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Polyclonal antibody preparation and application of ORF1-encoded protein of Tobacco bushy top virus

烟草丛顶病毒ORF1蛋白的多克隆抗体制备及应用



全 文 :植物病理学报
ACTA PHYTOPATHOLOGICA SINICA  46(1): 63 ̄71(2016)
收稿日期: 2014 ̄09 ̄06ꎻ 修回日期: 2015 ̄10 ̄14
基金项目: 国家自然科学基金资助项目(31370179)ꎻ山东省自然科学基金资助项目(ZR2013CM015)
通讯作者: 原雪峰ꎬ教授ꎬ主要从事分子植物病毒学研究ꎻE ̄mail:snowpeak77@163.com
第一作者: 王国鲁ꎬ男ꎬ 山东菏泽人ꎬ硕士生ꎬ主要研究方向为植物病毒学ꎻE ̄mail:wangguolu89@126.comꎮ
doi:10.13926 / j.cnki.apps.2016.01.008
烟草丛顶病毒 ORF1蛋白的多克隆抗体制备及应用
王国鲁ꎬ 王德亚ꎬ 于成明ꎬ 原雪峰∗
(山东农业大学植物保护学院ꎬ山东省农业微生物重点实验室ꎬ泰安 271018)
摘要:PCR扩增烟草丛顶病毒(Tobacco bushy top virusꎬTBTV)的 ORF1序列并克隆到原核表达载体 pEHISTEV中ꎬ转化大
肠杆菌 Rosetta菌株经 IPTG诱导表达 TBTV ORF1蛋白ꎮ 利用切胶纯化的 ORF1蛋白免疫新西兰大耳白兔制备并获得抗
血清ꎬ间接 ELISA检测效价为 1 ∶ 24 3000ꎮ 经抗原亲和纯化从抗血清中得到特异性和灵敏度俱佳的 ORF1 多克隆抗体ꎮ
Western blot分析显示ꎬTBTV ORF1多克隆抗体既可以检测田间发病的烟草丛顶病样品中 ORF1 蛋白ꎬ也可检测在体内和
体外翻译体系中的 TBTV ORF1蛋白的表达ꎮ 另外ꎬ发现 ORF2 蛋白以 ORF1延长蛋白的形式存在ꎬ根据 ORF1和 ORF2的
重叠情况及潜在的七核苷酸滑动序列和下游的稳定二级结构ꎬ推测此 ORF1延长蛋白是移码翻译产物ꎮ
关键词:烟草丛顶病毒ꎻ ORF1基因ꎻ 原核表达ꎻ 抗血清ꎻ 移码翻译
Polyclonal antibody preparation and application of ORF1 ̄encoded protein of Tobacco
bushy top virus   WANG Guo ̄luꎬWANG De ̄yaꎬ YU Cheng ̄mingꎬ YUAN Xue ̄feng  (College of Plant Protec ̄
tionꎬ Shandong Agricultural Universityꎻ Shandong Province Key Laboratory of Agricultural Microbiologyꎬ Tai′an 271018ꎬChina)
Abstract: ORF1 sequence of Tobacco bushy top virus (TBTV) was amplified and cloned into prokaryotic ex ̄
pression vector pEHISTEV. The recombination plasmid containing ORF1 of TBTV was transformed into E.coli
Rosetta and performed to express ORF1 protein under the induction of IPTG. The purified ORF1 protein from
SDS ̄PAGE gel was used to inject the rabbits as antigens to get antiserum with high titer at 1 ∶ 24 3000 by indi ̄
rect ELISA.Through the antigen affinity purificationꎬ the polyclonal antibody against ORF1 protein with higher
sensitivity and specificity was purified from whole antiserum. The polyclonal antibody could be used to detect the
ORF1 of the TBTV ̄infected tobaccos in the field as well as in vivo ( refer to Arabidopsis protoplasts) and in
vitro translation system ( refer to WGE)ꎬ in which TBTV full ̄length RNA was incubated. In additionꎬ ORF2
was identified to be expressed as ORF1 ̄extended proteinꎬ possibly through translational frameshift mechanism
based on the over ̄lapping status of ORF1 and ORF2ꎬ potential hepta ̄nucleotide slippery sequence and down ̄
stream stable stem ̄loop structure. This project provided substantial serological support for the consequent research
on the detailed mechanism of the multi ̄levels of translation of ORF1 and ORF2 in Tobacco bushy top virus.
Key words: Tobacco bushy top virusꎻ ORF1ꎻ prokaryotic expressionꎻ antiserumꎻ translational frameshift
中图分类号: S432.41          文献标识码: A          文章编号: 0412 ̄0914(2016)01 ̄0063 ̄09
    烟草丛顶病毒 ( Tobacco bushy top virusꎬ
TBTV)属于幽影病毒属(Umbravirus)ꎬ自然状态
下与黄症病毒科( Luteoviridae)的烟草脉扭病毒
(Tobacco vein distorting virusꎬTVDV)复合侵染导
致烟草丛顶病[1]ꎮ 感病烟株叶色淡绿或黄化ꎬ并
伴有系统坏死枯斑ꎬ苗期感病烟株严重矮化、缩顶ꎬ
叶片变小ꎬ而晚期感病的烟株腋芽过度增生ꎬ为密
生小叶、小枝的丛枝状ꎮ 20 世纪 90 年代烟草丛顶
病在云南保山、三江流域暴发流行ꎬ给部分烟区造
成毁灭性灾害[2]ꎮ TBTV 在自然界的传播主要依

 
植物病理学报 46卷
靠介体蚜虫ꎬ由 TVDV 基因组编码的病毒外壳蛋
白是重要的蚜传因子ꎮ TBTV 在实验室条件下可
通过摩擦接种侵染烟草[3]ꎮ
    TBTV 基因组是一条由 4 152 个核苷酸组成
的正义单链 RNA[4]ꎬ软件预测和同源比对表明其
基因组编码 4个蛋白(图 1)ꎬ编码框有 8 个密码子
重叠的 ORF1(编码分子量为 35 kD蛋白)和 ORF2
(编码分子量为 63 kD 蛋白)ꎬ可能是病毒的复制
酶组分[5]ꎬORF3(编码分子量为 26 kD 蛋白)可能
参与病毒的长距离运输[6ꎬ7]ꎬORF4(编码分子量为
27 kD 蛋白)可能是病毒细胞间运动的功能蛋
白[8ꎬ9]ꎮ 以上关于 TBTV 基因组编码蛋白的功能
没有直接的实验证据ꎬ均来自于同属其他病毒的研
究结果ꎮ 根据 ORF1 和 ORF2 的重叠排列形式以
及在 ORF1终止密码子上游的潜在七核苷酸滑动
序列( UGCUAGꎬ阴影部分为七核苷酸
序列ꎬ终止密码子为斜体)的情况推测ꎬORF2 蛋白
可能是通过 ̄1 位的移码( frameshiftꎬ fs)机制表达
的ꎬ而以 ORF1延长蛋白的形式存在ꎮ 由于 ORF2编
码部分含有 GDD 结构域ꎬ此 ORF1 延长蛋白起到
RNA依赖的 RNA聚合酶(RdRp)的作用[5ꎬ10]ꎮ
    特异性抗体的制备是病毒检测和基因表达调
控研究的有效手段ꎮ Long 等[11] 制备的 TBTV
ORF3 和 ORF4 蛋白抗血清可用于田间发病的烟
草丛顶样品的检测ꎮ 为研究 TBTV ORF1和 ORF2
的表达情况ꎬ本文制备了 TBTV ORF1 的多克隆抗
体ꎮ 首先克隆 TBTV 的 ORF1 基因并进行原核表
达ꎬ以纯化的 ORF1 蛋白为抗原免疫家兔ꎬ抗血清
经抗原亲和纯化后获得 ORF1 的多克隆抗体ꎮ 此
抗体既可以检测田间的烟草丛顶病样品中 TBTV
ORF1 的表达ꎬ也可检测体内和体外翻译体系中
TBTV ORF1的表达ꎻ 确认 TBTV编码的 ORF2 蛋
白是以 ORF1延长蛋白的形式存在ꎮ 为进一步深
入研究 TBTV ORF1 蛋白的表达调控以及 ORF2
蛋白的移码翻译调控奠定了血清学基础ꎮ
1  材料与方法
1.1  菌种、载体和感病材料
    大肠杆菌 DH5α 菌株、BL21(DE3)Rosetta 菌
株和原核表达载体 pEHISTEV[12]由山东农业大学
植保学院李向东教授惠赠ꎮ 田间发病的烟草丛顶
病叶由云南农业大学李凡教授惠赠ꎮ 质粒 pT7 ̄
Rluc(含海肾荧光素酶 Rluc的序列)由美国马里兰
大学 Anne E. Simon 教授惠赠ꎮ 质粒 pMTB1(T7
启动子下游含有 TBTV 全长序列ꎬGenBank 登录
号:NC004366)由本实验室构建并保存ꎮ
1.2  引物设计与合成
    所有引物(表 1)均由上海生工股份有限公司合成ꎮ
1.3  TBTV ORF1蛋白的原核表达、纯化
1.3.1  原核表达   原核表达质粒转化大肠杆菌
BL21(DE3)Rosettaꎮ 挑取阳性单菌落接种于 LB
液体培养基ꎬ37 ℃过夜培养ꎬ再按 1 ∶ 100 比例转
接至新鲜的 LB 液体培养基ꎬ培养至 OD600值达到
0.4 左右ꎬ分别在 0.2 mmol / L ~ 1.0 mmol / L IPTG
条件下 37 ℃诱导培养 4 hꎬ培养物经 SDS ̄PAGE
电泳分析目的蛋白的表达ꎮ 在确定有目的蛋白表
达的前提下ꎬ利用超声波破碎培养物ꎬ离心后分别
收集上清和沉淀ꎬ然后 SDS ̄PAGE 电泳分析目的
蛋白的可溶性ꎮ
1.3.2  蛋白的切胶纯化  离心收集原核表达的培
养物ꎬ超声波破碎后收集沉淀ꎬ用含 8 mol / L 尿素
的 PBS 缓冲液重悬沉淀ꎬ经 12.5%的 SDS ̄PAGE
电泳后将凝胶用预冷的显色溶液(0. 25 mmol / L
KClꎬ1 mmol / L DTT)浸泡 5 ~ 10 min 至显出白色
沉淀带ꎬ重蒸水冲洗后切下含目的条带的凝胶ꎮ 将
凝胶放在预先处理的透析袋中ꎬ在蛋白电泳缓冲液
中水平电泳 2 hꎬ取出凝胶条ꎬ在 0.8%的生理盐水
中 4℃过夜透析ꎬ得到纯化蛋白ꎮ
Fig. 1  Genomic organization of Tobacco bushy top virus
46

 
  1期 王国鲁ꎬ等:烟草丛顶病毒 ORF1蛋白的多克隆抗体制备及应用
Table 1  List of primers used in this paper
Primer name Primer sequences (5′→3′) Polarity Template
TB ̄ORF1 ̄5F 5 ̄GATCGATATCATGGAGTTCATCAACAAGATAAAGC ̄3ꎬ
Underlined nucleotides indicate EcoR V site
+ TBTV (NC004366)
TB ̄ORF1 ̄3R 5 ̄GATCGAATTCTCACTAGCAAAAATCCTTGGGCCCAC ̄3ꎬ
Underlined nucleotides indicate EcoR I site
- TBTV (NC004366)
Rluc ̄F 5 ̄GATCATGCATCATGACTTCGAAAGTTTATGATCCAG ̄3
Underlined nucleotides indicate Nsi I site
+ Renilla luciferaseꎬ RLuc
Rluc ̄F ̄M 5 ̄GATCATGCATATGACTTCGAAAGTTTATGATCCAG ̄3
Underlined nucleotides indicate Nsi I site
+ Renilla luciferaseꎬ RLuc
Rluc ̄Term ̄R 5 ̄GATCAGATCTTTACGTCGACATTTGTTCATTTTTG ̄3
Underlined nucleotides indicate Bgl II site
- Renilla luciferaseꎬ RLuc
  Note:Italic part is the protection nucleotides of primers.
1.4  抗血清的制备与间接 ELISA测定效价
1.4.1  抗血清的制备
    (1)免疫前从兔子耳缘静脉取血 0.5 ~ 1 mLꎬ
分离抗血清ꎬ作为免疫前的背景ꎬ备用ꎮ
    (2)用纯化的 ORF1 蛋白免疫新西兰大耳白
兔ꎬ共免疫 4次(第 1 与第 2 次免疫间隔 3 周ꎬ第 2
~4 次免疫间隔均为 2 周)ꎬ每次的蛋白量为 0.5
mgꎮ 第 1次与等体积的弗氏完全佐剂混合ꎬ注射
皮下 6点ꎬ第 2 ~ 4 次与等体积的弗氏不完全佐剂
混合ꎬ注射皮下 4 点ꎮ 第 4 次免疫 10 d 后耳缘静
脉取血ꎬ 37℃静置 1 hꎬ4℃静置过夜ꎬ6 000 r / min
离心 20 minꎬ分离抗血清ꎬ然后利用间接 ELISA检
测效价ꎬ若效价达标ꎬ则在效价测定的第 2 d 以心
脏穿刺的方法采血ꎬ并分离抗血清ꎬ保存于-80℃ꎮ
1.4.2  间接 ELISA  2 μg / mL 的免疫原蛋白包被
到酶标板中ꎬ100 μL /孔ꎬ4℃过夜ꎻPBST 洗涤 3 次
后ꎬ利用 5%脱脂奶粉封闭ꎬ300 μL /孔ꎬ37℃ꎬ封闭 2
hꎻPBST洗涤 3次后ꎬ将待检测抗血清或免疫前血清
按设计稀释度稀释后加入酶标板中ꎬ100 μL /孔ꎬ
37℃ꎬ孵育 1 h 进行一抗反应ꎻPBST 洗涤 3 次后ꎬ
HRP标记的山羊抗兔 IgG 按适当比例稀释后加入
酶标板ꎬ100 μL /孔ꎬ37℃ꎬ孵育 40 min 进行二抗反
应ꎻPBST洗涤 3次后加入现配的 TMB底物显色工
作液(CWbio 公司 CW0050)ꎬ100 μL /孔ꎬ显色 10
minꎻ加入 2 mol / L H2SO4终止显色ꎬ50 μL /孔ꎻ最终
用酶标仪(BIO ̄RAD 680)测 450 nm波长的 OD值ꎮ
1.5  抗原亲和纯化
1.5.1  抗原亲和柱制备   用活化缓冲液将 CnBr ̄
activated Sepharose 4B(GE)充分活化ꎬ然后 Cou ̄
pling Buffer平衡活化的 CnBr凝胶至基线平稳ꎻ将
抗原加入平衡好的层析柱凝胶中常温旋转反应 2 h
挂柱ꎬ然后加入封闭缓冲液常温旋转反应 1 hꎬ封闭
剩余活化基团ꎻ最后用Washing Buffer1和Washing
Buffer2交替洗制备好的抗原亲和柱ꎬ备用ꎮ
1.5.2  特异性抗体纯化   用 Binding Buffer 平衡
抗原亲和柱至基线平稳ꎻ然后将待纯化的抗血清负
载上柱ꎬ收集流穿液ꎬ再将流穿液二次上柱ꎬ继续平
衡至基线平稳ꎻ加入 Elution Buffer 洗脱ꎬ收集洗脱
峰ꎬSDS ̄PAGE检测纯度ꎮ 用 0.01 mol / Lꎬ pH 7.2
PBS 透析收集的洗脱峰ꎬ使纯化后的抗体保存在
0.01 mol / Lꎬ pH 7.2 PBS 环境中ꎮ 最终浓缩透析
后的抗体ꎬ并用蛋白定量检测仪测定特异抗体
浓度ꎮ
    所有相关的溶液和试剂均来自康为世纪公司
的抗原纯化试剂盒ꎮ
1.6  Western blot
    取 10 μL 蛋白样品进行 SDS ̄PAGE电泳后ꎬ用
电转移的方法将蛋白质转移至硝酸纤维素膜上(200
mAꎬ80 min)ꎻ然后将硝酸纤维素膜在 TBST缓冲液
中漂洗ꎬ转入 10 mL 封闭液(TBST+5%脱脂奶粉)
中 37℃封闭 1 hꎻ封闭完成后ꎬ直接在封闭液中按一
定比例加入特异性抗体或抗血清ꎬ37℃反应 1 hꎮ 在
TBST缓冲液中漂洗 3 次ꎬ每次 10 minꎬ加入用
TBST稀释(1 ∶ 5 000)的二抗HRP ̄IgGꎬ37℃反应 30
~60 minꎮ 再用 TBST洗膜 3次ꎬ每次 10 minꎮ 取等
体积的 ECL 化学发光试剂 Reagent 1 和 Reagent 2
混合均匀制成显色液ꎬ将硝酸纤维素膜置于培养皿
中ꎬ除去多余的 TBST缓冲液ꎬ将显色液均匀覆盖在
56

 
植物病理学报 46卷
上面ꎬ孵育 30 sꎬ除去显色液ꎬ然后放置在 ECL发光
检测仪(Tanon 5500 Multi)上拍照ꎮ
1.7  TBTV在麦胚提取物(Wheat germ extractꎬ
WGE)中的体外翻译反应
    参照 Promega 的产品说明书ꎬ线性化质粒在
T7 RNA聚合酶进行体外转录制备野生型和突变
型 TBTV的全长 RNAꎬ经酚仿抽提和乙醇沉淀后
的 1 μg RNA 加入到 25 μL 的反应体系中(12.5
μL WGE、 氨基酸混合物 2.0 μL、0.1 mol / L KAc、
2 mmol / L MgCl2、RNase抑制剂 0.5 μL)25℃反应
2 hꎬ然后进行检测ꎮ
1.8  拟南芥原生质体的制备及侵染试验
    参照文献[13]的方法ꎬ将表面消毒的 Col ̄0拟
南芥种子在 MS 固体培养基上诱导愈伤ꎬ第 4 ~ 6
代的愈伤组织在酶解液(纤维素酶 /果胶酶=5 ∶ 1)
的作用下避光酶解 4 hꎬ经 200 目筛网过滤得到原
生质体ꎮ 20~30 μg体外转录物在 50 % PEG的作
用下侵染 5×106个细胞ꎬ室温孵育 18 h后收集细胞
进行检测ꎮ
1.9  TBTV全长 cDNA克隆的突变体构建
1.9.1  TBTV ORF2 蛋白编码框的部分替换突变
体  以质粒 pT7 ̄Rluc 为模板ꎬ利用引物 Rluc ̄F 和
Rluc ̄Term ̄Rꎬ在 Pfu Taq 酶作用下进行 PCR 扩增
得到 Rluc 的编码序列ꎮ 此 PCR 产物经 Nsi I 和
Bgl II双酶切后与同样经 Nsi I 和 Bgl II 双酶切的
pMTB1连接ꎬ得到 TBTV ORF2 蛋白编码框的部
分替换突变体(部分替换后的 ORF2蛋白分子量约
为 59 kD)ꎮ
1.9.2  TBTV ORF2 蛋白编码框的提前终止突变
体  以质粒 pT7 ̄Rluc 为模板ꎬ利用引物 Rluc ̄F ̄M
和 Rluc ̄Term ̄Rꎬ在 Pfu Taq 酶作用下进行 PCR 扩
增得到 Rluc的编码序列ꎮ 此 PCR 产物经 Nsi I 和
Bgl II双酶切后与同样经 Nsi I 和 Bgl II 双酶切的
pMTB1连接ꎬ得到 TBTV ORF2 蛋白编码框的提
前终止突变体(翻译提前终止的 ORF2蛋白分子量
约为 23 kD)ꎮ
    2 个突变体仅用于 ORF2 表达及存在形式的
研究ꎬ突变体的具体构建及鉴定过程未在文中
呈现ꎮ
2  结果与分析
2.1  TBTV ORF1蛋白的原核表达载体构建
    以 pMTB1 为模板ꎬ利用引物 TB ̄ORF1 ̄5F 和
TB ̄ORF1 ̄3R在 Pfu Taq DNA 聚合酶的作用下扩
增得到约 950 bp 的 PCR 产物ꎬPCR 产物和质粒
pEHISTEV分别经 EcoR V 和 EcoR I 双酶切和胶
回收后进行连接ꎬ转化产物经菌落 PCR 筛选得到
阳性克隆 pEH ̄TB ̄ORF1ꎮ 提取质粒进行酶切鉴
定ꎬEcoR V和 EcoR I的双酶切得到约 950 bp酶切
条带(图 2 ̄A)ꎬ说明重组质粒中含有与 TBTV 的
ORF1 片段大小吻合的插入片段ꎮ 另外ꎬ以质粒
pEH ̄TB ̄ORF1 为模板ꎬ利用引物 TB ̄ORF1 ̄5F 和
TB ̄ORF1 ̄3R进行 PCR得到约 950 bp 的产物(图
2 ̄B)ꎮ 测序验证 TBTV ORF1 插入片段与载体的
接头情况ꎬ结果显示 TBTV ORF1 插入位置正确且
没有移码和随机突变的发生(测序图未展示)ꎮ
Fig. 2   Digestion and PCR of recombination
plasmid pEH ̄TB ̄ORF1
A: Digestion determination of pEH ̄TB ̄ORF1ꎻ M: λDNA /
EcoR I + Hind IIIꎻ Lane 1: pEH ̄TB ̄ORF1 / EcoR V+EcoR I.
B: PCR determination of pEH ̄TB ̄ORF1ꎻ M: DNA marker
(DL2000)ꎻ Lane 1: PCR product.
2.2  TBTV ORF1蛋白的原核表达及纯化
    质粒 pEH ̄TB ̄ORF1 转化大肠杆菌 BL21
(DE3)Rosettaꎬ在不同浓度梯度的 IPTG (0.2 ~ 1.0
mmol / L)诱导下进行蛋白表达ꎬSDS ̄PAGE电泳显
示经 IPTG 诱导表达的蛋白分子量在 31.0 ~ 43.0
kD之间ꎬ与 ORF1 蛋白的分子量 ( 35 kD)相符
(图 3)ꎮ
    原核表达产物的可溶性分析表明ꎬ在正常诱导
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  1期 王国鲁ꎬ等:烟草丛顶病毒 ORF1蛋白的多克隆抗体制备及应用
Fig. 3   SDS ̄PAGE of prokaryotic expression
product of pEH ̄TB ̄ORF1
Lane M: Protein markerꎻ Lane 1 - 5: E. coli protein under
the induction of 0.2ꎬ 0.4ꎬ 0.6ꎬ 0.8 and 1.0 mmol / L IPTGꎻ
Lane 6: E.coli protein without the induction of IPTG (nega ̄
tive control) .
条件下ꎬ诱导表达的 ORF1 蛋白大部分在沉淀中ꎮ
为获得高浓度和高纯度的 ORF1 蛋白ꎬ采用原核表
达产物的包涵体纯化及切胶回收方法ꎬ纯化的蛋白
样品经 SDS ̄PAGE 电泳显示ꎬ不同批次纯化的
ORF1蛋白纯度均较高ꎬ目的蛋白比重达 90% 以
上ꎬ可以用作家兔的免疫抗原(蛋白的可溶性分析
和纯化产物的 SDS ̄PAGE未显示)ꎮ
2.3  TBTV ORF1抗血清的制备、效价测定以及免
疫原性分析
    利用纯化的 TBTV ORF1 蛋白皮下注射免疫
新西兰大耳白兔ꎬ4次免疫后取血获得抗血清ꎮ 以
纯化的 ORF1 蛋白为抗原ꎬ用间接 ELISA 检测抗
血清的效价ꎬ结果发现1#兔和2#兔的抗血清进行
1 ∶ 243 000 稀释时仍表现出阳性反应 (表 2)ꎮ
Western blot 分析显示ꎬ在约 40 kD 处有信号强的
杂交条带ꎬ表明制备的抗血清能与原核表达的
ORF1蛋白以及切胶纯化的 ORF1 蛋白发生特异
性免疫反应(图 4ꎬ泳道 1和 2)ꎻ同时此 ORF1抗血
清还与大肠杆菌的部分蛋白有非特异性反应(图 4ꎬ
泳道 3)ꎬ泳道 2中分子量小于 ORF1蛋白的杂交条
带ꎬ可能为 ORF1蛋白的降解产物(图 4)ꎮ
Fig. 4  Specificity analysis of anti ̄TBTV ̄ORF1
antiserum
Lane M: Western Markerꎻ Lane 1:Purified TBTV ORF1 pro ̄
teinsꎻ Lane 2: E. coli protein under the induction of 0. 2
mmol / L IPTGꎻ Lane 3: E.coli protein without the induction
of IPTG (CK-) .
2.4  TBTV ORF1抗血清的抗原亲和纯化
    利用 ORF1 的抗血清检测 TBTV 在 WGE 中
的反应产物ꎬ可以检测到ORF1的表达ꎻ但同时存
Table 2  Titer determination of anti ̄TBTV ̄ORF1 antiserum by indirect ELISA
Antiserum
dilution
1# rabbit
negative
1# rabbit
positive
OD positive /
OD negative
2# rabbit
negative
2# rabbit
positive
OD positive /
OD negative
1 ∶ 1 000 0.058 2.742 47.3 0.169 3.232 19.1
1 ∶ 3 000 0.044 1.835 41.7 0.121 2.967 24.5
1 ∶ 9 000 0.041 0.804 19.5 0.035 2.084 59.5
1 ∶ 27 000 0.040 0.304 7.6 0.034 0.999 29.4
1 ∶ 81 000 0.033 0.138 4.2 0.030 0.507 16.9
1 ∶ 243 000 0.021 0.110 4.5 0.021 0.186 8.9
1 ∶ 729 000 0.015 0.034 2.2 0.018 0.069 3.8
CK ̄ 0.018 0.030 0.012 0.040
  Note: OD positive / OD negative >2.1ꎬand OD positive >0.1 is positive titer.
76

 
植物病理学报 46卷
Fig. 5  Specificity comparison between anti ̄TBTV ̄ORF1 polyclonal
antibody and antiserum after / before antigen affinity purification
A: Detection of TBTV ORF1 in WGE with whole antiserum before antigen affinity purification.
B: Detection of TBTV ORF1 in WGE with polyclonal antibody after antigen affinity purification.
Lane M: Western Markerꎻ Lane 1: Purified ORF1 proteinsꎻ
Lane 2: Mockꎻ Lane3ꎬ 4: In vitro translation products of TBTV full ̄length RNA in WGE.
在很多非特异性反应条带ꎬ杂交反应的背景较高ꎬ
无法满足后续的试验要求(图 5 ̄A)ꎮ
    为改进此 TBTV ORF1抗血清的反应特异性ꎬ
利用纯化的 TBTV ORF1蛋白制备抗原亲和柱ꎬ进
行抗原亲和纯化试验得到分子量约为 45 kD 的
ORF1多克隆抗体(SDS ̄PAGE 电泳图未显示)ꎬ其
对 ORF1 蛋白的检测灵敏度为 3.3 ng / mL(表 3)ꎮ
Western blot 分析显示ꎬ与抗原亲和纯化前的
TBTV ORF1 抗血清相比ꎬ抗原亲和纯化后的
TBTV ORF1多克隆抗体与WGE体外翻译系统中
Table 3   Titer determination of anti ̄TBTV ̄
ORF1 polyclonal antibody after an ̄
tigen affinity purification by indi ̄
rect ELISA
Antibody concentration
(ng / mL)
OD450
1 000 3.115
333 2.152
111 0.911
33 0.452
11 0.301
3.3 0.170
1.1 0.080
PBS 0.010
  Note: OD450>0.1 is positive.
的 TBTV表达的 ORF1蛋白的反应特异性更好ꎬ灵
敏度更高ꎬ反应背景低ꎻ 仅存在分子量小于 ORF1
的微弱非特异性条带(图 5 ̄B)ꎮ 经抗原纯化后的
TBTV ORF1 多克隆抗体ꎬ可以用来特异性检测
WGE反应中 TBTV ORF1的表达ꎮ
2.5  TBTV ORF1多克隆抗体的应用性分析
    利用抗原亲和纯化的 TBTV ORF1 多克隆抗
体检测田间发病的烟草丛顶病样品ꎬ可检测到
TBTV ORF1的表达(图 6ꎬ泳道 3 和 4)ꎻ但存在其
他的非特异性条带ꎬ且 ORF1 的检测灵敏度较低ꎬ
说明TBTVORF1抗体仅可做为田间烟草丛顶病
Fig. 6   Detection of TBTV ORF1 in diseased
tobacco
Lane 1: Purified TBTV ORF1 proteinsꎻ Lane 2: Health to ̄
baccoꎻ Lane 3: Diseased tobacco from Yunnanꎬ Jiangchuanꎻ
Lane 4: Diseased tobacco from Yunnanꎬ Midu.
86

 
  1期 王国鲁ꎬ等:烟草丛顶病毒 ORF1蛋白的多克隆抗体制备及应用
检测的备选抗体但不是首选ꎮ 另外ꎬ利用 TBTV
ORF1多克隆抗体检测 TBTV全长 RNA 侵染的拟
南芥原生质体ꎬ可以特异性检测到 ORF1 蛋白的表
达(图 7ꎬ泳道 3)ꎬ为在细胞体内定量研究 TBTV
ORF1的表达调控奠定了血清学基础ꎮ
Fig. 7  Detection of TBTV ORF1 in Arabidop ̄
sis protoplasts inoculated with viral
RNA
Lane M: Western Markerꎻ Lane 1: Purified ORF1 proteinsꎻ
Lane 2: Mockꎻ Lane 3: TBTV full ̄length RNA.
2.6  TBTV ORF2 蛋白以 ORF1 延长蛋白的形式
存在
    利用 TBTV ORF1的多克隆抗体对 TBTV 全长
RNA在WGE 中的翻译产物进行检测ꎬ 除了可以
检测到 ORF1蛋白的大量表达外ꎬ还可以检测到分
子量略大于 90 kD的蛋白(图 8 ̄Bꎬ泳道 3)ꎻ此ORF1
延长蛋白的分子量与 ORF1(35 kD)和 ORF2(63
kD)分子量之和相当ꎬ可推断 ORF2是以 ORF1延长
蛋白的形式表达并存在ꎮ 进一步构建了 2种类型突
变体:TBTV ORF2 部分替换突变体和 TBTV ORF2
提前终止突变体(图 8 ̄A)ꎮ ORF2 的部分替换突变
体的表达模式与野生型 TBTV 一致ꎬ其中 ORF1 延
长蛋白的分子量略小于野生型 TBTV(由 63 kD 变
为 59 kDꎬ详见 1.9.1) (图 8 ̄Bꎬ泳道 4)ꎻ而 TBTV
ORF2的提前终止突变体中 ORF1延长蛋白的分子
量则明显减小ꎬ约为 60 kD(图 8 ̄Bꎬ泳道 5)ꎬ等于
ORF1(35 kD)和提前终止的 ORF2(23 kD)分子量
之和ꎮ 2个突变体的试验结果说明ꎬORF1延长蛋白
的分子量大小与 ORF2 的编码情况有关ꎬ从而确认
ORF2蛋白是以 ORF1延长蛋白的形式存在ꎮ
Fig. 8  Expression pattern of TBTV ORF1 and ORF2
A: Genomic organization of wt ̄TBTV and mutants on ORF2.
B: Expression pattern of TBTV ORF1 and ORF2 in WGE.
Lane M: Western Markerꎻ Lane 1: Purified ORF1 proteinsꎻ Lane 2: Mockꎻ Lane 3: wt TBTV in WGEꎻ
Lane 4: Partial substitution mutant of ORF2 in WGEꎻ Lane 5: Pre ̄termination mutant of ORF2 in WGE.
96

 
植物病理学报 46卷
Fig. 9  Elements involved in translational frameshift of TBTVꎬ RCNMV and BYDV
3  讨论
    蛋白特异性抗体是进行蛋白检测和蛋白表达
调控研究的基本材料ꎬ血清学技术在植物病毒学研
究中占有重要地位ꎮ 目前制备抗体的方法有 2 种ꎬ
一种是利用抗原免疫实验动物获得ꎻ另一种是噬菌
体展示库技术ꎬ可获得单链抗体(ScFV) [14]ꎮ 利用
抗原免疫动物获得抗体是目前抗体制备的主流技
术ꎬ根据制备方法的不同ꎬ可获得多克隆抗体或单
克隆抗体ꎮ 多抗制备相对简单ꎬ但存在抗体特异性
较差的问题ꎻ单抗制备复杂且价格昂贵ꎬ但特异性
强ꎮ 本文通过对 TBTV ORF1 抗血清的进一步抗
原亲和纯化处理ꎬ获得了特异性明显提高的多克隆
抗体(图 5)ꎻ此技术的改进可在一定程度上解决传
统方法制备的多克隆抗体特异性较差的问题ꎮ
    本研究获得的 TBTV ORF1 多克隆抗体可检
测田间发病的烟草丛顶病样品ꎬ但也存在非特异性
反应条带ꎮ 与 Long等[11]等制备的 ORF3和 ORF4
的抗体相比没有明显的灵敏性和特异性优势ꎬ可能
和 ORF1蛋白在田间烟草丛顶病样中的表达量较
低有关ꎬ也可能与 ORF1蛋白的氨基酸序列在不同
分离物中差异较大有关ꎮ TBTV ORF1 的多抗可
作为田间烟草丛顶病样品检测的备选抗体之一ꎮ
    该 TBTV ORF1 的多克隆抗体可主要用于研
究 TBTV ORF1 的表达调控以及 ORF2 的移码翻
译调控ꎮ 在 TBTV的体内和体外翻译体系中均可
检测到 ORF1的表达(图 7 和图 8)ꎬ尤其是体外翻
译系统中 ORF1 有高量表达ꎬ可通过构建突变ꎬ对
ORF1表达调控元件进行初步定位ꎻ然后利用体内
系统对部分突变体的结果进行确认ꎮ 本研究发现
ORF2 是以 ORF1 的延长蛋白形式表达而存在的
(图 8)ꎮ 此 ORF1 延长蛋白的表达机制可能是移
码机制ꎮ 目前存在 3 种翻译后的重编码机制: 渗
漏扫描、通读和移码机制[15ꎬ16]ꎮ 若是渗漏扫描机
制ꎬ则 ORF2应单独表达ꎬ而不是以 ORF1 的延长
蛋白形式ꎬ可排除渗漏扫描机制的可能性ꎮ ORF1
和 ORF2是重叠排列ꎬ且编码框不是同相位ꎬ也可
以排除通读机制的可能性ꎮ 综合序列分析和利用
Mfold进行二级结构预测的结果ꎬTBTV 中存在潜
在的移码翻译所需的调控元件(图 9):①在 ORF1
终止密码子的上游存在七核苷酸滑动序列
GGAUUUUꎻ②在 ORF1 终止密码子的下游存在稳
定的二级结构ꎬ且与 RCNMV 和 BYDV 中调控移
码的二级结构类似[17]ꎮ 所有迹象表明ꎬ TBTV
ORF2蛋白是以 ORF1 延长蛋白形式存在ꎬ其机制
为移码翻译ꎻ其在体外翻译体系中的移码效率小于
10%(图 8 ̄B)ꎮ 由于其移码效率低ꎬ所以在田间病
样(图 6)和体内翻译系统(图 7)中很难检测到
ORF1延长蛋白ꎮ
07

 
  1期 王国鲁ꎬ等:烟草丛顶病毒 ORF1蛋白的多克隆抗体制备及应用
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责任编辑:于金枝
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