｘｃｅｌｌｅｎｔ ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎｓ Ａ３Ｂ１Ｃ２Ｄ２Ｅ１Ｆ１
４３１
　
　 ２期 王楠ꎬ等:三重 ＰＣＲ检测黄瓜炭疽病菌、菌核病菌和细菌性萎蔫病菌
２.３　 黄瓜病害三重 ＰＣＲ检测体系的灵敏度
　 　 不同模板浓度检测表明ꎬ在 ２５ μＬ 的三重
ＰＣＲ体系中ꎬ３个引物组扩增黄瓜细菌性萎蔫病菌
和黄瓜菌核病菌单个模板能够检测到 １ ｐｇ 基因组
ＤＮＡ(图 ３ＡꎬＣ)ꎬ扩增黄瓜炭疽病菌单个模板能够
检测到 １０ ｐｇ基因组 ＤＮＡ(图 ３Ｂ)ꎬ扩增 ３ 个模板
能够检测到 １０ ｐｇ基因组 ＤＮＡ(图 ４)ꎮ
２.４　 黄瓜发病植株组织和田间土壤的快速检测
　 　 按照 １.２中的方法从黄瓜炭疽病、黄瓜菌核病
和黄瓜细菌性萎蔫病发病和健康植株的叶片、果肉
及根围土壤中提取 ＤＮＡꎬ同时用该 ３ 种病原菌基
因组 ＤＮＡ做阳性对照ꎬ用三重 ＰＣＲ检测(图 ５)ꎮ
Ｆｉｇ. ２　 Ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｍｐｌｉｆｉｅｄ ｐｒｏｄｕｃｔｓ ｏｆ ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ ＰＣＲ
Ｍ: ＤＬ２０００ Ｍａｒｋｅｒꎻ Ｌａｎｅ １: Ｎｅｇａｔｉｖｅ Ｃｏｎｔｒｏｌꎻ Ｌａｎｅｓ ２－３: Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ ｏｒｂｉｃｕｌａｒｅꎬ Ｓｃｌｅｒｏｔｉｎｉａ ｓｃｌｅｒｏｔｉｏｒｕｍ ａｎｄ Ｅｒｗｉｎｉａ
ｔｒａｃｈｅｉｐｈｉｌａꎻ Ｌａｎｅ ４: Ｅｒｗｉｎｉａ ｃａｒｏｔｏｖｏｒａꎻ Ｌａｎｅ ５: Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍꎻ Ｌａｎｅ ６: Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｙｒｉｎｇａｅ ｐｖ. Ｌａｃｈｒｙｍａｎｓꎻ
Ｌａｎｅ ７: Ａｃｉｄｏｖｏｒａｘ ａｖｅｎａｅꎻ Ｌａｎｅ ８: Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓꎻ Ｌａｎｅ ９: Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌａｒｒｙｍｏｏｒｅｉꎻ Ｌａｎｅ １０: Ｆｕｓａｒｉｕｍ
ｏｘｙｓｐｏｒｕｍꎻ Ｌａｎｅ １１: Ｄｉｄｙｍｅｌｌａ ｂｒｙｏｎｉａｅꎻ Ｌａｎｅ １２: Ｃｏｒｙｎｅｓｐｏｒａ ｃａｓｓｉｉｃｏｌａꎻ Ｌａｎｅ １３: Ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍ ｆｕｌｖｕｍꎻ
Ｌａｎｅ １４: Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ ｃａｃｔｏｒｕｍꎻ Ｌａｎｅ １５: Ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍ ｃｕｃｕｍｅｒｉｎｕｍꎻ Ｌａｎｅ １６: Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕ ｇｌｏｅｏｓｐｏｒｉｏｉｄｅｓꎻ
Ｌａｎｅ １７: Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ ｄａｈｌｉａｅꎻ Ｌａｎｅ １８: Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｇｒａｍｉｎｅａｒｕｍꎻ Ｌａｎｅ １９: Ｃｕｒｖｕｌａｒｉａ ｌｕｎａｔａꎻ Ｌａｎｅ ２０: Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ ａｌｂｏ￣ａｔｒｕｍꎻ
Ｌａｎｅ ２１: Ｂｏｔｒｙｔｉｓ ｃｉｎｅｒｅａ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ ｃｕｃｕｍｂｅｒꎻ Ｌａｎｅ ２２: Ｂｏｔｒｙｔｉｓ ｃｉｎｅｒｅａ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ ｔｏｍａｔｏꎻ Ｌａｎｅ ２３: Ｂｏｔｒｙｔｉｓ
ｃｉｎｅｒｅａ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ ｓｔｒａｗｂｅｒｒｙꎻ Ｌａｎｅ ２４: Ｄｉｄｙｍｅｌｌａ ｂｒｙｏｎｉａｅꎻＬａｎｅ ２５: Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ Ｓｃｈｌ. ｆ.ｓｐ. ｆｒａｇａｒｉａｅ.
Ｆｉｇ. ３　 Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｔｒｉｐｌｅｘ ＰＣＲ ｆｏｒ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ＤＮＡ ｆｒｏｍ ａ ｓｉｎｇｌｅ ｐａｔｈｏｇｅｎ
Ａꎬ Ｂꎬ Ｃ: Ｔｈｅ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｔｒｉｐｌｅｘ ＰＣＲ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｕｓｉｎｇ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ＤＮＡ ｏｆ Ｅｒｗｉｎｉａ ｔｒａｃｈｅｉｐｈｉｌａꎬＣｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ
ｏｒｂｉｃｕｌａｒｅ ａｎｄ Ｓｃｌｅｒｏｔｉｎｉａ ｓｃｌｅｒｏｔｉｏｒｕｍ ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ. Ｍ: ＤＬ２０００ ＭａｒｋｅｒꎻＬａｎｅ １: Ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌꎻ Ｌａｎｅ ２: Ｎｅｇａｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌꎻ
Ｌａｎｅ ３: １０ ｎｇꎻ Ｌａｎｅ ４: １ ｎｇꎻ Ｌａｎｅ ５: １００ ｐｇꎻ Ｌａｎｅ ６: １０ ｐｇꎻ Ｌａｎｅ ７: １ ｐｇꎻ Ｌａｎｅ ８: １００ ｆｇꎻ Ｌａｎｅ ９:１０ ｆｇ.
５３１
　
植物病理学报 ４４卷
Ｆｉｇ. ４　 Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｔｒｉｐｌｅｘ ＰＣＲ ｆｏｒ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ＤＮＡ ｆｒｏｍ ｍｉｘｅｄ ｐａｔｈｏｇｅｎｓ
Ｍ: ＤＬ２０００ ＭａｒｋｅｒꎻＬａｎｅ １: Ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌꎻ Ｌａｎｅ ２: Ｎｅｇａｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌꎻ Ｌａｎｅ ３: １０ ｎｇꎻ Ｌａｎｅ ４: １ ｎｇꎻ
Ｌａｎｅ ５: １００ ｐｇꎻ Ｌａｎｅ ６: １０ ｐｇꎻ Ｌａｎｅ ７: １ ｐｇꎻＬａｎｅ ８: １００ ｆｇꎻ Ｌａｎｅ ９:１０ ｆｇ.
Ｆｉｇ. ５　 Ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｍｐｌｉｆｉｅｄ ｐｒｏｄｕｃｔｓ ｂｙ ｔｒｉｐｌｅｘ ＰＣＲ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｉｎｆｅｃｔｅｄ ｃｕｃｕｍｂｅｒ ｔｉｓｓｕｅｓ
ａｎｄ ｒｈｉｚｏｓｐｈｅｒｅ ｓｏｉｌｓ
Ｍ: ＤＬ２０００ Ｍａｒｋｅｒꎻ Ｌａｎｅ １: Ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌꎻ Ｌａｎｅ ２: Ｎｅｇａｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌꎻ Ｌａｎｅ ３: Ｉｎｆｅｃｔｅｄ ｔｉｓｓｕｅｓ ｏｆ Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ
ｏｒｂｉｃｕｌａｒｅꎬ Ｓｃｌｅｒｏｔｉｎｉａ ｓｃｌｅｒｏｔｉｏｒｕｍ ａｎｄ Ｅｒｗｉｎｉａ ｔｒａｃｈｅｉｐｈｉｌａꎬꎻ Ｌａｎｅ ４: Ｉｎｆｅｃｔｅｄ ｓｏｉｌ ｏｆ Ｅｒｗｉｎｉａ ｔｒａｃｈｅｉｐｈｉｌａꎬ Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ
ｏｒｂｉｃｕｌａｒｅ ａｎｄ Ｓｃｌｅｒｏｔｉｎｉａ ｓｃｌｅｒｏｔｉｏｒｕｍꎻ Ｌａｎｅ ５－６: Ｉｎｆｅｃｔｅｄ ｔｉｓｓｕｅｓ ｏｆ Ｅｒｗｉｎｉａ ｔｒａｃｈｅｉｐｈｉｌａꎬ Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ ｏｒｂｉｃｕｌａｒｅꎻ Ｌａｎｅ
７－８: Ｉｎｆｅｃｔｅｄ ｔｉｓｓｕｅｓ ｏｆ Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ ｏｒｂｉｃｕｌａｒｅ ａｎｄ Ｓｃｌｅｒｏｔｉｎｉａ ｓｃｌｅｒｏｔｉｏｒｕｍꎻ Ｌａｎｅ ９－１０: Ｉｎｆｅｃｔｅｄ ｔｉｓｓｕｅｓ ｏｆ Ｅｒｗｉｎｉａ
ｔｒａｃｈｅｉｐｈｉｌａ ａｎｄ Ｓｃｌｅｒｏｔｉｎｉａ ｓｃｌｅｒｏｔｉｏｒｕｍꎻ Ｌａｎｅ １１－１２: Ｉｎｆｅｃｔｅｄ ｔｉｓｓｕｅｓ ｏｆ Ｅｒｗｉｎｉａ ｔｒａｃｈｅｉｐｈｉｌａꎻ Ｌａｎｅ １３: Ｉｎｆｅｃｔｅｄ ｓｏｉｌ ｏｆ
Ｅｒｗｉｎｉａ ｔｒａｃｈｅｉｐｈｉｌａꎻ Ｌａｎｅ １４－１５: Ｉｎｆｅｃｔｅｄ ｔｉｓｓｕｅｓ ｏｆ Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ ｏｒｂｉｃｕｌａｒｅꎻ Ｌａｎｅ １６: Ｉｎｆｅｃｔｅｄ ｓｏｉｌ ｏｆ Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ
ｏｒｂｉｃｕｌａｒｅꎻ Ｌａｎｅ １７－１８: Ｉｎｆｅｃｔｅｄ ｔｉｓｓｕｅｓ ｏｆ Ｓｃｌｅｒｏｔｉｎｉａ ｓｃｌｅｒｏｔｉｏｒｕｍꎻ Ｌａｎｅ １９: Ｉｎｆｅｃｔｅｄ ｓｏｉｌ ｏｆ Ｓｃｌｅｒｏｔｉｎｉａ ｓｃｌｅｒｏｔｉｏｒｕｍꎻ
Ｌａｎｅ ２０－２４: Ｐａｔｈｏｇｅｎ－ｆｒｅｅ ｔｉｓｓｕｅｓ ａｎｄ ｓｏｉｌｓ.
　 　 结果显示ꎬ这 ３种发病黄瓜组织和根围土壤能
够扩增出该 ３种病害特异片段ꎬ特异检测结果和病
害症状相吻合ꎬ而健康组织扩增后没有特异条带出
现ꎮ 可见ꎬ该三重 ＰＣＲ 检测体系能够对发病组织
和根围土壤进行检测ꎬ可用于对该 ３种黄瓜病害的
早期田间检测和快速诊断ꎮ
３　 结论与讨论
　 　 本研究首次采用多重 ＰＣＲ技术对黄瓜炭疽病
菌、黄瓜菌核病菌、黄瓜细菌性萎蔫病菌进行检测ꎮ
正交优化后的三重 ＰＣＲ体系可准确将黄瓜炭疽病
(Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ ｏｒｂｉｃｕｌａｒｅ)、黄瓜菌核病 ( Ｓｃｌｅｒｏ￣
ｔｉｎｉａ ｓｃｌｅｒｏｔｉｏｒｕｍ(Ｌｉｂ.) ｄｅ Ｂａｒｙ)和黄瓜细菌性萎
蔫病(Ｅｒｗｉｎｉａ ｔｒａｃｈｅｉｐｈｉｌａ)检测出来ꎬ分别扩增出
４４２、 ２７８和 ７９４ ｂｐ 的条带ꎮ 三重 ＰＣＲ 体系为:２５
μＬ 反应体系中ꎬ０.２４ μｍｏｌ􀅰Ｌ－１ ＣＹ１ / ＣＹ２ꎬ０.７２
μｍｏｌ􀅰Ｌ－１ ＳＳＦＷＤ / ＳＳＲＥＶꎬ０.３３６ μｍｏｌ􀅰Ｌ－１ ＥＴ－
Ｐ１ / ＥＴ － Ｐ２ꎬ １ Ｕ Ｔａｑ 聚合酶ꎬ ０. １５ ｍｍｏｌ􀅰 Ｌ－１
ｄＮＴＰꎬ１ ｍｍｏｌ􀅰Ｌ－１ ＭｇＣｌ２ꎮ 三重 ＰＣＲ 程序为:
９５℃预变性 ５ ｍｉｎꎻ９４℃变性 １ ｍｉｎꎬ６３℃退火 １
ｍｉｎꎬ７２℃延伸 １. ５ ｍｉｎꎬ３０ 个循环ꎬ７２℃延伸 １０
ｍｉｎꎮ 检测灵敏度可达 １０ ｐｇ􀅰μＬ－１ꎮ 该三重 ＰＣＲ
体系检测黄瓜发病组织和根围土壤ꎬ也可以扩增出
相应的特异条带ꎮ
　 　 目前关于植物病害的检测大多是单一检测ꎬ但
是田间发病情况显示ꎬ病原菌复合侵染的情况比较
普遍ꎬ单一的病原菌检测时间长ꎬ成本高ꎮ 开发针
对不同病害的一次性检测技术具有很大的应用价
６３１
　
　 ２期 王楠ꎬ等:三重 ＰＣＲ检测黄瓜炭疽病菌、菌核病菌和细菌性萎蔫病菌
值ꎬ多重 ＰＣＲ检测体系能够解决这一难题ꎬ对田间
病害预测和诊断具有重要价值ꎮ
　 　 多重 ＰＣＲ 反应成分复杂ꎬ反应体系受多种因
素影响ꎬ要针对不同的影响因素进行分析研究ꎮ 首
先考虑引物间是否能够组合ꎬ是否会形成引物二聚
体等ꎬ依据多重 ＰＣＲ引物组合原则ꎬ选择合适的引
物组后ꎬ再进行多重 ＰＣＲ体系的优化[２ ４ ꎬ ２ ５ ]ꎮ 本试
验采用了正交优化的方法对影响多重 ＰＣＲ比较重
要的几个因素进行正交试验ꎬ快速高效地摸索出最
佳反应体系和条件ꎮ
　 　 本试验中的黄瓜病害三重 ＰＣＲ检测技术能够
在 ３ ｈ内完成对病害组织的检测ꎬ１０ ｈ内完成对植
株根围土壤的检测ꎬ可以快速高效地实现对病害发
生情况的预测和诊断ꎬ为病害的防治提供了重要的
依据和条件ꎮ
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植物病理学报 ４４卷
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责任编辑:李晖
８３１