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Phylogeny of Poplar in Section Tacamahaca Species from Southwest China Based on Sequence Data of cpDNA Fragments and rDNA ITS

基于cpDNA和rDNA ITS片段分析西南地区青杨派杨树的系统发育与进化关系



全 文 :书西北植物学报!
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基金项目$国家林业公益性行业专项"
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#&国家自然科学基金"
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#&云南省教育厅基金"
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#&云南省中青
年学术与技术带头人后备人才培养基金"
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#
作者简介$李佳蔓"
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#!女!在读硕士研究生!主要从事林木遗传育种研究
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通信作者$何承忠!博士!教授!主要从事林木遗传育种与分子生物学研究
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云南省高校林木遗传改良与繁育重点实验室!西南林业大学!昆明
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西南地区生物多样性保育国家林业局重点实验
室!西南林业大学!昆明
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云南生物多样性研究院!西南林业大学!昆明
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西南山地森林资源保育与利用省部共
建教育部重点实验室!西南林业大学!昆明
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#

!
要$西南地区青杨派杨树种质资源丰富!可为杨树遗传改良提供珍贵的基因资源!但树种之间形态学差异细
微!该研究以山杨作为外类群!测定了西南地区及其他地区杨属青杨派
#+
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份样本的
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#基于叶绿体联合序列和
,-.
片段的杨属青杨派树种的平均遗传距
离分别为
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叶绿体联合片段的
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47
A
B.
系统树树型基本一致!青杨派树种可以划分为
!
组!第
#
组由青杨(三脉青杨(大青杨和辽杨构成&第
!
组中的小叶杨(小青杨(川杨(德钦杨(昌都杨(乡城杨(康定
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%
#基于
,-.
的系统树与叶绿体联合片
段构建的系统树差异不大!仅在于第
!
组中的小青杨与小叶杨(川杨等差异明显!与第
#
组中的树种紧密聚拢
关键词$西南地区&青杨派&叶绿体联合片段&
,-.
&系统发育
中图分类号$
C+02
文献标志码$
D
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早在
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首次就揭示了杨属"
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#的系统发生关系和种间遗传分化!且至今依
然是杨属植物分类学的基础!其系统发育模型包括
三亚属六派)#*经过一百多年的研究!现通常把杨
属划分为
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派!即白杨派"
);17;
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-!7!*!%
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;603
#(大叶杨派"
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#
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个派!中国拥有的青杨派树种最多!分布最广!其天
然种的数量占中国杨树天然种的一半以上)*其
中!西南地区"主要包括四川省(云南省和西藏东南
部#为杨属青杨派树种分布的富集区之一!其基因资
源丰富!特有种多!分布广!变异丰富!拥有大量的变
种和天然杂种!这些树种蕴含了许多优良种质资源!
为杨树遗传改良提供了珍贵的基因资源)$(2*但由
于青杨派树种派内种间极易进行自然杂交!产生了
大量的自然杂交种!而大树上的短枝叶变异大!使其
表型多样性丰富!造成了系统分类上很大的困
难)#"*另外!西南地区青杨派树种大部分处于野生
状态!其开发和利用尚未受到研究者及公众的普遍
认识!导致其基因资源在杨树遗传改良上应用较少
因此!开展杨树青杨派树种的系统发育关系研究!不
仅有助于杨属青杨派系统分类!也能够为杨属青杨
派树种资源的开发和利用提供前期基础
分子生物技术的兴起!为植物系统发育的研究
开辟了新的路径!使其在研究方法和策略上均发生
了变革)##*在高等植物基因组中!线粒体基因组进
化速率较慢!遗传分化较小!不适合用于系统发育分
析)#!(#%*!故在对植物的系统发育研究中!通常从核基
因组和叶绿体基因组中寻找合适的片段李岩
等)#)*以
%
株岩荞菜属"
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#植株作为外
类群!结合核糖体
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测序结果和
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数据
库中相应数据分析了同科菘蓝属"
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合并为
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序列可用于棘豆属
种间系统发育关系的研究狄红艳等)#&*以白花草
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#和黄花草木樨"
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评价了突尼斯沙漠中沙拐枣属"
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%
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个待
定种在
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片段联合后的分支图中均表现出良好的单
系性
单基因片段序列能提供的信息量有限!很多研
究已不再满足于用单一片段序列来进行系统发育的
研究!如
Z:8S-.
等)#0*利用来自叶绿体和核基因组的
%
个基因片段对被子植物进行系统发育的研究&
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等)#2*比 较 了 桉 树
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个 属 "
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结构特点!并通过构建
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树和
47
A
B.
树区分了桉
树的主要分支!同时证明了叶绿体基因组变异片段
能应用于低水平遗传距离物种间的研究这种采用
多基因序列进行系统发育重建的方法逐渐被广泛采
)###
西
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用!成为分子系统发育研究的一种基本方法)!"(!!*
目前对西南地区乡土杨树的分类学研究均是基
于表型特征而来!从分子生物学水平获得的依据相
对较少!仅陈珂)!%*和
7`/
等)!)*对其系统关系进行
了探讨基于此!本研究以西南地区杨属青杨派树
种为主体材料!
)
个北方青杨派树种和
#
份小叶杨
材料为补充材料!选取其叶绿体
!"
#
$%!"
#
&
(
"()%
$

*!"+

%
个片段及核糖体
,-.
片段!以探讨
西南地区杨属青杨派树种间的系统发育关系!为西
南地区杨属青杨派树种的系统分类和遗传改良提供
科学依据
#
!
材料和方法
?*?
!

!

杨属青杨派树种于
!"#!

2
月采集于云南省
西北部"香格里拉县(德钦县(维西县#(四川省甘孜
州"乡城县(稻城县(理塘县(雅江县(康定县(汉源
县#和西藏昌都地区"芒康县(昌都县(贡觉县#!
#

小叶杨样本来自于北京!小青杨(青杨和辽杨来自于
内蒙古!大青杨采自于吉林!包括青杨派
#+
个种%杂
种以及作为外类群的白杨派山杨!共计
%&
份样本
"表
#
#鉴于本研究主要研究种间系统发育关系!

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杨树样本采集地
J7=8B#
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J;B.76
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8B.-SB.:T/0
#
1213
编号
I:*
树种
Z
>
B9-B.
拉丁名
E7S-//76B
来源
Z:YR9B
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/97626!"!
#
#
云南香格里拉
Z;7/
P
R-(87
!
GY//7/
!)
缘毛杨
GY7/67:
A
7/
P
/97626!"!
#
!
云南香格里拉
Z;7/
P
R-(87
!
GY//7/
!$
藏川杨
K7/
P
9;Y7/
A
7/
P
/93>;781!(67!W7R*"6B;"67!
#
#
云南德钦
NB
_
B/
!
GY//7/
!&
藏川杨
K7/
P
9;Y7/
A
7/
P
/93>;781!(67!W7R*"6B;"67!
#
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四川雅江
G7
,
-7/
P
!
Z-9;Y7/
!+
小青杨
a-7:
_
-/
PA
7/
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3;140%36*0(66
内蒙古赤峰
O;-TB/
P
!
F//BR?:/
P
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青杨
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PA
7/
P
/97!"8!
:
!(!
内蒙古赤峰
O;-TB/
P
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F//BR?:/
P
:8-7
!2
大青杨
N7
_
-/
PA
7/
P
/913316;(363
吉林抚松
UY.:/
P
!
1-8-/
%"
辽杨
E-7:
A
7/
P
/9*!<6*0=67>66
内蒙古赤峰
O;-TB/
P
!
F//BR?:/
P
:8-7
%#
疑似藏川杨
/93>;781!(67!W7R*"6B;"67!
+ 西藏芒康
?7R^76
!
J-=BS
%!
疑似杂交杨
/0
#
1213.
>
*
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#
云南德钦
NB
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B/
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%%
疑似杂交杨
/0
#
1213.
>
*
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云南德钦
NB
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B/
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山杨
Z;7/
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#
云南德钦
NB
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B/
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GY//7/
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山杨
Z;7/
A
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!
云南维西
B`-]-
!
GY//7/
%&
山杨
Z;7/
A
7/
P
/94!5646!(!
#
%
西藏芒康
?7R^76
!
J-=BS
$###
&

!!!!!
李佳蔓!等$基于
9
>
NID

RNID,-.
片段分析西南地区青杨派杨树的系统发育与进化关系

@
!
扩增引物及来源
J7=8B!
!
@O>
R-6BR.7/V.:YR9B.Y.BV-/S;-..SYV
A
片段
UR7
P
6B/S
方向
N-RB9S-:/
引物
@R-6BR.B
_
YB/9B
"
$b
#
%b
#
退火温度
D//B78
%
c
文献
\BTBRB/9B
!"
#
$%!"
#
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#
$
!"
#
&
DOJOMODODODOJOOOJJJOO
MOJJJJDJMMDDMOJJJDDODDJ
$+
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"()%$
F

DJJJMDDOJMMJMDODOMDM
OMDDDJOMMJDMDOMOJDOM
$2
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*!"+
F

ODJOJDMDDDDDJJMMJJOD
JJJDDODODDMDDDMJOMDDM
$)
)
!+
*
,-.
,-.#
,-.)
JOOMJDMMJMDDOOJMOMO
JOOJOOMOJJDJJMDJDJMO
$+
)
!0
*
按照分层抽样理论!尽可能在种水平上较多选取材
料!而种内只随机选取单株
!
"
%
株采集杨树各样
株幼嫩叶片!变色硅胶干燥保存!带回实验室备用
?*@
!
实验方法
?A@A?
!
*9B
扩增与测序
!
硅胶干燥后的样株叶片
经冷冻混合球磨仪研磨后!采用
ZNZ
法并稍加改
良!提取基因组总
NID
!用
"*&d
琼脂糖凝胶电泳
和核酸检测仪共同检测
NID
的浓度和纯度!稀释
至所需浓度"
$"
"
#""/
P
%
$
E
#后于
!"c
冰箱中
保存
选取在物种系统发育分析中应用较广的叶绿体
!"
#
$%!"
#
&
(
"()%$

*!"+ %
个片段!及核糖体
,-.
片段进行扩增!引物序列及来源见表
!
扩增
反应总体系为
!$
$
E
!其中正反引物各
#
$
E
"浓度为
$
>
6:8
#!
NID
模板
#
$
E
!
e-!
?
?7.SBR?-]#!*$
$
E
!去离子水
2*$
$
E

@O反应条件$
2)c
预变性
)6-/
&
2)c
变性
%".
!退火
)$.
"退火温度因引物而
异#!
+!c
延伸
#6-/
!共
%$
个循环&
+!c
总延伸
#"
6-/
扩增产物送往北京华大基因科技股份有限公
司进行纯化和测序
?*@*@
!
数据分析
!
所得序列采用
4-:BV-S+*"2

件)!2*进行序列的拼接和人工校对!使用
O8Y.S78a
#*0
)
%"
*进行多序列的对比!利用
?5MD$*"!
)
%#
*对序
列的长度(碱基组成和位点特性进行分析!通过
Q-6YR7!(
>
7R76BSBR
"
Q!@
#模型计算种间遗传距离

@DH@)=#"
软件)%!*对
%&
份供试材料的
!
#
"$%!"
#
&
(
"()%$
(
*!"+
(
,-.
片段进行非一致性
长度检验"
FEN
检验#!只有当
/
$
"*"$
时才能对序
列进行合并采用
@DH@
软件的
?@
法和
?R(
=7
A
B.%*#*!
软件的
47
A
B.
法构建系统发育树!其
中!
?@
采用
#"""

=::S.SR7
>
循环)%%*检验各分支
的支持率!并计算树长"
EB/
P
S;
#(总一致性指数
"
OF
#(总存留指数"
\F
#和尺度化后的一致性指数
"
\O
#&
47
A
B.
的模型选择是通过
?:VB8SB.S%*+
)
%)
*
比较分析!以
DFO
为准则进行筛选确定!采用马儿
科夫链的蒙特卡洛法"
?7R^:W9;7-/?:/SBO7R8:
@R:9B..
#!以随机树为起始!运行
#""""""
代!每
#""
代抽样
#
次!舍弃
!$""
个老化样本"占
!$d
#
后!以剩余样本构建一致树
!
!
结果与分析
@*?
!
基因序列的差异分析
由表
%
可看出!
%&
份杨树材料的
!"
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$%!"
#
&
(
"()%$

*!"+
片段的平均长度分别为
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"
&"$
"
&%)
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22$
"
2$+
"
#"#"
#和
0#2=
>
!其中
"()%$
片段
序列包含的变异位点和信息位点数最多!分别为
#!
个和
0

%
个叶绿体片段联合后的长度为
!%0#
"
!)&%=
>
!平均长度为
!))%=
>
!其中!变异位点
!2
个!信息位点
#$
个!
MfO
含量为
%#*&d

,-.
片段的长度范围为
&%$
"
&)$=
>
!平均长度为
&)!
=
>
!含有变异位点
#2
个!信息位点
#+
个!
MfO

量为
&$*$d


C
!
$#
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6+$#
5
7
(
#(/8+6
(
3$#9
(
120
片段的序列特征
J7=8B%
!
O;7R79SBR-.S-9.:TS;B!"
#
$%!"
#
&
!
"()%$
!
*!"+7/V,-..B
_
YB/9B.
序列特征
O;7R79SBR-.S-9:TS;B.B
_
YB/9B
叶绿体片段
O;8:R:
>
87.STR7
P
6B/S
!"
#
$%!"
#
& "()%$ *!"+ O:6=-/7S-:/
,-.
序列长度
EB
P
S;
%
=
>
&"$
"
&%) 2$+
"
#"#" 0#2 !%0#
"
!)&% &%$
"
&)$
MfO
%
d !0*& %!*& %!*0 %#*& &$*$
变异位点
g7R-7=8B.-SB. 0 #! 2 !2 #2
信息位点
F/T:R67S-WB.-SB. % 0 ) #$ #+
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西
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李佳蔓!等$基于
9
>
NID

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片段分析西南地区青杨派杨树的系统发育与进化关系
@*@
!
杨树青杨派树种的遗传距离分析
以青杨派
#+
个种和杂种及外类群山杨的
9
>
N(
ID

,-.
序列做为数据分析的基础!采用
?5MD
软件的
Q!@
模型计算树种之间的遗传距离"表
)
#
基于叶绿体联合片段的遗传距离表明!除去疑似种和
外类群!青杨派树种的平均遗传距离较小!为
"*""#%
!可分为
!
组三脉青杨(青杨(大青杨和辽

)
个树种共同组成第
#
组!组内树种的遗传距离在
"*""""
"
"*""#+
之间&剩余树种为第
!
组!组内遗传
距离较小"
*""""
"
"*"""&
#&
!
个组树种间的遗传距
离在
"*""!$
"
"*"")"
之间
,-.
序列间的平均遗
传距离为
"*""%&
!同样可分为
!
组!分组情况与叶绿
体联合片段类似!第
#
组仅多了小青杨!组内遗传距
离较小"
*""""
"
"*""%!
#!第
!
组"不含小青杨#的
组内遗传距离较大"
*""""
"
"*"##"
#
@*C
!
杨属青杨派树种的系统发育分析
单独分析叶绿体
!"
#
$%!"
#
&
(
"()%$

*!"+
片段的系统发育树!其支持率和分辨率均较低!通过
FEN
检测后发现!
%
种片段具有极高的同质性"
/h
#*""
$
"*"$
#!因此!合并后的联合片段可以用于系
统发育分析其中!
?@
树的一致性指数"
OF
#为
"*2"2#
!保持性指数"
\F
#为
"*2&2!
!存留一致性指
数"
\O
#为
"*00##
&
47
A
B.
树的最佳进化模型为
$0#
f,
用两种方法得到的系统树树型相似"图
#
和图
!
#!均先分离作为外类群的
%
株山杨!然后将青杨派
树种分为
!
个分支!第
#
分支包括青杨(辽杨(大青
杨(三脉青杨和疑似藏川杨的天然杂种!其置信值达
0%d
"
?@
树#和
#""d
"
47
A
B.
树#!其中!青杨和辽
杨具有极高的相似性!
?@

47
A
B.
的置信值分别

2)d

#""d
&其余
!&
株青杨派树种构成第
!


#
!
基于
!"
#
$%!"
#
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(
"()%$
(
*!"+
片段杨属青杨派树种
的最大简约树
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$"d
的置信值"
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的贝叶斯树
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的置信值"后验概率#
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:WBR$"d

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基于
,-.
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节点处仅显示超过
$"d
的置信值"后验概率#
U-
P
*)
!
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A
B.-7/SRBB-/.B9S*-!7!*!8!7!:T/0
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"
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A
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7RBRB
>
:RSBVT:R
/:VB.:WBR$"d
支"
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树和
47
A
B.
树的置信值分别为
&)d

2&d
#!其中!缘毛杨(疑似杂交种和
#
株川杨个体位
于第
!
分支的基部!而小叶杨(滇杨(小青杨(川杨"
#
个个体#(藏川杨(乡城杨(康定杨(西南杨(昌都杨和
德钦杨则以姐妹种的形式聚类!其分支互为平行支!
表明这
#"
个种之间的系统关系不够明确
基于
FJZ
片段的
?@
树"
OFh"*0&%&
!
\Fh
"*2$0%
!
\Oh"*0!++
#和
47
A
B.
树"最佳进化模型

-If,
#的分析表明!两种系统树均表明所有青
杨派树种聚在一起!与外类群山杨明显分离!而青杨
派树种也分为
!
个分支!其中辽杨(青杨(小青杨(大
青杨和三脉青杨为第
#
分支!位于系统树的基部!
?@
树和
47
A
B.
树的置信值分别为
$%d

+#d

其余的树种构成第
!
分支!位于系统树的顶部!其
?@
树和
47
A
B.
树的置信值分别为
$"d

2&d

在第
!
分支中!
?@
树"图
%
#和
47
A
B.
树"图
)
#的树
型有一定的差异!其中
?@
树首先分出
!
株小叶杨!
最后分出
%
株昌都杨和
#
株疑似藏川杨的天然杂
种!而
47
A
B.
树中! 株小叶杨个体以
+%d
的置信值
聚类后!再与其他杨树个体呈姐妹种关系相聚由
此可见!基于
,-.
序列依然不能够明确第
!
分支树
种之间的系统关系
%
!

!

CA?
!
青杨派杨树
$
%
&(

120
片段的序列特征
高等植物细胞中具有
%
个基因组!即核基因组(
叶绿体基因组和线粒体基因组!由于陆地植物的线
粒体基因进化速率相对较慢!并不适合用于系统发
育的研究!故而对植物的研究主要集中于核基因组
和叶绿体基因组)%$(%+*卫尊征等)%0*对杨属
)

#+
个主要栽培种及杂种共计
!&
个单株的
"()%$
间隔
区序列进行了研究!其结果显示!
!&
个单株基因
2###
&

!!!!!
李佳蔓!等$基于
9
>
NID

RNID,-.
片段分析西南地区青杨派杨树的系统发育与进化关系
"()%$
间隔区序列的长度为
++#
"
0##=
>
!对齐后
长度为
0$+=
>
!具有
)&
个变异位点!
%%
个信息位
点而本研究中!
"()%$
片段的长度为
2$+
"
#"#"
=
>
!对齐后为
22$=
>
!变异位点
#!
个!信息位点
0
个!与前者所报道的结构具有一定的差异!主要原因
可能为取材不同"前者包含杨属
)
个派!本研究仅为
青杨派树种#(外类群"前者为同科不同属的蒿柳和
极地柳!本研究为同属不同派的山杨#和序列片段范
围"前者根据序列自行设计
0""=
>
左右的引物!本
研究采用
J7=BR8BS
开发的通用引物#的选择不同
,-.
为核糖体
NID
"
/RNID
#的转录间隔区序
列片段!由于其进化速率快而被广泛应用于属和属
以下分类阶元的系统发育研究中)!0!%2()#*如
D=(
V:87;<7VB;
等)!*以杨树
!
个种为外类群!构建了柳

$$
个种
&!
个样
,-.
片段的
?@
树和
47
A
B.

G:.S
等)%*利用
,-.
片段分析景天科"
OR7..Y879B(
7B
#仙女杯属"
J142;
:
!
#二倍体物种的系统发育和
三倍体物种的进化起源!结果表明二倍体物种虽可
分成
)
个分支!但很多种间关系尚不能确定!三倍体
物种
,-.
片段上的信息量也不足以解决其起源问
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列片段范围选择的不同造成的
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西南地区青杨派树种系统进化关系
中国西南地区既有高原平面又有高山峡谷!地
形地貌复杂!立体气候和环境多样!冰川活动!人文
地史条件独特!特别是横断山区以山川骈列!南北走
向!在第四纪冰期来临时!为植物的退避提供了优异
的条件!为主要分布于北半球温带和寒带的杨树退
避提供了通道)$*因此!使该区孕育了丰富的生物
资源!杨树种类之多!性状变异之丰富!是世界其他
地方少有的)+*然而!据现有资料报道!西南地区分
布的青杨派乡土杨树既有广布树种!如小叶杨(青
杨(滇杨(川杨(藏川杨等!也有地域性较强的窄布树
种"或称为地方小种#!如德钦杨(康定杨(乡城杨(西
南杨(三脉青杨(昌都杨等!且其形态特征一般与广
布树种十分相似!仅存细微差异!如西南杨与青杨相
似!仅是西南杨的枝(叶(果序和果均密被毛&乡城杨
与川杨相似!仅是乡城杨的小枝(叶柄(叶脉和果序
轴均被毛)!!&!)$*
不可否认的是!形态特征的差异是经典分类学
中划分植物不同种类的重要依据!而微小的差异也
可能是同一物种在异质环境条件中长期进化的适应
性表现尤其是中国西南地区!物种分布区域的山
脉阻隔特点突出!地势高峻!冰川作用强烈)&*而
冰川作用更是促进植物演化的主要动力!每次冰期
气候来临!植物在寒冷气候作用下必然不断地产生
适应性!以新的形态(结构和习性适应新的环境由
此引出的问题是!当前西南地区分布的特有杨树种!
是否由于气候条件的变化(因地理隔离和地域间气
候条件的差异而由原来的广布树种在形态特征等方
面产生适应性+ 赵能等)0*依据表型性状将西南杨归
为康定杨的变种而
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等)!)*利用
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标记和
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缘关系进行了分析!结果表明西南杨可能并非康定
杨的变种!而是康定杨和青杨的自然杂交种本研
究对西南地区杨属青杨派树种的研究结果表明!基
于叶绿体基因组
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杨(川杨(德钦杨(昌都杨(乡城杨(康定杨(西南杨(
滇杨(藏川杨以姐妹种的形式共同聚为一个分支!之
间的系统关系不能确定他们与缘毛杨的遗传关系
较近!但却与青杨(三脉青杨(大青杨(辽杨所构成的
分支遗传关系较远基于
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A
B.

统树与叶绿体基因组联合片段的系统树差异不大!
其主要不同在于小青杨与青杨(辽杨等杨树紧密聚
在一起!表明小青杨很可能为青杨派
!
个分支树种
所产生的古老自然杂交种
通过比较形态学特征和系统进化关系发现!有
些形态特征相似的树种在系统树中紧密聚类!如乡
城杨(德钦杨(昌都杨(康定杨(藏川杨(川杨(滇杨
等!但地方小种如德钦杨(康定杨(乡城杨等是否为
广布树种小叶杨(川杨(藏川杨(滇杨等的一种环境
适应型尚不能确定!有待进一步研究此外!青杨与
川杨(滇杨(西南杨等树种之间!三脉青杨和小叶杨
之间的形态特征相近!但从遗传关系来看!无论是基
于叶绿体基因组(还是核基因组
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片段!都表明
他们之间具有明显的差异!这很可能是杨属派内种
间频繁地自然杂交现象所导致
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综上所述!西南地区青杨派乡土树种之间的遗
传关系较为复杂!虽然赵能等)&(2*经过长期研究!基
于形态特征建立了西南地区乡土杨树的分类系统!
但从分子生物学方面开展的研究却较少本研究基
于叶绿体基因组
%
个片段的联合和核基因组
,-.
序列分析了该区域青杨派树种的系统进化关系!初
步将西南地区青杨派树种归为
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个分支!第
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分支
为采集于该地区的小叶杨(滇杨(川杨(藏川杨(乡城
杨(康定杨(西南杨(昌都杨(德钦杨!第
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分支为三脉
青杨!但每个分支内的树种系统关系仍不能够明确!
需要借助更多的分子生物学技术深入地开展研究
参考文献!
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