全 文 ：书西北植物学报!
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文章编号$
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-
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收稿日期$
!"#%)")!*
&修改稿收到日期$
!"#$)"#)!*
基金项目$农业部公益性行业"农业#科研专项"
!"""%""!)"$
#&国家高技术研究发展计划"
!"##11#"1#"$
#&现代农业产业技术体系建设
专项"
2134)#%
#
作者简介$鲁美宏"
#55(
#!女!在读硕士研究生!主要从事作物遗传育种研究
6)78.9
$
#5!5%%!,#"
!
#,%+:;7
"
通信作者$孙万仓!博士!教授!主要从事油菜育种及十字花科种质资源研究
6)78.9
$
#5!%#!#5&#
!
#,%+:;7
白菜型冬油菜不育系
$%&(
花器生理生化
特性及其雄蕊发育特征研究
鲁美宏!孙万仓"!孔德晶!杨宁宁!刘自刚
"甘肃省油菜工程技术研究中心&甘肃省作物遗传改良与种质创新重点实验室%甘肃省干旱生境作物学重点实验室&甘肃农业大
学 农学院!兰州
*%""*"
#
摘
!
要$以白菜型冬油菜(陇油
5
号)
<
(陇油

号)杂交后代中选育出的不育系
=32>4
!以及代表性甘蓝型油菜不
育系"
?%1
*
?,51
*
@;9#"1
#和它们的保持系为材料!研究
=32>4
在盛花期花蕾和花中
@AB
*
4AB
*
21C
活性和可
溶性蛋白含量*过氧化物酶"
@AB
#同工酶谱变化特征及其雄蕊败育过程结果显示$"
#
#所有参试材料花朵中
@AB
活性普遍高于花蕾"
!
#不育材料
@AB
活性高于保持材料!甘蓝型不育材料
@AB
活性较保持材料增加幅度大于
=32>4
与(陇油

号)!
=32>4
花蕾与花的
@AB
活性分别较保持系材料(陇油

号)高出
#&+"D
和
+"D
&不育材
料花的
21C
活性高于保持系材料
5D
"
!%D
!而其花蕾的
21C
活性低于保持系材料
!&D
"
$%D
!
=32>4
与其
它不育材料间无显著差异&不育系材料花
4AB
活性低于保持系材料
#&D
"
!&D
!
=32>4
与其它不育材料无显著
差异!其花蕾
4AB
活性高于保持材料
,D
"
##!D
!但
=32>4
增加幅度低于其它不育材料&保持系材料花蕾与花
中蛋白质含量为
"+"#$
"
"+"!"7
E
%
E
!不育系材料花蕾与花中蛋白质含量为
"+"#!
"
"+"#,7
E
%
E
!所有不育材料蛋
白质含量均低于保持材料"
%
#
=32>4
的
@AB
同工酶谱在花中较对应的可育系(陇油

号)和其它甘蓝型雄性不
育多
#
条迁移率"
!
"
#为
"+,!%
的条带"
$
#
=32>4
雄蕊败育起始于造孢细胞期!造孢细胞粘连!无核仁!绒毡层未
发育!为无花粉囊型不育研究表明!
=32>4
与其他类型油菜不育系有着不同的遗传背景!是一个新的白菜型冬
油菜不育类型
关键词$冬油菜&细胞质不育&生理生化&雄蕊发育
中图分类号$
F$&+,
&
F$$+&5
文献标志码$
1
)*
+
,#"-#".*/0#.12&*131.4/3#,4#.,15!(410/56/7/2"
8
0/54&*131.4/3#,4#.,
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8
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"
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4AB
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T8
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Y
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Q
98/7.:789H/THS.9H
"
2>4
#&
Q
I
Y
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EY
80RX.;:IH7./TS
Y
&
/T87H0RHWH9;
Q
)
7H0T
!!
雄性不育克服了人工去雄杂交的困难!使杂交
变得容易*简单*方便!为生产上利用杂种提供了有
力工具!成为农作物利用杂种优势研究的重要内容
油菜是成功利用杂种优势的大田作物之一油菜雄
性不育的研究主要集中在甘蓝型油菜方面!且生产
上以傅廷栋
#*!
年发现的细胞质雄性不育系
@;9:)
7/
为主+#,!芥菜型油菜在中国也已实现-三系.配
套+!,白菜型油菜的雄性不育研究也开展较早!四
川省农业科学院最先报道了白菜型油菜细胞质雄性
不育材料!并育成了(天
1
)不育系与(阿油
1
)不育
系+%,胡宝成等+$,报道了白菜型油菜细胞质雄性不
育材料"
5#""5<
托品#!陈凤祥等+&,利用白菜型油菜
品种(广丰油菜)中的雄性不育株通过测交*选择和
回交!创制了白菜型雄性不育材料(广丰
1
)白菜
型油菜的早熟性及其对旱*涝*冻等的特殊适应能
力!在多熟制中有着甘蓝型油菜难以替代的作用
由于存在自交不亲和以及选育恢复系困难等问题!
白菜型油菜雄性不育材料尚未应用于生产+,,
过氧化物酶不仅与组织的呼吸和物质的氧化等
生理生化过程密切相关!同时又在呼吸代谢和氧自
由基清除中有积极功能超氧化物歧化酶和过氧化
氢酶能清除植物代谢中产生的氧自由基!防止活性
氧在植物体内积累过多导致脂膜受损超氧化物歧
化酶是活性氧清除系统的重要保护酶之一!它能有
效地阻止高浓度氧的积累!防止膜脂的过氧化!使植
物维持正常的生长和发育抗氧化物酶与雄性不育
有一定关系蒋培东等+*,对棉花不育系花蕾发育的
研究发现!不育系中超氧化物歧化酶的活性下降!致
使活性氧水平升高!导致膜脂过氧化!从而引起雄性
不育&但余筱南等+5,报道!不育系花蕾中超氧化物歧
化酶活性水平高于可育系!认为这是不育系对其体
内活性氧水平升高的应答反应过氧化氢酶在清除
和维持植物体内活性氧的水平及光呼吸中起作用!
而且分解过多的活性氧!减轻对植物产生伤害!从而
维持膜的稳定性在雄性不育花器中膜脂的破坏比
可育花器中的要快许多+,可溶性蛋白包含了各种
酶原*酶分子和代谢调节物!在花药和小孢子的发育
过程中具有决定意义研究发现油菜
2>4
不育系
和保持系之间的
@AB
同工酶谱带存在差异!且不同
不育系之间酶谱条带的差异说明两者之间的遗传背
景不同!为两个不育系的比较研究提供了证据据
报道!酶类活性的变化会引起花粉粒内新陈代谢紊
乱!最后导致蛋白质合成减弱或停止!影响小孢子的
发育而造成雄性不育+#",
另外!雄性不育与花药发育关系密切!余凤群
等+##,*杨光圣等+#!,通过对多个油菜可育品种研究!
将可育油菜的花药发育过程分为孢原细胞时期*造
孢细胞时期*花粉母细胞减数分裂至四分体时期*单
核花粉期*二细胞和三细胞花粉期等&并且根据败育
时期的不同!将多个油菜不育系分成无花粉囊型*花
粉母细胞败育型和单核花粉败育型等
%
类陈平
平+#%,发现转基因雄性不育系(湘
#&1
)的败育发生
在四分体至小孢子期!属单核花粉败育型&董军刚
等+#$,研究发现甘蓝型油菜生态雄性不育系
&%%4
花
药不能形成正常的孢原细胞!属无花粉囊败育型&危
文亮等+#&,的观察表明!来自甘蓝型油菜和埃塞俄比
亚远缘杂交后代的甘蓝型油菜雄性不育系
J28
花
药败育发生在单核晚期本研究以强冬性白菜型冬
"#&
西
!
北
!
植
!
物
!
学
!
报
!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
%$
卷
油菜(陇油
5
号)和(陇油

号)杂交后代中发现的细
胞质雄性不育材料
=32>4
为试验材料!通过对其
花器生理生化特征及雄蕊发育特性的观察!为白菜
型冬油菜雄性不育材料的选育提供理论依据
#
!
材料和方法
?+?
!
材
!
料
白菜型冬油菜不育材料
=32>4
和可育系(陇
油

号)&甘蓝型油菜不育材料(
@;9#"1
)*捷克引进
的(捷甘
%1
)*(捷甘
,51
)以及保持系材料(捷甘
%_
)*(捷甘
,5_
)试验材料均由甘肃农业大学提
供!种植于兰州市沙井驿!每个材料种
$7
!
!
%""
株!
田间管理同大田生产
?+@
!
测定指标及方法
?+@+?
!
不育系和可育系保护酶性活性
!
在盛花期
取
"+!
E
花蕾与花朵的鲜样!立即放入冰槽!在冰浴
下匀浆!
#!"""S
%
7.0
下离心
#"7.0
!取上清液用于
保护酶活性测定过氧化物酶"
@AB
#活性测定采
用愈创木酚法+#,,!以每分钟吸光度值
1
$*"
变化
"+#
为一个相对酶活单位"
G
#!计算植物组织内过氧化
物酶活力的大小!表示为
G
%
E
超氧化物歧化酶
"
4AB
#活性测定采用
J_C
光还原法+#*,!以每
#+"
E
鲜样抑制
J_C
光化还原
&"D
为一个酶活单位
"
G
#!表示为
G
%
7
E
过氧化氢酶"
21C
#活性测定
采用紫外吸收法+#*,!以每分钟
1
!$"
下降
"+#
为一个
酶活单位"
G
#!并计算过氧化氢酶活力的大小!表示
为
G
%
E
可溶性蛋白含量用考马斯亮蓝
M)!&"
法
测定!单位表示为
7
E
%
E
+
#*
,

?A@A@
!
不育系与可育系
)B6
同工酶分析
!
取样方
法同
#+@+?
!用
Q
`*+5
的磷酸缓冲液"含
141
*
6B)
C1)J8
!
#在冰浴下匀浆!
#!"""S
%
7.0
下离心
#"
7.0
!取上清液于
(!"a
冰箱中保存备用采用聚
丙烯酰胺凝胶电泳!分离胶和浓缩胶浓度分别为
*D
和
$D
!
Q
`
分别为
5+5
和
,+5
电极缓冲液用
CS./)
甘氨酸系统"
Q
`5+%
#上样量为
%"
#
=
电泳
开始时!稳压
#""b
!样品过浓缩胶后调制成
!""b
!
电泳时间约
&I
电泳完成后放入染色液"联苯胺
溶液#中染色直至可见清晰的蓝色条带!流水冲洗
后!照相保存迁移率
!
"
为原点到条带的迁移距
离%原点到指示剂的距离
?+@+C
!
不育系与可育系雄蕊发育细胞学观察
!
细
胞学观察采用石蜡切片法在现蕾期!取不育与可
育的材料并按其不同大小"花蕾直径
#
"
!77
*
%
"
$77
*
&
"
,77
#分装于事先配好的
1^1
"
*"D
乙
醇
c
甲醛
c
冰乙酸
d"c&c&
#固定液中!固定时长
大于
!$I
!于
$a
保存!各梯度体积分数酒精脱水!
二甲苯透明!石蜡"熔点
$*a
"
$a
#包埋!切片!
蛋白粘片!自然条件通风处放置
%R
脱蜡!苏木精染
色!显微镜观察并照相在显微镜下观察小孢子发
生和花粉的败育过程!并进行比较!以确定不育系的
败育时期和细胞学特征
!
!
结果与分析
@A?
!
$%&(
不育系和保持系花器形态比较
图
#
显示!
=32>4
与保持材料花器特征差异
明显!
=32>4
花瓣瘦长皱缩!基部皱缩尤为明显&
且雄蕊退化!长度约为雌蕊的一半左右!花药空瘪*
瘦小&柱头发育正常!略弯曲
图
#
!
白菜型冬油菜(陇油

号)"
1
#及
不育系
=32>4
"
_
#的形态比较
.^
E
+#
!
CIHU9;[HS7;S
Q
I;9;
EY
:;7
Q
8S./;0
XHT[HH0#$%&&(%[.0THS;.9/HHRS8
Q
H
(
=;0
EY
;V
)"
1
#
80R=32>4
"
_
#
2>4
@A@
!
各油菜不育系和保持系花蕾和花朵中保护酶
活性*可溶性蛋白含量比较
@A@A?
!
)B6
活性
!
测定结果"图
!
!
1
#显示!不育
材料"
=32>4
*
?%1
*
?,51
#
@AB
活性高于保持材
料"(陇油

号)*
?%_
*
?,5_
#!甘蓝型不育材料
@AB
活性较保持材料增加幅度大于
=32>4
和(陇油

号)!
=32>4
花蕾与花
@AB
活性较保持材料(陇油

号)高
#&+"D
与
+"D
但不同不育系之间花朵
中
@AB
活性相差不大
@A@A@
!
(B6
活性
!
从
4AB
活性测定结果"图
!
!
_
#
来看!不育材料"
=32>4
*
?%1
*
?,51
#花中
4AB
活
性低于保持材料"(陇油

号)*
?%_
*
?,5_
#!而花蕾
4AB
活性高于保持材料!不育材料花蕾
4AB
活性
较保持材料高
,D
"
##!D
!
=32>4
增加幅度低于
其它不育材料&花中
4AB
活性较保持材料低
#&D
"
!&D
!
=32>4
与其它不育材料"
?%1
*
?,51
*
@;9#"1
#在花蕾中无显著差异
@A@AC
!
&=D
活性
!
测定结果"图
!
!
2
#显示!不育材
料"
=32>4
*
?%1
*
?,51
#花中
21C
活性高于保持
##&
%
期
!!!!!!!
鲁美宏!等$白菜型冬油菜不育系
=32>4
花器生理生化特性及其雄蕊发育特征研究
材料"(陇油

号)*
?%_
*
?,5_
#!而花蕾
21C
活性
低于保持材料!不育材料花中
21C
活性较保持材
料高
5D
"
!%D
!花蕾
21C
活性较保持材料低
!&D
"
$%D
!
=32>4
与其它不育 材 料 "
?%1
*
?,51
*
@;9#"1
#无显著差异
@+@+E
!
可溶性蛋白含量
!
图
!
!
B
显示!保持材料
"(陇油

号)*
?%_
*
?,5_
#花蕾与花中蛋白质含量
在
"+"#$
"
"+"!"7
E
%
E
!不育材料"
=32>4
*
?%1
*
?,51
*
@;9#"1
#为
"+"#!
"
"+"#,7
E
%
E
!所有不育材
料蛋白质含量均低于保持材料
综上结果可知!白菜型冬油菜雄性不育系
=32>4
与其保持系(陇油

号)相比!花蕾和花中
的
@AB
*
4AB
和
21C
活性及可溶性蛋白含量表现
出明显的差异!这些生理生化指标可能受花发育的
影响!而在花蕾和花中表现出不同程度的升高或降
低趋势但不育系
=32>4
与其他不育系材料
?%1
*
?,51
*
@;9#"1
在
@AB
*
4AB
和
21C
活性以
及可溶性蛋白含量上均没有显著差异
@AC
!
$%&(
不育系花蕾和花朵中
)B6
同工酶酶
谱特征
通过对白菜型和甘蓝型的不育系及可育系的花
蕾和花的
@AB
同工酶酶谱分析表明"图
%
#!甘蓝型
油菜
?%1
*
?,51
*
?%_
*
?,5_
*
@;9#"1
在花蕾和开
放的花中带型虽一致!但对应的酶带染色深浅明显
不同!酶带染色深者活性相对较强!并以花朵中酶活
性较强这可能是由于花在开放过程中新陈代谢加
强!从而促进花中酶活性提高其中!白菜型冬油菜
不育系
=32>4
与甘蓝型不育系
?%1
*
?,51
*
@;9#"1
的
@AB
同工酶谱不同!主要表现在酶带数目不同"带
型不同#!多了
#
条迁移率"
!
"
#为
"+,!%
的迁移率最
图
!
!
各类型不育系和保持系花蕾和花朵
@AB
*
4AB
和
21C
活性以及可溶性蛋白含量比较
=+
可育材料(陇油

号)&
=2>4
*
?%1
*
?,51
*
@;9#"1+
不育系&
?%_
*
?,5_+
保持系
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E
+!
!
@AB
!
4AB
!
21C8:T.W.T.H/80R/;9VX9H
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!
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图
%
!
不育系与保持系花蕾与花的
@AB
同工酶酶谱图"
1
#及其模式图"
_
#
8+
(陇油

号)&
X+=32>4
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R+?%1
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H+?,5_
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U+?,51
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E
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花蕾&
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花朵
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西
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北
!
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!
物
!
学
!
报
!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
%$
卷
图
$
!
可育材料(陇油

号)*
?%_
和
?,5_
花药发育过程
1+
孢原细胞时期!
<$"
&
_+
造孢细胞时期!
<$"
&
2+
减数分裂时期!
<#""
&
B
*
6+
四分体时期!
<$"
&
^
*
M+
花药单细胞期 "箭头所指为正在解体的绒毡层#!
<$"
&
`+
花粉成熟期!
<#""
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E
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!
<$"
&
2+CIH7H.;/.//T8
E
H
!
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&
B
!
6+CIHTHTS8R/T8
E
H
!
<$"
&
^
!
M+CIH80TIHS/
8TTIH7;0;0V:9H8S:H9/T8
E
H
"
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&
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Q
;9H078TVS8T.;0/T8
E
H
!
<#""
快的酶带!且
!
"
为
"+$&
的谱带为所有不育系共
有&
=32>4
与(陇油

号)的酶谱带也明显不同!主
要表现在
=32>4
比(陇油

号)也多了一条
!
"
为
"+,!%
的迁移率最快的酶带
@AE
!
$%&(
及其它不育材料雄蕊发育细胞学比较
@AEA?
!
可育材料
!
本研究观察结果表明!可育保持
材料雄蕊发育有以下几个时期$"
#
#孢原细胞时期$
(陇油

号)*
?%_
*
?,5_
花蕾横切面上可见
#
个雌
蕊和
,
个雄蕊!雄蕊呈椭圆形或肾形!细胞染色均
匀!雄蕊内无子房腔的分化"图
$
!
1
#"
!
#造孢细胞
时期$花药横切面呈蝶形!绒毡层不易辨认&花粉囊
内的细胞连成一片均被染色!染色深浅一致"图
$
!
_
#"
%
#花粉母细胞减数分裂至四分体时期$早期
的花粉母细胞仍然相互连成一片!但比起造孢细胞
时期略为分散!各个细胞的胞间层逐渐溶解!细胞之
间的间隔隐约可见"图
$
!
2
#花粉母细胞和周围的
细胞在形态*界限上区别明显!花粉母细胞趋近花粉
囊中央!与绒毡层细胞在空间上区分开来"图
$
!
B
#
四分体时期绒毡层细胞呈四边形且染色较深!规则
地贴着药室内壁排列"图
$
!
6
#"
$
#单核花粉粒早
期$花粉粒细胞壁很薄而不明显!细胞质浓厚而染色
较深!细胞核位居细胞中央!绒毡层细胞依旧贴壁整
齐排列&随着小孢子进一步发育!绒毡层细胞离开药
室内壁!开始解体"图
$
!
^
#细胞内开始液泡化!随
着液泡的逐渐增大!迫使细胞核移向细胞一侧"图
$
!
M
#成熟时期绒毡层消失!花粉粒散出"图
$
!
`
#
@+E+@
!
不育材料
!
@;9#"1
的发育过程在造孢时期
花药横切面呈蝶形"图
&
!
1
#!在四分体前就已开始
退化"图
&
!
_
#!没有花粉囊的形成!花药发育受阻于
造孢细胞至四分体前"图
&
!
2
#
=32>4
在孢原时
期呈椭圆形!细胞染色均匀!雄蕊内无子房腔的分化
"图
&
!
B
#!在未发育成
$
个药室的时候就已开始退
化!没有造孢细胞和壁细胞的分化"图
&
!
6
#但在
发育后期有微量花粉散出"图
&
!
^
#甘蓝型不育材
料"
?%1
*
?,51
#在四分体前期仍然在发育"图
&
!
M
#&在单核晚期!花粉囊内陷!小孢子相互挤压"图
&
!
`
#&绒毡层退化解体!败育较彻底"图
&
!
O
#
=32>4
与其他甘蓝型不育材料 "
?%1
*
?,51
*
@;9#"1
#的差异主要表现在退化时期在造孢时期!
退化较早
%
!
讨
!
论
CA?
!
不育材料花蕾与花中
)B6
*
(B6
*
&=D
和可溶
性蛋白与不育的关系
过氧化物酶是一种含铁卟琳的线粒体外末端氧
化酶!是植物体内普遍存在且活性较高的一种酶
正常情况下!植物体内过氧化物酶活性维持一定水
平!以去除不断产生的活性氧!使植物体内过氧化物
酶活性和活性氧含量达到一定平衡+*,本研究发
现!白菜型冬油菜不育系
=32>4
的过氧化物酶活
%#&
%
期
!!!!!!!
鲁美宏!等$白菜型冬油菜不育系
=32>4
花器生理生化特性及其雄蕊发育特征研究
图
&
!
@;9#"1
*
=32>4
和
?%1
*
?,51
的花药发育过程
1+@;9#"1
造孢细胞时期!
<$"
&
_+@;9#"1
在造孢期开始退化!
<$"
&
2+@;9#"1
花粉的退化!
<$"
&
B+=32>4
孢原细胞时期!
<$"
&
6+=32>4
在孢原细胞时期就开始退化!没有造孢细胞和壁细胞的分化!
<$"
&
+^=32>4
在后期有的雄蕊
有微量花粉散出!
<$"
&
M+?%1
*
?,51
四分体时期!该时期持续时间较长!
<$"
&
`+?%1
*
?,51
单核晚期!
花粉囊内陷!小孢子相互挤压!
<#""
&
O+?%1
*
?,51
小孢子解体消失!
<$"
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E
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!
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E
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QQ
H8SHR
!
<$"
性和超氧化物歧化酶活性在花蕾发育过程中迅速升
高!显著高于保持系材料和可育系!在两类甘蓝型不
育材料中也存在类似现象&不育系过氧化氢酶活性
在开放的花中显著升高!高于可育系和保持系同
时!切片观察结果显示!
=32>4
在孢原时期或造孢
时期就已经退化!并未形成绒毡层!所以抗氧化物酶
活性在不育材料
=32>4
的花蕾中迅速升高可能与
绒毡层异常现象有关另外!不育系可溶性蛋白含
量也显著低于可育系!主要是由于雄性发育受到抑
制导致蛋白质合成异常!花药发育所需物质和能量
的匮乏!是最终导致雄性不育的重要因素这与前
人在不结球白菜不育系研究上得到的结果+#5,类似
CA@
!
白菜型冬油菜不育系
$%&(
花蕾与花的
)B6
同工酶谱
同工酶谱分析直接反映基因在生理生化水平的
表达与调控情况+#,本研究对
@AB
同工酶酶谱分
析表明!
=32>4
不育系在开放的花中较可育系中
的酶谱谱带数明显增多!且迁移距离不同&
=32>4
较(陇油

号)多了
#
条
!
"
值为
"+,!%
的谱带!且
在现有的甘蓝型不育材料也缺乏此带因此!此带
$#&
西
!
北
!
植
!
物
!
学
!
报
!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
%$
卷
可视为
=32>4
白菜型冬油菜不育的特征带!这条
特异带的存在可能与育性有关
CAC
!
白菜型冬油菜不育系
$%&(
花药发育进程
本实验研究发现!甘蓝型不育系"
?%1
*
?,51
#
花药发育受阻于四分体至单核花粉期!四分体以后!
花药发育出现异常!小孢子释放困难!不分裂解体!
表现延迟退化现象&
@;9#"1
和白菜型冬油菜不育系
=32>4
属于无花粉囊型!它们的大部分花药发育
一直处于孢原细胞时期或造孢细胞时期!没有壁细
胞的分化!从而不能形成花粉囊这与余凤群等+!",
在(陕
!1
)等不育材料研究中得到的结果一致
综上所述!白菜型冬油菜细胞质雄性不育系
=32>4
花朵中
@AB
活性普遍高于花蕾!其花朵中
@AB
*
21C
活性高于相应可育系(陇油

号)!而花
蕾中
4AB
活性*蛋白质含量低于可育系(陇油

号)
=32>4
与可育系(陇油

号)及
@;9#"1
等甘
蓝型不育材料
@AB
同工酶谱带差异明显!
=32>4
花中多
#
条
!
"
为
"+,!%
的谱带!且为
=32>4
不
育系特有的谱带与
@;9#"1
等甘蓝型不育材料在
雄蕊发育上不同之处在于
=32>4
雄蕊发育在造孢
时期受到抑制可见!
=32>4
是在白菜型冬油菜
中发现的一种新型白菜型不育系
参考文献!
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