全 文 ：书西北植物学报!
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文章编号$
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收稿日期$
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基金项目$云南省基金项目"
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#%云南省科技项目"
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#%国家转基因专项"
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#
作者简介$张
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秀"
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#!女!在读硕士研究生!主要从事生物化学与分子生物学方面的研究&
3)4567
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589!""+"*"#"#*(
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"
通信作者$程在全!博士!研究员!主要从事水稻分子育种方面的研究&
3)4567
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1-+#$
!基因和几丁质酶基因
双价基因导入水稻的研究
张
!
秀#!!钟巧芳#!付
!
坚#!李定琴#!程在全#"
"
#
云南省农业科学院 生物技术与种质资源研究所!昆明
+&"!!$
%
!
云南农业大学!昆明
+&""""
#
摘
!
要$为了提高云资粳
*#
(和云资粳
*$
(的抗稻瘟病能力!利用农杆菌介导法将二价表达载体
@
.AB2CA#$"")
!"#$%
D
#&("
转化到水稻愈伤组织中&经组织培养获得再生苗!再通过氯酚红显色法)
E.F
检测和抗稻瘟病鉴定法
获得抗稻瘟病的转基因植株!为进一步创建持久)广谱抗稻瘟病水稻新材料奠定基础&结果显示$"
#
#抗性愈伤组
织经分化和生根培养后!共获得
G
"
代水稻再生苗
#$(
株!其中云资粳
*#
(
#*
株!中花
##
(
1!
株!云资粳
*$
(
*#
株&"
!
#经氯酚红显色法和
E.F
对再生苗检测!中花
##
()云资粳
*#
()云资粳
*$
(的转化苗阳性率分别为
++H
)
*$H
和
&&H
&证明
!
个外源基因已经整合到水稻基因组中&"
$
#对转化阳性植株温室接种稻瘟病病菌
++8
鉴定结
果显示!转基因植株较非转基因植株对稻瘟病的抗性明显增强!而且转
!"#$%
D基因和几丁质酶基因双价的水稻植
株比转单价
!"#$%
D基因或几丁质酶基因的水稻植株抗稻瘟病能力强&"
*
#氯酚红检测结果存在一定的假阳性!
E.F
检测结果更真实可靠!但氯酚红显色法方便)快速!结果观察直观!可对大量的转基因植株进行初步筛选&研
究表明!转
!"#$%
D基因和几丁质酶基因双价基因的水稻植株具有更高的抗稻瘟病能力&
关键词$二价表达载体%
!"#$%
D基因%菜豆几丁质酶基因%稻瘟病
中图分类号$
I(1%
文献标志码$
A
1-+#$
!
"#$#%$&#%$()*+*$%,#"#$#-.%$,/0.1%+*0$*$+02*3#
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!!
水稻是重要的粮食作物之一*#+!稻瘟病又是世
界各稻区的主要病害之一&目前防控稻瘟病经济有
效的办法是培育抗病品种!而转基因技术为水稻的
遗传改良开创了新途径&利用转基因技术将外源抗
病基因引入水稻!选育集高产)优质和多抗于一体的
水稻品种成为创造新抗病品种的一条有效途径&
!"#$%
D基因是从高抗稻瘟病的景洪直立型紫秆
普通野生稻中克隆的抗稻瘟病
!"#$%
基因的同源基
因!与从日本栽培稻中分离的抗稻瘟病基因
!"#$%
既有相似性!又有很多差异&表明野生稻的
!"#$%
D
基因有着与栽培稻
!"#$%
基因不同的甚至是更广的
抗菌谱!是一个新的抗稻瘟病基因资源&几丁质酶
能够降解组成真菌细胞壁的主要成分几丁质!造成
病原菌细胞壁的水解!达到抑制真菌的作用&本课
题组前期工作中分离克隆的菜豆几丁质酶基因
&("
可作为非稻属植物的抗稻瘟病基因源&这
!
个抗稻瘟病基因源在水稻抗稻瘟病新品种培育上有
着广阔的应用前景&
目前粳稻抗稻瘟病育种面临稻瘟病病菌易变异)
抗性品种抗性易丧失)栽培稻品种抗源面窄)转单基
因抗稻瘟病水稻品种抗性不强和抗谱较窄等问题!本
研究采用构建好的二价表达载体
@
.AB2CA#$"")
!"#$%
D
#&("
"含有
!
个抗稻瘟病基因#转化水稻!并
对转基因植株的抗稻瘟病能力进行初步鉴定!为培
育持久)广谱抗稻瘟病水稻新材料奠定基础&
#
!
材料和方法
9;9
!
材
!
料
本实验所用水稻品种为粳稻中花
##
()云资
粳
*#
()云资粳
*$
(和蒙古稻*!+&云资粳
*#
(和
云资粳
*$
(是元江普通野生稻与栽培稻合系
$&
(
的杂交后代!长势及产量显著优于当地主栽品种!而
且具有耐旱)耐寒)大穗)着粒密度高)粒宽)株型好
等特性!但是抗稻瘟病能力较差&水稻品种的种子
及转单价
!"#$%
D基因或几丁质酶基因水稻植株的
种子由云南省农业科学院生物技术与种质资源研究
所实验室提供)保存并繁殖&
稻瘟病菌
++8
)二价表达载体
@
.AB2CA#$"")
!"#$%
D
#&("
"含有
EBC
标记基因#农杆菌等均由本
实验室保存和提供&
9;:
!
方
!
法
9;:;9
!
培养基
!
本研究水稻遗传转化)氯酚红显色
检测及抗稻瘟病鉴定等过程所使用培养基详见表
#
&
9;:;:
!
农杆菌介导的水稻遗传转化
!
将成熟胚表
表
9
!
本实验所用培养基
G587T#
!
BT[6>4>XT[M@
TY64T?S
培养基
BT[6>4
组分
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@
诱导培养基
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!
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N
,
QD
蔗糖
$"
N
,
QD
琼脂
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*)R$;"4
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,
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N
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N
,
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N
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N
,
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继代培养基
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B\D!
!
*)R!;"4
N
,
QD
蔗糖
$"
N
,
QD
琼脂
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*)R!;"4
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,
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N
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N
,
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N
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N
,
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液体培养基
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:
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酵母浸膏
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N
,
QD
胰蛋白胨
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N
,
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N
,
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"灭菌后加
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共培养培养基
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,
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N
,
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蔗糖
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琼脂
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N
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N
,
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N
,
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B洗液
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N
76
:
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蔗糖
$"
N
,
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@
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N
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N
,
Q
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筛选培养基
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N
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蔗糖
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N
,
QD
甘露糖
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N
,
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,
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,
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琼脂
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N
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N
,
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,
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!
*)R!;"4
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,
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N
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分化培养基
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,
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N
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生根培养基
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蔗糖
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N
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氯酚红检测培养基
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UT?<7YT[4T[6>4
B\D
甘露糖
#"
N
,
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蔗糖
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,
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氯酚红
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,
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番茄燕麦培养基
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燕麦片
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,
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番茄汁
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,
QD.5.L
$
";+
N
,
QD5
N
5Y%
N
,
Q
@
/b&;1
ERA
固体培养基
ERAX<76[4T[6>4
土豆
!""
N
,
QD
葡萄糖
*"
N
,
QD
琼脂
!"
N
,
Q
@
/b&;1
@
N
,
QD
N
7>9N
,
QD5
N
5Y!"
N
,
Q
@
/b&;1
*&%#
西
!
北
!
植
!
物
!
学
!
报
!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
$$
卷
面消毒!接种至诱导培养基上!置于
!1c
培养箱中
暗培养&
!#[
后!选取胚性愈伤组织接种于继代培
养基上暗培养
&
"
([
后!将愈伤组织切成
$
"
*44
左右的小块!置于共培养基中!待转化&农杆菌培养
至
LR
+""
约为
";*
"
";+
时!将农杆菌菌液滴到置于
共培养基中的愈伤组织上!侵染
#"46?
!吸去多余
的菌液!
1c
暗培养
!
"
$[
*
$
+
&共培养后的愈伤用
B液体培养基
D!&"4
N
,
Q
头孢拉定和无菌水
D
!&"4
N
,
Q
头孢拉定交替进行振荡清洗!过夜用
B液体培养基
D&""4
N
,
Q
头孢拉定清洗*+&待洗液
清澈时!将愈伤组织置于灭菌的吸水纸上吸干水分!
风干后转接于筛选培养基上筛选
!
次!每次筛选
#&
"
!"[
*
&
+
&将筛选的抗性愈伤转入分化培养基!置
于
#+U
,
[
光照培养!直至分化出苗&当再生苗长至
足够高时移至生根培养基!生根壮苗培养后移栽*++&
9;:;;
!
氯酚红显色检测转基因植株
!
氯酚红
"
.EF
#显色检测主要是利用甘露糖代谢能使培养基
酸化的原理&指示剂氯酚红在液体培养基
@
/+;*
时呈红色!随着
@
/
下降液体培养基转变为黄色!以
达到检测
EBC
基因的目的&在超净台上将生根壮
苗试管中的再生水稻苗叶片剪成小段!接种到氯酚
红液体培养基的离心管中!
1c
暗培养
$
"
&[
后
观察颜色变化并统计
.EF
阳性植株比例&
9<:<=
!
>(2
检测转基因植株
!
剪取少量再生苗叶
片!采用
.GA2
法提取基因组
RJA
!
E.F
检测目的
基因的整合情况&以含有外源基因的质粒
RJA
作
为阳性对照!非转化的植株基因组
RJA
作为阴性对
照!水作为空白对照&
&("
基因引物
&(")#
"
KKK)
KAG..AKAKAAAGKAAKAAKAAGAKK
#和
&(")!
"
...A..AG.GAG.AAGAAAGKAK.G...
#%
!"#$%
D
基因
E
(
,
E
1
引物为
E6S(
"
GK.GKKK.GAAKKAKKG)
G.K
#和"
E6S1
$
KG.KAG.AA..G...AAA.AG
#&
E.F
反应参数$
%*c&46?
%
*c*&X
!
G4
温
度
*&X
!
(!c!46?
!
$&
个循环%
(!c#"46?
&
&("
基因的退火温度为
&+c
!
!"#$%
D基因的退火温度为
&&c
&
9;:;?
!
转基因植株的抗稻瘟病鉴定
!
在
ERA
固
体斜面培养基上活化保存的单孢菌株小块&在番茄
燕麦培养基上扩大培养!制备孢子密度为
#d#"
&
个,
4Q
的稻瘟病病菌孢子悬浮液&将孢子悬液定
量注射和洒接种于经氯酚红显色法和
E.F
检测的
转基因水稻植株的茎或叶上!以非转基因水稻植株
和易感品种蒙古稻植株接种作为对照&接种
([
后!开始每天观察植株的发病情况!比较植株病斑大
小和病斑发病时间的情况!进行记录拍照&
!
!
结果与分析
:;9
!
转化再生植株的氯酚红检测
甘露糖筛选后的抗性愈伤组织经过分化和生根
培养后!共获得
G
"
代水稻再生苗
#$(
株!其中云
资粳
*#
(
#*
株!中花
##
(
1!
株!云资粳
*$
(
*#
株&
对再生苗进行氯酚红检测!通过颜色的反应可初步
判定是否为阳性转基因植株!检测结果如图
#
所示!
部分再生苗的叶片出现颜色变化&初步统计结果表
明中花
##
()云资粳
*#
(和云资粳
*$
(再生苗阳
性率分别为
($H
)
&"H
和
+1H
&初步判断这些阳性
植株已经整合外源基因&
:<:
!
氯酚红检测的转化再生植株进行
>(2
检测
经氯酚红初步显色检测的
G
"
代水稻再生苗的
叶片基因组
RJA
作为模板!进行
E.F
检测&外源
&("
基因大小约
#e8
!外源
!"#$%
D基因大小约
(""
8
@
!电泳图"图
!
!
5
)
8
#显示大部分转基因植株出现
与阳性对照相同的特异条带!进一步表明外源基因
已经整合到了水稻基因组中&根据
E.F
检测结果
统计转基因植株的阳性率!中花
##
()云资粳
*#
(
和云资粳
*$
(的转化苗阳性率分别为
++H
)
*$H
和
&&H
&与氯酚红法检测结果相比!再生苗阳性率降
低!说明氯酚红检测法存在一定假阳性!只能对转基
因苗进行初步判断和鉴定&相比之下!
E.F
检测结
果更真实可靠&氯酚红显色检测和
E.F
检测证明
两个外源基因已经整合到水稻基因组中&
:;
!
转基因植株的抗稻瘟病鉴定
接菌
([
后开始观察稻瘟病的发病情况"图
$
#!
相对转基因植株和非转基因植株!易感对照蒙古稻
发病情况比较严重!表明稻瘟病病菌
++8
在温室接
种是可行的&与非转基因植株对照相比!转基因植
株出现病斑的时间较晚!病斑的扩展速度很慢!病斑
比较小&非转基因植株接种稻瘟病菌
++8
后茎秆出
现的病斑相对较大!总体表现出明显的感病症状&
说明转
!"#$%
D和
&("
基因的植株抗稻瘟病能力较
非转基因植株明显提高&与转单价基因植株对照相
比!转二价基因植株出现病斑相对较小!扩散速度相
对较慢!出现时间相对较晚&说明转
!"#$%
D和
&("
基因的植株抗稻瘟病能力较转
!"#$%
D或
&("
基因
植株增强&综合以上!转二价抗稻瘟病基因的水稻
植株具有较强的抗病能力&
&&%#
#"
期
!!!!!!!!!!
张
!
秀!等$
!"#$%
D基因和几丁质酶基因双价基因导入水稻的研究
图
#
!
转化再生苗叶片氯酚红显色反应
5;
中花
##
%
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云资粳
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(具有许多优于当地主栽品种的优良性状&本研
究表明!云资粳
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(和云资粳
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(的抗稻瘟病特性
有所改良!有利于其今后大面积推广应用&
景洪直立型紫秆普通野生稻属于
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基因组!
与栽培稻属于同一个基因组&
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基因
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因植株稻瘟病鉴定时! 个外源基因在水稻中表现
抗病性!故不存在很严重的生殖隔离!遗传物质的交
流相对比较容易&研究发现水稻植株的大多数性状
是由多个基因共同控制的!
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D基因和
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基因
是不同抗性机制的
!
个抗稻瘟病基因&目前将
!
个
基因单独转化水稻进行抗稻瘟病研究的比较多!转
基因植株表现抗病性比非转基因植株加强!但是将
!
个基因进行聚合用于栽培稻的抗病性改良的研究
不多*##)#$+&本研究对转基因植株进行稻瘟病鉴定
时! 个外源基因表现协同抗菌作用&
!"#$%
D基因
和
&("
基因如何协同抗菌将是具有挑战性的探索
研究并具有广阔的应用价值&同时为进一步创建持
久)广谱抗稻瘟病水稻新材料奠定了基础&
随着科学与技术的发展和进步!安全标记基因将
逐步代替抗生素标记基因!以糖类代谢相关的基因作
为安全基因标记的植物转基因体系将具有更广阔的
应用前景&
EBC
基因作为转基因植株的报告基因!采
用氯酚红显色法可以更方便)快速地对大量的转基因
植株进行初步筛选和检测!结果观察比较直观&相对
于已有研究*&+!节约了成本!提高了效率&
在对转基因植株进行稻瘟病鉴定时!只用一个
稻瘟病菌生理小种对
G
"
代的转基因水稻植株进行
了抗稻瘟病的鉴定!这是本实验的局限&在鉴定中!
发现虽然大部分转基因植株对稻瘟病菌生理小种
++8
具有抗性!但是还有一些转基因植株表现出抗
病性不够强&转基因植株抗病能力的强弱差异!可
能是转基因植株之间存在个体差异%也可能是基因
整合过程中发生基因沉默&
目前克服及预防基因沉默!主要的改进方面有$
转基因密码子的优化及转化载体的修饰!使用合适
的增强子%在对转基因植株进行后代筛选中!尽量避
免多拷贝转基因植株%对遗传转化体系的改进或者
寻找新的遗传转化方法%使用去甲基化试剂*#*+&此
外!在进行抗稻瘟病鉴定的过程中!应注意影响稻瘟
病鉴定的多方面因素&第一!尽量保证接种稻瘟病
菌浓度统一!避免因局部浓度较高!造成不必要的影
响&第二!应该将生理期比较相近的转基因植株进
行对比接种鉴定&第三!稻瘟病接种鉴定转基因植
株抗性能力时!发现苗期和孕穗期对稻瘟病的抗性
不同!这种抗性差异还有待今后进一步的验证&
参考文献!
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