全 文 ：书西北植物学报!
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文章编号$
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-
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收稿日期$
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&修改稿收到日期$
!"#$)"$)##
基金项目$长江学者和创新团队发展计划"
123#%"$,
#
作者简介$高
!
原"
#44(
#!男!在读硕士研究生!主要从事植物分子生物学研究
5)67.8
$
9
:70$&&!4$&&
!
#&%+;<6
"
通信作者$高宏波!博士!教授!主要从事植物分子生物学研究
5)67.8
$
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7<>
-
?:
!9
7@<<+;<6
拟南芥角质层发育突变体中
1%2$$
基因的分析与鉴定
高
!
原!贾
!
宁!潘
!
登!高述民!高宏波"
"北京林业大学 生物科学与技术学院!北京
#"""4%
#
摘
!
要$从拟南芥"
!"#$%&
(
)%)*+#,%#-#A+
#突变体库中筛选到一个发育突变体
./,
01
#
!其突变表型为叶片狭长!
生长缓慢该研究利用图位克隆技术和候选基因测序鉴定出
./,
01
#
角质层发育基因"
2+%*34$"2-56
(
,37##
!
89:##
#有一个点突变对该突变体
;BCD
测序结果显示!
89:##
基因的突变导致其第
,
个内含子在形成成熟
62CD
时无法被正常剪切!使该突变体内
89:##
的
62CD
大量降解并在翻译时提前引入终止密码子甲苯胺蓝
染色实验显示!突变体叶片表面角质层有缺陷&遗传互补实验进一步证明!突变体
./,
01
#
中的突变基因是
89:##
!
./,
01
#
表型是由
89:##
突变造成的
关键词$拟南芥&角质层发育&
89:##
&图位克隆
中图分类号$
E,4
文献标志码$
D
%&(
)
*#*&!+!,&-#.#/-#"&".1%2$$0,&,#&12-#/(,
3,4,("
5
6,&-72-&-".!($3-.&
4
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!
OK.
-
.0
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R9
T0.UKS/.Q
9
!
OK.
-
.0
=
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N@.07
#
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6K0Q6:Q70Q./,
01
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S9
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P.P7QK
=
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X
:K0;.0
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#
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K0K./,
01
#+;BCD/K
X
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=
SK/:8Q,Q@.0QS<0.0Q@K67Q:SK62CD
!
W@.;@09
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S7P7Q.<0:Q78/<8KPQ<
V
SK67Q:SK
QS70/87Q.<078QKS6.07Q.<0+3<8:.P.0K>8:K/Q7.0.0
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K/QKPQ@7Q.Q/8K7?;:Q.;:87S@7P7PK?K;Q+FK0KQ.;;<6)
V
8K6K0Q7Q.<0KY
V
KS.6K0Q?:SQ@KS;<0?.S6KPQ@7QQ@K6:Q70Q
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$
!"#$%&
(
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V
6K0Q
&
89:##
&
67
V
)>7/KP;8<0.0
=
!!
角质层对于植物保持水分和适应陆生环境至关
重要(#)角质层覆盖于植物体各器官表面"包括茎*
叶*花*果实和种子等#(!)%)!在植物生长发育过程中
起着重要的作用!如控制非气孔水分流失*高湿度环
境中防止病原菌的入侵等($)*)另外!角质层在防止
器官融合方面也起着重要的作用!例如超表达真菌
角质酶基因的转基因株系!出现了花器官畸形 (&)
植物角质层主要包括角质和蜡质(,)!角质是由
脂肪酸的衍生物酯化交联聚合而成!拟南芥角质主
要成分是
N
#&
和
N
#4
脂肪酸(4)!而蜡质则主要是由较
长碳链的脂肪酸等各种分子组成()但对角质和蜡
质是如何从表皮细胞分泌并组装成复合物以及在植
物表面形成立体结构这一系列过程还不够清楚角
质层蜡质运输主要分为两步$第一步是蜡质从合成
位点向质膜运输!但是表皮细胞内蜡质分子的运输
机制现在还不清楚!目前有
!
种假说()#")!分别是囊
泡介导的高尔基体分泌途径和非囊泡介导的内质网
到质膜的直接转运途径&第二步是蜡质从质膜向质
膜外运输!蜡质首先从质膜被释放到质膜外环境!目
前在拟南芥中发现有
!
个转运蛋白
ZON##
和
N52*
参与这个过程($)在拟南芥
2$5##
和
53"*
突
变体中!表皮蜡质含量明显减少!细胞内蜡质含量明
显增加!表明
ZON##
和
N52*
蛋白参与植物表皮
蜡质运输($!#")#!)有研究表明拟南芥
ZON##
和
N52*
蛋白作用路径相同或者形成异源二聚体共同
参与蜡质运输($)蜡质从表皮细胞运出后!可能通
过脂转运蛋白穿过细胞壁被运输至角质层(#%)
本实验室从拟南芥突变体库中筛选到一个叶片
狭长*生长缓慢且不可育的隐性突变体本研究运
用图位克隆技术*
BCD
测序技术和遗传互补实验!
确定
./,
01
#
突变体是
89:##
基因的一个等位突
变体&该突变体角质层发育严重受阻!叶片和茎表面
蜡质含量降低&该突变体是研究植物角质层发育的
一个新材料
#
!
材料和方法
$+$
!
材
!
料
野生型拟南芥"
!"#$%&
(
)%)*+#,%#-# A+
#有
N<8
"
N<8:6>.7
#和
AKS
"
A70P/>KS
=
#
!
种常见生态型
植物角质层缺陷突变体
./,
01
#
是本实验室从一个
以
N<8
为背景的突变体与
AKS
杂交后产生的
R
!
代
植物中分离得到的
$+<
!
方
!
法
$+<+$
!
拟南芥生长条件
!
种子经表面消毒后种植
于
#
%
![L
培养基!放置于植物培养间培养培养
条件为
!"
"
!!!
#&@
光照和
4@
黑暗交替!光照
强度为
#!"
#
6<8
+
6
(!
+
/
(#
!相对湿度约
&"]

$+<+<
!
基因的粗定位
!
观察种植在
#
%
![L
固体
培养基中的
R
!
代植物的表型从中随机挑选
!$
棵
具有突变表型的单株分别提取
BCD
!然后取等量均
匀混合构建一个
BCD
池以这个
BCD
池为模板!
选择均匀分布于
*
条染色体!并且在
N<8
与
AKS
两
亲本之间有明显多态性的
!%
对分子标记进行
JN2
扩增!然后用
%+"]
的琼脂糖凝胶电泳分析
$+<+=
!
基因的精细定位
!
首先用经粗定位确定连
锁的
!
个分子标记
NM#)$+#
和
NM#)#"+$
对
!$
株
突变体植物进行单株分析!确定紧密连锁的分子标
记然后在这
!
个分子标记附近开发新的分子标记
"表
#
#通过上述分析方法!找到进一步紧密连锁
的分子标记!进而从两边缩小定位区间!最终将突变
基因定位于极小的一段区间内
$+<+>
!
甲苯胺蓝染色
!
将
"+"*]
"
8
%
;
#甲苯胺蓝
溶液直接倒在生长
%
周左右拟南芥的
#
%
![L
培养
基上!并完全浸没植物静置
!6.0
后倒出甲苯胺
蓝并用水轻轻洗去残留的甲苯胺蓝(#!&)
$?!
78A
9:
$
遗传互补实验
!
以野生型拟南芥
表
$
!
78A
9:
$
精细定位所用分子标记的引物序列
37>8K#
!
JS.6KS/K
X
:K0;K/VV
.0
=
01
#
分子标记
[7S^KS
位置
A<;7Q.<0
%
>^
正向引物
RV
S.6KS
"
*_)%_
#
反向引物
2KUKS/K
V
S.6KS
"
*_)%_
#
分子标记类型
[7S^KSQ
9V
K
NM#)$+# $#*& N3FD3DF3FDFFN33N3FD3F3DN FD3DNNN3FD3DDNNF3D3DNDNDN LLAJ
NM#)*+# *#*# FFFDFD3F33FD3F33N33NF FFF3NDNFDF3FDDF3N3DF3N LLAJ
NM#)*+# *## NNFDFN3FF3DD3NDD3FFFDFD33N FD3F333DDNFFDN3DDDDNF3N3F3N LLAJ
NM#)&+"* &"*# NFFND3DF3FDDD3FDFDDF33DFNN NFN3FD3D33NDN3N33N3NN33NN LLAJ
NM#)&+## &### FDN3DN3NND3NDDDNDFNNDNDN ND3FFDDFD3N3DDDDD3FN3FDNDN LLAJ
NM#)&+#% &#! NDDDN3DDDFNDDF3333DF3N3N3N FD3NNFF333N3F3333NN3NF3N NDJL
NM#)&+!"& &!"& FDDNN33FN3NND3D3ND3333FN ND3FDD3F3N3FFDF33FNDN3F NDJL
NM#)&+!, &!,, NFDND3FFNNDFF33D3DDN3F FDFN3DFDN33N3D3FDNF3NDFN LLAJ
NM#)&+* &*, NNF3FDDDFND3NND3FD33FN FNFNDNDN3DDDF3N3NNDD3F LLAJ
NM#),+* ,*,4 NFFFNDDN3N333DN3333FDF F3FFDFDD3FDFDFDF3F33FDF LLAJ
NM#)4+" 4", NFND33NF3NFFDNND33F FNNDDF33FD3D33FD3FF3F3N LLAJ
NM#)#"+$ #"$* NDD3FDFD3FDNNFDFFNDF F33DNF3FN3N3NDDF3N3DDDNN LLAJ
!!
注$
LLAJ
简单序列长度多态性&
NDJL
酶切扩增多态性序列&
NM#)&+#%
扩增产物用
<)
(
$
酶切!
NM#)&+!"&
扩增产物用
=#
>
$
酶切
C$
LLAJ+L.6
V
8K/K
X
:K0;K8K0
=
Q@
V
<8
9
6V
@./6
&
NDJL+N8K7UKP76
V
8.?.KP
V
<8
9
6V
@.;/K
X
:K0;K/
&
3@K76
V
8.?.KP
V
S
9
<)
(
$
+
3@K76
V
8.?.KP
V
S
9
=#
>
$
+
""##
西
!
北
!
植
!
物
!
学
!
报
!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
%$
卷
N<8
基因组
BCD
为模板!以
#F#,4$")&
和
#F#,4$"),
为引物扩增含有自身启动子的
89:##
基因片段
#F#,4$")&
"
*_)NN3FFD3NNFF33DDDFFNNND33)
D3F33NN)%_
#&
#F#,4$"),
"
*_)N33FDNF3NFFDF)
3333FD3D33FNDFFNN)%_
#
JN2
扩增产物经
9#6M
$
)MR
和
!#*
%
酶消化后克隆到双元载体
%%"!H!
中!然后转入大肠杆菌感受态细胞中!经测
序确定
89:##
全长克隆到了
%%"!H!
载体上并且
克隆基因无突变使用冻融法转化农杆菌!使用蘸
花法转化拟南芥(#$)由于
./,
01
#
不育!故使用
./,
01
#R
%
杂合子进行转化!转化得
3
#
代种
3
#
代种子并用
&"6
=
%
A
的草铵膦筛选!对筛选得到的
植物进行遗传鉴定
$?!
78A
9:
$
转基因互补植物基因鉴定
!
在
89:##
基因两侧各寻找
#
个分子标记用以检测突
变位点是否为
N<8
纯合!若
!
个
[7S^KS
均为
N<8
纯
合则可推测突变位点亦为
N<8
纯合用
!
个离突变
位点距离很近的
NM#)*+#
和
NM#)&+!,
分子标记
对转基因拟南芥基因型进行初步鉴定!筛选突变区
间为
N<8
纯合的转基因后代
从初步鉴定出的拟南芥中挑选
#
株进行
89:##
基因型鉴定在
89:##
基因中设计
#
条正向引物
#F#,4$")$
!在
89:##
基因以外拟南芥基因组上设计
#
条反向引物
#F#,4$")#%
检测内源
89:##
基因!
JN2
扩增长度为
#%!*>
V
用
#F#,4$")$
与
%%"!H!
载体上设计的另
#
条反向引物
HN)2!
检测转入的
89:##
基 因!
JN2
扩 增 长 度 为
!"!!>
V
用
#F#,4$")$
和
#F#,4$")#%
*
#F#,4$")$
和
HN)2!
为引
物分别
JN2
扩增转基因互补拟南芥*突变体和
N<8
野生型转基因互补拟南芥可以同时被
JN2
扩增出
内源和外源的
89:##
基因片段!而突变体植株和
N<8
野生型只能扩增出内源的
89:##
基因片段!同
时将转基因植物内源
89:##
基因测序有关引物为
#F#,4$")$
"
*_)N3FDDNF33FFFDN3DFN3DNDF)
%_
#*
#F#,4$")#%
"
*_)NDNDN3NFDDF333N3N3FN)
3F3N)%_
#*
HN)2!
"
*_)N3DN33F3DNDFN3NF3N)
ND3FN)%_
#
$?!
1%2$$
基因
6CD%
分析
!
用艾德莱公司
提供的植物总
2CD
提取试剂盒!分别提取种植于
#
%
![L
培养基上
!4P
的突变体
./,
01
#
和
N<8
野生
型植物以及转基因互补拟南芥的
2CD
!然后用
RKS)
6K0Q7/
公司的
2KUKSQD.P
3[
R.S/QLQS70P;BCD
L
9
0Q@K/./ .`Q
试剂盒进行反转录!将反转录产生的
;BCD
连续
$
倍梯度稀释!以此为模板进行
JN2
扩
增用半定量
23)JN2
技术分析
./,
01
#
*
N<8
野生型
和转基因互补拟南芥中
89:##
基因的
62CD
含量
JN2
扩增程序为
$预变性
*6.0
&
$变性
%"/
!
*&退火
%"/
!
,!延伸
%"/
!共
!*
个循环&
,!延
伸
*6.0
扩增
89:##
引物为
#F#,4$")!
"
*_)NND)
DNFFD3ND3NFN33FN33N)%_
#和
#F#,4$")%
"
*_)
NNN33N3FD3ND333NN3FDFD3F)%_
#&扩增
?=!
基因的引物为
M3DR
"
*_)FF3N3NNDF33NNN)
DF33FF)%_
#和
M3D2
"
*_)N3NN3ND3N3NNDN)
FDD3NFN)%_
#
!
!
结果与分析
!
角质层发育突变体
78A
9:
$
的分离
./,
01
#
突变体是从一个突变体的
R
!
代分离得
到!与野生型
N<8
"图
#
!
D
#相比!该突变体表现为生
长严重受阻!具体表现为叶片狭长!根部生长缓慢!
植物畸形矮小"图
#
!
O
#
!
78A
9:
$
中突变基因的鉴定
为了进一步研究
./,
01
#
并最终成功克隆该突
变基因!对该突变体进行了粗定位和精细定位!以确
定该突变基因在染色体上的位置
JN2
及凝胶电
泳分析发现!该突变基因与第
#
条染色体上的
NM#)
$+#
和
NM#)#"+$
分子标记连锁较为紧密单株分
析粗定位使用的
!$
株突变体植物!分别用分子标记
NM#)$+#
和
NM#)#"+$
进行
JN2
扩增用
NM#)$+#
鉴定的
!$
株植物中有
!
株在该位点为杂合子!重组
率为
4+%]
&用
NM#)#"+$
鉴定的
!#
株植物中有
&
棵
在该位点为杂合子!重组率高达
!4+&]
上述结果表
明
./,
01
#
突变基因与
NM#)$+#
连锁更紧密
为了更进一步确定突变位点在染色体上的位
置!在
NM#)$+#
和
NM#)#"+$
分子标记附近开发新
的合适的分子标记利用新的分子标记来进行
JN2
扩增!逐步缩小定位区间首先使用
NM#)*+#
和
NM#)4+"
对
./,
01
#R
%
代植物进行作图!挑出有
遗传交换的拟南芥植株!然后将挑出的植物分别利
用
NM#)*+#
*
NM#)&+"*
*
NM#)&+##
*
NM#)&+!,
*
NM#)&+*
*
NM#),+*
这
&
个分子标记继续作图利
用这些分子标记对
&#$$
株
R
%
代野生型拟南芥进
行精细定位分析!结果显示在
NM#)&+##
处出现
$
棵有遗传交换的拟南芥!在
NM#)&+!,
处出现
,
棵
有遗传交换的拟南芥为了更进一步缩小作图区
间!开发了
!
个具有酶切扩增多态性序列"
NDJL
#
的分子标记
NM#)&+#%
和
NM#)&+!"&
利用这
!
个
分子标记分别对
NM#)&+##
和
NM#)&+!,
挑出的植
#"##
&
期
!!!!!!!!!!!
高
!
原!等$拟南芥角质层发育突变体中
89:##
基因的分析与鉴定
物进行作图!在分子标记
NM#)&+#%
处产生了
%
个
单交换!在分子标记
NM#)&+!"&
处产生了
!
个单交
换通过以上实验最终将
./,
01
#
基因定位在分子
标记
NM#)&+#%
和
NM#)&+!"&
之间的
,& >^
区段
内在这
,& >^
区段内共有
!%
个基因!根据
3D12
网站"
@QQ
V
$%%
WWW+7S7>.P<
V
/./+=
#的相关信息分
析和预测!确定
89:##
为候选基因"图
!
#
对该候选基因进行测序!测序结果显示
./,
01
#
的
89:##
基因的第
,
个内含子与第
4
个外显子连
接处的
!#"&
位碱基由鸟嘌呤"
=
#变为腺嘌呤"
7
#!
即
Q
=
;7
=
F3N33
变为
Q
=
;77F3N33
"图
%
!
D
和
O
#根据以上测序结果推测!碱基突变可能影响
62CD
剪切对
./,
01
#
中
89:##
基因
;BCD
进
行测序!结果显示!
./,
01
#
中
89:##
基因的第
,
个内含子没有被剪切!即第
,
个内含子的全部
4#
个
图
!
!
./,
01
#
中突变基因的精细作图定位
图中从上往下是精细定位的顺序!作图使用的分子标记在
染色体上的相应位置均已标出&
!=#@#,4$"
是发现的突变基因
R.
=
+!
!
R.0K67
VV
.0
=
=
K0K.0./,
01
#
[7
V
/?S<6Q@KQ<
V
QV
SK/K0QQ@K67
VV
.0
=
+N@S<6V
Q@K67
VV
.0
=
7SK67S^KP+!=#@#,4$"./Q@K.PK0Q.?.KP6:Q70Q
=
K0K
图
#
!
./,
01
#
的表型及鉴定
D+
野生型
N<8
&
O+./,
01
#
&
N+
转
89:##
基因
./,
01
#
幼苗&
B+
甲苯胺蓝染色
R.
=
+#
!
J@K09V
K70P.PK0Q.?.;7Q.<001
#
D+N<8W.8PQ
9V
K
&
O+./,
01
#
&
N+./,
01
#/KKP8.0
=
W.Q@89:##
=
K0KQS70/?&
B+3<8:.P.0K>8:K/Q7.0.0
=
图
%
!
./,
01
#
中
89:##
基因的分析
D+89:##
基因的结构及在突变体
./,
01
#
中碱基的变化"小写字母表示内含子#&
O+
突变体
./,
01
#
中
89:##
基因的基因组
BCD
测序结果&
N+
野生型
N<8
和
./,
01
#
的
;BCD
序列及对应的氨基酸序列
"小写字母表示新增加的
;BCD
序列!红色表示突变引入的氨基酸序列#
R.
=
+%
!
D078
9
/./=
K0K.0./,
01
#
D+FK0K/QS:;Q:SK01
#
&
D/QKS./^ .0P.;7QK/Q@K
V
"
CV
SK/K0Q.0QS<0/
#&
O+LK
X
:K0;.0
=
SK/:8Q=
K0<6.;BCD=
K0K.0./,
01
#
&
N+;BCD/K
X
:K0;K/70PQ@K;V
<0P.0
=
76.0<7;.P/K
X
:K0;K/9V
KN<870P./,
01
#
"
CV
SK/K0Q
Q@K0KW8
9
7PPKP;BCD/K
X
:K0;K/70PQ@K8KQQKS/.0SKP;<8
9
Q@K6:Q7Q.<0
#
!"##
西
!
北
!
植
!
物
!
学
!
报
!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
%$
卷
图
$
!
89:##
基因转化
./,
01
#
互补结果
D+
转
89:##
基因
./,
01
#
的
JN2
分子标记鉴定"
#
"
4+
转
89:##
基因拟南芥&
NM#)*+#
和
NM#)&+!,
是
!
个鉴定用分子标记&
R
#
是
N<8
野生型和
AKS
野生型杂交子一代#&
O+./,
01
#
互补拟南芥基因型鉴定"上边为
JN2
扩增外源的
89:##
基因片段&下边为
JN2
扩增内源的
89:##
基因片段&
[+BA!"""
&
N<6+
转基因拟南芥#
R.
=
+$
!
N<6
V
8K6K0Q7Q.<001
#>
9
7W.8P)Q
9V
K89:##QS70/
=
K0K
D+1PK0Q.?.;7Q.<001
#QS70/?9V
K89:##U.7JN267S^KS/
"
#
"
4SK
V
SK/K0QQS70/?89:##.0!"#$%&
(
)%)
&
NM#)*+#70PNM#)&+!,7SK6<8K;:87S67S^KS/:/KP?01
#
&
R
#
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K0KS7Q.<0#&
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K.PK0Q.?.;7Q.<0V
8K6K0QKPQS70/
=
K0.;./,
01
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(
)%)
"
3@K:
VV
KS
V
70K8./Q@KJN276
V
8.?.;7Q.<0=
K0<:/89:##
=
K0K?S7
=
6K0Q
&
3@K8V
70K8./Q@KJN2
76
V
8.?.;7Q.<0=
K0<:/89:##
=
K0K?S7
=
6K0Q
&
[+BA!"""
&
N<6+3S70/
=
K0.;!"#$%&
(
)%)
#
碱基被留在成熟的
62CD
中"图
%
!
N
#这说明!由
于碱基突变使原有的
DF
剪切位点消失!导致内含
子无法被正常剪切
62CD
中引入的
4#
个碱基导
致该基因从第
$&#
位密码子开始!
62CD
序列发生
改变!并且翻译时引入了第
,
个内含子的前
&
个碱
基序列!随后翻译遇到终止密码子!发生无义突变!
导致翻译过程被提前终止"图
%
!
N
#
!
78A
9:
$
甲苯胺蓝染色分析
为了初步验证此突变体的突变基因为
89:##
!
将生长于
#
%
![L
培养基上
!"P
的
N<8
野生型和
./,
01
#
突变体用
"+"*]
"
8
%
;
#甲苯胺蓝染色结
果显示
./,
01
#
突变体整株被染成蓝色"图
#
!
B
#!
而
N<8
野生型除了根部和子叶被轻微染色!真叶部
分均未被染上色说明该突变体表面角质层有缺
陷!使得甲苯胺蓝溶液可以进入表皮内部甲苯胺
蓝染色结果初步证明
./,
01
#
突变基因为
89:##


!
78A
9:
$
突变体的
1%2$$
基因互补分析
为了进一步验证突变体
./,
01
#
中突变基因是
89:##
!克隆了含有自身启动子的
89:##
基因
由于
./,
01
#
突变体拟南芥只能在培养皿中生长且
生长发育严重受阻!故采用农杆菌侵染法将目的基
因转入
./,
01
#R
%
杂合型拟南芥中首先用分子标
记
NM#)*+#
和
NM)&+!,
对转基因植物进行初步
鉴定!从
$4
棵抗除草剂植物中筛选出
4
株在
NM#)
*+#
和
NM#)&+!,
为
N<8
纯合的转基因拟南芥植株
"图
$
!
D
#!从
4
棵筛选出的拟南芥中挑选
#
株进行
89:##
基因型鉴定
JN2
鉴定结果"图
$
!
O
#显示转基因拟南芥转
入了外源
89:##
基因!而作为对照的
./,
01
#
突变
体和
N<8
野生型拟南芥均无外源
89:##
基因对
图
*
!
89:##
基因半定量
23)JN2
分析
黑色三角指示连续
$
倍梯度稀释反转录
;BCD
的方向
R.
=
+*
!
LK6.)
X
:70Q.Q7Q.UK23)JN27078
9
/./3@K>87;^ QS.70
=
8K.0P.;7QK/Q@KP.SK;Q.<0/KS.78P.8:Q.<0V
Q.<0;BCD
该转基因互补拟南芥内源
89:##
进行测序!测序
结果显示转基因互补拟南芥中内源
89:##
基因在
./,
01
#
突 变 位 点 是 突 变 的 这 说 明 转 入
89:##
基因后
./,
01
#
突变体表型被恢复并生长
正常 "图
$
!
N
#上述结果进一步说明突变体
./,
01
#
中的突变基因是
89:##
!
./,
01
#
表型是由
89:##
突变造成的
!
78A
9:
$
中
1%2$$
基因
6CD%
含量
为了探究本实验中
89:##
基因无义突变对其
62CD
含量的影响!分别提取培养皿中相同生长条
件下的
./,
01
#
*转基因拟南芥和
N<8
野生型拟南芥
的
2CD
!进行半定量
23)JN2
分析!检测突变基因
89:##
的
62CD
含量
?=!
编码组蛋白
M
!
D
!
是一个持家基因因此!选取
?=!
基因作为对照
基因结果"图
*
#显示!
./,
01
#
中
89:##
的
62)
CD
水平比
N<8
野生型拟南芥低!约降低了
,*]
!说
明有很大一部分
62CD
被降解另外!转基因互补
%"##
&
期
!!!!!!!!!!!
高
!
原!等$拟南芥角质层发育突变体中
89:##
基因的分析与鉴定
拟南芥的
62CD
水平也有明显提高!这应该是由于
转入的一个野生型
89:##
基因导致的
%
!
讨
!
论
./,
01
#
是一个以
N<8
为背景的角质层发育缺
陷突变体!其具体表型为叶片狭长且生长缓慢本
研究通过图位克隆技术将该突变基因定位于拟南芥
第一条染色体
NM#)&+#%
和
NM#)&+!"&
这
!
个分
子标记之间
,& >^
区间内通过测序和甲苯胺蓝染
色实验以及遗传互补实验最终确定
./,
01
#
的突变
表型是由
89:##
突变引起的
ZON##
蛋白对于角质层的形成和蜡质的聚集
是至关重要的($)
O.SP
等($)报道了带有标签的
ZON##
蛋白定位于表皮细胞质膜上!这一结果推测
ZON##
蛋白在运输蜡质和构建角质层并形成正常
器官的过程中具有重要作用本研究的角质层突变
体
./,
01
#
在土中无法生长!只能生长在培养皿中!
但生长
#
个月后逐渐死亡推测原因可能是由于在
培养皿中水分充足且环境稳定!没有细菌等微生物
的侵染使得
./,
01
#
可以短暂生长!随后由于培养
皿中养分不足并且突变体本身弱小也无法提供足够
的养分!最终死亡另外!
./,
01
#
在发芽后的第一
个星期生长正常!具体原因还有待进一步研究
./,
01
#
突变体的有些表型不同于以往报道的
89:##
基因的突变体表型($!#!!#*)#&)!主要表现为叶
片狭长!生长缓慢以往报道的
89:##
基因突变
体均为
3)BCD
插入突变体!而本研究的
89:##
基
因突变体是由
5[L
诱变引起的单个核苷酸序列的
突变!并且这一突变造成
62CD
翻译过程中引入了
!
个氨基酸后被提前终止半定量
23)JN2
显示!
突变体
./,
01
#
中
89:##
基因的
62CD
含量与
N<8
中
89:##
基因
62CD
含量相比下降了约
,*]
已有研究(#,)#4)显示!在动物体内!基因的无义
突变会介导
62CD
的降解!使突变基因
62CD
水
平下降综合分析以上结果!这些差异可能是导致
./,
01
#
突变体表型较以往报道不同的原因
参考文献!
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