全 文 ：植物病理学报
ＡＣＴＡ ＰＨＹＴＯＰＡＴＨＯＬＯＧＩＣＡ ＳＩＮＩＣＡ ４６(１): ６３￣７１(２０１６)
收稿日期: ２０１４￣０９￣０６ꎻ 修回日期: ２０１５￣１０￣１４
基金项目: 国家自然科学基金资助项目(３１３７０１７９)ꎻ山东省自然科学基金资助项目(ＺＲ２０１３ＣＭ０１５)
通讯作者: 原雪峰ꎬ教授ꎬ主要从事分子植物病毒学研究ꎻＥ￣ｍａｉｌ:ｓｎｏｗｐｅａｋ７７＠１６３.ｃｏｍ
第一作者: 王国鲁ꎬ男ꎬ 山东菏泽人ꎬ硕士生ꎬ主要研究方向为植物病毒学ꎻＥ￣ｍａｉｌ:ｗａｎｇｇｕｏｌｕ８９＠１２６.ｃｏｍꎮ
ｄｏｉ:１０.１３９２６ / ｊ.ｃｎｋｉ.ａｐｐｓ.２０１６.０１.００８
烟草丛顶病毒 ＯＲＦ１蛋白的多克隆抗体制备及应用
王国鲁ꎬ 王德亚ꎬ 于成明ꎬ 原雪峰∗
(山东农业大学植物保护学院ꎬ山东省农业微生物重点实验室ꎬ泰安 ２７１０１８)
摘要:ＰＣＲ扩增烟草丛顶病毒(Ｔｏｂａｃｃｏ ｂｕｓｈｙ ｔｏｐ ｖｉｒｕｓꎬＴＢＴＶ)的 ＯＲＦ１序列并克隆到原核表达载体 ｐＥＨＩＳＴＥＶ中ꎬ转化大
肠杆菌 Ｒｏｓｅｔｔａ菌株经 ＩＰＴＧ诱导表达 ＴＢＴＶ ＯＲＦ１蛋白ꎮ 利用切胶纯化的 ＯＲＦ１蛋白免疫新西兰大耳白兔制备并获得抗
血清ꎬ间接 ＥＬＩＳＡ检测效价为 １ ∶ ２４ ３０００ꎮ 经抗原亲和纯化从抗血清中得到特异性和灵敏度俱佳的 ＯＲＦ１ 多克隆抗体ꎮ
Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ分析显示ꎬＴＢＴＶ ＯＲＦ１多克隆抗体既可以检测田间发病的烟草丛顶病样品中 ＯＲＦ１ 蛋白ꎬ也可检测在体内和
体外翻译体系中的 ＴＢＴＶ ＯＲＦ１蛋白的表达ꎮ 另外ꎬ发现 ＯＲＦ２ 蛋白以 ＯＲＦ１延长蛋白的形式存在ꎬ根据 ＯＲＦ１和 ＯＲＦ２的
重叠情况及潜在的七核苷酸滑动序列和下游的稳定二级结构ꎬ推测此 ＯＲＦ１延长蛋白是移码翻译产物ꎮ
关键词:烟草丛顶病毒ꎻ ＯＲＦ１基因ꎻ 原核表达ꎻ 抗血清ꎻ 移码翻译
Ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ＯＲＦ１￣ｅｎｃｏｄｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｏｆ Ｔｏｂａｃｃｏ
ｂｕｓｈｙ ｔｏｐ ｖｉｒｕｓ ＷＡＮＧ Ｇｕｏ￣ｌｕꎬＷＡＮＧ Ｄｅ￣ｙａꎬ ＹＵ Ｃｈｅｎｇ￣ｍｉｎｇꎬ ＹＵＡＮ Ｘｕｅ￣ｆｅｎｇ (Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｐｌａｎｔ Ｐｒｏｔｅｃ￣
ｔｉｏｎꎬ Ｓｈａｎｄｏｎｇ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙꎻ Ｓｈａｎｄｏｎｇ Ｐｒｏｖｉｎｃｅ Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙꎬ Ｔａｉ′ａｎ ２７１０１８ꎬＣｈｉｎａ)
Ａｂｓｔｒａｃｔ: ＯＲＦ１ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ Ｔｏｂａｃｃｏ ｂｕｓｈｙ ｔｏｐ ｖｉｒｕｓ (ＴＢＴＶ) ｗａｓ ａｍｐｌｉｆｉｅｄ ａｎｄ ｃｌｏｎｅｄ ｉｎｔｏ ｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃ ｅｘ￣
ｐｒｅｓｓｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒ ｐＥＨＩＳＴＥＶ. Ｔｈｅ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｐｌａｓｍｉｄ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ＯＲＦ１ ｏｆ ＴＢＴＶ ｗａｓ ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ ｉｎｔｏ Ｅ.ｃｏｌｉ
Ｒｏｓｅｔｔａ ａｎｄ ｐｅｒｆｏｒｍｅｄ ｔｏ ｅｘｐｒｅｓｓ ＯＲＦ１ ｐｒｏｔｅｉｎ ｕｎｄｅｒ ｔｈｅ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ＩＰＴＧ. Ｔｈｅ ｐｕｒｉｆｉｅｄ ＯＲＦ１ ｐｒｏｔｅｉｎ ｆｒｏｍ
ＳＤＳ￣ＰＡＧＥ ｇｅｌ ｗａｓ ｕｓｅｄ ｔｏ ｉｎｊｅｃｔ ｔｈｅ ｒａｂｂｉｔｓ ａｓ ａｎｔｉｇｅｎｓ ｔｏ ｇｅｔ ａｎｔｉｓｅｒｕｍ ｗｉｔｈ ｈｉｇｈ ｔｉｔｅｒ ａｔ １ ∶ ２４ ３０００ ｂｙ ｉｎｄｉ￣
ｒｅｃｔ ＥＬＩＳＡ.Ｔｈｒｏｕｇｈ ｔｈｅ ａｎｔｉｇｅｎ ａｆｆｉｎｉｔｙ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎꎬ ｔｈｅ ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ａｇａｉｎｓｔ ＯＲＦ１ ｐｒｏｔｅｉｎ ｗｉｔｈ ｈｉｇｈｅｒ
ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ａｎｄ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｗａｓ ｐｕｒｉｆｉｅｄ ｆｒｏｍ ｗｈｏｌｅ ａｎｔｉｓｅｒｕｍ. Ｔｈｅ ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｃｏｕｌｄ ｂｅ ｕｓｅｄ ｔｏ ｄｅｔｅｃｔ ｔｈｅ
ＯＲＦ１ ｏｆ ｔｈｅ ＴＢＴＶ￣ｉｎｆｅｃｔｅｄ ｔｏｂａｃｃｏｓ ｉｎ ｔｈｅ ｆｉｅｌｄ ａｓ ｗｅｌｌ ａｓ ｉｎ ｖｉｖｏ ( ｒｅｆｅｒ ｔｏ Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔｓ) ａｎｄ ｉｎ
ｖｉｔｒｏ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ ( ｒｅｆｅｒ ｔｏ ＷＧＥ)ꎬ ｉｎ ｗｈｉｃｈ ＴＢＴＶ ｆｕｌｌ￣ｌｅｎｇｔｈ ＲＮＡ ｗａｓ ｉｎｃｕｂａｔｅｄ. Ｉｎ ａｄｄｉｔｉｏｎꎬ ＯＲＦ２
ｗａｓ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ ｔｏ ｂｅ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ａｓ ＯＲＦ１￣ｅｘｔｅｎｄｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎꎬ ｐｏｓｓｉｂｌｙ ｔｈｒｏｕｇｈ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ ｆｒａｍｅｓｈｉｆｔ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ
ｂａｓｅｄ ｏｎ ｔｈｅ ｏｖｅｒ￣ｌａｐｐｉｎｇ ｓｔａｔｕｓ ｏｆ ＯＲＦ１ ａｎｄ ＯＲＦ２ꎬ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｈｅｐｔａ￣ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｌｉｐｐｅｒｙ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ ｄｏｗｎ￣
ｓｔｒｅａｍ ｓｔａｂｌｅ ｓｔｅｍ￣ｌｏｏｐ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ. Ｔｈｉｓ ｐｒｏｊｅｃｔ ｐｒｏｖｉｄｅｄ ｓｕｂｓｔａｎｔｉａｌ ｓｅｒｏｌｏｇｉｃａｌ ｓｕｐｐｏｒｔ ｆｏｒ ｔｈｅ ｃｏｎｓｅｑｕｅｎｔ ｒｅｓｅａｒｃｈ
ｏｎ ｔｈｅ ｄｅｔａｉｌｅｄ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｏｆ ｔｈｅ ｍｕｌｔｉ￣ｌｅｖｅｌｓ ｏｆ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ ｏｆ ＯＲＦ１ ａｎｄ ＯＲＦ２ ｉｎ Ｔｏｂａｃｃｏ ｂｕｓｈｙ ｔｏｐ ｖｉｒｕｓ.
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ: Ｔｏｂａｃｃｏ ｂｕｓｈｙ ｔｏｐ ｖｉｒｕｓꎻ ＯＲＦ１ꎻ ｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎꎻ ａｎｔｉｓｅｒｕｍꎻ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ ｆｒａｍｅｓｈｉｆｔ
中图分类号: Ｓ４３２.４１ 文献标识码: Ａ 文章编号: ０４１２￣０９１４(２０１６)０１￣００６３￣０９
烟草丛顶病毒 ( Ｔｏｂａｃｃｏ ｂｕｓｈｙ ｔｏｐ ｖｉｒｕｓꎬ
ＴＢＴＶ)属于幽影病毒属(Ｕｍｂｒａｖｉｒｕｓ)ꎬ自然状态
下与黄症病毒科( Ｌｕｔｅｏｖｉｒｉｄａｅ)的烟草脉扭病毒
(Ｔｏｂａｃｃｏ ｖｅｉｎ ｄｉｓｔｏｒｔｉｎｇ ｖｉｒｕｓꎬＴＶＤＶ)复合侵染导
致烟草丛顶病[１]ꎮ 感病烟株叶色淡绿或黄化ꎬ并
伴有系统坏死枯斑ꎬ苗期感病烟株严重矮化、缩顶ꎬ
叶片变小ꎬ而晚期感病的烟株腋芽过度增生ꎬ为密
生小叶、小枝的丛枝状ꎮ ２０ 世纪 ９０ 年代烟草丛顶
病在云南保山、三江流域暴发流行ꎬ给部分烟区造
成毁灭性灾害[２]ꎮ ＴＢＴＶ 在自然界的传播主要依
植物病理学报 ４６卷
靠介体蚜虫ꎬ由 ＴＶＤＶ 基因组编码的病毒外壳蛋
白是重要的蚜传因子ꎮ ＴＢＴＶ 在实验室条件下可
通过摩擦接种侵染烟草[３]ꎮ
ＴＢＴＶ 基因组是一条由 ４ １５２ 个核苷酸组成
的正义单链 ＲＮＡ[４]ꎬ软件预测和同源比对表明其
基因组编码 ４个蛋白(图 １)ꎬ编码框有 ８ 个密码子
重叠的 ＯＲＦ１(编码分子量为 ３５ ｋＤ蛋白)和 ＯＲＦ２
(编码分子量为 ６３ ｋＤ 蛋白)ꎬ可能是病毒的复制
酶组分[５]ꎬＯＲＦ３(编码分子量为 ２６ ｋＤ 蛋白)可能
参与病毒的长距离运输[６ꎬ７]ꎬＯＲＦ４(编码分子量为
２７ ｋＤ 蛋白)可能是病毒细胞间运动的功能蛋
白[８ꎬ９]ꎮ 以上关于 ＴＢＴＶ 基因组编码蛋白的功能
没有直接的实验证据ꎬ均来自于同属其他病毒的研
究结果ꎮ 根据 ＯＲＦ１ 和 ＯＲＦ２ 的重叠排列形式以
及在 ＯＲＦ１终止密码子上游的潜在七核苷酸滑动
序列( ＵＧＣＵＡＧꎬ阴影部分为七核苷酸
序列ꎬ终止密码子为斜体)的情况推测ꎬＯＲＦ２ 蛋白
可能是通过￣１ 位的移码( ｆｒａｍｅｓｈｉｆｔꎬ ｆｓ)机制表达
的ꎬ而以 ＯＲＦ１延长蛋白的形式存在ꎮ 由于 ＯＲＦ２编
码部分含有 ＧＤＤ 结构域ꎬ此 ＯＲＦ１ 延长蛋白起到
ＲＮＡ依赖的 ＲＮＡ聚合酶(ＲｄＲｐ)的作用[５ꎬ１０]ꎮ
特异性抗体的制备是病毒检测和基因表达调
控研究的有效手段ꎮ Ｌｏｎｇ 等[１１] 制备的 ＴＢＴＶ
ＯＲＦ３ 和 ＯＲＦ４ 蛋白抗血清可用于田间发病的烟
草丛顶样品的检测ꎮ 为研究 ＴＢＴＶ ＯＲＦ１和 ＯＲＦ２
的表达情况ꎬ本文制备了 ＴＢＴＶ ＯＲＦ１ 的多克隆抗
体ꎮ 首先克隆 ＴＢＴＶ 的 ＯＲＦ１ 基因并进行原核表
达ꎬ以纯化的 ＯＲＦ１ 蛋白为抗原免疫家兔ꎬ抗血清
经抗原亲和纯化后获得 ＯＲＦ１ 的多克隆抗体ꎮ 此
抗体既可以检测田间的烟草丛顶病样品中 ＴＢＴＶ
ＯＲＦ１ 的表达ꎬ也可检测体内和体外翻译体系中
ＴＢＴＶ ＯＲＦ１的表达ꎻ 确认 ＴＢＴＶ编码的 ＯＲＦ２ 蛋
白是以 ＯＲＦ１延长蛋白的形式存在ꎮ 为进一步深
入研究 ＴＢＴＶ ＯＲＦ１ 蛋白的表达调控以及 ＯＲＦ２
蛋白的移码翻译调控奠定了血清学基础ꎮ
１ 材料与方法
１.１ 菌种、载体和感病材料
大肠杆菌 ＤＨ５α 菌株、ＢＬ２１(ＤＥ３)Ｒｏｓｅｔｔａ 菌
株和原核表达载体 ｐＥＨＩＳＴＥＶ[１２]由山东农业大学
植保学院李向东教授惠赠ꎮ 田间发病的烟草丛顶
病叶由云南农业大学李凡教授惠赠ꎮ 质粒 ｐＴ７￣
Ｒｌｕｃ(含海肾荧光素酶 Ｒｌｕｃ的序列)由美国马里兰
大学 Ａｎｎｅ Ｅ. Ｓｉｍｏｎ 教授惠赠ꎮ 质粒 ｐＭＴＢ１(Ｔ７
启动子下游含有 ＴＢＴＶ 全长序列ꎬＧｅｎＢａｎｋ 登录
号:ＮＣ００４３６６)由本实验室构建并保存ꎮ
１.２ 引物设计与合成
所有引物(表 １)均由上海生工股份有限公司合成ꎮ
１.３ ＴＢＴＶ ＯＲＦ１蛋白的原核表达、纯化
１.３.１ 原核表达 原核表达质粒转化大肠杆菌
ＢＬ２１(ＤＥ３)Ｒｏｓｅｔｔａꎮ 挑取阳性单菌落接种于 ＬＢ
液体培养基ꎬ３７ ℃过夜培养ꎬ再按 １ ∶ １００ 比例转
接至新鲜的 ＬＢ 液体培养基ꎬ培养至 ＯＤ６００值达到
０.４ 左右ꎬ分别在 ０.２ ｍｍｏｌ / Ｌ ~ １.０ ｍｍｏｌ / Ｌ ＩＰＴＧ
条件下 ３７ ℃诱导培养 ４ ｈꎬ培养物经 ＳＤＳ￣ＰＡＧＥ
电泳分析目的蛋白的表达ꎮ 在确定有目的蛋白表
达的前提下ꎬ利用超声波破碎培养物ꎬ离心后分别
收集上清和沉淀ꎬ然后 ＳＤＳ￣ＰＡＧＥ 电泳分析目的
蛋白的可溶性ꎮ
１.３.２ 蛋白的切胶纯化 离心收集原核表达的培
养物ꎬ超声波破碎后收集沉淀ꎬ用含 ８ ｍｏｌ / Ｌ 尿素
的 ＰＢＳ 缓冲液重悬沉淀ꎬ经 １２.５％的 ＳＤＳ￣ＰＡＧＥ
电泳后将凝胶用预冷的显色溶液(０. ２５ ｍｍｏｌ / Ｌ
ＫＣｌꎬ１ ｍｍｏｌ / Ｌ ＤＴＴ)浸泡 ５ ~ １０ ｍｉｎ 至显出白色
沉淀带ꎬ重蒸水冲洗后切下含目的条带的凝胶ꎮ 将
凝胶放在预先处理的透析袋中ꎬ在蛋白电泳缓冲液
中水平电泳 ２ ｈꎬ取出凝胶条ꎬ在 ０.８％的生理盐水
中 ４℃过夜透析ꎬ得到纯化蛋白ꎮ
Ｆｉｇ. １ Ｇｅｎｏｍｉｃ ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｔｏｂａｃｃｏ ｂｕｓｈｙ ｔｏｐ ｖｉｒｕｓ
４６
１期 王国鲁ꎬ等:烟草丛顶病毒 ＯＲＦ１蛋白的多克隆抗体制备及应用
Ｔａｂｌｅ １ Ｌｉｓｔ ｏｆ ｐｒｉｍｅｒｓ ｕｓｅｄ ｉｎ ｔｈｉｓ ｐａｐｅｒ
Ｐｒｉｍｅｒ ｎａｍｅ Ｐｒｉｍｅｒ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ (５′→３′) Ｐｏｌａｒｉｔｙ Ｔｅｍｐｌａｔｅ
ＴＢ￣ＯＲＦ１￣５Ｆ ５￣ＧＡＴＣＧＡＴＡＴＣＡＴＧＧＡＧＴＴＣＡＴＣＡＡＣＡＡＧＡＴＡＡＡＧＣ￣３ꎬ
Ｕｎｄｅｒｌｉｎｅｄ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ｉｎｄｉｃａｔｅ ＥｃｏＲ Ｖ ｓｉｔｅ
＋ ＴＢＴＶ (ＮＣ００４３６６)
ＴＢ￣ＯＲＦ１￣３Ｒ ５￣ＧＡＴＣＧＡＡＴＴＣＴＣＡＣＴＡＧＣＡＡＡＡＡＴＣＣＴＴＧＧＧＣＣＣＡＣ￣３ꎬ
Ｕｎｄｅｒｌｉｎｅｄ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ｉｎｄｉｃａｔｅ ＥｃｏＲ Ｉ ｓｉｔｅ
－ ＴＢＴＶ (ＮＣ００４３６６)
Ｒｌｕｃ￣Ｆ ５￣ＧＡＴＣＡＴＧＣＡＴＣＡＴＧＡＣＴＴＣＧＡＡＡＧＴＴＴＡＴＧＡＴＣＣＡＧ￣３
Ｕｎｄｅｒｌｉｎｅｄ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ｉｎｄｉｃａｔｅ Ｎｓｉ Ｉ ｓｉｔｅ
＋ Ｒｅｎｉｌｌａ ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅꎬ ＲＬｕｃ
Ｒｌｕｃ￣Ｆ￣Ｍ ５￣ＧＡＴＣＡＴＧＣＡＴＡＴＧＡＣＴＴＣＧＡＡＡＧＴＴＴＡＴＧＡＴＣＣＡＧ￣３
Ｕｎｄｅｒｌｉｎｅｄ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ｉｎｄｉｃａｔｅ Ｎｓｉ Ｉ ｓｉｔｅ
＋ Ｒｅｎｉｌｌａ ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅꎬ ＲＬｕｃ
Ｒｌｕｃ￣Ｔｅｒｍ￣Ｒ ５￣ＧＡＴＣＡＧＡＴＣＴＴＴＡＣＧＴＣＧＡＣＡＴＴＴＧＴＴＣＡＴＴＴＴＴＧ￣３
Ｕｎｄｅｒｌｉｎｅｄ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ｉｎｄｉｃａｔｅ Ｂｇｌ ＩＩ ｓｉｔｅ
－ Ｒｅｎｉｌｌａ ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅꎬ ＲＬｕｃ
Ｎｏｔｅ:Ｉｔａｌｉｃ ｐａｒｔ ｉｓ ｔｈｅ ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ｏｆ ｐｒｉｍｅｒｓ.
１.４ 抗血清的制备与间接 ＥＬＩＳＡ测定效价
１.４.１ 抗血清的制备
(１)免疫前从兔子耳缘静脉取血 ０.５ ~ １ ｍＬꎬ
分离抗血清ꎬ作为免疫前的背景ꎬ备用ꎮ
(２)用纯化的 ＯＲＦ１ 蛋白免疫新西兰大耳白
兔ꎬ共免疫 ４次(第 １ 与第 ２ 次免疫间隔 ３ 周ꎬ第 ２
~４ 次免疫间隔均为 ２ 周)ꎬ每次的蛋白量为 ０.５
ｍｇꎮ 第 １次与等体积的弗氏完全佐剂混合ꎬ注射
皮下 ６点ꎬ第 ２ ~ ４ 次与等体积的弗氏不完全佐剂
混合ꎬ注射皮下 ４ 点ꎮ 第 ４ 次免疫 １０ ｄ 后耳缘静
脉取血ꎬ ３７℃静置 １ ｈꎬ４℃静置过夜ꎬ６ ０００ ｒ / ｍｉｎ
离心 ２０ ｍｉｎꎬ分离抗血清ꎬ然后利用间接 ＥＬＩＳＡ检
测效价ꎬ若效价达标ꎬ则在效价测定的第 ２ ｄ 以心
脏穿刺的方法采血ꎬ并分离抗血清ꎬ保存于－８０℃ꎮ
１.４.２ 间接 ＥＬＩＳＡ ２ μｇ / ｍＬ 的免疫原蛋白包被
到酶标板中ꎬ１００ μＬ /孔ꎬ４℃过夜ꎻＰＢＳＴ 洗涤 ３ 次
后ꎬ利用 ５％脱脂奶粉封闭ꎬ３００ μＬ /孔ꎬ３７℃ꎬ封闭 ２
ｈꎻＰＢＳＴ洗涤 ３次后ꎬ将待检测抗血清或免疫前血清
按设计稀释度稀释后加入酶标板中ꎬ１００ μＬ /孔ꎬ
３７℃ꎬ孵育 １ ｈ 进行一抗反应ꎻＰＢＳＴ 洗涤 ３ 次后ꎬ
ＨＲＰ标记的山羊抗兔 ＩｇＧ 按适当比例稀释后加入
酶标板ꎬ１００ μＬ /孔ꎬ３７℃ꎬ孵育 ４０ ｍｉｎ 进行二抗反
应ꎻＰＢＳＴ洗涤 ３次后加入现配的 ＴＭＢ底物显色工
作液(ＣＷｂｉｏ 公司 ＣＷ００５０)ꎬ１００ μＬ /孔ꎬ显色 １０
ｍｉｎꎻ加入 ２ ｍｏｌ / Ｌ Ｈ２ＳＯ４终止显色ꎬ５０ μＬ /孔ꎻ最终
用酶标仪(ＢＩＯ￣ＲＡＤ ６８０)测 ４５０ ｎｍ波长的 ＯＤ值ꎮ
１.５ 抗原亲和纯化
１.５.１ 抗原亲和柱制备 用活化缓冲液将 ＣｎＢｒ￣
ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４Ｂ(ＧＥ)充分活化ꎬ然后 Ｃｏｕ￣
ｐｌｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ平衡活化的 ＣｎＢｒ凝胶至基线平稳ꎻ将
抗原加入平衡好的层析柱凝胶中常温旋转反应 ２ ｈ
挂柱ꎬ然后加入封闭缓冲液常温旋转反应 １ ｈꎬ封闭
剩余活化基团ꎻ最后用Ｗａｓｈｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ１和Ｗａｓｈｉｎｇ
Ｂｕｆｆｅｒ２交替洗制备好的抗原亲和柱ꎬ备用ꎮ
１.５.２ 特异性抗体纯化 用 Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ 平衡
抗原亲和柱至基线平稳ꎻ然后将待纯化的抗血清负
载上柱ꎬ收集流穿液ꎬ再将流穿液二次上柱ꎬ继续平
衡至基线平稳ꎻ加入 Ｅｌｕｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ 洗脱ꎬ收集洗脱
峰ꎬＳＤＳ￣ＰＡＧＥ检测纯度ꎮ 用 ０.０１ ｍｏｌ / Ｌꎬ ｐＨ ７.２
ＰＢＳ 透析收集的洗脱峰ꎬ使纯化后的抗体保存在
０.０１ ｍｏｌ / Ｌꎬ ｐＨ ７.２ ＰＢＳ 环境中ꎮ 最终浓缩透析
后的抗体ꎬ并用蛋白定量检测仪测定特异抗体
浓度ꎮ
所有相关的溶液和试剂均来自康为世纪公司
的抗原纯化试剂盒ꎮ
１.６ Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ
取 １０ μＬ 蛋白样品进行 ＳＤＳ￣ＰＡＧＥ电泳后ꎬ用
电转移的方法将蛋白质转移至硝酸纤维素膜上(２００
ｍＡꎬ８０ ｍｉｎ)ꎻ然后将硝酸纤维素膜在 ＴＢＳＴ缓冲液
中漂洗ꎬ转入 １０ ｍＬ 封闭液(ＴＢＳＴ＋５％脱脂奶粉)
中 ３７℃封闭 １ ｈꎻ封闭完成后ꎬ直接在封闭液中按一
定比例加入特异性抗体或抗血清ꎬ３７℃反应 １ ｈꎮ 在
ＴＢＳＴ缓冲液中漂洗 ３ 次ꎬ每次 １０ ｍｉｎꎬ加入用
ＴＢＳＴ稀释(１ ∶ ５ ０００)的二抗ＨＲＰ￣ＩｇＧꎬ３７℃反应 ３０
~６０ ｍｉｎꎮ 再用 ＴＢＳＴ洗膜 ３次ꎬ每次 １０ ｍｉｎꎮ 取等
体积的 ＥＣＬ 化学发光试剂 Ｒｅａｇｅｎｔ １ 和 Ｒｅａｇｅｎｔ ２
混合均匀制成显色液ꎬ将硝酸纤维素膜置于培养皿
中ꎬ除去多余的 ＴＢＳＴ缓冲液ꎬ将显色液均匀覆盖在
５６
植物病理学报 ４６卷
上面ꎬ孵育 ３０ ｓꎬ除去显色液ꎬ然后放置在 ＥＣＬ发光
检测仪(Ｔａｎｏｎ ５５００ Ｍｕｌｔｉ)上拍照ꎮ
１.７ ＴＢＴＶ在麦胚提取物(Ｗｈｅａｔ ｇｅｒｍ ｅｘｔｒａｃｔꎬ
ＷＧＥ)中的体外翻译反应
参照 Ｐｒｏｍｅｇａ 的产品说明书ꎬ线性化质粒在
Ｔ７ ＲＮＡ聚合酶进行体外转录制备野生型和突变
型 ＴＢＴＶ的全长 ＲＮＡꎬ经酚仿抽提和乙醇沉淀后
的 １ μｇ ＲＮＡ 加入到 ２５ μＬ 的反应体系中(１２.５
μＬ ＷＧＥ、 氨基酸混合物 ２.０ μＬ、０.１ ｍｏｌ / Ｌ ＫＡｃ、
２ ｍｍｏｌ / Ｌ ＭｇＣｌ２、ＲＮａｓｅ抑制剂 ０.５ μＬ)２５℃反应
２ ｈꎬ然后进行检测ꎮ
１.８ 拟南芥原生质体的制备及侵染试验
参照文献[１３]的方法ꎬ将表面消毒的 Ｃｏｌ￣０拟
南芥种子在 ＭＳ 固体培养基上诱导愈伤ꎬ第 ４ ~ ６
代的愈伤组织在酶解液(纤维素酶 /果胶酶＝５ ∶ １)
的作用下避光酶解 ４ ｈꎬ经 ２００ 目筛网过滤得到原
生质体ꎮ ２０~３０ μｇ体外转录物在 ５０ ％ ＰＥＧ的作
用下侵染 ５×１０６个细胞ꎬ室温孵育 １８ ｈ后收集细胞
进行检测ꎮ
１.９ ＴＢＴＶ全长 ｃＤＮＡ克隆的突变体构建
１.９.１ ＴＢＴＶ ＯＲＦ２ 蛋白编码框的部分替换突变
体 以质粒 ｐＴ７￣Ｒｌｕｃ 为模板ꎬ利用引物 Ｒｌｕｃ￣Ｆ 和
Ｒｌｕｃ￣Ｔｅｒｍ￣Ｒꎬ在 Ｐｆｕ Ｔａｑ 酶作用下进行 ＰＣＲ 扩增
得到 Ｒｌｕｃ 的编码序列ꎮ 此 ＰＣＲ 产物经 Ｎｓｉ Ｉ 和
Ｂｇｌ ＩＩ双酶切后与同样经 Ｎｓｉ Ｉ 和 Ｂｇｌ ＩＩ 双酶切的
ｐＭＴＢ１连接ꎬ得到 ＴＢＴＶ ＯＲＦ２ 蛋白编码框的部
分替换突变体(部分替换后的 ＯＲＦ２蛋白分子量约
为 ５９ ｋＤ)ꎮ
１.９.２ ＴＢＴＶ ＯＲＦ２ 蛋白编码框的提前终止突变
体 以质粒 ｐＴ７￣Ｒｌｕｃ 为模板ꎬ利用引物 Ｒｌｕｃ￣Ｆ￣Ｍ
和 Ｒｌｕｃ￣Ｔｅｒｍ￣Ｒꎬ在 Ｐｆｕ Ｔａｑ 酶作用下进行 ＰＣＲ 扩
增得到 Ｒｌｕｃ的编码序列ꎮ 此 ＰＣＲ 产物经 Ｎｓｉ Ｉ 和
Ｂｇｌ ＩＩ双酶切后与同样经 Ｎｓｉ Ｉ 和 Ｂｇｌ ＩＩ 双酶切的
ｐＭＴＢ１连接ꎬ得到 ＴＢＴＶ ＯＲＦ２ 蛋白编码框的提
前终止突变体(翻译提前终止的 ＯＲＦ２蛋白分子量
约为 ２３ ｋＤ)ꎮ
２ 个突变体仅用于 ＯＲＦ２ 表达及存在形式的
研究ꎬ突变体的具体构建及鉴定过程未在文中
呈现ꎮ
２ 结果与分析
２.１ ＴＢＴＶ ＯＲＦ１蛋白的原核表达载体构建
以 ｐＭＴＢ１ 为模板ꎬ利用引物 ＴＢ￣ＯＲＦ１￣５Ｆ 和
ＴＢ￣ＯＲＦ１￣３Ｒ在 Ｐｆｕ Ｔａｑ ＤＮＡ 聚合酶的作用下扩
增得到约 ９５０ ｂｐ 的 ＰＣＲ 产物ꎬＰＣＲ 产物和质粒
ｐＥＨＩＳＴＥＶ分别经 ＥｃｏＲ Ｖ 和 ＥｃｏＲ Ｉ 双酶切和胶
回收后进行连接ꎬ转化产物经菌落 ＰＣＲ 筛选得到
阳性克隆 ｐＥＨ￣ＴＢ￣ＯＲＦ１ꎮ 提取质粒进行酶切鉴
定ꎬＥｃｏＲ Ｖ和 ＥｃｏＲ Ｉ的双酶切得到约 ９５０ ｂｐ酶切
条带(图 ２￣Ａ)ꎬ说明重组质粒中含有与 ＴＢＴＶ 的
ＯＲＦ１ 片段大小吻合的插入片段ꎮ 另外ꎬ以质粒
ｐＥＨ￣ＴＢ￣ＯＲＦ１ 为模板ꎬ利用引物 ＴＢ￣ＯＲＦ１￣５Ｆ 和
ＴＢ￣ＯＲＦ１￣３Ｒ进行 ＰＣＲ得到约 ９５０ ｂｐ 的产物(图
２￣Ｂ)ꎮ 测序验证 ＴＢＴＶ ＯＲＦ１ 插入片段与载体的
接头情况ꎬ结果显示 ＴＢＴＶ ＯＲＦ１ 插入位置正确且
没有移码和随机突变的发生(测序图未展示)ꎮ
Ｆｉｇ. ２ Ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ ａｎｄ ＰＣＲ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ
ｐｌａｓｍｉｄ ｐＥＨ￣ＴＢ￣ＯＲＦ１
Ａ: Ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｐＥＨ￣ＴＢ￣ＯＲＦ１ꎻ Ｍ: λＤＮＡ /
ＥｃｏＲ Ｉ ＋ Ｈｉｎｄ ＩＩＩꎻ Ｌａｎｅ １: ｐＥＨ￣ＴＢ￣ＯＲＦ１ / ＥｃｏＲ Ｖ＋ＥｃｏＲ Ｉ.
Ｂ: ＰＣＲ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｐＥＨ￣ＴＢ￣ＯＲＦ１ꎻ Ｍ: ＤＮＡ ｍａｒｋｅｒ
(ＤＬ２０００)ꎻ Ｌａｎｅ １: ＰＣＲ ｐｒｏｄｕｃｔ.
２.２ ＴＢＴＶ ＯＲＦ１蛋白的原核表达及纯化
质粒 ｐＥＨ￣ＴＢ￣ＯＲＦ１ 转化大肠杆菌 ＢＬ２１
(ＤＥ３)Ｒｏｓｅｔｔａꎬ在不同浓度梯度的 ＩＰＴＧ (０.２ ~ １.０
ｍｍｏｌ / Ｌ)诱导下进行蛋白表达ꎬＳＤＳ￣ＰＡＧＥ电泳显
示经 ＩＰＴＧ 诱导表达的蛋白分子量在 ３１.０ ~ ４３.０
ｋＤ之间ꎬ与 ＯＲＦ１ 蛋白的分子量 ( ３５ ｋＤ)相符
(图 ３)ꎮ
原核表达产物的可溶性分析表明ꎬ在正常诱导
６６
１期 王国鲁ꎬ等:烟草丛顶病毒 ＯＲＦ１蛋白的多克隆抗体制备及应用
Ｆｉｇ. ３ ＳＤＳ￣ＰＡＧＥ ｏｆ ｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ
ｐｒｏｄｕｃｔ ｏｆ ｐＥＨ￣ＴＢ￣ＯＲＦ１
Ｌａｎｅ Ｍ: Ｐｒｏｔｅｉｎ ｍａｒｋｅｒꎻ Ｌａｎｅ １ － ５: Ｅ. ｃｏｌｉ ｐｒｏｔｅｉｎ ｕｎｄｅｒ
ｔｈｅ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ０.２ꎬ ０.４ꎬ ０.６ꎬ ０.８ ａｎｄ １.０ ｍｍｏｌ / Ｌ ＩＰＴＧꎻ
Ｌａｎｅ ６: Ｅ.ｃｏｌｉ ｐｒｏｔｅｉｎ ｗｉｔｈｏｕｔ ｔｈｅ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ＩＰＴＧ (ｎｅｇａ￣
ｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌ) .
条件下ꎬ诱导表达的 ＯＲＦ１ 蛋白大部分在沉淀中ꎮ
为获得高浓度和高纯度的 ＯＲＦ１ 蛋白ꎬ采用原核表
达产物的包涵体纯化及切胶回收方法ꎬ纯化的蛋白
样品经 ＳＤＳ￣ＰＡＧＥ 电泳显示ꎬ不同批次纯化的
ＯＲＦ１蛋白纯度均较高ꎬ目的蛋白比重达 ９０％ 以
上ꎬ可以用作家兔的免疫抗原(蛋白的可溶性分析
和纯化产物的 ＳＤＳ￣ＰＡＧＥ未显示)ꎮ
２.３ ＴＢＴＶ ＯＲＦ１抗血清的制备、效价测定以及免
疫原性分析
利用纯化的 ＴＢＴＶ ＯＲＦ１ 蛋白皮下注射免疫
新西兰大耳白兔ꎬ４次免疫后取血获得抗血清ꎮ 以
纯化的 ＯＲＦ１ 蛋白为抗原ꎬ用间接 ＥＬＩＳＡ 检测抗
血清的效价ꎬ结果发现１＃兔和２＃兔的抗血清进行
１ ∶ ２４３ ０００ 稀释时仍表现出阳性反应 (表 ２)ꎮ
Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ 分析显示ꎬ在约 ４０ ｋＤ 处有信号强的
杂交条带ꎬ表明制备的抗血清能与原核表达的
ＯＲＦ１蛋白以及切胶纯化的 ＯＲＦ１ 蛋白发生特异
性免疫反应(图 ４ꎬ泳道 １和 ２)ꎻ同时此 ＯＲＦ１抗血
清还与大肠杆菌的部分蛋白有非特异性反应(图 ４ꎬ
泳道 ３)ꎬ泳道 ２中分子量小于 ＯＲＦ１蛋白的杂交条
带ꎬ可能为 ＯＲＦ１蛋白的降解产物(图 ４)ꎮ
Ｆｉｇ. ４ Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ａｎｔｉ￣ＴＢＴＶ￣ＯＲＦ１
ａｎｔｉｓｅｒｕｍ
Ｌａｎｅ Ｍ: Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｍａｒｋｅｒꎻ Ｌａｎｅ １:Ｐｕｒｉｆｉｅｄ ＴＢＴＶ ＯＲＦ１ ｐｒｏ￣
ｔｅｉｎｓꎻ Ｌａｎｅ ２: Ｅ. ｃｏｌｉ ｐｒｏｔｅｉｎ ｕｎｄｅｒ ｔｈｅ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ０. ２
ｍｍｏｌ / Ｌ ＩＰＴＧꎻ Ｌａｎｅ ３: Ｅ.ｃｏｌｉ ｐｒｏｔｅｉｎ ｗｉｔｈｏｕｔ ｔｈｅ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ
ｏｆ ＩＰＴＧ (ＣＫ－) .
２.４ ＴＢＴＶ ＯＲＦ１抗血清的抗原亲和纯化
利用 ＯＲＦ１ 的抗血清检测 ＴＢＴＶ 在 ＷＧＥ 中
的反应产物ꎬ可以检测到ＯＲＦ１的表达ꎻ但同时存
Ｔａｂｌｅ ２ Ｔｉｔｅｒ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ａｎｔｉ￣ＴＢＴＶ￣ＯＲＦ１ ａｎｔｉｓｅｒｕｍ ｂｙ ｉｎｄｉｒｅｃｔ ＥＬＩＳＡ
Ａｎｔｉｓｅｒｕｍ
ｄｉｌｕｔｉｏｎ
１＃ ｒａｂｂｉｔ
ｎｅｇａｔｉｖｅ
１＃ ｒａｂｂｉｔ
ｐｏｓｉｔｉｖｅ
ＯＤ ｐｏｓｉｔｉｖｅ /
ＯＤ ｎｅｇａｔｉｖｅ
２＃ ｒａｂｂｉｔ
ｎｅｇａｔｉｖｅ
２＃ ｒａｂｂｉｔ
ｐｏｓｉｔｉｖｅ
ＯＤ ｐｏｓｉｔｉｖｅ /
ＯＤ ｎｅｇａｔｉｖｅ
１ ∶ １ ０００ ０.０５８ ２.７４２ ４７.３ ０.１６９ ３.２３２ １９.１
１ ∶ ３ ０００ ０.０４４ １.８３５ ４１.７ ０.１２１ ２.９６７ ２４.５
１ ∶ ９ ０００ ０.０４１ ０.８０４ １９.５ ０.０３５ ２.０８４ ５９.５
１ ∶ ２７ ０００ ０.０４０ ０.３０４ ７.６ ０.０３４ ０.９９９ ２９.４
１ ∶ ８１ ０００ ０.０３３ ０.１３８ ４.２ ０.０３０ ０.５０７ １６.９
１ ∶ ２４３ ０００ ０.０２１ ０.１１０ ４.５ ０.０２１ ０.１８６ ８.９
１ ∶ ７２９ ０００ ０.０１５ ０.０３４ ２.２ ０.０１８ ０.０６９ ３.８
ＣＫ￣ ０.０１８ ０.０３０ ０.０１２ ０.０４０
Ｎｏｔｅ: ＯＤ ｐｏｓｉｔｉｖｅ / ＯＤ ｎｅｇａｔｉｖｅ >２.１ꎬａｎｄ ＯＤ ｐｏｓｉｔｉｖｅ >０.１ ｉｓ ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｔｉｔｅｒ.
７６
植物病理学报 ４６卷
Ｆｉｇ. ５ Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｂｅｔｗｅｅｎ ａｎｔｉ￣ＴＢＴＶ￣ＯＲＦ１ ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ
ａｎｔｉｂｏｄｙ ａｎｄ ａｎｔｉｓｅｒｕｍ ａｆｔｅｒ / ｂｅｆｏｒｅ ａｎｔｉｇｅｎ ａｆｆｉｎｉｔｙ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ
Ａ: Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ＴＢＴＶ ＯＲＦ１ ｉｎ ＷＧＥ ｗｉｔｈ ｗｈｏｌｅ ａｎｔｉｓｅｒｕｍ ｂｅｆｏｒｅ ａｎｔｉｇｅｎ ａｆｆｉｎｉｔｙ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ.
Ｂ: Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ＴＢＴＶ ＯＲＦ１ ｉｎ ＷＧＥ ｗｉｔｈ ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ａｆｔｅｒ ａｎｔｉｇｅｎ ａｆｆｉｎｉｔｙ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ.
Ｌａｎｅ Ｍ: Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｍａｒｋｅｒꎻ Ｌａｎｅ １: Ｐｕｒｉｆｉｅｄ ＯＲＦ１ ｐｒｏｔｅｉｎｓꎻ
Ｌａｎｅ ２: Ｍｏｃｋꎻ Ｌａｎｅ３ꎬ ４: Ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ ｐｒｏｄｕｃｔｓ ｏｆ ＴＢＴＶ ｆｕｌｌ￣ｌｅｎｇｔｈ ＲＮＡ ｉｎ ＷＧＥ.
在很多非特异性反应条带ꎬ杂交反应的背景较高ꎬ
无法满足后续的试验要求(图 ５￣Ａ)ꎮ
为改进此 ＴＢＴＶ ＯＲＦ１抗血清的反应特异性ꎬ
利用纯化的 ＴＢＴＶ ＯＲＦ１蛋白制备抗原亲和柱ꎬ进
行抗原亲和纯化试验得到分子量约为 ４５ ｋＤ 的
ＯＲＦ１多克隆抗体(ＳＤＳ￣ＰＡＧＥ 电泳图未显示)ꎬ其
对 ＯＲＦ１ 蛋白的检测灵敏度为 ３.３ ｎｇ / ｍＬ(表 ３)ꎮ
Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ 分析显示ꎬ与抗原亲和纯化前的
ＴＢＴＶ ＯＲＦ１ 抗血清相比ꎬ抗原亲和纯化后的
ＴＢＴＶ ＯＲＦ１多克隆抗体与ＷＧＥ体外翻译系统中
Ｔａｂｌｅ ３ Ｔｉｔｅｒ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ａｎｔｉ￣ＴＢＴＶ￣
ＯＲＦ１ ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ａｆｔｅｒ ａｎ￣
ｔｉｇｅｎ ａｆｆｉｎｉｔｙ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｂｙ ｉｎｄｉ￣
ｒｅｃｔ ＥＬＩＳＡ
Ａｎｔｉｂｏｄｙ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ
(ｎｇ / ｍＬ)
ＯＤ４５０
１ ０００ ３.１１５
３３３ ２.１５２
１１１ ０.９１１
３３ ０.４５２
１１ ０.３０１
３.３ ０.１７０
１.１ ０.０８０
ＰＢＳ ０.０１０
Ｎｏｔｅ: ＯＤ４５０>０.１ ｉｓ ｐｏｓｉｔｉｖｅ.
的 ＴＢＴＶ表达的 ＯＲＦ１蛋白的反应特异性更好ꎬ灵
敏度更高ꎬ反应背景低ꎻ 仅存在分子量小于 ＯＲＦ１
的微弱非特异性条带(图 ５￣Ｂ)ꎮ 经抗原纯化后的
ＴＢＴＶ ＯＲＦ１ 多克隆抗体ꎬ可以用来特异性检测
ＷＧＥ反应中 ＴＢＴＶ ＯＲＦ１的表达ꎮ
２.５ ＴＢＴＶ ＯＲＦ１多克隆抗体的应用性分析
利用抗原亲和纯化的 ＴＢＴＶ ＯＲＦ１ 多克隆抗
体检测田间发病的烟草丛顶病样品ꎬ可检测到
ＴＢＴＶ ＯＲＦ１的表达(图 ６ꎬ泳道 ３ 和 ４)ꎻ但存在其
他的非特异性条带ꎬ且 ＯＲＦ１ 的检测灵敏度较低ꎬ
说明ＴＢＴＶＯＲＦ１抗体仅可做为田间烟草丛顶病
Ｆｉｇ. ６ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ＴＢＴＶ ＯＲＦ１ ｉｎ ｄｉｓｅａｓｅｄ
ｔｏｂａｃｃｏ
Ｌａｎｅ １: Ｐｕｒｉｆｉｅｄ ＴＢＴＶ ＯＲＦ１ ｐｒｏｔｅｉｎｓꎻ Ｌａｎｅ ２: Ｈｅａｌｔｈ ｔｏ￣
ｂａｃｃｏꎻ Ｌａｎｅ ３: Ｄｉｓｅａｓｅｄ ｔｏｂａｃｃｏ ｆｒｏｍ Ｙｕｎｎａｎꎬ Ｊｉａｎｇｃｈｕａｎꎻ
Ｌａｎｅ ４: Ｄｉｓｅａｓｅｄ ｔｏｂａｃｃｏ ｆｒｏｍ Ｙｕｎｎａｎꎬ Ｍｉｄｕ.
８６
１期 王国鲁ꎬ等:烟草丛顶病毒 ＯＲＦ１蛋白的多克隆抗体制备及应用
检测的备选抗体但不是首选ꎮ 另外ꎬ利用 ＴＢＴＶ
ＯＲＦ１多克隆抗体检测 ＴＢＴＶ全长 ＲＮＡ 侵染的拟
南芥原生质体ꎬ可以特异性检测到 ＯＲＦ１ 蛋白的表
达(图 ７ꎬ泳道 ３)ꎬ为在细胞体内定量研究 ＴＢＴＶ
ＯＲＦ１的表达调控奠定了血清学基础ꎮ
Ｆｉｇ. ７ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ＴＢＴＶ ＯＲＦ１ ｉｎ Ａｒａｂｉｄｏｐ￣
ｓｉｓ ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔｓ ｉｎｏｃｕｌａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｖｉｒａｌ
ＲＮＡ
Ｌａｎｅ Ｍ: Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｍａｒｋｅｒꎻ Ｌａｎｅ １: Ｐｕｒｉｆｉｅｄ ＯＲＦ１ ｐｒｏｔｅｉｎｓꎻ
Ｌａｎｅ ２: Ｍｏｃｋꎻ Ｌａｎｅ ３: ＴＢＴＶ ｆｕｌｌ￣ｌｅｎｇｔｈ ＲＮＡ.
２.６ ＴＢＴＶ ＯＲＦ２ 蛋白以 ＯＲＦ１ 延长蛋白的形式
存在
利用 ＴＢＴＶ ＯＲＦ１的多克隆抗体对 ＴＢＴＶ 全长
ＲＮＡ在ＷＧＥ 中的翻译产物进行检测ꎬ 除了可以
检测到 ＯＲＦ１蛋白的大量表达外ꎬ还可以检测到分
子量略大于 ９０ ｋＤ的蛋白(图 ８￣Ｂꎬ泳道 ３)ꎻ此ＯＲＦ１
延长蛋白的分子量与 ＯＲＦ１(３５ ｋＤ)和 ＯＲＦ２(６３
ｋＤ)分子量之和相当ꎬ可推断 ＯＲＦ２是以 ＯＲＦ１延长
蛋白的形式表达并存在ꎮ 进一步构建了 ２种类型突
变体:ＴＢＴＶ ＯＲＦ２ 部分替换突变体和 ＴＢＴＶ ＯＲＦ２
提前终止突变体(图 ８￣Ａ)ꎮ ＯＲＦ２ 的部分替换突变
体的表达模式与野生型 ＴＢＴＶ 一致ꎬ其中 ＯＲＦ１ 延
长蛋白的分子量略小于野生型 ＴＢＴＶ(由 ６３ ｋＤ 变
为 ５９ ｋＤꎬ详见 １.９.１) (图 ８￣Ｂꎬ泳道 ４)ꎻ而 ＴＢＴＶ
ＯＲＦ２的提前终止突变体中 ＯＲＦ１延长蛋白的分子
量则明显减小ꎬ约为 ６０ ｋＤ(图 ８￣Ｂꎬ泳道 ５)ꎬ等于
ＯＲＦ１(３５ ｋＤ)和提前终止的 ＯＲＦ２(２３ ｋＤ)分子量
之和ꎮ ２个突变体的试验结果说明ꎬＯＲＦ１延长蛋白
的分子量大小与 ＯＲＦ２ 的编码情况有关ꎬ从而确认
ＯＲＦ２蛋白是以 ＯＲＦ１延长蛋白的形式存在ꎮ
Ｆｉｇ. ８ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｐａｔｔｅｒｎ ｏｆ ＴＢＴＶ ＯＲＦ１ ａｎｄ ＯＲＦ２
Ａ: Ｇｅｎｏｍｉｃ ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｗｔ￣ＴＢＴＶ ａｎｄ ｍｕｔａｎｔｓ ｏｎ ＯＲＦ２.
Ｂ: Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｐａｔｔｅｒｎ ｏｆ ＴＢＴＶ ＯＲＦ１ ａｎｄ ＯＲＦ２ ｉｎ ＷＧＥ.
Ｌａｎｅ Ｍ: Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｍａｒｋｅｒꎻ Ｌａｎｅ １: Ｐｕｒｉｆｉｅｄ ＯＲＦ１ ｐｒｏｔｅｉｎｓꎻ Ｌａｎｅ ２: Ｍｏｃｋꎻ Ｌａｎｅ ３: ｗｔ ＴＢＴＶ ｉｎ ＷＧＥꎻ
Ｌａｎｅ ４: Ｐａｒｔｉａｌ ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ ｍｕｔａｎｔ ｏｆ ＯＲＦ２ ｉｎ ＷＧＥꎻ Ｌａｎｅ ５: Ｐｒｅ￣ｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｍｕｔａｎｔ ｏｆ ＯＲＦ２ ｉｎ ＷＧＥ.
９６
植物病理学报 ４６卷
Ｆｉｇ. ９ Ｅｌｅｍｅｎｔｓ ｉｎｖｏｌｖｅｄ ｉｎ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ ｆｒａｍｅｓｈｉｆｔ ｏｆ ＴＢＴＶꎬ ＲＣＮＭＶ ａｎｄ ＢＹＤＶ
３ 讨论
蛋白特异性抗体是进行蛋白检测和蛋白表达
调控研究的基本材料ꎬ血清学技术在植物病毒学研
究中占有重要地位ꎮ 目前制备抗体的方法有 ２ 种ꎬ
一种是利用抗原免疫实验动物获得ꎻ另一种是噬菌
体展示库技术ꎬ可获得单链抗体(ＳｃＦＶ) [１４]ꎮ 利用
抗原免疫动物获得抗体是目前抗体制备的主流技
术ꎬ根据制备方法的不同ꎬ可获得多克隆抗体或单
克隆抗体ꎮ 多抗制备相对简单ꎬ但存在抗体特异性
较差的问题ꎻ单抗制备复杂且价格昂贵ꎬ但特异性
强ꎮ 本文通过对 ＴＢＴＶ ＯＲＦ１ 抗血清的进一步抗
原亲和纯化处理ꎬ获得了特异性明显提高的多克隆
抗体(图 ５)ꎻ此技术的改进可在一定程度上解决传
统方法制备的多克隆抗体特异性较差的问题ꎮ
本研究获得的 ＴＢＴＶ ＯＲＦ１ 多克隆抗体可检
测田间发病的烟草丛顶病样品ꎬ但也存在非特异性
反应条带ꎮ 与 Ｌｏｎｇ等[１１]等制备的 ＯＲＦ３和 ＯＲＦ４
的抗体相比没有明显的灵敏性和特异性优势ꎬ可能
和 ＯＲＦ１蛋白在田间烟草丛顶病样中的表达量较
低有关ꎬ也可能与 ＯＲＦ１蛋白的氨基酸序列在不同
分离物中差异较大有关ꎮ ＴＢＴＶ ＯＲＦ１ 的多抗可
作为田间烟草丛顶病样品检测的备选抗体之一ꎮ
该 ＴＢＴＶ ＯＲＦ１ 的多克隆抗体可主要用于研
究 ＴＢＴＶ ＯＲＦ１ 的表达调控以及 ＯＲＦ２ 的移码翻
译调控ꎮ 在 ＴＢＴＶ的体内和体外翻译体系中均可
检测到 ＯＲＦ１的表达(图 ７ 和图 ８)ꎬ尤其是体外翻
译系统中 ＯＲＦ１ 有高量表达ꎬ可通过构建突变ꎬ对
ＯＲＦ１表达调控元件进行初步定位ꎻ然后利用体内
系统对部分突变体的结果进行确认ꎮ 本研究发现
ＯＲＦ２ 是以 ＯＲＦ１ 的延长蛋白形式表达而存在的
(图 ８)ꎮ 此 ＯＲＦ１ 延长蛋白的表达机制可能是移
码机制ꎮ 目前存在 ３ 种翻译后的重编码机制: 渗
漏扫描、通读和移码机制[１５ꎬ１６]ꎮ 若是渗漏扫描机
制ꎬ则 ＯＲＦ２应单独表达ꎬ而不是以 ＯＲＦ１ 的延长
蛋白形式ꎬ可排除渗漏扫描机制的可能性ꎮ ＯＲＦ１
和 ＯＲＦ２是重叠排列ꎬ且编码框不是同相位ꎬ也可
以排除通读机制的可能性ꎮ 综合序列分析和利用
Ｍｆｏｌｄ进行二级结构预测的结果ꎬＴＢＴＶ 中存在潜
在的移码翻译所需的调控元件(图 ９):①在 ＯＲＦ１
终止密码子的上游存在七核苷酸滑动序列
ＧＧＡＵＵＵＵꎻ②在 ＯＲＦ１ 终止密码子的下游存在稳
定的二级结构ꎬ且与 ＲＣＮＭＶ 和 ＢＹＤＶ 中调控移
码的二级结构类似[１７]ꎮ 所有迹象表明ꎬ ＴＢＴＶ
ＯＲＦ２蛋白是以 ＯＲＦ１ 延长蛋白形式存在ꎬ其机制
为移码翻译ꎻ其在体外翻译体系中的移码效率小于
１０％(图 ８￣Ｂ)ꎮ 由于其移码效率低ꎬ所以在田间病
样(图 ６)和体内翻译系统(图 ７)中很难检测到
ＯＲＦ１延长蛋白ꎮ
０７
１期 王国鲁ꎬ等:烟草丛顶病毒 ＯＲＦ１蛋白的多克隆抗体制备及应用
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[９] Ｎｕｒｋｉｙａｎｏｖａ Ｋ Ｍꎬ Ｒｙａｂｏｖ Ｅ Ｖꎬ Ｋａｌｉｎｉｎａ Ｎ Ｏꎬ ｅｔ ａｌ.
Ｕｍｂｒａｖｉｒｕｓ ｅｎｃｏｄｅｄ ｍｏｖｅｍｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎｄｕｃｅｓ ｔｕｂｕｌｅ
ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｎ ｔｈｅ ｓｕｒｆａｃｅ ｏｆ ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔｓ ａｎｄ ｂｉｎｄｓ ＲＮＡ
ｉｎｃｏｍｐｌｅｔｅｌｙ ａｎｄ ｎｏｎ￣ｃｏｏｐｅｒａｔｉｖｅｌｙ [ Ｊ] . Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ
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ｔｉｏｎ ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ｉｎ ｈｉｇｈｅｒ ｐｌａｎｔｓ [ Ｊ ] . Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ
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[１７] Ｔａｊｉａｍａ ＹꎬＩｗａｋａｗａ Ｈꎬ Ｋａｉｄｏ Ｍꎬ ｅｔ ａｌ. Ａ ｌｏｎｇ￣ｄｉｓ￣
ｔａｎｃｅ ＲＮＡ￣ＲＮＡ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ｐｌａｙｓ ａｎ ｉｍｐｏｒｔａｎｔ ｒｏｌｅ ｉｎ
ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ￣１ ｒｉｂｏｓｏｍａｌ ｆｒａｍｅｓｈｉｆｔｉｎｇ ｉｎ ｔｈｅ ｔｒａｎｓｌａ￣
ｔｉｏｎ ｏｆ ｐ８８ ｒｅｐｌｉｃａｓｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｏｆ Ｒｅｄ ｃｌｏｖｅｒ ｎｅｃｒｏｔｉｃ ｍｏ￣
ｓａｉｃ ｖｉｒｕｓ [Ｊ] . Ｖｉｒｏｌｏｇｙꎬ ２０１１ꎬ ４１７:１６９－１７８.
责任编辑:于金枝
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