全 文 ：书西北植物学报!
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!
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"
$
#$
"&&("&)#
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!!
文章编号$
#"""*$"!+
"
!"#$
#
"$*"&&*"&
!!!!!!!!!!!!
!"#
$
#",&"&
%
-
,.//0,#"""*$"!+,!"#$,"$,"&&
收稿日期$
!"#%*#!*!%
&修改稿收到日期$
!"#$*"%*"#
基金项目$国家
)&%
课题"
!"#%11#"!&"$
#&国家自然科学基金"
%###&"+
!
%#%#&))
#
作者简介$朱海龙"
#2)(
#!男!硕士研究生!主要从事植物蛋白组学研究
3*45.6
$
78985.6:0
;
&!2
!
#!&,<:4
"
通信作者$徐景升!副研究员!硕士生导师!主要从事甘蔗分子生物学研究
3*45.6
$
=9
-
.0
;
/8>0
;!
#!&,<:4
甘蔗条纹花叶病毒
$%
蛋白与甘蔗
&(#)*"
大亚基互作的研究
朱海龙!程光远!彭
!
磊!柴
!
哲!郭晋隆!许莉萍!徐景升"
"福建农林大学 农业部福建甘蔗生物学与遗传改良重点实验室!福州
%+"""!
#
摘
!
要$该研究以甘蔗条纹花叶病毒"
!"
#
$%&$()*%($+,-)$.&/.%")
!
?@?AB
#的
C%
蛋白"
?@?AB*C%
#为诱饵!采
用酵母双杂交技术"
D
>5/EEF:*8
D
GH.I/
D
/E>4
!
J!K?
#从甘蔗酵母文库中筛选到
#
个编码核酮糖
*#
!
+*
二磷酸羧化
酶%加氧酶"
H.G96:/>*#
!
+*G./
L
8:/
L
85E><5HG:=
D
65/>
%
:=
D;
>05/>
!
M9G./<:
#大亚基的基因!命名为
!&01&2
序列分析
表明!该基因开放读码框"
:
L
>0H>5I.0
;
NH54>
!
OMP
#长度为
#%%G
L
!编码
$)
个氨基酸残基
J!K?
和双分子荧
光互补"
G.4:6><965HN6:9H>/<>0<><:4
L
6>4>0E5E.:0
!
Q.P@
#实验表明!
?与
?@?AB*C%
存在互作关系研究认
为
?@?AB*C%
与
?的互作可能是
?@?AB
侵染甘蔗导致花叶症状发生的分子基础
关键词$甘蔗条纹花叶病毒&
C%
蛋白&
M9G./<:
&互作
中图分类号$
S)2
文献标志码$
1
+,-./0*-#",(.-1..,2
3
0/*0,.2-/.045")0#*6#/)$%
0,!&(#)*"70/
3
.2(,#-8/"92
3
0/*0,.
TKUK5.6:0
;
!
@K3VWW950
;D
950
!
C3VWR>.
!
@K1XT8>
!
WUOY.06:0
;
!
ZUR.
L
.0
;
!
ZUY.0
;
/8>0
;
"
"
[>
D
R5G:N?9
;
5H<50>Q.:6:
;D
50IW>0>E.>I.0
;
!
A.0./EH
D
:N1
;
H.<96E9H>
!
P9
-
.501
;
H.<96E9H>50IP:H>/EH
D
U0.\>H/.E
D
!
P978:9
%+"""!
!
@8.05
#
:()-/0*-
$
!"
#
$%&$()*%($+,-)$.&/.%")
"
?@?AB
#
./:0>:NE8><59/5E.\>5
;
>0E/:N/9
;
5H<50>
"
!$&&3$%",
-
44
.&.$%",R,
#
4:/5.5/>,X0E8.//E9I
D
5/9
;
5H<50><]V16.GH5H
D
F5//>0>IF.E8C%NH:4?@*
?AB5/G5.E9/.0
;D
>5/EEF:*8
D
GH.I/
D
/E>4
"
J!K?
#
,1
;
>0>>0<:I.0
;
E8>65H
;
>/9G90.E:NH.G96:/>*#
!
+*G.*
/
L
8:/
L
85E><5HG:=
D
65/>
%
:=
D;
>05/>
"
M9G./<:
#
F5/:GE5.0>I50II>/.
;
0>I5/!&01&2,^ 8>:
L
>0H>5I.0
;
NH54>
"
OMP
#
:N!&01&2./#%%G
L
.06>0
;
E850I<:I>/N:H$)54.0:5<.I/,^8>.0E>H5EF>>0E8>
?0E.N.>IG
D
J!K?50IG.4:6><965HN69:H>/<>0<><:4
L
6>4>0E5E.:0
"
Q.P@
#
,
8^./H>/>5H<8
L
H:\.I>I0>F<9>/E:E8>.0\>/E.
;
5E.:0:NE8>4:6><965H4><850./4:N?@?AB.0N>/9
;
5H<50>
!
>/
L
><.56
D
:0E8>4:/5.D
0IH:4>I>\>6:
L
4>0E<59/>IG
D
/9
;
5H<50>4:/5.5/>,
;.
<
1"/!)
$
?@?AB
&
C%
L
H:E>.0
&
M9G./<:
&
.0E>H5!!
甘蔗"
!$&&3$%",-
44
.&.$%",R,
#是中国乃至
全世界最重要的糖料作物和能源作物之一!甘蔗糖
占中国食糖总量的
2!_
!占世界食糖总量的
$_
!
甘蔗乙醇占世界生物质燃料乙醇的
&"_
甘蔗花
叶病"
/9
;
5H<50>4:/5.5/>
!
?A]
#是严重危害
甘蔗生产的病毒性病害之一!在全世界各大蔗区普
遍发生(#*+)甘蔗感染花叶病后!叶片出现黄绿相
间*大小不一的条纹或斑驳&生长缓慢!植株矮小&品
质变劣!蔗糖结晶率下降&种苗萌芽率下降!分蘖减
少当
?A]
发病率达
+"_
以上时!蔗糖产量损失
#!_
"
%_
(
&
)

?A]
的病原主要有
%
种!即甘蔗花
叶病毒"
!"
#
$%&$(,-)$.&/.%")
!
?@AB
#*高粱花叶病
毒"
!-%
#
3",,-)$.&/.%")
!
?HAB
#和甘蔗条纹花叶病
毒"
!"
#
$%&$()*%($+,-)$.&/.%")
!
?@?AB
#!均属于马
铃薯
J
病毒科"
C:E
D
\.H.I5>
#其中!
?@AB
和
?HAB
属于马铃薯
J
病毒属"
5-*
6
/.%")
#
?@?AB
于
#2)
年在美国首次发现并报道!
#22)
年确定其属于
5-*
6
7
/.%.8$(
(

)
!
"#!
年国际病毒分类委员会"
X0E>H05E.:056
@:44.EE>>:0 5^=:0:4
D
:NB.H9/>/
!
X@^ B
#将其立为
该科新属!即禾病毒属"
5-$&(/.%")
#"
8EE
L
$%%
FFF,.<*
E\:06.0>,:H
;
#该病毒主要分布在孟加拉*印度*日
本*印度尼西亚*巴基斯坦等地()*2)!在中国甘蔗主产
区广西*云南*广东*浙江*福建等地普遍发生并广泛
传播(#!#")
?@?AB
是单链正义
MV1
病毒!基因组结构与
5-*
6
/.%")
病毒相同!编码
##
个成熟蛋白(!##)!其中
C%
蛋白是
5-*
6
/.%.8$(
病毒中研究比较多的蛋白!
该蛋白功能复杂!参与病毒的复制*翻译*胞间移动
等过程(#!)病毒结构简单!必须借助寄主因子才能
完成侵染过程!因此!分离参与病毒复制*翻译*移动
和长距离运输等生物学过程的寄主因子基因对研究
病毒侵染的分子机制具有重要意义本研究以
?@*
?AB
的
C%
蛋白为诱饵!利用酵母双杂交技术
"
D
>5/EEF:*8
D
GH.I/
D
/E>4
!
J!K?
#!从甘蔗酵母文
库中筛选到
#
个编码核酮糖
*#
!
+*
二磷酸羧化酶%加
氧酶"
H.G96:/>*#
!
+*G./
L
8:/
L
85E><5HG:=
D
65/>
%
:=
D
*
;
>05/>
!
M9G./<:
#大亚基基因!命名为
!&01&2
利
用
J!K?
和双分子荧光互补"
G.4:6><965HN69:H>/*
<>0<><:4
L
6>4>0E5E.:0
!
Q.P@
#技术验证了
?与
?@?AB*C%
的互作关系!为探讨
?@?AB
侵染甘
蔗导致花叶症状的分子机理提供了实验证据
#
!
材料和方法
=,=
!
实验材料
供试材料为甘蔗热带种原始栽培种
Q5I.65
!由
农业部福建甘蔗生物学与遗传育种重点实验室提
供!种植于温室内本氏烟"
9.&-*.$$1(*3$,.7
$$
#种植于培养室内
=,>
!
实验方法
=?>?=
!
甘蔗
&(#)*"
大亚基基因克隆及生物信息
学分析
!
以
?@?AB
的
C%
蛋白为诱饵!利用
J!K?
方法从甘蔗
<]V1
文库"由农业部福建甘蔗生物学
与遗传育种重点实验室构建并保存#中筛选到一个
互作因子基因将该克隆测序后!使用
V@QX
"
8E*
E
L
$%%
0;
:%#站点上的在线软件
OMP
N.0I>H
预测开放读码框"
:
L
>0H>5I.0
;
NH54>
!
OMP
#!采
用
Q65/E
进行同源分析!筛选同源序列并用
@69/E56`
进行多序列比对!利用
A3W1$,"
构建进化树
=?>?>
!
2*&(*7
与
2@256A$%
的
B>C2
载体构建及
互作验证
!
将
!&01&2
和
!:!;<75%
基因分别克
隆到
L
A]#2*^
载体中!命名为
L
A]*?和
L
A]*?@?AB*C%
使用
C@M
引物
?@*C%*
L
Q^ *P
*
?@*C%*
L
Q^ *M
!
?L
CM%*P
*
?L
CM%*M
"表
#
#!分别以含有目的基因的质粒
L
A]*?*
L
A]*?@?AB*C%
为模板!经
C@M
扩增得到含有
!
4
.
酶切位点的目的片段!回收并克隆到
L
A]#2*^
载体测序验证正确后!用
!
4
.
酶切!回收目的条
带!利用
^
$
]V1
连接酶将其分别与同样酶切回收
的酵母双杂交载体
L
Q^ %*V
*
L
CM%*V
进行连接连
接后转化大肠杆菌
]K+
#
!分别涂布于含有
RQ
%
[50
a
*
RQ
%
14
L
a的固体培养基上!
%b
培养
#&8
!
挑单菌落分别在
RQ
%
[50
a
*
RQ
%
14
L
a液体培养基
中培养
&8
!提取重组质粒
L
Q^ %*V*?@?AB*C%
和
L
CM%*V*?!采用酶切和
C@M
产物测序方法对
重组酵母表达载体进行鉴定与验证
分别将重组质粒组合
L
Q^ %*V*?@?AB*C%
与
L
CM%*V*?!阳性对照质粒组合
L
?^U!*1CC
与
L
V9GW*P>&+
!阴性对照质粒组合
L
Q^ %*V
与
L
CM%*V
!
L
Q^ %*V*?@?AB*C%
与
L
CM%*V
!
L
Q^ %*V
与
L
CM%*V*?转化酵母细胞!
%"b!+"H
%
4.0
培养至
O]
+$&
达到
",&
"
",)
!将转化后的酵母细胞
+
倍梯度稀释!在
?]*R>9
%
H^
L
固体培养基上培养!培
养基表面涂布
#"
$
R!"4
;
%
4RZ*
;
56
!
%"b
倒置培
养
$
"
+I
待菌落长到直径为
%
"
$44
左右后!挑
取单菌落转移到
#4R?]*^H
L
%
R>9
%
K./
%
1I>
液体
培养基中培养!如果酵母生长!将其转移到
?]*^H
L
%
R>9
%
K./
%
1I>
固体培养基上培养!培养基表面涂布
#"
$
R!"4
;
%
4RZ*
;
56
!观察菌落生长状况!验证蛋
白之间是否存在互作
=?>?%
!
2*&(*7
与
2@256A$%
的
D#E@
载体构建及
互作验证
!
分别以克隆载体
L
A]*?*
L
A]*
?@?AB*C%
为模板!使用
C@M
引物
C%*Q.P@*P
*
C%*
Q.P@*M
!
?*
?"表
#
#进
行
C@M
扩增
C@M
产物经琼脂糖凝胶电泳检测
后!回收目的片段!利用
W5E>F5
D
QC
反应将目的片
段克隆到
L
]OVM!!#
载体中提取重组载体质粒!
用
;="
酶切!按照
W>E>F5
D
RM
反应体系!将
?@*
?AB
的
C%
基因克隆到
Q.P@
载体
L
35H6>
D;
5E>!"#*
&
$
期
!!!!!!!!!!
朱海龙!等$甘蔗条纹花叶病毒
C%
蛋白与甘蔗
M9G./<:
大亚基互作的研究
表
=
!
本研究使用的
$@&
引物
5^G6>#
!
C@M
L
H.4>H/9/>I.0E8.//E9I
D
引物名称
CH.4>H054>
引物序列
CH.4>H/>
c
9>0<>
"
+d
#
%d
#
产物长度
CH:I90
;
E8
%
G
L
?@?AB*C%*P 1^ @W11^ W^W1WW1W^ ^^ W^@@
22"
?@?AB*C%*M @W@1@^ ^^ 1^ WW^ @^@^ W1W@@
?@*C%*
L
Q^*P 1^ 1^1@11WW@@1^ 1^@WW@@1^ @W11^ W^W1WW1W^ ^^ W^@@
#"%$
?@*C%*
L
Q^*M ^^ W1@^ 11WW@@W1WW@WW@@@@@W@1@^ ^^ 1^ WW^ @^@^ W1W@@
?L
CM%*P 1^ 1^1@11WW@@1^ 1^@WW@@1^ W^ @1@@1@111@1W111@
#%)#
?L
CM%*M ^^ W1@^ 11WW@@W1WW@WW@@W@^ 1^^ @^ 1^ WW^ 1^ @@1@@W@
?@*C%*QXP@*P WWWW1@11W^ ^^ W^ 1@111111W@1WW@^ @^1^ @W11^ W^W1WW1W^ ^^ W^@@
#"$!
?@*C%*QXP@*M WWWW1@@1@^ ^^ W^ 1@11W111W@^ WWW^ @@W@1@^ ^^ 1^ WW^ @^@^ W1W@@
?#%)2
?JV
中!将
!&01&2
基因克隆到
Q.P@
载体
L
35H6>
D;
*
5E>!"!*J@
中
L
35H6>
D;
5E>!"#*JV
带有黄色荧光
蛋白"
J>6:FN69:H>/<>0<>
L
H:E>.0
!
JPC
#
V
端的
#$
个氨基酸!
L
35H6>
D;
5E>!"!*J@
带有
JPC
的
&+
个氨基酸采用液氮冻融法将重组质粒转化到农杆
菌
3K1#"+
中
将转化的农杆菌转移到含有
+4RRQ
培养基
"
M.N
a
+"
$
;
%
4R
!
[50
a
+"
$
;
%
4R
#的试管中!
!)
b
!
""H
%
4.0
培养过夜!使其终浓度
O]
&""
达到
#,"
常温下!
+"""H
%
4.0
!离心
+4.0
!弃上清加
入
#4R
侵染液"
]*
葡萄糖
!+"4
;
!
A3?+4R
!
V5
%
CO
$
+
#!K
!
O+ 4R
!乙酰丁 香酮
+
$
R
!加
IIK
!
O
至终体积为
+"4R
#!重悬菌液!测量菌液
O]
&""
并将其调节至
",#
取含有待互作验证的重
组质粒的菌液各
+"
$
R
加入到
!4R
无菌离心管
中!混匀!放置
%
"
+8
取生长旺盛*长有
+
"

片叶
片的本氏烟!选择两片大的叶片做好标记!在叶片背
面"
!
个叶脉间#注射菌液!正常条件下培养
!
"
%
I
后取侵染叶片
#
"
!<4
!
!背面朝上!用德国莱卡
@^??C!
激光共聚焦显微镜观察
!
!
结果与分析
>?=
!
0"12"3
基因克隆及生物信息学分析
以
?@?AB
的
C%
蛋白为诱饵从甘蔗酵母文库中
筛选到
#
个编码
M9G./<:
的基因!生物信息学分析表
明!该基因
OMP
长度为
#%%G
L
!编码
$)
个氨基酸
残基!是甘蔗
M9G./<:
大亚基!命名为
!&01&2
根据
Q65/E
结果!选择禾本科
@
$
植物甘蔗*高粱"
!-%
#
3",
1.&-=&-%
#*玉米"
>($,$
6
)
#!
@
%
植物大麦"
?-%8(",
/"=
#
$%(
#*二穗短柄草"
@%$&3
6A
-8.",8.)*$&3
6
-
#*小
麦"
B%.*.&",$()*./",
#和水稻"
C%
6
D$)$*./$
#
M9G./<:
的大*小亚基氨基酸序列做多序列比对分析多序
列比对结果表明!本研究得到的
?与
V@QX
上公布的高粱
M9G./<:
大亚基 "
1QC"#$$),#
#相似
性最高!为
22,)_
!与甘蔗"
JC
,
"!$%),#
#的相似
性为
22,+)_
!与玉米"
@11"$#&,#
#的相似性为
22,#&_
!与水稻"
Q11""+%2,#
#的相似性最低!为
2%,!_
进化树分析结果表明!
M9G./<:
大*小亚
基分别聚在一起!形成
!
个明显不同的群!
@
%
植物
和
@
$
植物
M9G./<:
的大*小亚基形成不同的亚群
"图
#
#
>?>
!
2*&(*7
与
2@256A$%
互作的
B>C2
验证
!&01&2
基因长度为
#%%G
L
!其重组表达载体
质粒
L
CM%*V*?经
!
4
.
酶切后!电泳结果显
示在
#+""G
L
的位置出现单一条带!与预期相符
?@?AB*C%
蛋白编码序列长度为
22"G
L
!其重组表
达载体质粒
L
Q^ %*V*?@?AB*C%
经
!
4
.
酶切后!电
泳结果显示!在
#"""G
L
左右的位置出现单一条
带!与预期相符"图
!
#测序结果也表明目的基因
插入到正确位置!说明载体构建成功
重组酵母表达载体
L
CM%*V*?和
L
Q^ %*
V*?@?AB*C%
共转化的酵母菌株
VAJ+#
在四缺
选择性培养基
?]*^H
L
%
R>9
%
K./
%
1I>
上生长良好
同时!作为对照的阳性对照菌株生长良好!阴性菌株
不能生长"图
$
#
>?%
!
2*A&(*7
与
2@256A$%
互作的
D#E@
验证
C@M
扩增重组质粒
J0*?*
J<*?*
J0*?@?AB*C%
*
J<*?@?AB*C%
的插入片段!电泳
检测表明扩增产物长度与预期大小一致"图
%
#测
序结果也表明目的序列插入到载体的正确位置!证
明载体构建成功
剪取共侵染的本氏烟叶片!激光共聚焦显微镜
)&
西
!
北
!
植
!
物
!
学
!
报
!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
%$
卷
图
#
!
甘蔗和其他近缘禾本科植物
M9G./<:
蛋白的进化树分析
分支点数字表示
Q::E/EH5
L
验证中基于
)"""
次重复该节点可信度
P.
;
,#
!
C8
D
6:
;
>0>E.<5056
D
/./G5/>I:0M9G./<:54.0:5<.I/>
c
9>0<>/NH:4/9
;
5H<50>50I:E8>H
L
:5<>:9//
L
><.>/
8^>094G>H5EE8>0:I>/H>
L
H>/>0E/E8>H>6.5G.6.E
DL
>H<>0E:NG::E/EH5
L
/\569>/G5/>I:0)"""H>
L
6.<5E.:0/
图
!
!
重组质粒
L
Q^ %*V*?@?AB*C%
和
L
CM%*V*?的
!
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蛋白之间的互作关系"图
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讨
!
论
在高等植物中!
M9G./<:
由
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)
个
小亚基组成!大亚基由叶绿体基因组编码!小亚基则
由核基因组编码
M9G./<:
在植物光合作用过程中
既参与
@O
!
的固定!也参与光呼吸代谢途径!是决
定植物净光合的关键酶(#%*#&)
M9G./<:
的含量*活
化程度等因素影响光合速率(#*#2)!其活化程度受
M9G./<:
活化酶"
H9G./<:5
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M@1
#
(
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)和磷酸
糖类物质调控(!#)磷酸糖类抑制物与
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变成封闭型构象!其
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端结构域中的
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中的
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和磷酸糖基键之间相互
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端结构域的移动!导致
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当
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侵染甘蔗后!很可能由于
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蛋白与
图
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!
用于
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互作验证的重组质粒的
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验证
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V
端结构域的相互识别!使
M9G./<:
无法变成开放型构象!导致
M9G./<:
失活
M9G./<:
失活会导致两种情况!一种是反应向
@O
!
固定方向移动!光呼吸被抑制而产生过量乙醇
酸(#&)!对植物产生毒害而使叶绿体破坏!叶片失绿!
产生花叶症状另一种可能是阻止
@O
!
固定!从而
减少了
%*
磷酸甘油酸的生成!导致糖酵解反应底物
不足!产生的
1^ C
大量减少(!$*!+)!无法为叶绿体中
各个耗能反应提供足够能量!最终导致类囊体膜降
解!叶片失绿
植物的
M9G./<:
与马铃薯
J
病毒科病毒的
C%
蛋白
的互作很可能是一种普遍存在现象在洋葱中!
M9G./<:
大亚基和小亚基都可以跟马铃薯
J
病毒属
芜菁花叶病毒"
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*
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分别互作(!&)在烟草中!
M9G./<:
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病毒的
@C
互作!可能也是影响
叶绿体结构造成花叶症状的因素之一(!)叶绿体
是一个动态的细胞器!细胞核里编码的蛋白不断地
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$
期
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朱海龙!等$甘蔗条纹花叶病毒
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蛋白与甘蔗
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为诱饵载体!
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为
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和捕获载体
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为阳性对照缺陷型培养基
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侵染甘蔗后!除了
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蛋白与
M9G./<:
互作外!
推测病毒编码的其他蛋白也会与寄主因子互作!由
此造成叶绿体的结构和功能的不稳定!最终导致叶
绿素的缺失!但是目前还未见到有关
?@?AB
与甘
蔗互作的研究报道综上!本研究首次证明了甘蔗
中
M9G./<:
大亚基与
?@?AB
的
C%
蛋白的互作!为
研究
?@?AB
侵染甘蔗造成花叶病症状的分子机制
提供了实验证据
参考文献!
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