全 文 ：植物病理学报
ＡＣＴＡ ＰＨＹＴＯＰＡＴＨＯＬＯＧＩＣＡ ＳＩＮＩＣＡ　 ４３(４): ３７６￣３８２(２０１３)
收稿日期: ２０１２￣０５￣０４ꎻ 修回日期: ２０１３￣０３￣１０
基金项目: 国家自然科学基金(３０３００２０７)
通讯作者: 孔维文ꎬ博士ꎬ副教授ꎬ主要从事植物抗病性机制和抗病基因工程研究ꎻ Ｅ￣ｍａｉｌ: ｗｗｋｏｎｇ＠ｙｚｕ. ｅｄｕ. ｃｎ
刘爱新ꎬ博士ꎬ副教授ꎬ主要从事分子植物病理学研究ꎻ Ｅ￣ｍａｉｌ: ｌｉｕａｘ＠ｓｄａｕ. ｅｄｕ. ｃｎꎮ
串联双病原物诱导启动子驱动基因表达的特性
孔维文１∗ꎬ 王丹丹２ꎬ 刘爱新２∗
( １ 扬州大学园艺与植物保护学院ꎬ 扬州　 ２２５００９ꎻ２ 山东农业大学植物保护学院ꎬ 泰安　 ２７１０１８)
摘要:在植物抗病基因工程中ꎬ目标基因可控的高效表达是一重要目标ꎮ 在前期的研究中ꎬ我们将串联的病原物高度特异
性诱导启动子 ＥＡＳ４(ＥＰ)和 ｈｓｒ２０３Ｊ(ＨＰ)转入烟草ꎬｕｉｄＡ基因在相应病原物或激发子诱导后可被驱动表达ꎮ 为进一步研究
此串联双启动子驱动的基因表达特性ꎬ采用荧光法对 ＧＵＳ 诱导表达活性进行了定量检测ꎮ 结果发现ꎬ双启动子表现较高
的诱导表达活性ꎬ双启动子与单启动子的活性差异均达极显著水平ꎮ 研究还发现ꎬ两个启动子串联的顺序对其活性强度和
时间动态有影响ꎬ双启动子 ＨＰ ＋ ＥＰ的诱导表达高峰出现在诱导后 ６ ~ １０ ｈꎬ而 ＥＰ ＋ ＨＰ的活性高峰出现在诱导后 ８ ~ １４ ｈꎮ
同时ꎬ初步分析了串联的 ＥＰ和 ＨＰ协同促进基因高水平表达的原因ꎮ 串联的双病原物特异性诱导启动子不但可响应较广
谱的病原物的诱导表达ꎬ而且可协同促进基因的高效表达ꎬ因而在植物抗病基因工程中具有广阔的应用前景ꎮ
关键词:植物抗病基因工程ꎻ 人工启动子ꎻ 病原物诱导启动子ꎻ 基因表达调控
Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ ｏｆ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｄｒｉｖｅｎ ｂｙ ｔｗｏ ｔａｎｄｅｍ ｐａｔｈｏｇｅｎ￣ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ ｐｒｏ￣
ｍｏｔｅｒｓ　 ＫＯＮＧ Ｗｅｉ￣ｗｅｎ１ꎬ ＷＡＮＧ Ｄａｎ￣ｄａｎ２ꎬ ＬＩＵ Ａｉ￣ｘｉｎ２ 　 ( １ Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｈｏｒｔｉｃｕｌｔｕｒｅ ａｎｄ Ｐｌａｎｔ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎꎬ Ｙａｎｇ￣
ｚｈｏｕ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙꎬ Ｙａｎｇｚｈｏｕ ２２５００９ꎬ Ｃｈｉｎａꎻ ２ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｐｌａｎｔ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎꎬ Ｓｈａｎｄｏｎｇ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙꎬ Ｔａｉａｎ ２７１０１８ꎬ
Ｃｈｉｎａ)
Ａｂｓｔｒａｃｔ: Ｈｉｇｈ￣ｌｅｖｅｌ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｅｘｏｇｅｎｏｕｓ ｇｅｎｅｓ ｕｎｄｅｒ ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ｉｓ ａｎ ｉｍｐｏｒｔａｎｔ ｔａｒｇｅｔ ｏｆ ｇｅ￣
ｎｅｔｉｃ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｆｏｒ ｐｌａｎｔ ｄｉｓｅａｓｅ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ. Ｆｒｏｍ ｏｕｒ ｐｒｅｖｉｏｕｓ ｒｅｓｅａｒｃｈ ｉｔ ｗａｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｉｎ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｔｏ ｉｎ￣
ｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｃｅｒｔａｉｎ ｐａｔｈｏｇｅｎｓ ｏｒ ｅｌｉｃｉｔｏｒꎬ ｕｉｄＡ ｉｎ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｔｏｂａｃｃｏ ｐｌａｎｔｓ ｃｏｕｌｄ ｂｅ ｄｒｉｖｅｎ ｔｏ ｅｘｐｒｅｓｓ ｕｎｄｅｒ ｔｈｅ
ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ ｔｗｏ ｈｉｇｈｌｙ ｐａｔｈｏｇｅｎ￣ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ ｐｒｏｍｏｔｅｒｓꎬ ｃｏｎｃａｔｅｎａｔｅｄ ｂｙ ＥＡＳ４ ａｎｄ ｈｓｒ２０３Ｊ ｐｒｏｍｏｔｅｒ. Ｉｎ ｏｒｄｅｒ ｔｏ
ｆｕｒｔｈｅｒ ｅｘｐｌｏｒｅ ｔｈｅ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ ｏｆ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｕｎｄｅｒ ｔｈｅ ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ ｔｈｅ ｔａｎｄｅｍ ｐｒｏｍｏｔｅｒｓꎬ ｔｈｅ ｉｎｄｕｃｅｄ
ＧＵＳ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｗａｓ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅｌｙ ａｓｓａｙｅｄ ｂｙ ｔｈｅ ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｒｉｃ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ ｏｆ Ｊｅｆｆｅｒｓｏｎ. Ｉｔ ｗａｓ ｆｏｕｎｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ
ｔａｎｄｅｍ ｐｒｏｍｏｔｅｒｓ ｈａｄ ｈｉｇｈｅｒ ｉｎｄｕｃｅｄ ａｃｔｉｖｉｔｙꎬ ａｎｄ ｔｈｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｔａｎｄｅｍ ｐｒｏｍｏｔｅｒｓ ｉｓ ｖｅｒｙ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｆｒｏｍ ｔｈａｔ
ｏｆ ｓｉｎｇｌｅ ｐｒｏｍｏｔｅｒ. Ｆｕｒｔｈｅｒｍｏｒｅꎬ ｔｈｅ ｔａｎｄｅｍ ｏｒｄｅｒ ｏｆ ｔｈｅ ｔｗｏ ｐｒｏｍｏｔｅｒｓ ｈａｄ ａｌｓｏ ａｎ ｅｆｆｅｃｔ ｏｎ ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ ａｎｄ
ｔｉｍｅ ｃｏｕｒｓｅ ｏｆ ｉｎｄｕｃｅｄ ＧＵＳ ａｃｔｉｖｉｔｙ. Ｄｙｎａｍｉｃ ａｓｓａｙ ｏｆ ｉｎｄｕｃｅｄ ＧＵＳ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｔａｎｄｅｍ ＨＰ ＋ ＥＰ
ｐｒｏｍｏｔｅｒｓ ｒｅａｃｈｅｄ ｔｈｅ ｈｉｇｈｅｓｔ ｖａｌｕｅ ｉｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｃｔｉｖｉｔｙ ａｆｔｅｒ ６ － １０ ｈｏｕｒ ｏｆ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎꎬ ｗｈｉｌｅ ｔｈｅ ｈｉｇｈｅｓｔ
ｖａｌｕｅ ｏｃｃｕｒｒｅｄ ｉｎ ｔｈｅ ｔａｎｄｅｍ ＥＰ ＋ ＨＰ ｐｒｏｍｏｔｅｒｓ ａｆｔｅｒ ８ － １４ ｈｏｕｒｓ. Ｉｎ ｔｈｅ ｅｎｄꎬ ｔｈｅ ｃａｕｓｅｓ ａｒｅ ｄｉｓｃｕｓｓｅｄ ｆｏｒ
ｃｏｏｐｅｒａｔｉｖｅｌｙ ｅｌｅｖａｔｉｎｇ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｌｅｖｅｌ ｏｆ ｕｉｄＡ ｂｙ ｔａｎｄｅｍ ＥＰ ａｎｄ ＨＰ ｐｒｏｍｏｔｅｒｓ. Ｔｗｏ ｔａｎｄｅｍ ｐａｔｈｏｇｅｎ￣
ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ ｐｒｏｍｏｔｅｒｓ ｃａｎ ｎｏｔ ｏｎｌｙ ｍａｋｅ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｐｌａｎｔｓ ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ ｔｏ ｍｏｒｅ ｐａｔｈｏｇｅｎｓ ｂｕｔ ａｌｓｏ ｂｏｏｓｔ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ
ｌｅｖｅｌ ｏｆ ｅｘｏｇｅｎｏｕｓ ｇｅｎｅｓꎬ ｗｉｌｌ ｔｈｅｒｅｆｏｒｅ ｂｅ ｗｉｄｅｌｙ ａｐｐｌｉｅｄ ｉｎ ｇｅｎｅｔｉｃ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｏｆ ｐｌａｎｔｓ ｆｏｒ ｄｉｓｅａｓｅ ｒｅｓｉｓ￣
ｔａｎｃｅ.
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ:ｇｅｎｅｔｉｃ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｏｆ ｐｌａｎｔ ｆｏｒ ｄｉｓｅａｓｅ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅꎻ ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｐｒｏｍｏｔｅｒꎻ ｐａｔｈｏｇｅｎ￣ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ ｐｒｏ￣
ｍｏｔｅｒꎻ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ
　
　 ４ 期 　 　 孔维文ꎬ等:串联双病原物诱导启动子驱动基因表达的特性
中图分类号:Ｓ４３２. ４１ 　 　 　 　 　 文献标识码: Ａ　 　 　 　 　 文章编号: ０４１２￣０９１４(２０１３)０４￣０３７６￣０７
　 　 外源基因在可控制条件下的高效表达是植物
抗病基因工程的目标之一ꎮ 与基因的组成性表达
不同ꎬ当且仅当遭受病原物侵染时ꎬ转基因植物才
开始高效表达外源基因ꎬ由此而获得或增强的抗病
能力ꎬ可使植物避免不必要的物质和能量消耗ꎬ甚
至可避免持续过量表达外源基因带来的不良反应ꎮ
要实现这样的目标ꎬ需使外源基因置于病原物特异
性诱导启动子下ꎮ
植物体内存在受病原物诱导的启动子ꎬ它们对
于植物抗病基因工程具有重要意义ꎮ 例如ꎬ拟南芥
ＰＤＦ１. ２ 基因的启动子受黑斑病菌 ( Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ
ｂｒａｓｓｉｃｉｃｏｌａ)和灰霉病菌(Ｂｏｔｒｙｔｉｓ ｃｉｎｅｒｅａ) 诱导后
强烈表达[１]ꎬＡｔＣＭＰＧ１ 和 ＡｔＣＭＰＧ２ 启动子则受
霜霉菌(Ｐｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ ｐａｒａｓｉｔｉｃａ)、黑斑病菌(Ａｌｔｅｒ￣
ｎａｒｉａ ｂｒａｓｓｉｃｉｃｏｌａ)和丁香假单胞菌(Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ
ｓｙｒｉｎｇａｅ ｐｖ. ｔｏｍａｔｏ)的诱导表达[２]ꎮ
诱导启动子除了直接从植物体内获得ꎬ还可以
通过构建获得人工启动子 ( ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｐｒｏｍｏｔｅｒ)ꎮ
比如ꎬ在设计的启动子中引入多种顺式调控元件ꎬ
这些元件来自病原物特异性诱导启动子[３ ~ ５]ꎮ 由
于这些人工启动子是按特定目标设计出来的ꎬ因而
可以非常精巧ꎬ不但可对多种病原物的侵染作出灵
敏反应ꎬ而且可将基因表达局限在受侵染位点ꎬ做
到既能在合适时间和合适部位表达ꎬ又能迅速开启
和迅速关闭ꎮ 外源基因转入植物体后ꎬ可能由于多
种原因导致不表达或表达效率低下[６ ~ ９]ꎬ从而使抗
病基因工程目标落空ꎮ 因此ꎬ开展植物抗病基因工
程时ꎬ不仅要考虑外源基因表达与否ꎬ还需考虑其
表达强度ꎮ
另一个需要考虑的问题是ꎬ目前常使用单一病
原物诱导启动子ꎬ限制了外源基因受诱导表达的病
原物种类ꎬ而植物在生长的各阶段常遭受多种病原
物的侵染ꎮ 为了克服这个问题ꎬ我们考虑通过串联
双病原物诱导启动子ꎬ使外源基因可在面临更多病
原物侵染时均受诱导表达[１０]ꎮ 烟草倍半萜烯环化
酶基因启动子 ＥＡＳ４[１１]和烟草防卫基因 ｈｓｒ２０３Ｊ启
动子[１２]均严格受病原物和病原物激发子诱导ꎮ 我
们以此两个典型的受病原物特异诱导的启动子串
联与编码 β￣葡萄糖苷酸酶(β￣ｇｌｕｃｕｒｏｎｉｄａｓｅꎬＧＵＳ)
的 ｕｉｄＡ基因融合ꎬ构建了可受多种病原物或激发
子诱导表达的植物表达载体[１０]ꎬ转入烟草中获得
含不同类型启动子与 ｕｉｄＡ 基因融合的转基因植
株ꎬ并以此研究串联双病原物诱导启动子驱动基因
表达的特性ꎮ
１　 材料与方法
１. １　 材料
本研究使用的转基因烟草植株均由作者创
制[１０]ꎮ 烟草黑胫病菌(Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ ｎｉｃｏｔｉａｎｅａ[０
小种])ꎬ烟草青枯病菌(Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍ)由
本研究室保存ꎮ 激发子 Ｐａｒａｓｉｔｉｃｅｉｎ 由本实验室制
备ꎮ
１. ２　 方法
蛋白质激发子 Ｐａｒａｓｉｔｉｃｅｉｎ 的制备参照文献
[１３]的方法ꎮ
烟草疫霉游动孢子悬浮液的制备:(１)将保存
的 Ｐ. ｎｉｃｏｔｉａｎｅａ 接入装有灭菌的燕麦培养基(燕
麦片 ３０ ｇ、琼脂 １７ ~ ２０ ｇ / １ ０００ ｍＬ水)的茄瓶内ꎬ
２８℃培养ꎮ 当菌丝长满时ꎬ向茄瓶内加入 １０ ~
２０ ｍＬ的无菌水ꎬ２８℃培养 ２ ｄꎮ (２)放入 ４℃静止
３０ ｍｉｎꎮ (３)轻轻震荡茄瓶ꎬ倒出游动孢子悬浮液ꎬ
用血球记数板检测其浓度ꎬ接种浓度为每毫升孢子
数目达 １ ×１０４个ꎮ
烟草青枯病菌菌悬液的制备:(１)熔化后的
ＮＡ 培养基冷却至 ５５℃加入 １％的 ＴＴＣ 至终浓度
为 ０􀆰 ００５％ ꎬ倒平板ꎮ (２)用平板稀释法在含有
ＴＴＣ的 ＮＡ 培养基上划线ꎮ 至菌落长出后ꎬ选择
致病力强的单菌落(白色ꎬ或仅中间有淡红色)ꎬ于
液体 ＮＡ中培养至线性增长期ꎮ (３)４ ０００ ｒｐｍ 离
心收集菌体ꎬ用无菌水稀释至菌液浓度为每毫升菌
悬液含细菌 １ ×１０８个ꎮ
诱导接种或处理:用一次性注射器将一定浓度
的激发子、孢子或细菌注射进转基因烟草新长成的
叶片中ꎬ根据具体实验设计ꎬ在不同时间取样分析ꎬ
以无菌水同样处理为对照ꎬ实验重复 ３ 次ꎮ
参照文献[１４]方法定量检测 ＧＵＳ 活性ꎮ 过
程如下:(１)预热分析液和提取液到 ３７℃ꎮ (２)取
０. １ ｇ诱导处理的转基因阳性的植株叶片ꎬ液氮研
磨ꎬ加入 ５００ μＬ提取液ꎬ离心取上清ꎮ (３)加 ８０ μＬ
７７３
　
植物病理学报 ４３ 卷
ＧＵＳ分析液到预热的 １ ｍＬ 提取液中于 ３７℃反应
３０ ｍｉｎ后ꎬ立刻取出 ４００ μＬ 于 ３. ６ ｍＬ 反应终止
液中ꎮ (４)以反应 ０ ｈ 的样品为对照ꎮ (５)用荧光
分光光度计读数ꎬ激发波长 ３６５ ｎｍꎬ放射波长 ４５５
ｎｍꎮ 并计算反应产物 ４￣ＭＵ的浓度ꎮ
蛋白质含量的测定:取含植物材料的 ＧＵＳ提取
液 ２９. ６３ μＬ[８０ × ４００ / (１ ０００ ＋ ８０)]加水稀释至
４ ｍＬꎬ加入 １ ｍＬ考马斯亮蓝溶液并混匀ꎬ室温放置
２ ｍｉｎ后测定 ５９５ ｎｍ处的吸光值ꎬ对照蛋白质浓度
的标准曲线ꎬ求出反应中植物材料的蛋白含量ꎮ
酶活计算:ＧＵＳ 的活性 ＝反应产物 ４￣ＭＵ 的
浓度 / (反应时间 ３０ ｍｉｎ ×反应中植物材料的蛋白
含量)ꎮ 最终酶活性采用 ３ 次结果的平均值ꎮ
２　 结果与分析
２. １ 　 串联双病原物诱导启动子可协同促进基因
的高效表达
为使外源基因不仅在遭到病原物侵染时才表
达ꎬ而且对多种病原物侵染均能作出响应ꎬ前期研
究中我们将两个具有高度病原物特异性诱导的启
动子 ＥＡＳ４ 和 ｈｓｒ２０３Ｊ串联ꎬ构建了以 ｕｉｄＡ 为外源
基因的植物表达载体ꎻ初步研究显示ꎬ在受到特异
性激发子或病原物诱导时ꎬ转基因烟草可迅速启动
ｕｉｄＡ基因的表达ꎬ在处理的叶片部位可观察到
ＧＵＳ的显色反应ꎮ 同时ꎬ我们注意到ꎬ不同转基因
材料的 ＧＵＳ 染色深浅不一ꎬ肉眼观察有明显差
异[１０]ꎮ
为了定量测定 ＧＵＳ 染色的差别ꎬ并明确其是
否具有差异显著性ꎬ我们随机选取了以单拷贝整合
到基因组中且可通过 ＲＴ￣ＰＣＲ 检测到外源基因转
录的烟草植株 ２０ 株ꎬ其中含单一启动子的植株各
３ 株ꎬ含双启动子的植株各 ７ 株ꎬ分别用 Ｐａｒａｓｉｔｉｃｅ￣
ｉｎ、Ｐ. ｎｉｃｏｔｉａｎｅａ 游动孢子悬浮液和 Ｒ. ｓｏｌａｎａ￣
ｃｅａｒｕｍ菌悬液注射转基因植株的幼嫩叶片ꎬ６ ｈ 后
取处理的叶片用荧光法测定 ＧＵＳ 的诱导表达水
平ꎮ 另设清水处理为对照ꎮ
定量测定发现ꎬ在清水对照中ꎬ２０ 株转基因植
株的 ＧＵＳ表达水平较低ꎮ 用 ＤＰＳ ｖ７. ０５ 对所测数
据进行方差分析ꎬ发现尽管 ＧＵＳ表达水平较低ꎬ但
是不同启动子及组合间活性存在极显著差异(表
１)ꎮ 经 Ｐ. ｎｉｃｏｔｉａｎｅａ、Ｒ. ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍ 和激发子
ｐａｒａｓｉｔｉｃｅｉｎ诱导后ꎬ含双病原物诱导启动子的转基
因植株ꎬ其 ＧＵＳ诱导表达活性均明显高于含单一
病原物诱导启动子的植株(表 １)ꎮ 根据诱导因子
的不同ꎬ双启动子 ＨＰ ＋ ＥＰ 比单启动子 ＨＰ 的诱导
表达活性高 ４. ６ ~ ８. ７ 倍ꎬ比 ＥＰ的高 ５. ７ ~ ９. ０ 倍ꎻ
双启动子 ＥＰ ＋ ＨＰ 比单启动子 ＨＰ 的诱导表达活
性高 ３. ５ ~ ７. ５ 倍ꎬ比 ＥＰ 的高 ４. ０ ~ ８. ６ 倍ꎮ 经方
差分析ꎬ发现双启动子与单启动子的活性差异均达
极显著水平(表 １)ꎮ 双启动子 ＨＰ ＋ ＥＰ和 ＥＰ ＋ ＨＰ
的诱导表达活性也存在极显著差异ꎬ而两个单启动
子 ＨＰ和 ＥＰ之间没有明显差别(表 １)ꎬ这表明双
启动子的串联顺序可影响其活性ꎮ
而根据诱导因子的不同ꎬ四种类型启动子活性
在诱导后均比水处理对照大大提高ꎬ其中双启动子
ＨＰ ＋ ＥＰ提高了 １５. ７ ~ ３２. ６ 倍ꎬ双启动子 ＥＰ ＋ ＨＰ
提高了 １８. ４ ~ ３３. １ 倍ꎻ而单一启动子 ＨＰ 提高了
２. ５ ~ ５. ５ 倍ꎬＥＰ提高了 ２. ６ ~ ９. ２ 倍ꎮ
２. ２ 　 串联双病原物诱导启动子诱导活性的时间
动态
与单一病原物特异性诱导启动子 ＨＰ和 ＥＰ相
比ꎬ双病原物特异性启动子 ＨＰ ＋ ＥＰ和 ＥＰ ＋ ＨＰ在
诱导 ６ ｈ后表达活性存在显著差异ꎮ 为了分析这
些差异是否与取样时间有关ꎬ我们进一步测定了转
基因植株在 ２ ~ ２４ ｈ 的各时间段中启动子的诱导
表达活性(图 １ ~图 ３)ꎮ
从图 １ 可见ꎬ用激发子 Ｐａｒａｓｉｔｉｃｅｉｎ 诱导 ４ ｈ
后ꎬ４ 种启动子类型的转基因植株的 ＧＵＳ 活性均
逐渐升高ꎬ但含双病原物诱导启动子植株的 ＧＵＳ
活性上升更快ꎬ活性高峰出现在 ６ ~ １４ ｈꎬ其中双启
动子 ＨＰ ＋ ＥＰ活性在 ８ ｈ处达到最高峰ꎬ之后活性
水平逐渐下降ꎮ 双启动子 ＥＰ ＋ ＨＰ 在 Ｐａｒａｓｉｔｉｃｅｉｎ
诱导后的 ６ ~ １４ ｈ中ꎬ一直保持较稳定的高水平活
性ꎬＧＵＳ活性峰值出现在 １０ ｈ 处ꎮ 而在所有的时
间段中ꎬ含单一病原物诱导启动子的两类转基因植
株的 ＧＵＳ表达活性一直处于低水平状态ꎬ明显低
于各时间点串联的双启动子驱动的 ＧＵＳ表达活性
(图 １)ꎮ 进一步分析发现ꎬ虽然实测 ＧＵＳ 活性值
变化很大ꎬ但是不同类型的启动子及组合活性的倍
数变化并不大ꎮ 与 ２ ｈ 时 ＧＵＳ 活性比ꎬ在最大值
时ꎬＨＰ ＋ ＥＰ活性提高了 ７. ０ 倍ꎬＥＰ ＋ ＨＰ活性提高
了 ９. ８ 倍ꎬ而 ＨＰ 活性也提高了 ８. ４ 倍ꎬＥＰ 活性提
高了 １０. ４ 倍ꎮ
８７３
　
　 ４ 期 　 　 孔维文ꎬ等:串联双病原物诱导启动子驱动基因表达的特性
Ｔａｂｌｅ １　 ＧＵＳ ａｃｔｉｖｉｔｙ ａｆｔｅｒ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｂｙ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｆａｃｔｏｒｓ ａｆｔｅｒ ６ ｈ
Ｐｒｏｍｏｔｅｒ
ＧＵＳ ａｃｔｉｖｉｔｙ (Ｍｅａｎ ± Ｓ. Ｅ. ) / ｎｍｏｌ􀅰ｍｉｎ －１􀅰ｍｇ －１
Ｈ２Ｏ Ｐａｒａｓｉｔｉｃｅｉｎ Ｒ. ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍ Ｐ. ｎｉｃｏｔｉａｎｅａ
ＨＰ ＋ ＥＰ １ ９６８. ３９ ±１１７. １５ Ａ ３７ ５４３. ６１ ±１ ７６４. ８４ Ａ ５７ ２９７. ９９ ±３ ０５５. ０３ Ａ ３３ ６４２. ２９ ±８７４. ２３ Ａ
ＥＰ ＋ ＨＰ １ ３７５. ３５ ±８２. ７７ ＢＣ ３２ ０３２. ３６ ±５ ２２２. ７９ Ｂ ３９ ９６８. ９７ ±２ ７５６. ００ Ｂ ２７ ６２７. ２４ ±７３８. ９０ Ｂ
ＨＰ １ ６２０. ２１ ±２０７. ６２ Ｂ ６ ３６８. ７０ ±１ ３７３. ５４ Ｃ ７ １２８. ５６ ±２１２. １８ Ｃ ４ ８１３. ６８ ±２４９. ３１ Ｃ
ＥＰ １ ２５０. １１ ±２４４. ９０ Ｃ ５ ３２０. ７５ ±９７１. ３３ Ｃ ８ ５５６. ５４ ±６６２. ７２ Ｃ ４ ２７３. ４５ ±３２７. ４４ Ｃ
Ｔｈｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｖａｒｉａｎｃｅ (ＡＮＯＶＡ) ｗａｓ ｃａｒｒｉｅｄ ｏｕｔ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｔｈｅ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｄａｔａ ｕｓｉｎｇ ＤＰＳ ｄａｔａ ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍ
(ｖ７. ０５) . Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ａｒｅ ｆｒｏｍ ａ ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｖｅ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ ａｍｏｎｇ ｓｅｖｅｒａｌ ｒｅｐｅａｔｓꎬ ｗｈｉｃｈ ｖａｒｉｅｄ ｉｎ ａｂｓｏｌｕｔｅ ｌｅｖｅｌｓ ｏｆ ＧＵＳ
ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ ｂｕｔ ｇａｖｅ ｔｈｅ ｓａｍｅ ｔｒｅｎｄｓ ｆｏｒ ｐｒｏｍｏｔｅｒ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ. ＨＰ: ｈｓｒ２０３Ｊ ｇｅｎｅ ｐｒｏｍｏｔｅｒ ｆｒｏｍ ｔｏｂａｃｃｏꎻ ＥＰ: ＥＡＳ４ ｇｅｎｅ
ｐｒｏｍｏｔｅｒ ｆｒｏｍ ｔｏｂａｃｃｏꎻ ＨＰ ＋ ＥＰ ａｎｄ ＥＰ ＋ ＨＰ ｍｅａｎ ｔｗｏ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｔａｎｄｅｍ ｏｒｄｅｒｓ.
Ｆｉｇ. １　 Ｔｉｍｅ ｃｏｕｒｓｅ ｏｆ ＧＵＳ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ ｐａｒａｓｉｔｉｃｅｉｎ
Ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ ｕｉｄＡ ｒｅｐｏｒｔｅｒ ｇｅｎｅ ｐｒｏｄｕｃｔ (ＧＵＳ) ｉｎ ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｘｔｒａｃｔｓ ｗａｓ ｍｅａｓｕｒｅｄ ａｔ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｔｉｍｅ ｐｏｉｎｔｓ ａｆｔｅｒ
ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｔｏｂａｃｃｏ ｌｉｎｅｓ ｂｙ ｐａｒａｓｉｔｉｃｅｉｎ. Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ａｒｅ ｆｒｏｍ ａ ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｖｅ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ ａｍｏｎｇ ｓｅｖｅｒａｌ
ｒｅｐｅａｔｓꎬ ｗｈｉｃｈ ｖａｒｉｅｄ ｉｎ ａｂｓｏｌｕｔｅ ｌｅｖｅｌｓ ｏｆ ＧＵＳ ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ ｂｕｔ ｇａｖｅ ｔｈｅ ｓａｍｅ ｔｒｅｎｄｓ ｆｏｒ ｐｒｏｍｏｔｅｒ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ.
ＨＰ: ｈｓｒ２０３Ｊ ｇｅｎｅ ｐｒｏｍｏｔｅｒ ｆｒｏｍ ｔｏｂａｃｃｏꎻ ＥＰ: ＥＡＳ４ ｇｅｎｅ ｐｒｏｍｏｔｅｒ ｆｒｏｍ ｔｏｂａｃｃｏꎻ
ＨＰ ＋ ＥＰ ａｎｄ ＥＰ ＋ ＨＰ ｍｅａｎ ｔｗｏ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｔａｎｄｅｍ ｏｒｄｅｒｓ.
　 　 用 Ｐ. ｎｉｃｏｔｉａｎｅａ 和 Ｒ. ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍ 诱导后ꎬ
含不同启动子类型的 ４ 种转基因植株的 ＧＵＳ诱导
活性变化的时间动态与 Ｐａｒａｓｉｔｉｃｅｉｎ 的结果基本一
致(图 ２ꎬ图 ３)ꎮ 但是ꎬＧＵＳ 表达活性达到峰值的
时间有所不同:在含 ＨＰ ＋ ＥＰ 的转基因植株中ꎬ２
种病原物诱导的 ＧＵＳ表达活性的峰值出现在 ６ ｈꎬ
而激发子诱导的 ＧＵＳ峰值推迟了 ２ 小时ꎮ 这是否
暗示含双启动子的转基因植株对病菌的敏感程度
高于对激发子的敏感程度? 若果真如此ꎬ则将是一
种有趣的现象ꎮ
仔细分析还发现ꎬ在约 １０ ｈ 前ꎬ双启动子 ＨＰ
＋ ＥＰ的诱导表达活性一直高于 ＥＰ ＋ ＨＰ 的活性ꎻ
而在 １０ ｈ后ꎬ前者比后者活性下降更快ꎬ其活性一
直低于后者ꎮ 另外ꎬＨＰ ＋ ＥＰ 的诱导活性有一个明
显的峰值ꎬ而 ＥＰ ＋ ＨＰ的诱导活性则有一个明显的
平台ꎬ这提示双启动子串联的顺序对其活性表现有
一定的影响ꎮ
９７３
　
植物病理学报 ４３ 卷
Ｆｉｇ. ２　 Ｔｉｍｅ ｃｏｕｒｓｅ ｏｆ ＧＵＳ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ ｎｉｃｏｔｉａｎｅａ
Ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ ｕｉｄＡ ｒｅｐｏｒｔｅｒ ｇｅｎｅ ｐｒｏｄｕｃｔ (ＧＵＳ) ｉｎ ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｘｔｒａｃｔｓ ｗａｓ ｍｅａｓｕｒｅｄ ａｔ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｔｉｍｅ ｐｏｉｎｔｓ ａｆｔｅｒ ｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ
ｏｆ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｔｏｂａｃｃｏ ｌｉｎｅｓ ｗｉｔｈ Ｐ. ｎｉｃｏｔｉａｎｅａ [０] . Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ａｒｅ ｆｒｏｍ ａ ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｖｅ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ ａｍｏｎｇ
ｓｅｖｅｒａｌ ｒｅｐｅａｔｓꎬ ｗｈｉｃｈ ｖａｒｉｅｄ ｉｎ ａｂｓｏｌｕｔｅ ｌｅｖｅｌｓ ｏｆ ＧＵＳ ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ ｂｕｔ ｇａｖｅ ｔｈｅ ｓａｍｅ ｔｒｅｎｄｓ ｆｏｒ ｐｒｏｍｏｔｅｒ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ.
ＨＰ: ｈｓｒ２０３Ｊ ｇｅｎｅ ｐｒｏｍｏｔｅｒ ｆｒｏｍ ｔｏｂａｃｃｏꎻ ＥＰ: ＥＡＳ４ ｇｅｎｅ ｐｒｏｍｏｔｅｒ ｆｒｏｍ ｔｏｂａｃｃｏꎻ
ＨＰ ＋ ＥＰ ａｎｄ ＥＰ ＋ ＨＰ ｍｅａｎ ｔｗｏ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｔａｎｄｅｍ ｏｒｄｅｒｓ.
Ｆｉｇ. ３　 Ｔｉｍｅ ｃｏｕｒｓｅ ｏｆ ＧＵＳ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍ
Ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ ｕｉｄＡ ｒｅｐｏｒｔｅｒ ｇｅｎｅ ｐｒｏｄｕｃｔ (ＧＵＳ) ｉｎ ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｘｔｒａｃｔｓ ｗａｓ ｍｅａｓｕｒｅｄ ａｔ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｔｉｍｅ ｐｏｉｎｔｓ ａｆｔｅｒ ｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ
ｏｆ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｔｏｂａｃｃｏ ｌｉｎｅｓ ｗｉｔｈ Ｒ. ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍ. Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ａｒｅ ｆｒｏｍ ａ ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｖｅ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ ａｍｏｎｇ ｓｅｖｅｒａｌ
ｒｅｐｅａｔｓꎬ ｗｈｉｃｈ ｖａｒｉｅｄ ｉｎ ａｂｓｏｌｕｔｅ ｌｅｖｅｌｓ ｏｆ ＧＵＳ ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ ｂｕｔ ｇａｖｅ ｔｈｅ ｓａｍｅ ｔｒｅｎｄｓ ｆｏｒ ｐｒｏｍｏｔｅｒ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ.
ＨＰ: ｈｓｒ２０３Ｊ ｇｅｎｅ ｐｒｏｍｏｔｅｒ ｆｒｏｍ ｔｏｂａｃｃｏꎻ ＥＰ: ＥＡＳ４ ｇｅｎｅ ｐｒｏｍｏｔｅｒ ｆｒｏｍ ｔｏｂａｃｃｏꎻ
ＨＰ ＋ ＥＰ ａｎｄ ＥＰ ＋ ＨＰ ｍｅａｎ ｔｗｏ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｔａｎｄｅｍ ｏｒｄｅｒｓ.
３　 讨论
本研究定量分析了串联的两个病原物特异性
诱导启动子的诱导表达活性ꎬ发现不管是受激发子
诱导还是病原卵菌或细菌诱导ꎬ串联的双启动子均
能协同促进报告基因高水平表达ꎬ且与单一启动子
相比表达水平有显著的差异ꎻ研究结果还显示ꎬ两
个启动子的串联顺序对双启动子的活性强度和峰
值出现的时间有影响ꎮ 可见ꎬ双病原物诱导启动子
不仅有更广泛的诱导表达谱ꎬ而且诱导表达活性显
著高于单一病原物诱导启动子ꎮ
目前ꎬ已有一些关于人工启动子驱动基因高水
０８３
　
　 ４ 期 　 　 孔维文ꎬ等:串联双病原物诱导启动子驱动基因表达的特性
平表达的报道ꎮ 这些人工启动子以一个微小的启
动子核心区如 ＣａＭＶ ３５Ｓ 核心序列提供 ＴＡＴＡ 盒
和 ＣＡＡＴ 盒ꎬ然后在其上游添加多个顺式调控元
件ꎬ如来自病原物诱导启动子的 Ｗ 盒、Ｓ 盒、Ｄ 盒
和 Ｇｓｔ１ 盒[３]ꎬ或来自植物中组成性高水平表达的
基因启动子区的 ＡＣＧＴ 盒、ＯＣＳ 元件、ＧＴ１ 元件、
和 ＧＡＴＡ盒等[１５ꎬ １６]ꎬ这类顺式调控元件都是以各
自的多拷贝形式置于人工启动子中ꎬ从而赋予启动
子驱动基因高水平表达的特性ꎮ 关于人工启动子
驱动基因高水平表达的分子机制的研究ꎬ目前可查
找到的文献很少ꎬ且相关研究不深入ꎮ 有研究指
出ꎬ不同顺式调控元件的组合ꎬ以协同或拮抗作用
调控着核心启动子区转录复合物的稳定性ꎬ从而影
响基因的表达水平[１６]ꎮ 这样的结论是不全面的ꎬ
没有考虑到启动子核心区上游结合的转录因子对
基因表达调控的影响ꎮ
关于本研究使用的 ＥＰ 和 ＨＰ２ 个病原物诱导
启动子协同促进其驱动的基因高水平表达的机制ꎬ
有待今后通过更多的实验阐明ꎮ 我们曾分析了 ＥＰ
和 ＨＰ 启动子序列ꎬ发现 ＥＰ 含 ＨＤ￣Ｚｉｐ、ＭｙｂＩ、
ＭＹＣ和ＷＲＫＹ / ＴＧＡ等一系列顺式调控元件及未
知保守序列ꎬ ＨＰ 含 Ｇ￣ｂｏｘ￣ｌｉｋｅ、 ＨＳＲＥ、 ＭｙｂＩＩ、
ＭＹＢ、ＴＧＡ和 ３ 个ＷＲＫＹ顺式调控元件及未知保
守序列ꎮ 其中的 ＭＹＢ、ｂＺＩＰ / ＴＧＡ 和 ＷＲＫＹ 转录
因子结合位点序列ꎬ暗示 ２ 个启动子可能需要此 ３
个转录因子参与其功能的激活ꎬ而这 ３ 个转录因子
是调节许多植物防卫反应基因表达所必需
的[１７ ~ １９]ꎻ当病原物侵染转基因植株时ꎬ推测这 ３ 种
转录因子可能参与了对双启动子驱动功能目标基
因诱导表达的调控ꎮ
我们推测ꎬＥＰ 和 ＨＰ２ 个启动子的串联ꎬ构成
了一个新的功能强大的“融合启动子”ꎬ这个“融合
启动子”叠加获得了更多的顺式调控元件ꎬ从而使
其能被更多的转录因子识别和结合ꎮ 不同病原物
侵染或激发子诱导ꎬ分别激活不同或相同的抗病信
号途径ꎬ进而激活与之相对应的调控防卫反应基因
表达的转录因子ꎬ如 ＭＹＢ、ｂＺＩＰ / ＴＧＡ 和 ＷＲＫＹ
等ꎬ这些转录因子迅速结合到“融合启动子”上ꎬ其
结果就是强烈而协同促进其驱动的基因高水平表
达ꎮ
本研究结果可为开展植物广谱抗病基因工程
提供一条有效途径ꎬ也为在可控条件下实现外源基
因的高水平表达提供有价值的方法ꎬ因而在植物抗
病基因工程中具有广阔的应用前景ꎮ
参考文献
[１] 　 Ｍａｎｎｅｒｓ Ｊ Ｍꎬ Ｐｅｎｎｉｎｃｋｘ Ｉ Ａ Ｍ Ａꎬ Ｖｅｒｍａｅｒｅ Ｋꎬ ｅｔ
ａｌ. Ｔｈｅ ｐｒｏｍｏｔｅｒ ｏｆ ｔｈｅ ｐｌａｎｔ ｄｅｆｅｎｓｉｎ ｇｅｎｅ ＰＤＦ１. ２
ｆｒｏｍ Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｉｓ ｓｙｓｔｅｍｉｃａｌｌｙ ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｂｙ ｆｕｎｇａｌ
ｐａｔｈｏｇｅｎｓ ａｎｄ ｒｅｓｐｏｎｄｓ ｔｏ ｍｅｔｈｙｌ ｊａｓｍｏｎａｔｅ ｂｕｔ ｎｏｔ ｔｏ
ｓａｌｉｃｙｌｉｃ ａｃｉｄ [Ｊ] . Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙꎬ １９９８ꎬ ３８
(６): １０７１ －１０８０.
[２] 　 Ｈｅｉｓｅ Ａꎬ Ｌｉｐｐｏｋ Ｂꎬ Ｋｉｒｓｃｈ Ｃꎬ ｅｔ ａｌ. Ｔｗｏ ｉｍｍｅｄｉａｔｅ￣
ｅａｒｌｙ ｐａｔｈｏｇｅｎ￣ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ ｍｅｍｂｅｒｓ ｏｆ ｔｈｅ ＡｔＣＭＰＧ
ｇｅｎｅ ｆａｍｉｌｙ ｉｎ Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ ａｎｄ ｔｈｅ Ｗ￣ｂｏｘ￣
ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｅｌｉｃｉｔｏｒ￣ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｅｌｅｍｅｎｔ ｏｆ ＡｔＣＭＰＧ１ [Ｊ] .
Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓꎬ
２００２ꎬ ９９(１３): ９０４９ －９０５４.
[３] 　 Ｒｕｓｈｔｏｎ Ｐ Ｊꎬ Ｒｅｉｎｓｔäｄｌｅｒ Ａꎬ Ｌｉｐｋａ Ｖꎬ ｅｔ ａｌ. Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ
ｐｌａｎｔ ｐｒｏｍｏｔｅｒｓ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｄｅｆｉｎｅｄ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｅｌｅｍｅｎｔｓ
ｐｒｏｖｉｄｅ ｎｏｖｅｌ ｉｎｓｉｇｈｔｓ ｉｎｔｏ ｐａｔｈｏｇｅｎ￣ ａｎｄ ｗｏｕｎｄ￣ｉｎ￣
ｄｕｃｅｄ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ [ Ｊ] . Ｔｈｅ Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌꎬ ２００２ꎬ １４(４):
７４９ －７６２.
[４] 　 Ｇｕｒｒ Ｓ Ｊꎬ Ｒｕｓｈｔｏｎ Ｐ Ｊ. Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｐｌａｎｔｓ ｗｉｔｈ ｉｎ￣
ｃｒｅａｓｅｄ ｄｉｓｅａｓｅ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ: ｗｈａｔ ａｒｅ ｗｅ ｇｏｉｎｇ ｔｏ ｅｘ￣
ｐｒｅｓｓ [ Ｊ] . Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙꎬ ２００５ꎬ ２３ (６):
２７５ －２８２.
[５] 　 Ｖｅｎｔｅｒ Ｍ. Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｐｒｏｍｏｔｅｒｓ: ｇｅｎｅｔｉｃ ｃｏｎｔｒｏｌ
ｔｈｒｏｕｇｈ ｃｉｓ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ [Ｊ] . Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉｅｎｃｅꎬ
２００７ꎬ １２(３): １１８ －１２４.
[６] 　 Ａｓｓａａｄ Ｆ Ｆꎬ Ｔｕｃｋｅｒ Ｋ Ｌꎬ Ｓｉｇｎｅｒ Ｅ Ｒ. Ｅｐｉｇｅｎｅｔｉｃ ｒｅ￣
ｐｅａｔ￣ｉｎｄｕｃｅｄ ｇｅｎｅ ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ ( ＲＩＧＳ) ｉｎ Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ
[Ｊ] . Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙꎬ １９９３ꎬ ２２(６): １０６７ －
１０８５.
[７] 　 Ｉｎｇｅｌｂｒｅｃｈｔ Ｉꎬ Ｖａｎ Ｈｏｕｄｔ Ｈꎬ Ｖａｎ Ｍｏｎｔａｇｕ Ｍꎬ ｅｔ ａｌ.
Ｐｏｓｔｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ ｏｆ ｒｅｐｏｒｔｅｒ ｔｒａｎｓｇｅｎｅｓ ｉｎ
ｔｏｂａｃｃｏ ｃｏｒｒｅｌａｔｅｓ ｗｉｔｈ ＤＮＡ ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ [ Ｊ] . Ｐｒｏ￣
ｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓꎬ １９９４ꎬ
９１(２２): １０５０２ －１０５０６.
[８] 　 Ｍａｔｚｋｅ Ｍ Ａꎬ Ｍａｔｚｋｅ Ａ Ｊ Ｍ. Ｇｅｎｅ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ ａｎｄ
ｅｐｉｇｅｎｅｔｉｃ ｖａｒｉａｔｉｏｎ ｉｎ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｐｌａｎｔｓ [Ｊ] . Ｄｅｖｅｌｏｐ￣
ｍｅｎｔａｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓꎬ １９９０ꎬ １１(３): ２１４ －２２３.
１８３
　
植物病理学报 ４３ 卷
[９] 　 Ｓｔａｍ Ｍꎬ Ｍｏｌ Ｊ Ｎ Ｍꎬ Ｋｏｏｔｅｒ Ｊ Ｍ. Ｒｅｖｉｅｗ Ａｒｔｉｃｌｅ:
Ｔｈｅ ｓｉｌｅｎｃｅ ｏｆ ｇｅｎｅｓ ｉｎ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｐｌａｎｔｓ [ Ｊ] . Ａｎｎａｌｓ
ｏｆ Ｂｏｔａｎｙꎬ １９９７ꎬ ７９(１): ３ －１２.
[１０] Ｗａｎｇ Ｄ Ｄꎬ Ｗａｎｇ Ｒꎬ Ｔａｎｇ Ｌ Ｌꎬ ｅｔ ａｌ. Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ ｏｆ
ｐｌａｎｔ ｓａｆｅｔｙ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒ ｈａｒｂｏｒｉｎｇ ｔｗｏ ｐａｔｈｏｇｅｎ
ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ ｐｒｏｍｏｔｅｒｓ ( ｉｎ Ｃｈｉｎｅｓｅ) [ Ｊ] . Ａｃｔａ Ｐｈｙｔｏ￣
ｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａ Ｓｉｎｉｃａ(植物病理学报)ꎬ ２００９ꎬ ３９ (２):
１５３ －１５９.
[１１] Ｙｉｎ Ｓꎬ Ｍｅｉ Ｌꎬ Ｎｅｗｍａｎ Ｊꎬ ｅｔ ａｌ. Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｅｓ￣
ｑｕｉｔｅｒｐｅｎｅ ｃｙｃｌａｓｅ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ (ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ
ａｎ ｅｌｉｃｉｔｏｒ￣ ａｎｄ ｐａｔｈｏｇｅｎ￣ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ ｐｒｏｍｏｔｅｒ) [ Ｊ] .
Ｐｌａｎｔ ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙꎬ １９９７ꎬ １１５(２): ４３７ －４５１.
[１２] Ｐｏｎｔｉｅｒ Ｄꎬ Ｇｏｄｉａｒｄ Ｌꎬ Ｍａｒｃｏ Ｙꎬ ｅｔ ａｌ. ｈｓｒ２０３Ｊꎬ ａ ｔｏ￣
ｂａｃｃｏ ｇｅｎｅ ｗｈｏｓｅ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｉｓ ｒａｐｉｄꎬ ｈｉｇｈｌｙ ｌｏｃａｌｉｚｅｄ
ａｎｄ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｆｏｒ ｉｎｃｏｍｐａｔｉｂｌｅ ｐｌａｎｔ / ｐａｔｈｏｇｅｎ ｉｎｔｅｒａｃ￣
ｔｉｏｎｓ [Ｊ] . Ｔｈｅ Ｐｌａｎｔ Ｊｏｕｒｎａｌꎬ １９９４ꎬ ５(４): ５０７ －５２１.
[１３] Ｌｉａｎｇ Ｙ Ｃꎬ Ｌｉｕ Ａ Ｘꎬ Ｄｏｎｇ Ｈ Ｓꎬ ｅｔ ａｌ. Ｃｌｏｎｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ
ＰａｒＡ１ ｇｅｎｅ ｆｒｏｍ Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ ｐａｒａｓｉｔｉｃａ ａｎｄ ｉｔｓ ｅｘ￣
ｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ( ｉｎ Ｃｈｉｎｅｓｅ) [ Ｊ] . Ａｃｔａ
Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａ Ｓｉｎｉｃａ(微生物学报)ꎬ ２００４ꎬ ４４(２):
２０２ －２０５.
[１４] Ｊｅｆｆｅｒｓｏｎ Ｒ. Ａｓｓａｙｉｎｇ ｃｈｉｍｅｒｉｃ ｇｅｎｅｓ ｉｎ ｐｌａｎｔｓ: Ｔｈｅ
ＧＵＳ ｇｅｎｅ ｆｕｓｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ. Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ
Ｒｅｐｏｒｔｅｒꎬ １９８７ꎬ ５(４): ３８７ －４０５.
[１５] Ｓａｗａｎｔ Ｓꎬ Ｓｉｎｇｈ Ｐ Ｋꎬ Ｍａｄａｎａｌａ Ｒꎬ ｅｔ ａｌ. Ｄｅｓｉｇｎｉｎｇ
ｏｆ ａｎ ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｃａｓｓｅｔｔｅ ｆｏｒ ｔｈｅ ｈｉｇｈ￣ｌｅｖｅｌ ｅｘ￣
ｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｔｒａｎｓｇｅｎｅｓ ｉｎ ｐｌａｎｔｓ [ Ｊ] . Ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ ａｎｄ
Ａｐｐｌｉｅｄ Ｇｅｎｅｔｉｃｓꎬ ２００１ꎬ １０２(４): ６３５ －６４４.
[１６] Ｓａｗａｎｔ Ｓ Ｖꎬ Ｋｉｒａｎ Ｋꎬ Ｍｅｈｒｏｔｒａ Ｒꎬ ｅｔ ａｌ. Ａ ｖａｒｉｅｔｙ ｏｆ
ｓｙｎｅｒｇｉｓｔｉｃ ａｎｄ ａｎｔａｇｏｎｉｓｔｉｃ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ ｍｅｄｉａｔｅｄ ｂｙ
ｃｉｓ￣ａｃｔｉｎｇ ＤＮＡ ｍｏｔｉｆｓ ｒｅｇｕｌａｔｅ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｐｌａｎｔ
ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ｍｏｄｕｌａｔｅ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｃｏｍｐｌｅｘ
ｆｏｒｍｅｄ ｏｎ ａ ｂａｓａｌ ｐｒｏｍｏｔｅｒ [ Ｊ] . Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉ￣
ｍｅｎｔａｌ Ｂｏｔａｎｙꎬ ２００５ꎬ ５６(４１９): ２３４５ －２３５３.
[１７] Ｒｕｓｈｔｏｎ Ｐ Ｊꎬ Ｓｏｍｓｓｉｃｈ Ｉ Ｅ. Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ
ｐｌａｎｔ ｇｅｎｅｓ ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ ｔｏ ｐａｔｈｏｇｅｎｓ [ Ｊ] . Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏ￣
ｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｐｌａｎｔ Ｂｉｏｌｏｇｙꎬ １９９８ꎬ １(４): ３１１ －３１５.
[１８] Ｓｉｎｇｈ Ｋ Ｂꎬ Ｆｏｌｅｙ Ｒ Ｃꎬ Ｏñａｔｅ￣Ｓáｎｃｈｅｚ Ｌ. Ｔｒａｎｓｃｒｉｐ￣
ｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒｓ ｉｎ ｐｌａｎｔ ｄｅｆｅｎｓｅ ａｎｄ ｓｔｒｅｓｓ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ [ Ｊ] .
Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｐｌａｎｔ Ｂｉｏｌｏｇｙꎬ ２００２ꎬ ５(５): ４３０ －
４３６.
[１９] ｖａｎ Ｖｅｒｋ Ｍ Ｃꎬ Ｇａｔｚ Ｃꎬ Ｌｉｎｔｈｏｒｓｔ Ｈ Ｊ Ｍ. Ｃｈａｐｔｅｒ １０
ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｌａｎｔ ｄｅｆｅｎｓｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ
[Ａ] . Ｌｏｏｎ ＬＣＶ. Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｂｏｔａｎｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ
[Ｍ] . Ｖｏｌｕｍｅ ５１: Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓꎬ ２００９. ３９７ －４３８.
责任编辑:李晖
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