全 文 ：书西北植物学报!
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文章编号$
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#
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-
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收稿日期$
!"#%*"1*!
&修改稿收到日期$
!"#$*"$*"
基金项目$国家自然科学基金"
%##("!&%
#
作者简介$刘
!
浩"
#1()
#!男!博士!讲师!主要从事植物生理与分子生物学方面的研究
2*34.5
$
5.6748
!
7906,9:6,;0
"
通信作者$王棚涛!副教授!主要从事逆境生物学研究
2*34.5
$
<40
=>
?
!
7906,9:6,;0
拟南芥
$%$
敏感突变体
$12&
的分离与鉴定
刘
!
浩!王棚涛"!于雅薇
"河南大学 棉花生物学国家重点实验室!河南省植物逆境生物学重点实验室!河南大学 生命科学学院!河南开封
$(&""$
#
摘
!
要$以拟南芥"
!"#$%&
(
)%)*+#,%#-#
#为研究材料!从
@*ABC
突变体库中筛选分离得到
#
株脱落酸"
CDC
#敏感
突变体
#).#
"
CDC/90/.?.E936?40?#
!
#).#
#!在含有
CDC
的培养基中!与野生型相比!
#).#
突变体的根伸长明显
受到抑制!且其种子萌发结果显示
#).#
对
CDC
同样表现出敏感特性在生长发育方面!
#).#
突变体抽苔时间提
前!植株矮化!并且荚果长度明显小于野生型利用远红外成像系统分析发现!在干旱胁迫下
#).#
突变体叶面温
度高于野生型&失水率分析显示突变体失水率降低以及水分散失减少遗传学分析表明!
#).#
是单基因隐性突变
且与一个
@*ABC
插入共分离&通过图位克隆成功获得候选基因
!/0#

F@*GHF
结果显示!在突变体中
!/0#
的
表达受到抑制!并且能够调控多种
CDC
信号通路和胁迫应答基因的表达水平研究结果表明!
!/0#
可能参与调
控
CDC
信号转导并应答干旱胁迫
关键词$拟南芥&脱落酸&图位克隆&
!/0#
中图分类号$
I(#
&
I(1
文献标志码$
C
(")*+#",*,!-.*/*0+1/#2*+#","3$%$41,(#+#51
67+*,+$12&#,!($3-.&
4
1-1
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S
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S
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J4T8U4?8U
S
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=S
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4U?390?8VD.858
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!
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S
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R4.V90
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H7.04
#
$8(+/*0+
$
K0!"#$%&
(
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!
<9/;U9909:40:./854?9:436?40?#).#
"
CDC/90/.?.E936?40?#
!
#).#
#
.0?79
@*ABC36?40?5.TU4U
S
!
80CDC39:.63#).#<4/38U9/90/.?.E9?8CDC?740?79<.5:?
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980U88?9580*
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9U3.04?9:94U5.9U?740N@,K0?9U3/8V
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390?
!
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S
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7908?
S>
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!
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Y
69/8V?7936?40?/<4/
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!
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36?40?<4/58<9U40:<4?9U58//<4/U9:6;9:,O909?.;4045
S
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59U9;9//.E9*
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909
36?40?40:;8/9
=
U9
=
4?9:<.?74@*ABC?4
=
!
N96/9:34
>
*T4/9:;580.0
=
?8.:90?.V
S
?79;40:.:4?9
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909
!/0#,F@*GHFU9/65?//78<9:?74?.0?7936?40??799W
>
U9//.808V!/0#<4/.07.T.?9:
!
40:;865:U9
=
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54?99W
>
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S
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045.0
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80/9
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!/0#34
S
T9.0E85E9:.0?79U9
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045?U40/:6;?.8040:U9/
>
80/9?8:U86
=
7?/?U9//,
91
:
;"/!(
$
!"#$%&
(
)%)
&
CDC
&
34
>
*T4/9:;580.0
=
&
!/0#
!!
植物激素脱落酸"
4T/;./.;4;.:
!
CDC
#在植物应 对干旱(盐(冷等多种非生物胁迫中发挥重要作用
同时
CDC
还调控植物的种子休眠(萌发(幼苗生
长(主根和侧根发育(生殖生长及衰老等多种生长发
育过程)#*$*目前
CDC
受体及其结构已经成功被
解析)&*(*!其下游的信号转导研究工作也取得了较大
的进展!大量可被
CDC
诱导的基因已被克隆和分
析!并且多种受
CDC
诱导的蛋白在其性质和功能
上也作了比较深入的探讨但是由于
CDC
信号转
导途径异常庞杂!受内外诸多因素调控!并且由于研
究对象众多(表型多样化!至今我们在
CDC
信号转
导方面仍然缺乏深入了解
已知核孔复合体
BGH
"
06;594U
>
8U9;83
>
59W
!
BGH
#为多蛋白复合体!并且是大分子物质从胞质运
输到细胞核的唯一通道)*结构上!核孔复合体主
要由蛋白质构成&功能上!核孔复合体可以看做是一
种特殊的跨膜运输蛋白复合体!并且是一个双功能(
双向性的亲水性核质交换通道)*在植物中
BGH
通过控制
3FBC/
!
?FBC/
!
3.FBC/
和蛋白质的核
内核外运输对环境信号做出应答!进而调控生长发
育)1*研究证实
BGH
还参与了
CDC
信号转导的
调控
/!1!
"
/90/.?.E9?8CDC40::U86
=
7?!
!
/!1!
#编码一个类核运输受体"
.3
>
8U?.0
"
*5.Z9
>
U8*
?9.0
#!通过构建
FA!1C[JLH
报告基因的突变体
库!以冷和渗透胁迫作为筛选条件获得此突变体
)#&!*#
突变体在种子萌发以及根伸长方面均显示
出
CDC
敏感的特性!因此推测
/!1!
可能是
CDC
信号转导的负调控因子)#"*水稻
2)3!4!
编码
F4/
相关核蛋白
O@G
酶!该酶是核质间蛋白和
FBC
穿越核膜转运过程所必需的一个调控因子
过量表达
2)3!4!
的转基因水稻对盐胁迫(渗透胁
迫和
CDC
敏感性增强!在拟南芥中超表达水稻
2)5
3!4!
基因能够扰乱核运输!同样可以增强植株对
CDC
的敏感性)##*
迄今为止!
CDC
抑制拟南芥主根生长机制的研
究相对较少!为了更好地研究其分子机制!在本研究
中我们以左建儒实验室构建的
@*ABC
突变体库为
材料(外源施加
CDC
为筛选条件!成功获得
#
株根
长对
CDC
超敏感突变体
#).#
"
CDC/90/.?.E936*
?40?#
!
#).#
#!在种子萌发方面
#).#
也显示出
CDC
敏感特性!进一步的研究发现该基因同时还参
与了干旱胁迫应答采用图位克隆的方法!利用
!
群体我们成功地将
!/0#
基因定位并克隆!通过对
其序列分析发现!
!/0#
在拟南芥中编码一个分子
量为
!%(ZA
的核孔锚蛋白"
06;594U
>
8U940;78U
!
BLC
#!其全长基因组序列为
#%(&T
>
!在植物开
花时间控制和生长发育方面扮演重要角色
#
!
材料和方法
&,&
!
材
!
料
拟南芥"
!"#$%&
(
)%)*+#,%#-#J,
#为
H8563T.4
"
H85
#生态型
@*ABC
突变体库由中国科学院遗传
与发育生物学研究所植物基因组学国家重点实验室
提供
&,<
!
方
!
法
&,<,&
!
植物培养
!
将拟南芥种子清洗消毒后点播
于
]Q
培养基上!为了使幼苗生长一致!
$^
黑暗条
件下处理
!
#
%:
!放置在材料室内进行培养光照
周期为
#+7
光照%
7
黑暗!培养温度为"
!"_!
#
^
!光照强度为
#!"
#
#&"
$
385
+
3
)!
+
/
)#
!相对湿
度为
"`
根据实验需要在适宜的时间取材检测
&,<,<
!
干旱处理及远红外热成像仪对叶温度的检
测
!
远红外热成像仪"
@79U34HC]QH%"""
!美国#
配备
%!"a!$"G?Q.
探测器!能够探测短波红外线
"

#
1
$
3
#!在室温下温度分辨率小于
","%^
成
像仪安装在距叶片
%&
#
$&;3
的高度!同时与监视
器连接得到可视的植物热成像图拍摄的热成像图
储存于
G]HKC
存储卡中通过计算机用仪器所配
热成像处理软件对热成像(面积和温度频度分布直
方图进行分析处理将拟南芥
@*ABC
突变体种子
均匀播种于混有蛭石的营养土中"蛭石与营养土的
体积比为
%[#
#!每株周缘间隔大约
#;3
!种植后覆
盖塑料薄膜以保持湿度
$^
处理
%:
后!置于温
室"
#
#
!!^
!光照强度为
#&"
$
385
+
3
)!
+
/
)#
!
光周期为
#+7
光照%
7
黑暗!相对湿度为
+&`
#中
培养生长
#":
后停止浇水!转移至一个较为干燥
的培养箱中"
!&^
!相对湿度为
&"`
!
#+7
光照%
7
黑暗#继续培养干燥处理
&:
后!通过远红外热成
像仪对干旱处理后的幼苗进行叶面温度检测
&,<,=
!
背景纯化与遗传分析
!
以
#).#
突变体为
母本!与野生型进行回交得到
#
代!
#
代自交后产
生群体
!
把
!
点种在含
#"
$
385
%
JCDC#,!`
琼脂的
]Q
培养基上!观察生长受抑制的主根与正
常生长主根的比例!以确定遗传性质
&,<,>
!
图位克隆
!
图位克隆"
34
>
*T4/9:;580.0
=
#参
考
J6Z8<.?X
等)#!*描述的方法实验中所用
]4UZ9U
来自
@CKF
网 站"
7??
>
$%%
4U4T.:8
>
/./,8U
=
%
/9UE59?/
%
Q94U;7
,
4;?.80b09<
-
/94U;7c?
S>
9b34UZ9U
#
&?!
半定量
ABCD-A
!
取
",#
=
拟南芥幼苗液氮
中充分研磨后将材料转移至装有
#3J@FKdeJ
的
1(
&
期
!!!!!!!!!!!!
刘
!
浩!等$拟南芥
CDC
敏感突变体
#).#
的分离与鉴定
表
&
!
ABCD-A
分析所用的引物序列
@4T59#
!
GU.39U/9
Y
690;9/8VF@*GHF
引物
GU.39U
引物序列
GU.39U/9
Y
690;9
"
&f*%f
#
46!
$
&f*@OHCH@COHCOH@@HCH@H@*%f
F
$
&f*@HHH@OH@H@@HCOH@H@@@*%f
!7894
$
&f*@@HH@HC@OHHC@HH@HHO@H@@*%f
F
$
&g*HCOHOC@CHH@OCOCCHC@CO@OO*%f
31!1!
$
&f*OC@OCHOCOH@COCCHH@*%f
F
$
&f*CC@HH@@CHHOCOCCHCO*%f
2/8#
$
&f*CCHCHHCCHHHC@@@COH*%f
F
$
&f*H@HCOOCOHOC@O@CCOH*%f
723$(
$
&f*OCOO@@CHOOC@HO@OOC@*%f
F
$
&f*OH@@@H@HO@HO@OO@OC*%f
!:9!
$
&f*OCOO@@CHOOC@HO@OOC@*%f
F
$
&f*OH@@@H@HO@HO@OO@OC*%f
离心管中!剧烈振荡
#&/
!室温静置
&3.0
!加入
!""
$
J
氯仿并充分混匀!再静置
&3.0
然后
$ ^
##&"a
=
离心
#&3.0
!小心吸取上清
&""
$
J
于
#
个新的离心管中!并加入等体积的异丙醇混匀后室
温静置
#&3.0
然后于
$^
下!
##&"a
=
离心
#&
3.0
!吸干上清后加入
#3J(&`
乙醇"
A2GH
处理
水配制#洗涤沉淀于
$ ^
下!
(&""a
=
离心
&
3.0
!吸干上清后室温干燥
&3.0
!加入
!"
$
JA2GH
处理水溶解沉淀
;ABC
第
#
链的合成按照逆转录
试剂盒说明书进行!所用引物见表
#
!基因表达分析
按照普通
GHF
方法进行
!
!
结果与分析
!
$%$
敏感突变体
$12&
的表型验证
从左建儒实验室构建的
@*ABC
插入突变体库
中筛选获得
#
株潜在的
CDC
相关突变体!其在根
伸长方面呈现
CDC
超敏感的表型为了进一步验
证该表型!将突变体单株收种后!与野生型"
N@
#一
同播种于正常的
#,!` ]Q
培养基上!竖直生长
(:
后!分别转苗至含有
#"
$
385
%
JCDC
以及正常的
]Q
培养基上继续生长
&:
如图
#
!
C
(
Cf
所示!
]Q
培养基上野生型与突变体根伸长之间无任何差异
在
#"
$
385
%
JCDC
的培养基上野生型主根能够弯
曲并伸长!而突变体主根伸长则完全被抑制!仍然显
示出对
CDC
超敏感的表型!说明突变体表型能够
稳定遗传"图
#
!
D
(
Df
#因此该突变体被命名为
#).#
"
CDC/90/.?.E936?40?#
!
#).#
#接下来又
检测了外源
CDC
对种子萌发的影响如图
#
!
H
(
Hf
所示!正常
",+` ]Q
培养基中生长
(:
后!野生型
与
#).#
之间在萌发及生长方面无任何差异!而在
含有
",&
$
385
%
JCDC
培养基中!突变体的萌发受
到强烈抑制!而野生型则能够正常萌发并生长"图
#
!
A
(
Af
#进一步的遗传分析证实!在与野生型回交
后的
!
群体中!
CDC
敏感表型植株的分离比例符合
#[%
!说明该表型是由单基因隐性突变所控制
!
!05&
对开花时间的影响
CDC
能够促进植物开花提前!并决定器官和植
株形态大小如图
!
!
C
所示!
#).#
突变体抽苔时
间明显提前!统计分析显示
#).#
在

片莲座叶时
已经进入抽苔期!而野生型直到
##
片莲座叶时才进
入抽苔期"图
!
!
C
#进一步观察发现
#).#
突变体
植株矮化!且荚果长度明显小于野生型"图
!
!
D
#
这就暗示了
!/0#
能够影响植物的开花时间!并且
其功能缺失会引起植物发育异常
!
!05&
响应干旱胁迫
植物受到干旱胁迫后体内迅速合成
CDC
!
CDC
进一步诱导气孔关闭!减少植物的水分散失从
而增强抗旱性已知水分散失可使叶片表面的温度
降低!远红外热成像仪可以检测叶片温度的微小差
异为了进一步检测
!/0#
是否参与干旱胁迫应
答!将
#).#
与野生型"
N@
#一同播种于正常的
]Q
培养基上待幼苗长出
$
#
+
片真叶时将二者移栽
到同一个盘中"图
%
!
C
#!干旱处理
&:
后利用远红
外成像仪对叶面温度进行检测如图
%
!
D
所示突
变体的叶面温度明显高于野生型!二者相差大约
",&
^
"图
%
!
H
#!暗示了
#).#
突变体通过气孔散失水分
的速度低于野生型为了进一步证实远红外实验结
果!又分别检测了
#).#
突变体与野生型的失水率
分析显示
#).#
失水速率明显低于野生型!
+"3.0
时
N@
和
#).#
的失水率分别为
("`
和
&"`
"图
%
!
A
#结果证实
!/0#
能够对干旱胁迫做出响应

!
!05&
基因的图位克隆
上述结果证实拟南芥
!/0#
基因参与
CDC
信
号转导通路!同时调控植物开花并对干旱胁迫做出
应答为了进一步研究
!/0#
的生理功能!我们首
先试图用
@CKJ*GHF
"
?79U3454/
S
339?U.;.0?9U*
54;9:*GHF
!
@CKJ*GHF
#技 术 对 该 基 因 进 行 克
隆)#%*#$*!但是始终未能获得特异性条带于是又构
建了用于图位克隆的遗传群体!初定位证实突变基
因与第
#
条染色体末端部的
]4UZ9U@%"\!#
紧密
连锁!重组率约为
",`
为进一步确定突变基因
位置!又在
@%"\!#
附近分别设计了
\%\1
(
\1R!"
(
PLGM#!F
等
%
个
]4UZ9U
!发现重组率分别为
",`
(
",+&`
和
"`
!因此推测突变位点和
]4UZ9U
PLGM#!F
连锁在一起"图
$
!
C
#我们对这个
DCH
上的所有基因进行分析!并对相关基因进行
"
西
!
北
!
植
!
物
!
学
!
报
!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
%$
卷
GHF
检测!最终找到了候选的突变基因
46!
!并发
现
@*ABC
插入到
46!
基因的外显子上通过半
定量
F@*GHF
检测!证实
@*ABC
的插入导致该基
因被敲除"图
$
!
D
#我们已有的结果表明
!/0#
%
图
#
!
CDC
敏感突变体
#).#
的分离与验证
C,
正常
#,!` ]Q
培养基上生长
&:
后野生型"
N@
#与突变体
#).#
的幼苗根长&
D,#"
$
385
%
JCDC
抑制
#).#
根的生长&
H,
正常
",+` ]Q
培养基上
N@
与
#).#
种子萌发
(:
的情况对比&
A,",&
$
385
%
JCDC
抑制
#).#
的种子萌发
\.
=
,#
!
K/854?.8040:;74U4;?9U.X4?.808V?79!;*+#,%#-##).#36?40?
C,@79U88?590
=
?78VN@40:#).#80?7908U345#,!` ]Q4V?9U&:4
S
/
&
D,@79U88?590
=
?78V#).#
<9U9.07.T.?9:T
S
#"
$
385
%
JCDC
&
H,@79:.VV9U90;9T9?<990N@40:#).#80?79/99:
=
9U3.04?.80
&
A,@79/99:
=
9U3.04?.808V#).#<4/.07.T.?9:T
S
",&
$
385
%
JCDC
图
!
!
!/0#
对开花时间的影响
\.
=
,!
!
@799VV9;?8V!/0#80V58<9U.0
=
?.39
#
&
期
!!!!!!!!!!!!
刘
!
浩!等$拟南芥
CDC
敏感突变体
#).#
的分离与鉴定
图
%
!
!/0#
响应干旱胁迫
C,
干旱胁迫下
#).#
突变体与野生型"
N@
#幼苗的生长状况&
D,
远红外热图显示干旱胁迫下
#).#
突变体
叶片温度高于
N@
&
H,
干旱胁迫下
#).#
突变体的叶片温度比
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高约
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CDC
信号通路相关基因表达检测
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46!
参与了
CDC
与干旱胁迫的信号转导过程!目
前已知许多受脱水(盐和低温等逆境胁迫诱导的基
因也可被
CDC
诱导!胁迫诱导基因的表达能够增
强植物抗性)#&*因此我们检测了野生型和突变体
中标志基因
31!1!
(
2/8#
(
723$(
等表达情况
如图
$
!
H
所示!
#).#
突变体中
31!1!
(
2/8#
(
723$(
等基因表达上调
!:9!
编码
GG!H
类蛋白
磷酸酶!遗传分析显示
!:9!
是
CDC
信号转导途径
的负调控因子)#+*与
31!1!
(
2/8#
(
723$(
等基
因表达情况相反!在
#).#
突变体中
!:9!
的表达下
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H
#
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!
讨
!
论
CDC
是植物体内重要的逆境响应激素!被誉为
.胁迫激素/!它既是环境胁迫信号的诱导产物!又是
胁迫信号的传导者!通过它使环境信号迅速级联放
大研究表明
CDC
与干旱(高盐(低温(损伤(低
氧(光照以及病原体侵染等多种生物和非生物胁迫
有关!是植物响应逆境胁迫信号!并引起体内适应性
调节反应和基因表达的重要因子近年来随着
CDC
信号转导中间成分以及
CDC
受体
GPF
%
GPJ
%
FHCF
的相继发现)&*(*!科学家们在细胞与分
子水平上对其表达调控规律及生物学功能有了更深
入的认识但是!由于
CDC
信号网络极其庞杂!依
然有许多科学问题值得我们关注
CDC
在植物的生长发育中起重要的作用!尽管
CDC
信号转导网络中许多重要的成分已被发现!但
是迄今为止
CDC
抑制拟南芥主根生长机制的研究
却很少为了更好地了解
CDC
与根伸长的信号转
导过程!本研究从
@*ABC
标签法构建的突变体库
中筛选得到
#
株
CDC
抑制主根伸长的突变体
#).#
!其在种子萌发方面也显示出对
CDC
敏感的
!
西
!
北
!
植
!
物
!
学
!
报
!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
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卷
表型!暗示了
!/0#
可能参与调控了
CDC
信号转
导通过对突变体的生长发育进行持续观察!发现
突变体抽苔时间提前!且植株呈现矮化状态以及荚
果较短!说明
!/0#
的功能缺失会影响植物开花时
间以及造成植物生长发育缺陷进一步研究发现!
干旱处理后突变体叶片表面的温度明显高于野生
型!失水率分析证实
#).#
失水速度明显较野生型
慢!说明干旱处理后
#).#
突变体通过气孔散失的
水分减少!从而增强了对干旱的抗性为了进一步
研究
!/0#
的生理功能!我们对该基因进行了克
隆尽管该突变体为
@*ABC
插入突变体!但是由
于
@CKJ*GHF
技术本身的缺陷!例如在扩增的过程
中!可能会出现非特异性条带的扩增等!因此我们在
利用
@CKJ*GHF
克隆目的基因时并没有获得有价
值的信息!所以决定通过图位克隆技术对
!/0#
进
行基因克隆!利用拟南芥网站上提供的分子标记把
!/0#
基因粗定位在第
#
条染色体的下部!而后根
据拟南芥数据库中
QBG
和
QQJG
多态性序列设计
了一些细定位的分子标记!利用这些分子标记对拟
南芥
!/0#
基因进行精细作图!发现了
!/0#
基因
所在的候选
DCH
克隆
PLGM#!F
通过序列测定
找到了突变基因
46!
该基因编码一个核孔锚蛋
白!隶属于
BGH
家族!定位于核膜内侧!参与调控
FBC
的运输已有的研究证实在拟南芥中
46!
定位于核膜!该基因功能缺失后植物抽苔时间提前!
同时伴随叶片面积减小(花及果荚发育异常等)#(*#*!
说明
46!
在植物发育进程中起着重要作用!我们
的部分研究结果也证实了这一结论但是
46!
在
其他信号转导网络中的作用始终未见报道!目前已
知
46!
基因组全长
#%(&T
>
!编码一个
!%(ZA
蛋白!这可能为更深入的研究该基因功能带来了极
大的困难!而我们的研究结果说明
46!
可能通过
对
CDC
信号转导途径相关基因调控进而参与了
CDC
以及干旱胁迫应答过程!因此对该突变体进行
进一步分析!将为更好地诠释
46!
的生理功能及
其在
CDC
信号转导过程中的作用提供理论依据
致谢!感谢中国科学院遗传与发育生物学研究所植物基因组学国家重点实验室左建儒研究员提供
@*ABC
突变体库"
参考文献!
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