全 文 ：植物病理学报
ACTA PHYTOPATHOLOGICA SINICA　 41(6): 618-625(2011)
收稿日期: 2010-10-21; 修回日期: 2011-08-13
基金项目: 公益性行业(农业)科研专项(200903035; 200903004); 国家自然科学基金项目(31071642)
通讯作者: 马占鸿,教授,主要从事植物病害分子流行学和宏观植物病理学研究, E-mail: mazh@cau. edu. cn
第一作者: 闫佳会(1984 - ),女,湖北宜昌人,硕士,主要从事植物病害分子流行学研究。
应用 real-time PCR 定量检测田间
小麦条锈菌潜伏侵染的研究
闫佳会1, 骆 勇1,2, 潘娟娟1, 王海光1, 金社林3, 曹世勤3, 马占鸿1*
( 1中国农业大学植物病理学系 农业部植物病理学重点开放实验室, 北京 100193;
2美国加州大学 Kearney农业研究中心, Parlier CA 93648; 3甘肃省农业科学院植物保护研究所, 兰州 730070)
摘要: 为快速、及时地定量检测处于潜育状态下的小麦条锈菌菌量,本研究于 2009 - 2010 年实施田间试验,在北京和甘肃
各设 3 个试验小区,将小区分割成 1 m ×1 m或 1. 5 m ×1. 5 m 的小格。 初春刚返青叶片出现症状前,在每小格内采集 30
片叶,提取叶片基因组 DNA,应用已建立的 real-time PCR定量测定方法,计算每个样本的分子病情指数(molecular-detected
disease index, MDI)。 在本试验的天气条件和试验设计下,采样 10 d 后,调查田间标记采样点的发病情况,计算病情指数
DI,比较 MDI和 DI的关系,建立回归模型。 结果表明:甘肃甘谷 3 个试验小区的 MDI 和 DI 存在极显著的相关性(R21 =
0． 813 6,R22 =0. 884 5,R23 = 0. 592 8);北京上庄 3 个试验小区的 MDI 和 DI 也存在极显著的相关性(R21 = 0. 742 3,R22 =
0． 578 4,R23 =0. 858 4)。 本研究证明了应用分子生物学方法可估测小麦条锈病潜育侵染程度的可能性,为建立分子定量测
定田间潜育侵染量系统提供了可靠依据。
关键词: Puccinia striiformis; 分子流行学
Quantification of latent infection of wheat stripe rust in the fields using real-time
PCR　 YAN Jia-hui1, LUO Yong1,2, PAN Juan-juan1, WANG Hai-guang1, JIN She-lin3, CAO Shi-qin3,
MA Zhan-hong1 ( 1 Department of Plant Pathology,The Key Laboratory of China Ministry Agriculture,China Agricultural
University,Beijing 100193,China; 2 University of California,Kearney Agricultural Center, Parlier CA 93648,USA; 3 Institute of
Plant Protection,Gansu Academy of Agriculture Science, Lanzhou 730070,China )
Abstract: Wheat stripe rust, caused by Puccinia striiformis f. sp. tritici (Pst), is one of the most important
wheat disease world wide. The key issue of the disease forecast is to timely and accurately quantify the latent
infection levels in overwintering and oversummering volunteer seedlings that may serve as sources of initial
inoculum of epidemics. The field experiments were conducted with nature infections in Gangu (Gansu Pro-
vince), and with artificial inoculations in Shangzhuang, Beijing from 2009 to 2010. There were 3 test plots
each in Beijing and Gansu, each plot was divided into 36 grids with same area. In early spring , the new ap-
peared leaves were collected for DNA extraction. The real-time PCR assay was applied to quantify both host
DNA and the Pst DNA from each sample. The proportion of Pst DNA (pg) over the total amount of wheat
DNA (ng) was assigned as the molecular-detected disease index (MDI) . The visual disease index (DI) in
each plot was recorded 10 days after leaf sampling. Linear regression between MDI and DI was performed
using the corresponding data set. The regressions were significant for both Gangu fields (R21 = 0. 813 6,R22 =
0． 884 5,R23 =0. 592 8)and Shangzhuang fields (R21 =0. 742 3,R22 =0. 578 4,R23 =0. 858 4) . This study dem-
onstrated the potential applications of real-time PCR in quantification of latent infection level for various
　
　 6 期 　 闫佳会,等:应用 real-time PCR 定量检测田间小麦条锈菌潜伏侵染的研究
research objectives.
Key words: Puccinia striiformis; molecular epidemiology
中图分类号: S435. 121　 　 　 　 　 文献标识码: A　 　 　 　 　 文章编号: 0412-0914(2011)06-0618-08
　 　 小麦条锈病是由小麦条形柄锈菌(Puccinia
striiformis f. sp. tritici)引起的气传性病害,遍及世
界各主要小麦生产区,也是我国小麦生产中最主要
的病害和主要监控研究对象。 1950 年以来,该病
害多次流行成灾,是制约小麦高产稳产的一个重要
灾害性因子[1 ~ 4]。 及早、有效地降低初始菌量是
小麦条锈病防治的重要环节之一。 除应用抗病品
种外,药剂防治是降低初始菌源量的重要措施。 初
始菌源的来源因不同地区的流行特点而异,秋苗或
越冬后春苗上的第一代受侵染病叶产生的孢子是
季节流行的主要侵染来源。 然而,这些潜在侵染的
病原菌在越冬的很长一段时间内处于潜伏状态,在
秋苗上的侵染也可能会因环境不适宜而处于潜伏
状态推迟发病。 追踪潜伏侵染的变化和显著降低
这一类侵染量对遏制流行至关重要。 但传统方法
必须通过麦苗培养确定潜伏侵染量,无法快速获得
大面积的有效数据。 应用及时、准确、定量的方法
测定潜伏侵染是流行学研究的重要内容。
近年来,分子生物学技术的发展为植物体内病
原菌的快速、准确诊断提供了有效的工具。 Real-
time PCR作为一种成熟的方法已经用于定量测定
植物体内侵染病原菌的 DNA 含量[ 5]。 Winton
等[ 6 , 7]开发出 2 个不同标记的 Taqman 探针,可通
过实时荧光定量 PCR技术定量检测寄主道格拉斯
冷杉 和 病 原 菌 Phaeocryptopus gaeumannii 的
DNA,从而获得侵染早期病原菌在寄主中的含量,
为病害的早期预测预警提供帮助。 Pan 等[ 8]建立
了 real-time PCR 系统,能够定量测定小麦叶片在
接种条锈菌后组织内的病原菌 DNA 随时间的变
化。
目前国内外开展了一些对小麦条锈病病原菌
的定性或者定量的检测研究[ 8 ~ 10],大多应用室内
方法,尚未见田间小麦条锈病早期定量检测的报
道。 本研究使用 real-time PCR 的方法定量检测田
间潜育侵染的小麦条锈菌 DNA和小麦叶片 DNA,
构建分子病情指数(MDI)和病情指数(DI)的回归
模型,为快速、有效测定潜伏侵染量和准确预测该
病害的流行趋势提供新的方法。
1　 材料与方法
1. 1　 试验田概况
田间试验于 2009 -2010 年在甘肃省甘谷县白
家湾乡的王家新庄(北纬:34°09′ 东经:105°21′,海
拔高度 1 670m,年均气温 10. 72℃,年均降雨量
570 mm) 和东三十里铺 (北纬: 34. 15° 东经:
105． 35°,海拔高度 1 770 m,年平均气温 8. 9 ℃,年
降雨量 530 mm)和中国农业大学上庄试验站同时
进行。 白家湾乡属于山区,土壤肥力偏低,小麦生
育期的用水主要依靠降雨。 上庄试验站土壤状况
相对较好,土壤肥沃,采用渠道灌概以保证小麦整
个生育期的需水,小麦生长状况好。
1. 2　 试验设计
甘谷试验地面积 243 m2。 设 3 个小区,1、2 小
区位于王家新庄,3 小区位于东三十铺村,每小区
面积 81 m2(9 m ×9 m),品种为中度感病的临洮系
157。 2009 年 9 月 14 日按 225 kg / hm2的密度种植
小麦,春季条锈病能自然发生。 春季返青后用塑料
绳把每小区分割成 36 个 1. 5 m ×1. 5 m的小格,在
叶片未显症前(2010 年 3 月 19 日)采样,采样时在
每小格内按 Z字形 5 点采样的方法每点选择 30 株
小麦(起身期),任意采集 6 片叶,每小格共计 30
片叶。 上庄试验地面积 108 m2。 设 3 个小区,小
区面积 36 m2(6 m ×6 m),种植中度感病的品种京
0045,小麦返青后划分成 36 个 1 m × 1 m 的小格。
由于上庄在自然条件下发病困难,于 2010 年 4 月
8 日在每小区的诱发穴(种植铭贤 169)接种条锈
菌 CYR33。 用小型喷雾器将配制好的小麦条锈菌
孢子悬浮液均匀喷洒在麦苗上,利用水喷雾处理的
塑料薄膜覆盖过夜,次日早晨揭去薄膜。 在诱发穴
显症 3d后,每小格按上述方法采样。
1. 3　 田间病情指数的调查
采样 10 d 后,调查田间标记的采样点发病情
况,调查叶片为每株小麦的拔节期第三片叶,记录
普遍率与严重度,计算实际病情指数(DI)。 其中
916
　
植物病理学报 41 卷
DI利用下列公式计算:
病情指数(DI) =普遍率(% ) ×平均严重度
(% ) ×100
1. 4　 样品处理
1. 4. 1　 小麦叶片 DNA 的提取　 采集的样品采用
0. 8% CTAB 法提取总基因组 DNA。 将 0. 8%
CTAB提取缓冲液置于 65℃水浴锅中预热;碾磨:
取小麦叶片剪成 1 cm长,放入研钵中,在液氮中快
速研磨;尽快将研钵磨好的样品转入离心管中,加
入预热 65℃的 0. 8% CTAB 提取缓冲液 1 mL,再
加 400 mL氯仿,反复颠倒混匀;65℃水浴 30 min,
期间轻摇 1 次;将离心管管壁上的水擦干净,于
17 949 g离心 20 min;转移上清液 700 μL 于 1. 5
mL离心管中,加入 400 mL 氯仿,反复颠倒混匀后
静置 3 min,17 949 g 离心 10 min;转移上清液 500
μL于一新的 1. 5 mL 离心管中,然后加入等体积
的异丙醇,反复颠倒数次,此时可清晰看见 DNA
絮状沉淀; - 20℃条件下静置 20 min,于 17 949 g
离心 20 min,小心去除上清液;加入 400 μL 70%的
乙醇冲洗液,将沉淀弹起,充分洗涤,于 10 621 g离
心 5 min,重复此步骤 2 次,晾干;加入 20 μL 1 ×
TE缓冲液,和 2 μL 10 mg / mL RNase, 4℃溶解
DNA过夜,置于 -20℃保存备用。
将提取备用的 DNA分成 2 份,一份稀释 90 倍
用于定量病原菌,一份稀释 500 倍用于定量小麦
DNA。
1. 4. 2　 Real-time PCR 定量测定叶片 DNA 和样品
中病原菌 DNA　 试验应用 Pan 等[ 8]报道的根据小
麦条锈菌 β-tubilin 序列设计的引物 pst-F 和 pst-R
扩增条锈菌 DNA 并应用 Sandberg 等[ 11]报道的根
据小麦属醇溶蛋白基因设计的小麦特异性引物
TAG2315F 和 TAG2473R 扩增小麦 DNA。 使用
ABI7000进行 real-time PCR扩增,引物序列见表 1。
Pan等[ 8]建立的定量测定小麦条锈菌 DNA
量的标准曲线,其方程式为 Y1 = - 0. 289 1X1 +
9． 185 (R2 =0. 994 6, P <0. 01),其中 Y1为条锈菌
DNA浓度(pg / μL)常用对数( log10)值,X1为样品
中病原菌经 real-time PCR 的 Ct 值。 同时建立了
定量测定小麦基因组 DNA 的标准曲线,其方程式
为 Y2 = - 0. 48X2 + 16. 11 (R2 = 0. 995 7, P <
0． 01),其中 Y2为小麦 DNA 浓度(pg / μL)常用对
数( log10 ) 值, X2 为经 real-time PCR 扩增后的
Ct值。
1)小麦条锈菌 real-time PCR反应体系和条件
以 SYBR Green Ⅰ为荧光染料,PCR 在 20 μL
的反应体系为:10 μL SYBR Green Ⅰ Premix Ex
TaqTM ( TaKaRa),模板 DNA 1 μL,正反引物
(2 mmol / L)各 1 μL,7. 6 μL ddH2O。 反应条件:
95℃ 30 s; 95℃ 5 s, 65℃ 31 s,40 个循环。 收集
荧光做溶解曲线观察,确定是否有唯一的产物峰。
2)小麦叶片 DNA 的 real-time PCR 反应体系
和条件
以 SYBR Green Ⅰ为荧光染料,PCR 在 20 μL
的反应体系为:10 μL SYBR Premix Ex Taq TM
(TaKaRa),模板 DNA 1 μL,正反引物(2 mmol /
L)各 1 μL,7. 6 μL ddH2O。 反应条件:95℃ 30 s;
95℃ 5 s, 67℃ 20 s,72℃ 30 s,40 个循环。 收集荧
光做溶解曲线观察,确定是否有唯一的产物峰。
1. 5　 分子病情指数的计算
样品中条锈菌的量远远低于小麦 DNA 的量,
经标准曲线由 Ct 值换算得到的条锈菌的量用 pg
为单位,经标准曲线由 Ct 值换算得到的小麦的量
用 ng为单位。 每个样品各有病原菌的量和小麦的
量,用以下方法定义分子病情指数 (molecular-
detected disease index, MDI)。
Table 1　 Sequences of the primers used in this study
Primer Sequence(5′-3′)
pst-F TAAGGTGTCTGATACCGTTGTCG
pst-R GCTAGTTTACGGAGATCAGAGT
TAG2315F CAGAAAGCGAGTGGAAAGATGAAAG
TAG2473R GCAAGGAGG ACA AAGATGAGGAA
026
　
　 6 期 　 闫佳会,等:应用 real-time PCR 定量检测田间小麦条锈菌潜伏侵染的研究
MDI =条锈菌 DNA量(pg) /小麦 DNA量(ng)
1. 6　 数据分析
对每个田块,将 MDI 与 DI 通过 SAS 统计软
件 REG程序进行回归分析,确定其直线相关关系。
2　 结果与分析
2. 1　 甘谷试验田MDI和 DI回归分析
应用 SAS 软件对甘谷 3 个试验小区的 MDI
与田间实际调查的病情指数 DI进行回归分析。 甘
谷 1 号小区回归分析结果见图 1, 回归方程 y =
0． 218 5x +0. 207 1 (R2 = 0. 813 6, P < 0. 01),表
明二者存在极显著相关性。 MDI 的最大检测值为
23. 19,其相应的病情指数 DI的最大值为 4. 20。
甘谷 2 号小区的回归分析结果见图 2,回归方
程 y = 0. 515 5x + 0. 103 4 (R2 = 0. 884 5,P <
0． 01),表明 MDI 和病情指数 DI 存在极显著相关
性。 MDI检测值的范围在 0. 02 到 4. 54 之间,相应
DI的范围在 0 到 2. 63 之间。
Fig. 1　 Liner regression between molecular-detected disease index (MDI) and
visualized disease index of wheat stripe rust
The data were from the experiment in the Gangu field #1, Gansu Province.
Fig. 2　 Liner regression between molecular-detected disease index (MDI) and
visualized disease index of wheat stripe rust
The data were from the experiment in the Gangu field #2, Gansu Province.
126
　
植物病理学报 41 卷
　 　 甘谷 3号小区的回归方程(图 3)为 y =0. 704 6x
+0. 017 5 (R2 = 0. 592 8,P < 0. 01),表明 MDI 与
DI存在极显著的线性相关。 MDI检测值的范围在
0. 007 到 0. 61 之间,相应的 DI的范围在 0 到 0. 72
之间。
综合甘肃 3 个小区的回归结果分析,直线斜率
在 0. 22 到 0. 70之间。 即,用此研究测定的 MDI 预
测病情指数(DI)的单位增长率为 0. 22 到 0. 70 之
间。 直线截距在 0. 017 到 0. 20,呈现了较高的差异。
2. 2　 上庄试验田MDI和 DI回归分析
上庄 1 号小区的回归分析结果如图 4,回归方
程为 y = 0. 119 8x + 0. 094 4 (R2 = 0. 742 3, P <
0． 01),表明 MDI 和病情指数(DI)存在极显著相
关性。 MDI的最大检测值为 12. 28,其相应的病情
指数(DI)的最大检测值为 1. 57。
上庄 2 号小区 MDI 和病情指数(DI)做回归
分析(图 5),回归方程为 y = 0. 315 9x + 0. 091 9
(R2 =0. 578 4, P <0. 01),表明 MDI与 DI 存在极
显著的线性相关。 MDI 检测值的范围在 0. 01 到
4． 64 之间,相应 DI的范围在 0 到 1. 49 之间。
上庄 3 号小区 MDI 和 DI 的回归方程 y =
0． 658 0x +0. 026 1 (R2 = 0. 858 4, P < 0. 01), 表
明 MDI 和病情指数 (DI)存在极显著相关性。
MDI的最大检测值为 2. 88,其相应的病情指数
(DI)的最大检测值为 1. 97(图 6)。
Fig. 3　 Liner regression between molecular-detected disease index (MDI) and
visualized disease index of wheat stripe rust
The data were from the experiment in the Gangu field #3, Gansu Province.
Fig. 4　 Liner regression between molecular-detected disease index (MDI) and
visualized disease index of wheat stripe rust
The data were from the experiment in the Shangzhuang field #1, Beijing.
226
　
　 6 期 　 闫佳会,等:应用 real-time PCR 定量检测田间小麦条锈菌潜伏侵染的研究
Fig. 5　 Liner regression between molecular-detected disease index (MDI) and
visualized disease index of wheat stripe rust
The data were from the experiment in the Shangzhuang field #2, Beijing.
Fig. 6　 Liner regression between molecular-detected disease index (MDI) and
visualized disease index of wheat stripe rust
The data were from the experiment in the Shangzhuang field #3, Beijing.
　 　 综合上庄 3 个小区的回归结果分析,回归方程
的斜率在 0. 12 到 0. 66 之间,即,用此研究测定的
MDI预测的病情指数 DI 的单位增长率为 0. 22 到
0. 70 之间,直线截距在 0. 009 到 0. 02 之间。
3　 讨论
本研究通过对甘谷 3 个试验小区的 MDI 和
DI的回归分析发现,二者之间有极显著的相关性
(R1 2 =0. 813 6,R22 =0. 884 5,R23 =0. 592 8)。 上庄
3 个试验小区的 MDI 和 DI 也存在极显著的相关
性(R21 =0. 742 3,R22 = 0. 578 4,R23 = 0. 858 4)。 甘
谷试验点的相关性要好于上庄试验点的相关性。
同时发现甘谷和上庄 MDI 的最低检测值都不为
零,即都能检测到条锈菌,两地 DI的最低检测值均
为零。 研究表明,分子检测手段能有效地监测到侵
染程度低且尚未显症叶片中微量的病原菌侵染量。
这一结果显示了分子方法定量检测潜伏侵染的病
原菌具有极高的灵敏性。 田间实际发病情况受多
种因素的影响,说明分子方法监测到潜伏侵染状态
下的病原菌,寄主并不一定全部表现症状。
初始菌量在病害流行中起至关重要的作用,在
作物生长季节确定初始菌量对于病害的预测和防
326
　
植物病理学报 41 卷
治至关重要。 传统方法对大田作物病害的初始病
情估计依赖于田间的目测或室内培养,费时、费力,
且对培养条件有严格要求,对于处于潜育状态而又
对病害发展起重要作用的病情则很难快速估
计[12]。 本研究应用 real-time PCR 的方法,能够准
确定量田间的初始菌量,从而有的放矢地制定相关
防治措施。
本研究的关键是采样时间、调查时间的确定以
及高质量 DNA 样品的获得。 采样时间一般依据
当年的气候条件和往年调查最早出现病害的日期
来推断。 病害调查时一定要确保数据为田间取样
后的首批发病数据,即,采样检测结果和数据调查
结果在一个潜育期内完成。 在提取样品 DNA 时,
样本的均一性很重要,应避免由于操作造成的差
错。 对于远距离的样本,传送期间要注意保管好样
品使其保持新鲜。
在植物病理学研究中,应用 real-time PCR 对
侵染植物的病原菌 DNA 进行定量的研究已有很
多,Luo 等[13]研究开发出了监测空气中核果褐腐
菌(Monilinia fructicola)孢子浓度的实时荧光定量
PCR技术,首先建立实时荧光定量 PCR反应 Ct值
与不同数量孢子 DNA 浓度的标准曲线。 研究结
果表明,与用传统显微镜孢子计数方法获得的结果
存在极显著的相关性,从而证实了实时荧光定量
PCR在空气中病原菌定量研究中的可行性。 Just-
esen等[14]利用实时荧光 PCR 方法可定量检测出
大麦种子中条纹病菌 ( Pyrenophora graminea )
DNA的量,在此基础上,建立了病原菌 DNA 量与
侵染率的关系。 Gayoso 等[15]应用实时荧光定量
PCR检测被大丽轮枝菌(Verticillium dahilae)侵染
后的不同茄科植物辣椒、西红柿等,可在未显症的
样品中检测到大丽轮枝菌,以比较感病品种和抗病
品种中病原菌 DNA与寄主 DNA 比值的差异。 结
果表明,感病品种的比值高于抗病品种,且与发病
症状严重度一致。 本研究应用 real-time PCR 的方
法,建立了 MDI 和 DI 的回归模型,且二者达到极
显著相关。 因此,可以利用早期检测的 MDI 值来
估计潜育病情以及后期病情的发展,为条锈病的监
测和预测提供新的手段。
本研究定义的分子病情指数(MDI),不仅包
含了普遍率(发病叶片 /总叶片),还包含了病害的
严重度(病害叶面积 /叶片总面积)的信息。 由于
MDI和 DI存在极显著相关性,此研究也证明了用
MDI 来估计田间未来的病情指数 DI 是可行的。
用 real-time PCR 方法获得的 MDI 在流行学研究
中有广泛的应用前景。 例如,在条锈病的流行区,
由于冬季潜伏侵染的病原菌在春季流行中起重要
作用[16],可以在越冬前后用测定的 MDI 值估计田
间潜育侵染量和开春后的菌量。 在当地菌源和外
来菌源都存在的流行区[16],早春 MDI 值可以用来
估测未来流行的趋势,以有足够的时间制定防治措
施。 MDI的空间分布数据,可以确定田间潜在的
发病中心。 由于在发病中心实施防治是降低流行
中初始菌源的重要环节[17],在发病中心未显症时
施药,不仅有效地减少初菌量,还减少了农药的使
用并降低防治成本。 本研究应用的 real-time PCR
方法还可以用来探索条锈菌远距离传播的路径、前
沿和趋势,为条锈病大区流行规律的研究和区域性
防治提供参考。
致谢: 感谢甘肃省农业科学院植物保护研究所王
晓明和金明安老师在田间采样中给予的指
导与帮助。
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