全 文 ：植物病理学报
ACTA PHYTOPATHOLOGICA SINICA　 42(3): 242-251(2012)
收稿日期: 2011-08-16; 修回日期: 2012-02-17
基金项目: 国家自然科技资源共享平台(2005DKA21207-13); 长江上游林业生态工程省级重点实验室资助项目
通讯作者: 朱天辉,教授,博士生导师,主要从事林木病害教学及科研工作, E-mail: zhutianhui@yahoo. cn
第一作者: 张丽娜(1982 - ),女,山西晋中人,博士研究生,主要从事林木病害及生物防治研究, E-mail: zlnduck@126. com。
绛红褐链霉菌 YSSPG3 的鉴定及其抗菌蛋白纯化
张丽娜1, 朱天辉2*, 李芳莲2
( 1四川农业大学农学院, 雅安 625014;2四川农业大学林学院, 雅安 625014)
摘要:从四川碧峰峡撑 ×绿杂交竹健康植株根际分离到对杂交竹梢枯病菌(Arthrinium phaeospermum)有强拮抗作用的放线
菌菌株 YSSPG3,该菌株的无菌发酵液对多种真菌和细菌具有抗菌活性。 通过对菌株 YSSPG3 的形态特征、培养特性、生理
生化特性、细胞壁组分与 16S rDNA 序列分析,确定为绛红褐链霉菌(Streptomyces purpeofuscus)。 采用硫酸铵沉淀和柱层
析法对发酵液中起主要抑菌作用的抗菌物质进行分离纯化,获得单一的抗菌蛋白 AMP,分子量为 5 075. 619 Da,等电点为
6. 77。 抗菌蛋白在温度≥60℃和 pH <7,以及紫外线照射时间≥12 h的环境下抑菌活性均明显下降,但受蛋白酶 K、胰蛋白
酶和氯仿影响不大,无几丁质酶、葡聚糖酶等水解酶活性。 利用 Edman降解法测定抗菌蛋白 N末端 25 个氨基酸序列,与来
自 Streptomyces tendae Tü901 的 chitin-binding protein AFP1 的同源性较高,为 81. 00% 。
关键词:绛红褐链霉菌; 杂交竹梢枯病菌; 抗菌蛋白; 分离纯化; N端序列
Identification of Streptomyces purpeofuscus YSSPG3 and purification of its antifun-
gal protein 　 ZHANG Li-na1, ZHU Tian-hui2, LI Fang-lian2 　 ( 1Agricultural College, Sichuan Agricultural
University, Ya’an 625014, China; 2Forest College, Sichuan Agricultural University, Ya’an 625014, China)
Abstract: The actinomyces strain YSSPG3 suppressing Arthrinium phaeospermum was isolated from rhizo-
sphere of healthy hybrid bamboo in Sichuan, and its fermentation filtrate showed inhibitory effect to many fun-
gi and bacteria. Based on the study of its morphological, physiological and biochemical characteristics, togeth-
er with sequencing of 16S rDNA genes and phylogenetic analysis, strain YSSPG3 was identified as Streptomy-
ces purpeofuscus. The antifungal protein (AMP) with a molecular mass of 5 075. 619 Da was purified by the
methods of ammonium sulfate precipitating and column chromatography. The isoelectric point (pI) of AMP
was 6. 77 and lacked the activity of hydrolytic enzyme such as chitinase and glucanase. The inhibitory activity
of the antifungal protein decreased distinctly at the higher temperature (≥60℃), in the condition of acidity
(pH <7) and a long ultraviolet radiation time (≥12 h), but was tolerant of proteinase K, trypsin and chloro-
form. The N-terminal sequence between the antifungal protein and a kind of chitin-binding protein AFP1 from
S. tendae Tü901 was of higher homology in 81. 00% 。
Key words: Streptomyces purpeofuscus; Arthrinium phaeospermum; antifungal protein; isolation and purifi-
cation; N-terminal sequence
中图分类号: S432. 23　 　 　 　 　 文献标识码: A　 　 　 　 　 文章编号: 0412-0914(2012)03-0242-10
　 　 撑 ×绿杂交竹是南方重要的经济用竹材,也是
四川等地引种发展的主要经济竹种之一。 近年来,
由丝孢纲真菌暗孢节菱孢菌 [Arthrinium phaeo-
spermum (Corda) M. B. Ellis]引起的杂交竹梢枯
病导致撑 ×绿杂交竹大面积枯死[1,2],造成巨大的
经济损失,极大地威胁着长江中上游地区退耕还林
　
　 3 期 　 　 张丽娜,等:绛红褐链霉菌 YSSPG3 的鉴定及其抗菌蛋白纯化
的进程和生态屏障的建设。 目前主要采用化学防
治和营林措施,而生物防治措施研究较少。 Li
等[3,4]从杂交竹健康植株分离到一株铜绿假单胞
菌(Pseudomonas aeruginosa) ZB27,用其菌悬液和
代谢产物处理对杂交竹梢枯病有较好的防治效果,
但铜绿假单胞菌为条件致病菌,作为生防菌剂在田
间使用受到限制。 因此寻求拮抗活性强、无公害、
对环境友好的生防菌株和开发研究其代谢活性物
质至关重要。 放线菌(Actinomycetes)是天然抗生
物质的主要来源,不仅可产生次生代谢物质,还能
分泌多种抗菌蛋白。 大多数抗菌蛋白不仅具有较
强的抑菌作用,还较容易克隆到相应的编码基因,
为转基因工程菌的构建、转基因抗病植物的培育提
供外源基因。 因此,纯化高活力的抗菌蛋白是植物
生物防治研究中一项重要的基础性工作。 本文以
杂交竹梢枯病菌为指示菌分离筛选得到抑制作用
强且稳定的放线菌菌株 YSSPG3,并对其主要抗菌
物质———抗菌蛋白进行了分离纯化以及理化性质
分析。
1　 材料与方法
1. 1　 材料
1. 1. 1 　 供试菌株 　 杂交竹梢枯病菌(A. phaeo-
spermum)和抗菌谱测定所用菌株(表 1)均由四川
农业大学林学院森林保护实验室提供。
1. 1. 2　 发酵培养基 　 黄豆饼粉 3 g,葡萄糖 5 g,
甘油 5 g,蛋白胨 5 g,NaCl 2. 5 g,CaCO2 2 g,蒸馏
水 1 000 mL。
1. 1. 3　 柱分离材料和分离系统　 柱层析填料 DE-
AE Cellulose DE52 (Whatman 公司分装)、Sepha-
dex G-75 和 Sephadex G-50 ( Pharmacia 公司原
装)、Zorbax SB-C18 (0. 46 cm ×25 cm,5 μm) (美
国 Agilent)。 所用仪器为美国 BIO-RAD公司 Bio-
logic LP低压层析系统。
1. 2　 拮抗菌株的分离与筛选
分离用健康杂交竹样品采自四川碧峰峡撑 ×
绿杂交竹梢枯病发病区,拮抗放线菌分离采用梯度
稀释法于高氏一号培养基上进行,筛选采用对峙培
养法[5]。 通过测量拮抗带宽度和病原菌菌落的趋
向半径,筛选出对杂交竹梢枯病菌抗菌效果最好的
拮抗菌。
1. 3　 抑菌活性测定
采用杯碟法测定待测物质的抑菌活性。 对真
菌抑菌性的测定方法:在 PDA 平板中央接入直径
6 mm 供试真菌菌丝块,用打孔器距中心 3. 0 cm
处无菌挖取 4 个孔洞,每孔加入 100 μL待测物质。
于 25℃培养 3 ~ 5 d,测量抑菌带宽度。 下文中粗
蛋白及抗菌蛋白活性测定均以杂交竹梢枯病菌为
指示菌。 对细菌抑菌性的测定方法:在混好供试细
菌(109 cfu·mL -1)的 NA 平板上,距中央 2. 5 cm
处挖取 3 个孔洞,每孔加入 100 μL的待测物质,置
28℃培养 1 ~ 2 d 后测量抑菌圈直径。 以加灭菌后
的 Tris-HCl做对照,每处理均设 3 个重复。
1. 4　 菌株的发酵和发酵液抗菌谱测定
从新鲜培养的斜面菌种制备孢子悬浮液,调整
孢子浓度为 108 cfu·mL -1。 然后以 1%的接种量
接入发酵培养基中,于 25℃、140 r·min -1振荡培
养 4 d,发酵液于 8 000 rpm离心 15 min,取上清液
用 0. 45 μm孔径的微孔滤膜过滤除菌,即得无菌
发酵液。 抗菌谱测定分别通过测量 PDA平板上抑
菌带宽度和 NA 平板上抑菌圈直径来判断发酵液
对供试真菌和细菌抑菌活性的大小。
1. 5　 拮抗菌株的鉴定
1. 5. 1 　 形态学观察 　 采用插片法[6]在光学显微
镜下观察菌丝形态。 按 Kang 的方法[7] 对菌株
YSSPG3 进行扫描电镜样品处理,在电镜下观察菌
丝和孢子形态。
1. 5. 2　 培养特征和生理生化特征　 参照《链霉菌
鉴定手册》 [8]中推荐的部分培养基和方法进行,
28℃培养 12 ~ 15 d后观察记录特征。
1. 5. 3　 细胞壁化学成分分析　 采用快速薄板层析
法(TCL) [9,10]对菌株 YSSPG3 的细胞进行全细胞
水解液氨基酸和糖型的分析。
1. 5. 4 　 分子鉴定 　 用 EZ-10 Spin Column Ge-
nomic DNA Isolation Kit 提取菌株 YSSPG3 基因
组 DNA,采用细菌通用引物[11]进行 16S rDNA的
PCR扩增。 将 PCR 产物交上海生工生物工程技
术服务有限公司测序,所得序列提交到 NCBI 数
据库进行 BLAST 比对分析,选取相似性较高的
菌株,采用 MEGA 4 软件的邻接法构建系统发
育树。
342
　
植物病理学报 42 卷
1. 6　 活性粗蛋白的制备
采用硫酸铵沉淀法[12],取 10 份 100 mL 的无
菌发酵液,均以发酵原液为初始浓度,在 0℃下加
入硫酸铵分别至饱和度 20% 、30% 、40% 、50% 、
55% 、60% 、70% 、80% 、90%和 100% ,10 000 rpm
离心 15 min,收集每一饱和度所对应的沉淀物与上
清液,沉淀物溶解在 0. 05 mol·L -1 pH8. 5 Tris-
HCl缓冲液中,4℃下用 8 ~ 14 kDa 的透析袋透析
脱盐,聚乙二醇 20 000 包埋浓缩,每份浓缩样品均
调整至 5 mL。 测定各沉淀溶解液和上清液的抑菌
活性,确定最适的硫酸铵盐析浓度。 利用最适硫酸
铵盐析浓度对发酵液进行粗提取,得到的即为粗
蛋白。
1. 7　 抗菌蛋白纯化方法
1. 7. 1 　 DE52 离子交换层析 　 DE52 离子交换柱
(20 cm ×1. 5 cm)用 1 mol·L -1 NaCl 清洗后,以
0． 05 mol·L -1 pH8. 5 Tris-HCl 平衡。 取 2 mL 粗
蛋白上样后,先用 0. 05 mol·L -1 pH8. 5 Tris-HCl
淋洗 60 min,然后以 0. 05 mol·L -1 pH8. 5 Tris-
HCl和1 mol·L -1的 NaCl 进行阶式梯度洗脱[12],
流速为 1 mL·min -1,收集各洗脱蛋白峰,蛋白峰
液经 0. 05 mol·L -1 pH8. 5 的 Tris-HCl透析、聚乙
二醇 20 000 包埋浓缩,各浓缩蛋白峰液均调整至
2 mL,测定其抑菌活性。
1. 7. 2 　 Sephadex G-75 凝胶过滤层析 　 以 0. 05
mol·L -1 pH8. 5 的 Tris-HCl平衡层析柱(50 cm ×
1. 5 cm)。 取 2 mL经离子交换层析后的抗菌蛋白
上样,用 0. 05 mol·L -1 pH8. 5 的 Tris-HCl 洗脱,
流速为 0. 5 mL·min -1。 收集各洗脱蛋白峰。 同
1． 7. 1,蛋白峰液经透析、浓缩后,测定其抑菌活性。
具有抑菌活性的蛋白样品采用 SDS-PAGE 和反向
HPLC判断其纯度。
1. 7. 3　 Sephadex G-50凝胶过滤层析　 方法同1. 7. 2。
1. 7. 4　 抗菌蛋白纯度检测　 不连续的 SDS-PAGE
法进行粗略检测,分离胶浓度为 12% ,浓缩胶浓度
为 5% ,以考马斯亮蓝 R-250 染色。 反向 HPLC 进
一步检测,其中流动相为含 0. 05% TFA 的乙腈,
流速 1 mL·min -1,检测波长为 280 nm。
1. 8　 抗菌蛋白理化性质测定
1. 8. 1　 分子量测定　 抗菌蛋白的分子量采用两种
不同的方法测定:首先用不连续的 SDS-PAGE 法,
标准蛋白为 TaKaRa 公司产品;其次用 MALDI-
TOF质谱法进行精确测定,委托西农生(北京)生
物技术有限公司采用 MALDI TOF-Target (MTP
384,Bruker Daltonics公司)协助测定。
1. 8. 2　 等电点的测定　 采用 IEF等电聚焦测定抗
菌蛋白等电点[13]。
1. 8. 3　 稳定性测定 　 采用考马斯亮蓝染色法[13]
定量抗菌蛋白溶液的浓度至 221. 81 μg·mL -1。
参照 Ji 等[14] 方法,做如下处理:用 40、 60、 80、
100℃水浴、121℃蒸汽处理 20 min,室温处理为对
照;将抗菌蛋白液 pH 调至 3 ~ 11;经紫外线照射
(20 w,距离 40 cm)2、4、6、12、24 h,不照射为对
照;胰蛋白酶和蛋白酶 K 37℃水浴 60 min,不处理
为对照;将抗菌蛋白与等量氯仿混合振荡 60 min,
静置分层后取水相,待残留氯仿挥发完后测定,未
处理蛋白液为对照。 以上各处理后分别测定其抑
菌活性。
1. 8. 4　 抗菌蛋白酶活性检测 　 参考文献[15]的
方法,采用平板透明圈法检测抗菌蛋白的几丁质
酶、葡聚糖酶、纤维素酶和蛋白酶活性。
1. 9　 N末端部分氨基酸序列测定及其对蛋白质
序列库的类似性检索
经纯化得到的抗菌蛋白样品冻干后由西农生
(北京)生物技术有限公司采用蛋白测序仪 PPSQ-
31A (Shimadzu Corporation,日本)协助测定。 采
用 BLASTP程序,以测得的 N-末端氨基酸序列为
靶序列,通过 http: / / www. ncbi. nlm. nih. gov 网
站、http: / / www. uniprot. org /网站和 http: / / blast.
ddbj. nig. ac. jp / top- e. html 网站进行蛋白质序列
类似性检索。
2　 结果和分析
2. 1　 拮抗菌株的筛选及其发酵液抗菌谱
采集的杂交竹样品用稀释平板法共分离得到
放线菌 32 株。 通过初筛、复筛确定最优拮抗放线
菌为菌株 YSSPG3,平均抑菌带宽度达 10. 3 mm,
拮抗带处菌落边缘平截,菌丝萎缩不再生长。 对菌
株 YSSPG3 发酵液的抗菌谱测定(表 1,图 1)发现:
发酵液对子囊菌门的松针散斑壳(Lophodermium
pinastri)、油菜菌核病菌(Sclerotinia sclerotiorum)等
442
　
　 3 期 　 　 张丽娜,等:绛红褐链霉菌 YSSPG3 的鉴定及其抗菌蛋白纯化
Table1　 Inhibition effect of fermentation filtrate of strain YSSPG3 on
16 plant pathogenic fungi and 7 bacteria
Plant pathogenic fungi
Inhibition zone
width / mm
Plant pathogenic
fungi
Inhibition zone
width / mm
Bacteria
Inhibition
diameter / mm
Lophodermium pinastri 16. 5 Rhizoctonia solani 0. 0 Bacillus subtilis 36. 0
Sclerotinia sclerotiorum 4. 5 Setophaeria turcica 13. 0 Bacillus firmus ZP-1 36. 3
Cryphonectria parasitica 13. 5 Bipolaris maydis 0. 0 Bacillus velezensis 36. 0
Taphrina deformans 10. 5 Fusarium solani 0. 0 Escherichia coli 16. 3
Alternaria tenuis 7. 3 Fusarium moniliforme 2. 0 Staphylococcus aureus 39. 5
Aspergillus flavus 13. 5 Fusarium graminearum 0. 0 Pseudomonas aeruginosa 0. 0
Arthrinium phaeospermum 8. 5 Pestalotiopsis guepini 5. 8 Aeromonas hydrophila 20. 0
Rhizoctonia violacea 8. 0 Pestalotiopsis funerea 9. 5
Fig. 1　 Inhibition effect of strain YSSPG3 on fungi and bacteria
A: Sclerotinia sclerotiorum; B: Pestalotiopsis guepini; C: Escherichia coli; D: Bacillus subtilis.
4 个病原菌,半知菌门腔孢纲的山茶灰斑病菌
(Pestalotiopsis guepini)和松赤枯病菌 ( P. fune-
rea),以及丝孢纲的绿色交链孢(Alternaria tenu-
is)、杨树紫纹羽病菌(Rhizoctonia violacea)、玉米
大斑病菌(Setophaeria turcica)等 6 个病原菌都有
明显清晰但程度不一的抑菌带;丝孢纲的立枯丝核
菌(R. solani)和禾谷镰刀菌(Fusarium graminea-
rum)末端菌丝有被抑制生长的现象但无明显的抑
菌带;对玉米小斑病菌(Bipolaris maydis)和引起苗
木立枯病的腐皮镰刀菌(F. solani)无抑菌作用。
此外,除对铜绿假单孢菌(Pseudomonas aerugino-
sa)无作用外,对其余 6 种供试细菌也有较强的抑
制效果。 证明菌株 YSSPG3 的抗菌谱较广,且对不
同种类真菌和细菌具有选择性。
2. 2　 拮抗菌株 YSSPG3 的鉴定
2. 2. 1　 形态特征　 YSSPG3 菌株在葡萄糖酵母膏
培养基[8]上培养 7 d 后菌落呈烟灰色,单菌落圆
形,表面干燥呈粉状。 通过光学显微镜和电子显微
镜(图 2-A, 2-B)观察发现,菌株 YSSPG3 的孢子
丝长而直,边缘上形成丛的趋势,不产生螺旋;孢子
柱形,1. 1 ~ 2. 0 × 0. 7 ~ 1. 0 μm,表面皱,不透明,
常在气生菌丝上形成长孢子链。
2. 2. 2 　 培养特征和生理生化特征 　 表 2 为菌株
YSSPG3 在不同培养基上培养结果,其中在高氏一
号培养基上生长薄,气生菌丝白色,基内菌丝白色,
无可溶性色素产生。 而在葡萄糖酵母膏培养基上
生长茁壮,气生菌丝初为白色,日久成烟灰色,基内
菌丝黄褐色,无可溶性色素。
生理生化测定结果表明:菌株 YSSPG3 能水解
几丁质,明胶液化初慢后快,能产生硫化氢;可以在
纤维素上生长,但不分解滤纸,不水解淀粉,不能使
硝酸盐还原,也不能凝固牛奶。 对碳源的利用结果
表明,菌株 YSSPG3 可以很好的利用甘油、D-葡萄
糖、麦芽糖、D-果糖、L-鼠李糖、山梨糖、D-木糖、蔗
542
　
植物病理学报 42 卷
Fig. 2　 Morphologic characters of strain YSSPG3
A: Aerial mycelia (3 000 × ); B: Spores (30 000 × ) .
Table 2　 Cultural properties of strain YSSPG3
Medium Growth Aerial mycelium Substrate mycelium Soluble pigment
Gause No. 1 agar Poor White White None
Czapek’s agar Poor White White None
Ammonium Czapek’s agar Moderate Whitish gray Whitish gray Pale redish brown
Glucose-asparagine agar Moderate Gray Yellowish brown None
Carrot No. 1 agar Poor White White None
Glucose yeast extract agar Good Gray Yellowish brown None
Potato Moderate White Yellowish brown None
Nutrient agar Good None Yellowish brown Deep redish brown
Starch agar Not grow
Emerson’s agar Good None or white Yellowish brown None
Potato glucose-agar Good Whitish gray Yellowish brown None
Oat agar Good Light pinkish gray Light yellowish brown None
Glycerol asparagines agar Good light yellow Yellowish brown None
Yeast extract-malt agar Good Gray Yellowish brown None
糖,较难利用 L-阿拉伯糖、淀粉和甘露醇,不能利
用乳糖和肌醇。 最适生长温度为 20 ~ 28℃,高于
37℃ 停止生长。 在 pH 5 ~ 12. 5 范围内生长良好。
培养基中 NaCl浓度低于 0. 4% 时气生菌丝发达,
孢子丰富,高于 4% 停止生长。
2. 2. 3　 菌株 YSSPG3 的细胞壁化学成分　 细胞壁
化学成分分析显示,菌株 YSSPG3 含 LL-二氨基庚
二酸(LL-DAP)和甘氨酸;无特征性糖,糖型 C。
因此其细胞壁化学组分属于Ⅰ型,符合链霉菌属
(Streptomyces)的化学分类特性。
2. 2. 4 　 菌株 YSSPG3 的分子生物学 　 菌株
YSSPG3 16S rDNA 经 PCR扩增、测序得到一条长
度为 1 424 bp的核苷酸序列,将所得到 DNA 序列
提交到 NCBI 数据库进行 Blast 比对,登录号为
JN558347。 根据序列同源性从高到低的原则选取
11 株模式菌株用 MEGA 4 等软件进行序列分析,
采用 Neighbor- Joining 法构建系统进化树(图 3),
可以 看 出 菌 株 YSSPG3 与 S. purpeofuscus
(AB184234)和(AJ781364)聚于同一分支中,其相
似性均达到 99. 6% 。
2. 3　 不同饱和度硫酸铵的盐析效果
菌株 YSSPG3 的发酵液经不同饱和度硫酸铵
盐析后抑菌效果差异较大,硫酸铵饱和度 < 55%
时,沉淀物抑菌活性随饱和度升高而明显增大,而
上清液抑菌活性则逐渐降低。 当饱和度≥55%时,
沉淀物抑菌活性无明显变化,100%饱和度的沉淀
642
　
　 3 期 　 　 张丽娜,等:绛红褐链霉菌 YSSPG3 的鉴定及其抗菌蛋白纯化
Fig. 3　 Phylogenetic tree of strain YSSPG3 and its relatives
Numbers in parentheses represent the sequences accession number in NCBI. The number at each branch points is the
percentage supported by bootstrap. The scale bar indicates 0. 001 subtitutions per nucleotide position.
物抑菌活性仅比 55%提高 1. 5% ,而上清液均无抑
菌活性。 因饱和度越高硫酸铵沉淀物中杂蛋白含
量也越高,从而增大了纯化的难度,故选择 55%硫
酸铵饱和度为盐析抗菌蛋白的最适浓度。
2. 4　 抗菌蛋白的纯化
2. 4. 1　 DE52 离子交换层析结果　 55%饱和度的
硫酸铵盐析粗蛋白经 DE52 离子交换层析后,出现
9 个洗脱峰(图 4),其中峰 2、3、5 洗脱蛋白质有抑
菌活性,以峰 5 洗脱蛋白质活性最大。
2. 4. 2　 Sephadex G-75 凝胶过滤层析结果 　 峰 5
洗脱蛋白质经 Sephadex G-75 凝胶过滤层析,出现
4 个洗脱峰(图 5),只有峰 5-4 洗脱蛋白质具有抑
菌活性。 峰 5-4 洗脱蛋白质通过不连续 SDS-
PAGE检测,只有一条带。 进一步通过反向 HPLC
检测其纯度,经洗脱后得到 2 个峰,保留时间分别
为 17. 02 min和 21. 59 min。
2. 4. 3　 Sephadex G-50 凝胶过滤层析结果　 峰 5-4
洗脱蛋白质经 Sephadex G-50 凝胶过滤层析得到 2
个洗脱峰(图 6),其中峰 5-4-1 洗脱蛋白质具有抑
菌活性,且反向 HPLC 检测为单峰,保留时间为
21. 59 min。 蛋白峰 5-4-1 的多次收集液浓缩冻干
后为纯蛋白,命名为 AMP。
2. 5　 抗菌蛋白 AMP的分子量与等电点
用 SDS-PAGE测得抗菌蛋白 AMP 的分子量
小于 6. 5 kDa(图 7);使用 MALDI-TOF-Target,激
Fig. 4　 Elution profile of the crude protein by
DE52 ion exchange chromatography
with stepwise gradient of 1 mol·L -1
NaCl(%)
(0 % in 60 min, 0 ~ 10% in 20 min, 10% in 20 min, 10 ~
17% in 2 min, 17% in 20 min, 17 ~ 28% in 2 min, 28% in
40 min, 28 ~ 47% in 2 min, 47% in 45 min, 47 ~ 65% in 2
min, 65% in 25 min, 65 ~ 100% in 15 min, 100% in 60
min)
光频率 50 Hz、加速电压 20 kV、采用延迟引出和线
性工作方式,质谱图为 100 次扫描信号的累加结
果,测得 AMP的精确分子量为 5 075. 619 Da。 根
据 IEF-PAGE 电泳色带的实际距离和 pH 线性梯
度,计算出 AMP的等电点为 6. 77。
742
　
植物病理学报 42 卷
Fig. 5 　 Elution profile of protein peak 5 by
Sephadex G-75 gel chromatography
Fig. 6 　 Elution profile of protein peak 5-4 by
Sephadex G-50 gel chromatography
A purified protein of peak 5-4-1 showed inhibitory effect on
Arthrinium phaeospermum, being named AMP.
2. 6　 抗菌蛋白 AMP的稳定性
抗菌蛋白 AMP 的抑菌活性随着处理温度的
升高呈下降趋势,处理温度高于 60℃时,抑菌活性
显著下降,80℃和 100℃水浴处理后抑菌活性都仅
为对照的 53. 51% ,尤其经 121℃蒸汽处理 20 min,
其抑菌活性仅为对照的 12. 58% 。 说明抗菌蛋白
对高温比较敏感。
在 pH3 ~ 11 范围内,抗菌蛋白 AMP 均有抑菌
活 性 。当 pH8 . 5时 ,抑菌活性最强 ,抑菌带宽
Fig. 7　 SDS-PAGE spectrum of the antifungal
protein
M: Protein marker; 1: Purified protein; AMP: The antifun-
gal protein.
11. 6 mm;pH < 7 时,抑菌活性明显下降,pH3. 0
时,抑菌活性下降 56. 03% ;pH11. 0 时,抑菌活性
下降 43. 10% 。 表明该抗菌蛋白在弱碱性条件下
较为稳定。
随着紫外线照射时间的延长,抗菌蛋白 AMP
的抑菌活性逐渐降低。 照射时间小于 6 h,抑菌活
性与对照差异不显著,而照射 12 h和 24 h后,与对
照差异显著,抑菌活性分别为对照的 84. 65%和
68. 26% 。
另外,抗菌蛋白经蛋白酶 K、胰蛋白酶和氯仿
处理后,抑菌活性分别为对照的 97. 43% 、89. 92%
和 91. 69% ,表明该抗菌蛋白对蛋白酶 K、胰蛋白
酶和氯仿不敏感。
2. 7　 抗菌蛋白的酶活性
酶活性检测结果表明:抗菌蛋白 AMP 在几丁
质酶、葡聚糖酶、纤维素酶和蛋白酶检测平板上均
未形成透明圈,表明该蛋白不具有 4 种水解酶活
性。
2. 8　 抗菌蛋白的 N末端部分氨基酸序列
为保证测序样品纯度,测序前利用反向 HPLC
对抗菌蛋白 AMP样品进行纯度检测,收集保留时
间为 21. 59 min的洗脱峰,点加到预处理的玻璃纤
维膜上,氮气吹干,然后上机检测。 经自动 Edman
降解法检测,测的 AMP N 端 25 个氨基酸序列:
842
　
　 3 期 　 　 张丽娜,等:绛红褐链霉菌 YSSPG3 的鉴定及其抗菌蛋白纯化
H2N-Leu-Asn-Arg-Thr-Asp-Phe-Asn-Gln-Asn-Asp-
Tyr-Leu-Glu-Ile-His-Asn-Asn-Ser-Gly-Arg-Asp-Thr-
Leu-Asn-Phe
以 N末端 25 个氨基酸的序列片段为靶序列,
采用 BLASTP 程序对蛋白质数据库的类似性检
索,综合数据库 NCBI、Uniprot 和 DDBJ,从中检出
4 个序列与抗菌蛋白 AMP N 端序列相似(表 3),
同源性均为 81. 00% 。
3　 讨论
目前,有关根际拮抗放线菌对植物病原菌的防
治研究已有很多报道[16,17]。 本研究对根际放线菌
YSSPG3 的发酵液进行抗菌谱测定,表明该菌株具
有广谱的抗菌活性。 根据形态特征和细胞壁组分
分析,菌株 YSSPG3 属于链霉菌属,其培养特征、生
理生化特征与已知的绛红褐链霉菌相似, 16S
rDNA序列分析显示与绛红褐链霉菌亲缘关系最
近,综合表现型和基因型分析将该菌株确定为绛红
褐链霉菌。 有关绛红褐链霉菌的研究国外已有报
道,S. purpeofuscus能够产生负霉素、链丝霉素、多
烯类等抗生素,此类研究主要集中在医药领域,目
前尚无 S. purpeofuscus 用于农林业生物防治方面
的报道[18,19]。
链霉菌生防机理复杂,能够产生多种活性物
质,在防治农作物的病、虫、草害方面有积极的作
用[20 ~ 22]。 本文从绛红褐链霉菌 YSSPG3 发酵液中
分离纯化得到分子质量为 5 075. 619 Da,等电点为
6. 77 的抗菌蛋白 AMP,该蛋白不具有几丁质酶、
葡聚糖酶、纤维素酶和蛋白酶活性。 通过 N 末端
序列对蛋白质数据库进行类似性检索,共搜索到 4
种匹配率较高的蛋白,都来自于链霉菌属。 来源于
S. clavuligerus 的 ZP _ 05007966 序列是 ZP _
06776360 序列的 35 位到 125 位,均为性质未知的
预测蛋白[23],蛋白水平相关研究未见报道;来源于
S. tendae 的抗菌蛋白 CAB63113 是由 384 bp 的
afp1 基因编码的 128 个氨基酸序列,其中包括由
86 个氨基酸组成的成熟几丁质结合蛋白( chitin-
binding proteins)AFP1(1G6E)和 N末端的 42 个氨
基酸残基 [24]。
几丁质结合蛋白因倾向与新生几丁质结合从
而干扰真菌的生长。 目前已从植物[25]、甲壳类动
物[26]、革兰氏阴性细菌[27]和链霉菌[24,28 ~ 30]等多种
生物上分离到几丁质结合蛋白。 不同生物来源的
几丁质结合蛋白分子量范围在 3. 1 ~ 20 kDa[31]。
但也有例外,如分离自 P. aeruginosa 的几丁质结
合蛋白 CbpD 的分子量为 43 kDa[27]。 目前,已从
链霉菌中分离纯化获得几丁质结合蛋白 CHB1
(18. 7 kDa, pI 8. 23) [28]、CHB2 (18. 6 kDa, pI
8． 90) [29]和 CHB3(14. 9 kDa, pI 4. 58) [30],分别来
源于 S. olivaceoviridis、S. reticuli和 S. coelicolor。
其中 CHB2 与 CHB1 的氨基酸同源性为 77. 7% ,
CHB3 与 CHB1 的同源性仅为 37% [30]。 CHB1 和
CHB2 均无抑菌活性和水解酶活性[28,29],CHB3 在
抑菌性和酶活性方面的研究未见报道。 分离自 S.
tendae的 AFP1 是一种新颖的几丁质结合蛋白[24],
分子量为 9. 862 kDa,等电点为 5. 3,无几丁质酶活
Table 3　 Identification of AMP by the N-terminal amino acid sequence
The name of homologous
protein (NCBI no. ) of AMP
The source
of protein
Protein
existence
Matched peptide
sequence
Identity Score E-Value
Conserved hypothetical
protein ZP_05007966
Streptomyces clavuligerus
ATCC 27064
Predicted
INRTNCNQNDY
FEIHNNNGRDTLCF
81. 00% 128 3. 0 × 10 -7
Antifungal protein
ZP_06776360
Streptomyces clavuligerus
ATCC 27064
Predicted
INRTNCNQNDY
FEIHNNNGRDTLCF
81. 00% 128 3. 0 × 10 -7
Chain A, Antifungal
Protein 1G6E
Streptomyces
tendae Tü901
Evidence at
protein level
INRTDCNENSY
LEIHNNEGRDTLCF
81. 00% 121 2. 0 × 10 -6
Antifungal protein
CAB63113
Streptomyces
tendae Tü901
Evidence at
protein level
INRTDCNENSYL
EIHNNEGRDTLCF
81. 00% 121 2. 0 × 10 -6
942
　
植物病理学报 42 卷
性,对子囊菌有抑菌活性,通常对极端 pH 有较高
的耐受能力,对蛋白酶 K、胰蛋白酶不敏感,在 70
~ 100℃处理 60 min抗菌活性下降至 50% 。
蛋白质的末端氨基酸序列具有高度专一性。
43% ~ 83%蛋白质可用 N 端 4 个氨基酸残基来确
定,74% ~ 97%蛋白质可用 C 端 4 个氨基酸残基
确定。 若测定出蛋白质 N端或 C端 5 个氨基酸残
基, 鉴定蛋白质的专一性则更高[32]。 抗菌蛋白
AMP的 N末端 25 个氨基酸序列与几丁质结合蛋
白 AFP1 序列 1G6E 和 CAB63113 的同源性较高,
为 81. 00% 。 蛋白稳定性与 AFP1 相近[24],但分子
量和等电点有差异,AMP 是否为一种新的几丁质
结合蛋白尚需对其生物合成相关基因做进一步研
究。
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