全 文 ：书西北植物学报!
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文章编号$
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收稿日期$
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&修改稿收到日期$
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基金项目$国家自然科学基金"
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#&江西省教育厅科技计划"
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#&江西省科技支撑计划"
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#&江西省青年科学
家培养计划"
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#
作者简介$罗向东"
#)+,
#!博士!教授!主要从事植物遗传与分子生物学研究
7(89.:
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"
通信作者$谢建坤!博士!教授!主要从事植物遗传与分子生物学研究
7(89.:
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!C
9D>>*@>8
东乡野生稻及其渐渗系应答低磷
胁迫的基因差异表达分析
罗向东!赵
!
俊!戴亮芳!温秀芳!刘李珠!张帆涛!谢建坤"
"江西师范大学 生命科学学院!南昌
%%""!!
#
摘
!
要$以东乡野生稻耐低磷渐渗系
EF#+#
及其双亲"栽培稻(协青早
4
)和东乡野生稻#为试材!采用
@GHI(I5FJ
技术分析其幼苗期应答低磷胁迫的差异表达谱特征!并采用实时荧光定量
J6K
分析验证差异表达基因的表达特
性!为探究东乡野生稻耐低磷胁迫的分子机制*发掘耐低磷相关的基因奠定基础结果显示$"
#
#基于
#+
对扩增效
果较好的
@GHI(I5FJ
引物分析发现!不同胁迫时间的参试材料与其对照组"正常磷水平#相比!具有很多"
!"
"
#$)
个#上调或下调表达的差异片段"
!
#与(协青早
4
)相比!
EF#+#
中特异性上调的差异带有
%,
条!下调表达
,#
条!而东乡野生稻中分别有
+)
条和
#%,
条&
EF#+#
与东乡野生稻共有的上调差异带为
#%
条!下调差异带有
#$
条
"
%
#回收纯化其中
,"
条特异性差异表达条带!最终克隆测序获得
$"
个差异表达基因片段
LG5/
&通过
4:9/M
比对和
功能分析!可将
LG5/
分为
3
类!包括能量与代谢*基因表达调控*信号转导和转录因子等"
&
#实时荧光定量
J6K
验证其中
,
个
LG5/
发现!各差异片段的荧光定量
J6K
表达模式与
@GHI(I5FJ
结果一致!表明该实验的
@GHI(
I5FJ
差异表达结果可靠!东乡野生稻的部分耐低磷相关基因已成功导入到渐渗系中!是发掘利用东乡野生稻耐
低磷相关基因*探究其耐低磷分子机制的重要资源
关键词$东乡野生稻&低磷胁迫&
@GHI(I5FJ
&实时荧光定量
J6K
中图分类号$
N+3)
文献标志码$
I
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R
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#
#
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C
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R
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Z
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R
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R
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R
9.0/MMDAKIJ(G4<9M9]9/A*LDA?=0@M.>0/>?MDA8\AXA
R
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R
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R
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R
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R
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R
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RR
AX8
Z
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Z
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R
90<=M.:.V.0
R
MDA
Z
D>/
Z
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R
A0A/.0X.@A*E0
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!
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R
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R
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R
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AX.8A0M9:/
C
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Z
D>/
Z
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$
G>0
R
;.90
R
\.:&
Z
D>/
Z
D>X=/(C
/MXA//
&
@GHI(I5FJ
&
[
KL(J6K
!!
磷是植物体正常生长发育所必需的第二大营养
元素!具有多种重要的生理代谢功能+#,虽然土壤
中全磷含量较高!但有效磷含量却很低+!,因此土
壤中有效磷含量严重匮乏已成为制约水稻高产*稳
产的重要因素之一+%,据统计!全世界约
&%^
耕地
缺磷!中国约
!
%
%
耕地缺磷!即使施以磷肥!其当季
的磷利用率也仅为
!"^
左右+&,更为严峻的是!磷
肥的主要来源磷矿石是一种不可再生资源!预计将
在不久耗竭!持续施以磷肥不仅导致磷矿资源的巨
大浪费!而且将出现江河湖泊的水体日益富营养化
等环境问题+$(,,因此!发掘作物自身高效磷的吸收
与利用潜力!培育耐低磷新品种!是改善作物缺磷状
况的重要发展方向
前人研究表明!不同基因型间对低磷胁迫的耐
性存在明显的基因型差异+,!表明通过遗传改良培
育水稻耐低磷新品种具有重要的现实意义然而由
于栽培稻在长期驯化栽培过程中!其等位基因的数
量比野生稻减少了
$"^
"
,"^
+
3
,
!而且数十年来商
业杂交种的广泛应用使得许多优良的地方品种流失
严重!致使栽培稻的遗传基础越来越狭窄+),因此!
通过种间杂交!拓宽栽培稻的遗传基础!创制具有耐
低磷相关基因的杂种后代!是解决耐低磷育种瓶颈
的重要课题
东乡野生稻是迄今全世界分布最北的普通野生
稻"
!"
#
$%"*
+
(
,
-
.
-/1X.??*
#!被列为国家二级保护
野生植物由于长期处于野生状态!经受了各种灾
害和不良环境的选择!东乡野生稻比栽培稻具有更
加丰富的基因多样性!蕴藏大量栽培稻所没有或已
丢失的优异基因!如耐冷*抗旱*耐低磷等+#"(#!,通
过种间杂交!东乡野生稻耐低磷优异基因也已成功
导入到栽培种中!是水稻耐低磷基因挖掘与利用的
宝贵资源!具有重要的实践应用价值+#!,然而!水
稻耐低磷性状是多基因控制的数量性状!其遗传机
理及分子调控网络机制非常复杂!通过传统育种手
段挖掘和利用近缘野生种耐低磷基因的效率非常
低!并且目前有关东乡野生稻耐低磷相关基因的遗
传与分子机制还很缺乏为此!本研究以耐低磷渐
渗系
EF#+#
及其双亲"东乡野生稻和栽培稻(协青早
4
)#为试材!采用
@GHI(I5FJ
"
@GHI(98
Z
:.?.A<
?X9
R
8A0M:A0
R
MD
Z
>:
C
8>X
Z
D./8
#技术!分析东乡野
生稻及其耐低磷渐渗系幼苗期应答低磷胁迫的差异
表达谱特征!用实时荧光定量
J6K
分析验证差异表
达基因的表达特性!为探究东乡野生稻耐低磷胁迫
的分子机制*发掘耐低磷相关的基因提供参考
#
!
材料和方法
A*A
!
材料与胁迫处理
以江西东乡野生稻"
!0"*
+
(
,
-
.
-/1X.??*
#为供
体亲本!栽培稻(协青早
4
)"
!0&%()%/
Z
*(/1(2%_9(
M>*@Y*
(
Q.A
[
.0
R
V9>4
)#为受体亲本!杂交获得
5
#
代!再与(协青早
4
)回交获得
46
#
5
#
群体!经单粒传
加代获得
46
#
5
)
4EF/
群体+),本课题组前期耐低
磷鉴定发现!东乡野生稻和
EF#+#
具有较强耐低磷
能力本研究以耐低磷渐渗系
EF#+#
及其双亲为试
材!在
!3`
下进行种子催芽!选择发芽整齐一致的
种子!采用
a>/D.<9
培养液配方进行石英砂培
养+#%,待幼苗长至两叶一心时进行低磷胁迫处理!
设置正常
J
浓度"
#*!)88>:
-
F
#
#为对照!低磷处
理为对照浓度的
#
%
%"
"
&%*"+
#
8>:
-
F
#
#每
%<
更换
#
次营养液!
Z
T$*$
低磷胁迫处理
%
*
,
和
)
<
后!分别取对照组和处理组的根和叶!液氮速冻后
置于
3"`
冰箱备用
,"&!
西
!
北
!
植
!
物
!
学
!
报
!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
%$
卷
表
A
!
实时荧光定量
:B5
使用引物
L9]:A#
!
WA
[
=A0@A/>?
[
KL(J6K
Z
X.8AX
引物
JX.8AX
引物序列
JX.8AX/A
[
=A0@A/
"
$b
#
%b
#
正向
5>X\9X<
反向
KAYAX/A
32(/ I6IL61666L11I6LIL1I66I 1L61LI6L6I166LL116IIL
LG53 66L66I1LLI1IILLIL61LL16L IL66I166ILI1LLI6L66LL6I6
LG5#$ 6L61L6166LI6ILL6I1II1 1II16LL1IL1IL11L6L66L6
LG5#3 III1II61I166IL66ILI6LII1 6ILII661I6I66L1III6I1LI1
LG5!% 16LI1I1IL1LI61II6II61III I6LI161LIL11I66LIIII1L16
LG5!, IL6LILL61I11IL61LLL6I6L6 IL6L6II16L66I6ILI1I6IL6I
LG5,# L11IILI6I66L16I1II6L6LII I6I1LII6ILL11I1I6I6IL16L
ACD
!
6+E$<$F8:
分析
采用
LX.V>:
试剂盒"
E0Y.MX>
R
A0
#提取对照和各
处理时间点根和叶的总
KHI
用琼脂糖凝胶电泳
检测其纯度和浓度!并最终将总
KHI
浓度调整为
"*#
#
R
-
#
F
#
!参照
5.X/M(WMX90C
0MDA/./>?@G(
HI
试剂盒"
JX>8A
R
9
#的说明书合成
@GHI
!并存于
!"`
备用
参照
c>/
等+#&,和娄群峰等+#$,所述的方法进行
@GHI(I5FJ
酶切*连接*预扩及选择性扩增预扩
产物用
#*$^
琼脂糖凝胶电泳检测浓度!根据预扩
增产物的浓度将其稀释
#"
"
!"
倍后作为选择性扩
增的模板以
3
条
42-K
$
选择性扩增引物"
42-K
$
接头
d!
个随机碱基#和
3
条
5&6
$
选择性扩增
引物"
5&6
$
接头
d%
个随机碱基#进行两两组合!共
组成
,&
对选择性扩增引物!分别对
EF#+#
及其双亲
的对照组和处理组的各时间点根和叶的
@GHI
进
行
@GHI(I5FJ
分析选择性
J6K
扩增产物采用
,^
变性聚丙烯酰胺胶"
JI17
#垂直电泳分离!电泳
结束后!参照
W90
R
=.0AMM.
等+#,,所述的方法进行固
定*染色及显色
A*G
!
差异片段的回收*扩增及测序
用灭菌的一次性手术刀从
JI17
胶上切取与
对照处理有差异性的条带!置于
#""
#
F
灭菌超纯水
中!
+"`
水浴
)"8.0
后冷却至室温!
#!"""X
%
8.0
离心
#"8.0
!吸取上清!
!"`
保存备用取
#
#
F
回收的上清液作为再次选择性扩增的模板!体系中
其它试剂*浓度及扩增程序与之前的选择性扩增一
致!再次用
,^ JI17
电泳鉴定!与对照处理在同一
位置有稳定差异的条带经琼脂糖凝胶回收并连接到
Z
eG#)(L
载体"
L9_9K9
#上!之后用连接产物转化
大肠杆菌"
4&276"(27(%2-8(
#
GT$9
感受态细胞!进
行蓝白斑筛选序列测定由北京鼎国生物技术有限
公司完成获得的序列在
KIJ(G4
和
K.@A1A0>8A
I00>M9.>0JX>
-
A@M
网站上进行
4:9/M
比对!分析其
基因的同源性及推测其功能
ACH
!
实时荧光定量
:B5
验证
特异表达差异
GHI
片段"
MX90/@X.
Z
M(?X9
R
8A0M/
!
LG5/
#经克隆测序及生物信息学分析归
类后!从每一类中随机选择
#
"
!
个
LG5/
进行荧光
定量
J6K
分析根据
LG5/
同源基因的
6G/
序
列!利用
JX.8AX%*"
在线设计荧光定量
J6K
引物
以水稻肌动蛋白
32(/
基因作为内标检测基因!检
测
LG5/
序列同源基因的表达量
32(/
基因及荧
光定量
J6K
引物序列见表
#
反应体系及扩增程
序参照
59/MWa4K1XAA0e9/MAXe.;
"
!f
#"
I4E
!
OWI
#说明书设定!每样品
%
重复荧光定量
J6K
反应在实时定量
J6K
分析系统"
I4E
!
OWI
#上进
行荧光定量
J6K
程序为
)$`
预变性
$8.0
!
)$
`
变性
%"/
!
,"`
退火
%"/
!共
&"
个循环
!
!
结果与分析
DCA
!
低磷胁迫下基因差异表达的
6+E$<$F8:
分析
耐低磷渐渗系
EF#+#
及其双亲各时间点"
%
*
,
和
)<
#的总
KHI
检测结果见图
#
!
I
!用
32(/
引物
对总
KHI
反转录产物"
@GHI
#的
J6K
扩增检测结
果见图
#
!
4
!表明提取的总
KHI
和反转录产物良
好!可用于后续的
@GHI(I5FJ
分析通过
@GHI(
I5FJ
引物筛选!本文获得
#+
对多态性较好且条带
清晰的引物组合用于进一步的选择性
J6K
扩增
扩增产物经
JI17
凝胶电泳检测!共获得
#""
"
3""
]
Z
之间
@GHI
片段
#+,""
条!平均每对引物扩增
条带数约
&"
条"图
!
#各参试材料根和叶在低磷
胁迫下的基因表达谱与对照组相比具有明显差异!
各处理时间点均具有大量"
!"
"
#$)
个#上调或下调
表达的差异片段!并且各材料低磷胁迫下根中上调
或 下调差异表达片段多于叶"表
!
#!表明水稻地下
+"&!
#!
期
!!!!!!!!!
罗向东!等$东乡野生稻及其渐渗系应答低磷胁迫的基因差异表达分析
图
#
!
KHI
电泳检测"
I
#和
@GHI32(/
引物扩增电泳检测"
4
#
e*e9XBAX
&
1*
基因组
GHI
&
6*@GHI
5.
R
*#
!
LDAA:A@MX>
Z
D>XA/./XA/=:M/>?M>M9:KHI
"
I
#
90Z
X><=@M/98
Z
:.?.A<]
C
32(/
Z
X.8AX?>X8@GHI
"
4
#
e*e9XBAX
&
1*1A0>8.@GHI
&
6*@GHI
图
!
!
耐低磷渐渗系及其双亲的部分
@GHI(I5FJ
扩增检测结果
6_
为对照&
e*e9XBAX
&
I
为特异性上调差异表达片段&
4
为特异性下调差异表达片段
5.
R
*!
!
J9XM/>?@GHI(I5FJ98
Z
:.?.@9M.>090
Z
D>XA/./?>X
Z
D>/
Z
D>X=/(C
M>:AX90@A.0MX>
R
XA//.>0:.0A90<.M/
Z
9XA0M/
6_\9/@>0MX>:9M0>X89:@>0@A0MX9M.>0>?
Z
D>/
Z
D>X=/
&
e*e9XBAX
&
I90<4\9//
Z
A@.@.9:
=
Z
(XA
R
=:9MA<90<<>\0(XA
R
=:9MA<]90"
9XX>\/D>\A<
#!
XA/
Z
A@M.YA:
C
部参与应答低磷胁迫的基因比地上部更丰富
分析上调表达的条带发现"表
!
#!东乡野生稻
及其渐渗系中根和叶的差异上调条带数均随处理时
间增加而增加"东乡野生稻
,<
的叶除外#!在处理
)
<
时达到最大值&而受体亲本(协青早
4
)中不同时
间点的上调表达特征无明显规律与自身对照相
比!
EF#+#
根和叶中各时间点差异上调表达的总条
带数分别为
#"$
和
+$
!均低于双亲相应值&东乡野
生稻根中差异上调的条带最多"
&,"
条#!分别是
EF#+#
和(协青早
4
)中的
&*&
和
%*&
倍!表明东乡野
生稻应答低磷胁迫的基因更加丰富!其调控网络可
能更加复杂与(协青早
4
)相比!
EF#+#
中根和叶
各时间点特异上调表达的总条带"即(协青早
4
)中
无差异表达的条带#分别为
!3
和
%&
条!东乡野生稻
3"&!
西
!
北
!
植
!
物
!
学
!
报
!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
%$
卷
表
D
!
耐低磷渐渗系及其双亲应答低磷胁迫的差异表达特征
L9]:A!
!
LDA<.??AXA0M.9:
C
A;
Z
XA//A<@D9X9@MAX./M.@/>?:>Z
D>/
Z
D>X=/M>:AX90@A.0MX>
R
XA//.>0
:.0A/90Z
9XA0M/=0Z
D>/
Z
D>X=/(C
/MXA//
处理时间
LXA9M8A0M
M.8A
%
<
表达类型
7;
Z
XA//.>0
M
CZ
A
差异表达条带数
LDA0=8]AX>?<.??AXA0M.9:
C
A;
Z
XA//A<]90Q4
叶
FA9?
根
K>>M
GUK
叶
FA9?
根
K>>M
EF#+#
叶
FA9?
根
K>>M
EF#+#
和东乡野生稻
共有差异条带数
6>(A;
Z
XA//A<]90.0EF#+#90叶
FA9?
根
K>>M
%
d &3 &% %,
"
!%
#
#&,
"
!&
#
!"
"
$
#
!#
"
&
#
! "
,+ ,& 3&
"
$!
#
3+
"
&#
#
3"
"
&$
#
3!
"
%&
#
" !
,
d %! $" %#
"
!&
#
#$$
"
!&
#
!!
"
##
#
%,
"
#!
#
& %
!# !% !"
"
#"
#
+#
"
,"
#
#+
"
,
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%"
"
#)
#
" #
)
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"
&3
#
#$)
"
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#
%%
"
#3
#
&3
"
#!
#
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%) #!& #%&
"
3%
#
#%+
"
,$
#
&#
"
#&
#
#!3
"
&&
#
% )
总计
L>M9:
d #!! #%$ #")
"
)$
#
&,"
"
3%
#
+$
"
%&
#
#"$
"
!3
#
3 $
#!+ !## !%3
"
#&$
#
!)$
"
#,,
#
#%3
"
,$
#
!&"
"
)+
#
% #!
!!
注$
d
表示上调表达&

表示下调表达&
Q4
为(协青早
4
)&
GUK
为东乡野生稻&
EFE+#
为渐渗系
EF#+#
&括号前的数为各参试材料处理与对照的差异条带!括号
内为参试材料与(协青早
4
)相比的特异性差异表达条带&下同
H>MA
$
d 8A90/=
Z
(XA
R
=:9MAZ
XA//
&
8A90/<>\0(XA
R
=:9MAZ
XA//*Q4*!"
#
$%&%()%F*@YQ.A
[
.0
R
V9>4
&
GUK*G>0
R
;.0
R
\.:&
EF#+#*E0MX>
R
XA//.>0
:.0AEF#+#
&
LDA<9M9]A?>XA]X9@BAM/\9/MDA0=8]AX>?<.??AXA0M.9:
C
A;
Z
XA//A<]900MX>:
!
90<.0MDA]X9@BAM/\9/MDA/
Z
A@.9:<.??AXA0M.9:
C
A;
Z
XA//A<]90Z
9XAQ4*LDA/98A9/]A:>\*
中分别为
3%
和
)$
条"表
!
#扣除不同时间点被重
复计算的差异条带!
EF#+#
和东乡野生稻中分别有
%,
条和
+)
条特异上调表达的条带
EF#+#
的这
%,
条特异上调表达的条带中有
#%
条是与东乡野生稻
共有的差异条带"表
!
!图
!
#表明东乡野生稻部分
优异基因已转移到
EF#+#
中!而且通过种间杂交
EF#+#
获得了一些双亲中所没有的差异表达条带和
应答模式
比较下调表达的条带发现"表
!
#!各参试材料
的下调差异表达的规律基本一致!在处理
,<
时差
异表达的条带数处于最低与自身对照相比!
EF#+#
根和叶中各处理时间点差异下调表达条带的总和分
别为
!&"
和
#%3
&东乡野生稻下调差异表达条带最
多!分别为
!)$
和
!%3
条!再次表明东乡野生稻应答
低磷胁迫的基因调控网络更加丰富和复杂与(协
青早
4
)相比!
EF#+#
中根和叶各时间点特异下调表
达的总条带分别为
)+
和
,$
!东乡野生稻中分别为
#,,
和
#&$
"表
!
!图
!
#扣除不同时间点被重复计
算的差异条带!
EF#+#
和东乡野生稻中分别有
,#
条
和
#%,
条特异下调表达的条带
EF#+#
的这
,#
条
特异下调表达的条带中有
#$
条是与东乡野生稻共
有的差异条带"根和叶中分别有
#!
条和
%
条#再
次暗示种间杂种扩大了栽培种的遗传变异!东乡野
生稻部分优异基因已转移到
EF#+#
中
D*D
!
差异表达片段的克隆测序及分析
为了解耐低磷渐渗系应答低磷胁迫的分子调控
机制!对部分差异明显的条带进行测序和功能分析
从
EF#+#
和东乡野生稻中的条特异差异表达的条带
中共回收到
,"
条带型明亮清晰*差异明显的特异表
达条带"即(协青早
4
)中无差异表达的条带#进行二
次
J6K
扩增和电泳检测!选择能在同一位置稳定出
现差异的条带进行克隆*测序!最终得到
$"
条有效
序列"叶
%%
条!根
#+
条#将这
$"
条序列在
KIJ(
G4
和
K.@A1A0>8AI00>M9M.>0JX>
-
A@M
网站上进行
4:9/M
比对分析!结果有
%,
个
LG5/
序列和数据库
中已登录的基因具有很高的同源性"表
%
#!其中有
,
个基因序列是在东乡野生稻和
EF#+#
中特异性共表
达的序列"
LG5!#
*
LG5%,
*
LG5&#
*
LG5&)
*
LG5$!
和
LG5$)
#!比对的信息完全一致!因此这些重复的
基因序列未在表
%
中列出其余克隆测序的
#&
个
LG5/
中有
$
个未能找到同源序列信息!有
)
个与
已知序列同源性较低
根据
4:9/M
分析结果!按照功能分类可将获得
的
$"
个差异表达基因片段
LG5/
分为
3
类"图
%
#!
分别为$未知基因
#&
条"占总数
!3^
#!能量与代谢
相关基因
##
条"占总数
!!^
#!基因表达调控相关
基因
,
条"占总数
#!^
#!信号转导相关基因
,
条
"占总数
#!^
#!未知功能蛋白基因
,
条"占总数
#!^
#!转录因子相关基因
&
条"占总数
3^
#!物质
运输相关基因
!
条"占总数
&^
#及防御和抗病相关
基因
#
条"占总数
!^
#这些基因中有许多可直接
参与调控功能蛋白的表达或者通过信号转导*转录
)"&!
#!
期
!!!!!!!!!
罗向东!等$东乡野生稻及其渐渗系应答低磷胁迫的基因差异表达分析
表
G
!
部分特异差异表达片段的生物信息学分析及特征
L9]:A%
!
LDA].>.0?>X89M.@/909:
C
/./>?
Z
9XM.9:<.??AXA0M.9:
C
A;
Z
XA//AR
8A0M/
序列编号
LG5H>*
序列来源 "
LG5/>=X@A
基因号
1A0AEG
注释
I00>M9M.>0
相似度
W.8.:9X.M
C
%
^
7
值
7Y9:=A
LG53
GUK
的叶"
%
"
)<
#
FA9?>?GUK
"
%
"
)<
#
P/"+M",%+%""("#
类似于丙酮酸脱氢酶激酶
W.8.:9XM>
ZC
X=Y9MAC

R
A09/AB.09/A
33 !*3"7(!"
LG5#$
EF#+#
的根"
)<
#
K>>M>?EF#+#
"
)<
#
P/"&M"$)&#""("#
类似于
J(M
CZ
AK!K%
型
e
C
]
蛋白片段
W.8.:9XM>J(M
CZ
AK!K%e
C
]
Z
X>MA.0
"
5X9
R
8A0M
#
)% +*&"7(#&
LG5#+
EF#+#
的叶"
)<
#
FA9?>?EF#+#
"
)<
#
P/"#M"%&)3""("#
类似于细胞色素
J&$"
W.8.:9XM>@
C
M>@DX>8AJ&$"
3" "*"""#,
LG5#3
GUK
的叶"
)<
#
FA9?>?GUK
"
)<
#
P/"&M"&&!"""("#
假定的转录因子
4%
J=M9M.YAMX90/@X.
Z
M.>09:?9@M>X4%
3) +*&"7(!&
LG5#)
GUK
的叶"
)<
#
FA9?>?GUK
"
)<
#
P/"$M"%&+"""("#
LI5EE$$
保守区域的结构域蛋白
LI5EE$$
Z
X>MA.0@>0/AXYAR
.>0<>89.0@>0M9.0.0
RZ
X>MA.0
3! &*,"7(#,
LG5!"
GUK
的叶"
,<
#
FA9?>?GUK
"
,<
#
P/#!M",#)+""(""
保守假定蛋白
6>0/AXYACZ
>MDAM.@9:
Z
X>MA.0
)! #*$"7(#3
LG5!#
EF#+#
和
GUK
的根"
)<
#
K>>M>?EF#+#90"
)<
#
P/"!M"+!")""("&
类似于
0A
Z
A0MDA/.0(#
天冬氨酸蛋白酶
W.8.:9XM>I/
Z
9XM.@
Z
X>MA.09/A0A
Z
A0MDA/.0(#
)) !*$"7(!!
LG5!$
EF#+#
的叶"
)<
#
FA9?>?EF#+#
"
)<
#
P/"%M"$,&!""("#
功能未知的
GO5)$!
家族蛋白
JX>MA.0>?=0B0>\0?=0@M.>0GO5)$!?98.:
CZ
X>MA.0
3+ )*,"7("!
LG5!,
GUK
的叶"
,<
#
FA9?>?GUK
"
,<
#
P/#!M"#+,3""("#
类似于异染色质蛋白片段
W.8.:9XM>TAMAX>@DX>89M.0
Z
X>MA.0
"
5X9
R
8A0M
#
#"" !*""7(%3
LG5!+
GUK
的叶"
)<
#
FA9?>?GUK
"
)<
#
P/"%M"$+!)""("#
多抗菌挤压蛋白的伴侣家族蛋白
e=:M.90M.8.@X>].9:A;MX=/.>0
Z
X>MA.0e9M7?98.:
CZ
X>MA.0
,) "*"#3
LG5!)
GUK
的叶"
)<
#
FA9?>?GUK
"
)<
#
P/"$M"$,&%""("#
锌指结构!
KEH1
%
5ac7
%
JTG
类型结构域蛋白
S.0@?.0
R
AX
!
KEH1
%
5ac7
%
JTG(M
CZ
A<>89.0@>0M9.0.0
RZ
X>MA.0
)+ %*%"7(!"
LG5%%
EF#+#
的根"
)<
#
K>>M>?EF#+#
"
)<
#
P/"&M",,!#""("#
类似于
&"W
核糖体蛋白
W&
W.8.:9XM>&"WX.]>/>89:
Z
X>MA.0W&(:.BA
), #*)"7(!!
LG5%&
EF#+#
的叶
FA9?>?EF#+#
P/"+M"$&#)""("#
类似于结构域互作激酶
#
W.8.:9XM>_E<>89.0.0MAX9@M.0
R
B.09/A#
)! #*,"7(#%
LG5%,
EF#+#
和
GUK
的叶"
)<
#
FA9?>?EF#+#90"
)<
#
P/"$M"%&$&""("!
类似于螺旋结构的结构域蛋白
LAMX9MX.@>
Z
A
Z
M.89.0@>0M9.0.0
RZ
X>MA.0
), !*+"7(")
LG5%)
GUK
的根和叶"
)<
#
FA9?90>M>?GUK
"
)<
#
P/"+M"$&,"""("#
类似的异戊烯基焦磷酸$二甲基烯丙基焦磷酸异构酶"
76$*%*
%*!
#片段
W.8.:9XM>E/>
Z
A0MA0
C
:
ZC
X>
Z
D>/
Z
D9MA
$
<.8AMD
C
:9:
C
:
ZC
X>
Z
D>/
Z
D9MA./>8AX9/A
"
76$*%*%*!
#"
5X9
R
8A0M
#
)! "*%%
LG5&#
EF#+#
和
GUK
的"
)<
#
K>>M>?EF#+#90"
)<
#
P/"#M"%!3+""("#
吡啶核苷酸
5IG
依赖性!二硫氧化还原结构域蛋白
5IG(Z
A0ZC
X.<.0A 0=@:A>M.Z
D.;.<>XA<=@M9/A
<>89.0@>0M9.0.0
RZ
X>MA.0
)+ 3*,"7(#,
LG5&!
GUK
的叶"
%<
#
FA9?>?GUK
"
%<
#
P/##M"$&&3""("#
类似于谷氨酸
IGL
亚基
4W.8.:9XM>1IL4
"
1FO(IGLWO4(
OHEL4
#&
@9X]>0(0.MX>
R
A0:.
R
9/A
!
\.MD
R
:=M98.0A9/98.<>(H(<>(
0>X
%
R
:=M98.0
C
:(MKHI/
C
0MD9/A
"
R
:=M98.0A(D
C
:
C
V.0
R
#%
:.
R
9/A
)& )*)"7(#"
LG5&)
EF#+#
和
GUK
的叶"
)<
#
FA9?>?EF#+#90"
)<
#
P/"!M",#$$""("!
假定保守基因
T
CZ
>MDAM.@9:@>0/AXYA<
R
A0A ), "*"3+
LG5$"
GUK
的根"
,
"
)<
#
K>>M>?GUK
"
,<
"
)<
#
P/#"M"!"""""("!
类似于蛋白激酶结构域的表达蛋白
W.8.:9XM>
Z
X>MA.0B.09/A<>89.0@>0M9.0.0
RZ
X>MA.0
!
A;
Z
XA//A<
)$ "*"%)
LG5$!
EF#+#
和
GUK
的根"
)<
#
K>>M>?EF#+#90"
)<
#
P/",M"!"%$""("#
类似于
OeJ(6eJ
激酶家族蛋白
W.8.:9XM>OeJ(6eJB.09/A?98.:
CZ
X>MA.0
#"" #*""7(#")
LG5$)
EF#+#
和
GUK
的叶"
%
"
)<
#
FA9?>?EF#+#90"
%
"
)<
#
P/",M",&$3""("#
类似于转录起始因子
L5EEG
亚基
#
W.8.:9XM>LX90/@X.
Z
M.>0.0.M.9M.>0?9@M>XL5EEG/=]=0.M#
#"" $*""7(&!
LG5,#
EF#+#
的叶"
,<
#
FA9?>?EF#+#
"
,<
#
P/"#M",%,$""("#
类似于半乳糖醛缩酶
J1!
W.8.:9XM>
Z
>:
CR
9:9@M=X>09/AJ1!
)# &7(#"
LG5,!
GUK
的根"
%<
#
K>>M>?GUK
"
%<
#
P/")M"&,,)""("!
类似于丝氨酸!苏氨酸蛋白激酶
W.8.:9XM>WAX.0A(MDXA>0.0A
Z
X>MA.0B.09/A
33 $*""7(!3
LG5,&
GUK
的叶"
)<
#
FA9?>?GUK
"
)<
#
P/#!M"!")3""("#
类似于
H4(IK6
结构域蛋白
W.8.:9XM>H4(IK6<>89.0@>0M9.0.0
RZ
X>MA.0
!
A;
Z
XA//A<
33 $*""7(!"
LG5,$
GUK
的叶"
)<
#
FA9?>?GUK
"
)<
#
P/"+M"#&+$""("#
与光系统
%
#"BG9
的多肽!叶绿体前体类似
W.8.:9XM>
Z
D>M>/
C
/MA8
%
#"BG9
Z
>:
CZ
A
Z
M.!
@D:>X>
Z
:9/M
Z
XA@=X/>X
#"" &*""7(3%
LG5,,
EF#+#
的根"
,<
#
K>>M>?EF#+#
"
,<
#
P/##M"!,$"""("#
尿苷激酶家族蛋白
OX.<.0AB.09/A?98.:
CZ
X>MA.0 #"" #*""7($,
LG5,+
GUK
的叶"
)<
#
FA9?>?GUK
"
)<
#
P/"#M"+3&+""(""
丝氨酸%苏氨酸蛋白激酶相关的结构域蛋白
WAX.0A
%
MDXA>0.0A
Z
X>MA.0B.09/A(XA:9MA<<>89.0@>0M9.0.0
RZ
X>MA.0
)& #*""7("3
LG5,3
GUK
的根和叶"
%<
#
FA9?90>M>?GUK
"
%<
#
P/"%M",)"+""(""
假定保守蛋白
6>0/AXYACZ
>MDAM.@9:
Z
X>MA.0
+& !7(#"
LG5+$
EF#+#
的根"
)<
#
K>>M>?EF#+#
"
)<
#
P/"$M"!#$3""("#
功能未知的
GO5!$"
结构域蛋白
JX>MA.0>?=0B0>\0?=0@M.>0GO5!$"<>89.0@>0M9.0.0
RZ
X>MA.0
#"" %*""7(#%#
LG5+)
GUK
的叶"
%<
#
FA9?>?GUK
"
%<
#
P/"3M"!&"3""("#
与肌动蛋白丝集束蛋白
J(##$(I4J
类似
W.8.:9XM>I@M.0?.:98A0M]=0<:.0
RZ
X>MA.0J(##$(I4J
#"" #*""7()#
!!
注$
"
括号中的时间为低磷胁迫取样时间点
H>MA
$
"
LDAM.8A.0MDA]X9@BAM/\9/MDA<.??AXA0MMXA9M8A0M=0Z
D>/
Z
D>X=/(C
/MXA//*
"#&!
西
!
北
!
植
!
物
!
学
!
报
!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
%$
卷
图
%
!
@GHI(I5FJ
特异差异表达片段的功能分类
I*
未知基因&
4*
能量与代谢相关基因&
6*
基因表达调控相关基因&
G*
信号转导相关基因&
7*
未知功能蛋白基因&
5*
转录因子
相关基因&
1*
物质运输相关基因&
T*
防御和抗病相关基因
5.
R
*%
!
5=0@M.>09:<./MX.]=M.>0/>?/A
Z
A@.9:<.??AXA0M.9:
MX90/@X.
Z
M>8A/]
C
@GHI(I5FJ909:
C
/./
I*O0B0>\0
R
A0A/
&
4*70AX
RC
90<8AM9]>:./8XA:9MA<
R
A0A/
&
6*KA
R
=:9M.0
RR
A0AA;
Z
XA//.>0XA:9MA<
R
A0A/
&
G*W.
R
09:MX90/<=@M.>0
XA:9MA<
R
A0A/
&
7*1A0A/>?=0B0>\0?=0@M.>09:
Z
X>MA.0/
&
5*LX90/@X.
Z
M.>0?9@M>XXA:9MA<
R
A0A/
&
1*e9MAX.9:MX90/
Z
>XM9M.>0
XA:9MA<
R
A0A/
&
T*G./A9/AXA/./M90@AXA:9MA<
R
A0A/
调控途径调节下游基因的表达!另外还有较大比例
"
!3^
#差异表达序列是未知功能的基因!表明东乡
野生稻及其基因渐渗系应答低磷胁迫的分子机制相
当复杂!是挖掘耐低磷相关基因的重要资源"表
%
!
图
%
#
DCG
!
差异表达基因的
5I<:B5
分析
为了验证
@GHI(I5FJ
结果的可靠!本实验从
不同功能类型中各选取
#
"
!LG5/
进行
[
KL(J6K
分析验证"图
&
#!包含涉及能量与代谢的
LG5,#
"编
码多聚半乳糖醛酸酶#*基因表达调控的
LG5!,
"真
核翻译起始因子
!
&
#*信号转导的
LG53
"丙酮酸脱
氢酶激酶
!&9:;#
#*转录因子的
LG5#$
"
ea4
家
族转录因子#和
LG5#3
"生长素响应因子
)
#以及未
知功能的
LG5!%
通过检测
LG5/
对应处理时间
点的转录表达特性发现!
LG5,#
*
LG5!,
*
LG5#3
和
LG5!%
在耐低磷渐渗系
EF#+#
和供体亲本东乡野
生稻低磷处理
,
和
)<
的叶中同时显著上调表达!
LG5#$
仅在
EF#+#
低磷处理
,
和
)<
的根中显著上
调表达!
LG53
仅在东乡野生稻叶处理
)<
时显著
上调以上这
,
个基因的不同
[
KL(J6K
表达模式
符合其
@GHI(I5FJ
表达谱特征!表明本研究应答
低磷胁迫的
@GHI
差异片段真实可靠!
@GHI(
I5FJ
可用于东乡野生稻耐低磷渐渗系应答低磷胁
迫差异表达分析!同时也进一步证实了水稻参与应
答低磷胁迫的基因类型丰富
图
&
!
东乡野生稻与耐低磷渐渗系中特异
差异表达基因的实时荧光定量
J6K
分析
5.
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讨
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论
@GHI(I5FJ
具有准确*可靠*多态性丰富等优
点!能够用于揭示全基因组功能基因差异表达及相
关基因的分离研究!目前已被广泛应用于植物抗病*
抗逆等条件下的
8KHI
差异表达分析+#+,!包括以
此阐明植物响应低磷胁迫的分子机制+#3,本实验
利用
@GHI(I5FJ
技术研究东乡野生稻及其渐渗
系应答低磷胁迫的特异表达谱特征!结果发现耐低
磷渐渗系及其双亲有大量的基因参与了应答低磷胁
迫的调控网络!既有大量上调表达的基因!也有很多
下调表达的基因!而且东乡野生稻的响应低磷胁迫
差异表达的基因最丰富"尤其是根部!上调和下调分
别是栽培稻
%*&
倍和
#*&
倍#!表明水稻耐低磷性状
是受多基因控制的数量性状!调控网络非常复杂!与
前人的结果一致+&,本结果也暗示东乡野生稻可能
蕴藏着更加丰富的耐低磷相关基因!是研究水稻应
答低磷胁迫调控网络的重要试材!也是挖掘耐低磷
等抗逆基因的宝贵资源
本研究结果显示!
EF#+#
和东乡野生稻含有多
条"
#%
条上调和
#$
条下调#(协青早
4
)所没有的共
有差异条带!测序的
$"
个
LG5/
中!有
,
个是
EF#+#
和东乡野生稻共有的特异表达条带!序列完全一致!
暗示并证实了东乡野生稻部分优异基因已通过种间
杂交渐渗转移到
EF#+#
中此外!
EF#+#
中也有部
分双亲中所没有的差异表达条带!表明
EF#+#
可能
具有不同于双亲应答低磷胁迫的基因表达模式!说
明种间杂交扩大了栽培稻遗传变异基础然而!种
##&!
#!
期
!!!!!!!!!
罗向东!等$东乡野生稻及其渐渗系应答低磷胁迫的基因差异表达分析
间杂交后代基因表达模式改变的分子机制非常复
杂!既可能包括种间杂交遗传重组及其由此引发的
调控网络的改变!也可能包括种间杂交渐渗诱发的
表观遗传变异等!如此前发现东乡野生稻基因渐渗
系中出现甲基化水平和模式改变*转座子激活!存在
落后染色体和双核仁等+#)(!",这些相关的分子机制
都有待于进一步深入研究尽管如此!东乡野生稻
优异渐渗系为挖掘和利用野生稻抗逆性优异基因资
源奠定了的基础!本研究结果也可为今后研究水稻
耐低磷分子机理提供参考
本研究东乡野生稻及其耐低磷渐渗系应答低磷
胁迫的的
$"
个
LG5/
涉及能量与代谢*基因表达调
控*信号转导*转录因子和物质运输等这些
LG5/
中有许多与已鉴定的逆境胁迫相关功能基因具有较
高的同源性表明水稻对低磷胁迫的响应过程是对
低磷信号感受*转导和下游功能基因应答等综合协
调作用的结果!与小麦+#3,*拟南芥+!#,和水稻+!!,等关
于响应低磷胁迫的差异表达研究基本一致进一步
分析发现!本研究的
$"
个
LG5/
中比重最大是未知
基因"
!3^
#!还有
#!^
未知功能蛋白基因!表明东
乡野生稻中可能蕴藏非常丰富的耐低磷相关基因!
值得深入挖掘与利用其他
,
类
LG5/
中!基因表
达调控*信号转导以及能量与代谢相关基因比重最
大!均为
#!^
!暗示着东乡野生稻耐低磷可能更多
地是通过信号转导和基因表达调控等途径来调节植
株的能量与代谢!最终实现磷的高效吸收与利用
前人的研究表明!植株在生理生化上对低磷胁
迫的应答!较大程度上起因于信号转导后转录调控
水平的改变+!%,本研究中!不少介导植株体内信号
转导的蛋白激酶基因发生特异性上调表达!如丝氨
酸%苏氨酸激酶"
LG5%&
*
LG5,!
和
LG5,+
#*蛋白
质酪氨酸激酶"
LG5&)
和
LG5$"
#*丙酮酸脱氢酶
激酶
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"
LG53
#等受体蛋白激酶!表明东乡野
生稻及其渐渗系植株体内应答低磷胁迫信号的转导
通路中有特定蛋白激酶的参与!与拟南芥和西红柿
等相关研究一致+!&,另外!本实验东乡野生稻和耐
低磷 渐 渗 系
EF#+#
中 获 得
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"
LG5#$
#*
4%
"
LG5#3
#和
L5EEG
"
LG5$)
#等差异表达的转录因
子!其中
ea4
转录因子已被证实参与了低磷胁迫
等非生物逆境!如
ea4,!
和
JTK
&
4%
基因家族在
植物逆境胁迫响应和生长发育过程中也起着极其重
要的作用已有的研究显示
4%
主要存在于裸子植
物*苔藓和绿藻类植物中!在水稻中尚未见报道+!&,
由于转录因子在不同的环境刺激下可以调控激活一
系列与逆境相关功能基因的表达来提高植物整体的
抗逆性!因此本研究结果可为水稻耐低磷的复杂调
控通路研究可提供有用的信息
前人的研究也表明!植物在感应低磷胁迫信号
后!植株在生理*生化和形态学水平上发生明显的适
应性变化其中最普遍*最直接的反应就是能量与
代谢途径的变化!植物通过调整代谢途径而降低消
耗*提高磷利用率也是一种重要的低磷适应性反
应+&,本研究的特异差异片段中有
##
个是能量与
代谢相关的蛋白!如天冬氨酸蛋白酶"
LG5!#
#*异
戊 烯 焦 磷 酸 "
LG5%)
#*二 氢 硫 辛 酸 脱 氢 酶
"
LG5&#
#*聚半乳糖醛酸酶
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"
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#*尿苷激
酶"
LG5,,
#*细胞色素
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"
LG5#+
#和谷氨酰胺转
移酶"
LG5&!
#等其中细胞色素
J&$"
和谷氨酰胺
转移酶特异性上调!表明它们在增强植株对低磷胁
迫诱发的活性氧清除*进而缓解植株活性氧清除系
统的失衡中具有较重要的作用然而!克隆测序的
LG5/
仅仅是特异差异片段的一部分"东乡野生稻
和
EF#+#
中分别有
!!+
和
##+
个特异表达条带#!为
了能全面了解东乡野生稻及其渐渗系耐低磷的分子
机制!需要进一步克隆和功能验证更多的
LG5/
!并
揭示这些
LG5/
在低磷响应过程中的具体作用及调
控网络这将为揭示水稻响应低磷胁迫的分子机制
提供参考!也可为挖掘野生有利基因和提高水稻磷
高效吸收利用研究奠定基础
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