全 文 ：植物病理学报
ＡＣＴＡ ＰＨＹＴＯＰＡＴＨＯＬＯＧＩＣＡ ＳＩＮＩＣＡ ４４(４): ４１４￣４２１(２０１４)
收稿日期: ２０１２￣１２￣１２ꎻ 修回日期: ２０１３￣０９￣１７
基金项目: 国家重点基础研究发展计划 (２０１１ＣＢ１００４０３、２０１３ＣＢ１２７７００)、“十一五”科技支撑计划 (２０１２ＢＡＤ１９Ｂ０４) 和公益性行业(农
业)科研专项 (２０１３０３０１６)
通讯作者: 段霞瑜ꎬ研究员ꎬ博士生导师ꎬ主要从事分子植物病理学研究ꎻＥ￣ｍａｉｌ:ｘｙｄｕａｎ＠ ｉｐｐｃａａｓ.ｃｎ
第一作者: 石琳ꎬ女ꎬ甘肃张掖人ꎬ硕士研究生ꎬ主要从事小麦白粉病群体研究ꎻＥ￣ｍａｉｌ:ｓｈｉｌｉｎ＿５４０６８９＠１６３.ｃｏｍꎮ
ｄｏｉ:１０.１３９２６ / ｊ.ｃｎｋｉ.ａｐｐｓ.２０１４.０４.０１０
甘肃南部小麦白粉菌群体的毒性及多基因片段分析
石 琳１ꎬ２ꎬ 段霞瑜２∗ꎬ 高 洁１ꎬ 周益林２ꎬ 曹世勤３ꎬ 张 勃３
( １吉林农业大学ꎬ长春 １３０１１８ꎻ ２中国农业科学院植物保护研究所ꎬ植物病虫害生物学国家重点实验室ꎬ北京 １００１９３ꎻ
３甘肃省农业科学院植物保护研究所ꎬ兰州 ７３００７０)
摘要:为了解甘肃小麦白粉病菌的毒性变化动态及其群体遗传结构ꎬ利用毒性监测及多基因家系法ꎬ对采自甘肃省大陇南地
区陇南、天水两市的 ４９个小麦白粉菌的单孢子堆分离物进行群体遗传结构研究ꎮ 毒性监测结果显示:供试菌株对抗病基因
Ｐｍ１２、Ｐｍ１６、Ｐｍ１８、Ｐｍ２１的毒性频率均低于 １０％ꎬ表明上述抗病基因可以在育种和生产中继续使用ꎻ近些年定名的抗病基因
Ｐｍ２３、Ｐｍ２５、Ｐｍ３０、Ｐｍ３４、Ｐｍ３５的毒性频率为 ３５％~９５％ꎬ并在陇南、天水两市间存在差异ꎬ说明这些基因的利用需要慎重ꎻ对
Ｐｍ４ｂ的毒性频率已大幅度上升ꎻ在相似系数为 ０.７５２时ꎬ除 １１号菌株之外ꎬ其余聚为四类ꎮ 选择 ＡＯＸ、ＥＦＡ、ＰＫＡ、ＰＰＡ、ＴＵＢ
五个基因片段对供试菌株的多基因家系分析表明:基因序列聚为两类ꎬ病菌在陇南、天水两市间及各县市间存在传播ꎮ 甘肃省
大陇南地区病菌毒性多态性较高ꎻ白粉菌在各地区间存在交流的同时ꎬ也存在一定的独立进化ꎮ
关键词:毒性监测ꎬ多基因家系ꎬ群体遗传结构
Ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ ａｎｄ ｍｕｌｔｉｇｅｎｅ ａｎａｌｙｓｅｓ ｏｆ ｔｈｅ ｗｈｅａｔ ｐｏｗｄｅｒｙ ｍｉｌｄｅｗ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ ｉｎ
Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｇａｎｓｕ ＳＨＩ Ｌｉｎ１ꎬ２ꎬ ＤＵＡＮ Ｘｉａ￣ｙｕ２ꎬ ＧＡＯ Ｊｉｅ１ꎬ ＺＨＯＵ Ｙｉ￣ｌｉｎ２ꎬ ＣＡＯ Ｓｈｉ￣ｑｉｎ３ꎬ ＺＨＡＮＧ Ｂｏ３
( １Ｊｉｌｉｎ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙꎬ Ｃｈａｎｇｃｈｕｎ １３０１１８ꎻ２Ｓｔａｔｅ Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｆｏｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｐｌａｎｔ Ｄｉｓｅａｓｅ ａｎｄ Ｉｎｓｅｃｔ Ｐｅｓｔｓꎬ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ
Ｐｌａｎｔ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎꎬ ＣＡＡＳꎬ Ｂｅｉｊｉｎｇ １００１９３ꎻ３Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｐｌａｎｔ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎꎬ Ｇａｎｓｕ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓꎬ Ｌａｎｚｈｏｕ ７３００７０)
Ａｂｓｔｒａｃｔ: Ｔｏ ｕｎｄｅｒｓｔａｎｄ ｔｈｅ ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ ｄｙｎａｍｉｃｓ ａｎｄ ｔｈｅ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｇｅｎｅｔｉｃ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｔｈｅ ｗｈｅａｔ ｐｏｗｄｅｒｙ
ｍｉｌｄｅｗ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ (Ｂｌｕｍｅｒｉａ ｇｒａｍｉｎｉｓ ｆ.ｓｐ. ｔｒｉｔｉｃｉ) ｉｎ Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｇａｎｓｕꎬ ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ ａｎｄ ｍｕｌｔｉｇｅｎｅ ｇｅｎｅａｌｏｇｙ ｏｆ ４９
ｐｏｗｄｅｒｙ ｍｉｌｄｅｗ ｉｓｏｌａｔｅｓ ｃｏｌｌｅｃｔｅｄ ｆｒｏｍ Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｇａｎｓｕ ｗｅｒｅ ａｎａｌｙｚｅｄ. Ｉｔ ｗａｓ ｓｈｏｗｎ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ
ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ ｏｆ ｗｈｅａｔ ｐｏｗｄｅｒｙ ｍｉｌｄｅｗ ｔｏ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｇｅｎｅｓ Ｐｍ１２ꎬ Ｐｍ１６ꎬ Ｐｍ１８ ａｎｄ Ｐｍ２１ ｗａｓ ｌｅｓｓ ｔｈａｎ １０％ꎬ
ｉｎｄｉｃａｔｉｎｇ ｔｈａｔ ｔｈｅｓｅ ｇｅｎｅｓ ｃｏｕｌｄ ｂｅ ｕｓｅｄ ｆｏｒ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｂｒｅｅｄｉｎｇ. Ｔｈｅ ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ ｆｒｅｑｕｅｎｃｉｅｓ ｏｆ Ｐｍ２３ꎬ Ｐｍ２５ꎬ
Ｐｍ３０ꎬ Ｐｍ３４ ａｎｄ Ｐｍ３５ ｗｅｒｅ ｈｉｇｈ (３５％－９５％)ꎬ ｗｉｔｈ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ ｉｎ Ｌｏｎｇｎａｎ ａｎｄ Ｔｉａｎｓｈｕｉꎬ ｗｈｉｃｈ ｉｎｄｉｃａｔｅｄ ｔｈａｔ
ｗｅ ｓｈｏｕｌｄ ｂｅ ｖｅｒｙ ｃａｕｔｉｏｕｓ ｉｎ ｕｓｉｎｇ ｔｈｅｓｅ ｇｅｎｅｓ. Ｔｈｅ ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ ｏｆ Ｐｍ４ｂ ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｓｈａｒｐｌｙ. Ｔｈｅ
ｐｏｗｄｅｒｙ ｍｉｌｄｅｗ ｉｓｏｌａｔｅｓ ｗｅｒｅ ｄｉｖｉｄｅｄ ｉｎｔｏ ｆｏｕｒ ｇｒｏｕｐｓ ｅｘｃｅｐｔ ｉｓｏｌａｔｅ １１ꎬ ｗｉｔｈ ａ ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ ｉｎｄｅｘ ｏｆ ０.７５２. Ｇｅｎｅ
ｆｒａｇｍｅｎｔ ｆｒｏｍ ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ ｏｘｉｄａｓｅ (ＡＯＸ)ꎬ ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ－１α (ＥＦＡ)ꎬ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ Ａ (ＰＫＡ)ꎬ ｐｒｏｔｅｉｎ
ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ ｔｙｐｅ ２Ａ (ＰＰＡ) ａｎｄ β￣ｔｕｂｌｉｎ (ＴＵＢ) ｗｅｒｅ ｕｓｅｄ ｆｏｒ ｍｕｌｔｉｇｅｎｅ ｇｅｎｅａｌｏｇｉｃａｌ ａｎａｌｙｓｉｓ. Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔ
ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｉｓｏｌａｔｅｓ ｃｏｕｌｄ ｂｅ ｇｒｏｕｐｅｄ ｉｎｔｏ ｔｗｏ ｋｎｏｔｓ. Ｔｈｅ ｐａｔｈｏｇｅｎ ｄｉｓｐｅｒｓａｌ ｅｘｉｓｔｅｄ ｂｅｔｗｅｅｎ ｔｈｅ ｔｗｏ ｃｉｔｉｅｓ.
Ｔｈｅｒｅ ｗａｓ ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ａｌｔｈｏｕｇｈ ｉｎｔｅｒｃｈａｎｇｅｓ ｅｘｉｓｔｅｄ ｂｅｔｗｅｅｎ ｉｎ ｔｈｅ ｔｗｏ ｃｉｔｉｅｓ.
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ: ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ ａｎａｌｙｓｉｓꎻ ｍｕｌｔｉｇｅｎｅ ｇｅｎｅａｌｏｇｙꎻ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ ｇｅｎｅｔｉｃ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ
中图分类号: Ｓ４３５.１２１ 文献标识码: Ａ 文章编号: ０４１２￣０９１４(２０１４)０４￣０４１４￣０８
小麦白粉病是小麦上的一种重要病害ꎬ在我国
主产麦区均有发生ꎮ 其致病菌小麦白粉菌(Ｂｌｕｍｅ￣
ｒｉａ ｇｉａｍｉｎｉｓ ｆ.ｓｐ. ｔｒｉｔｉｃｉ)存在有性和无性世代ꎬ其无
性世代可在寄主上进行多代繁殖ꎬ产生大量的分生
孢子ꎮ 当存在大量感病寄主及环境条件适宜时ꎬ通
过气流传播的分生孢子可侵染小麦ꎬ病害发生严重
４期 石琳ꎬ等:甘肃南部小麦白粉菌群体的毒性及多基因片段分析
时可造成大流行并导致严重的经济损失[１]ꎮ 小麦白
粉病的防治主要通过应用品种抗病性和使用化学农
药ꎬ而化学农药长期使用除耗费大量人力物力及引
起病菌抗药性外ꎬ还能造成环境污染[２]ꎮ 小麦白粉
病是典型的符合 Ｆｌｏｒ“基因对基因”假说的病害体
系[３]ꎬ小麦白粉菌还存在有性重组ꎬ具有高度的变异
性ꎬ抗病品种利用的有效性就与病原菌群体的变异
形成了密切的关系ꎬ即品种抗性易受病菌群体中优
势毒性更替的影响ꎬ被新的毒性克服而“丧失”抗
性[４]ꎮ 因此ꎬ加强小麦白粉菌群体遗传结构的研究ꎬ
可为抗病育种及品种布局提供有力依据ꎮ
研究白粉菌群体结构的方法很多ꎬ传统的毒性
监测采用一套已知抗病基因的品种ꎬ根据“基因对基
因”学说ꎬ能够直观地看出各病菌对不同抗病基因的
毒性频率ꎬ以此来评价各抗病基因的有效性及其在
育种中的价值ꎬ为抗病育种提供指导ꎮ 但由于小麦
白粉菌为专性寄生菌ꎬ需要在活体上繁殖、鉴定ꎬ非
常耗时费力ꎮ 因此ꎬ随着分子生物学技术的发展ꎬ包
括 ＲＡＰＤ、ＳＳＲ、ＩＳＳＲ、ＡＦＬＰ在内的多种分子标记技
术在白粉病菌的群体研究中得到了应用[５ ~ ９]ꎮ 本研
究利用毒性分析方法对采自甘肃南部的 ４９ 个供试
小麦白粉菌菌株的毒性多态性进行了研究ꎬ揭示了
其毒性现状ꎬ并利用多基因家系分析ꎬ选择 ａｌｔｅｒｎａ￣
ｔｉｖｅ ｏｘｉｄａｓｅ (ＡＯＸ)、ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ － １α (ＥＦＡ)、
ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ Ａ ( ＰＫＡ)、 ｐｒｏｔｅｉｎ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ ｔｙｐｅ
２Ａ(ＰＰＡ)、β－ｔｕｂｕｌｉｎ(ＴＵＢ)共 ５ 个基因片段ꎬ对
甘肃南部小麦白粉菌群体的遗传结构进行研究ꎬ
对小麦白粉菌在甘肃省部分地区之间的传播进
行了分析ꎮ
１ 材料与方法
１.１ 试验材料
试验采用的 ４９个小麦白粉菌菌株采自甘肃南
部的天水、陇南两市的９个县(市)(表１)ꎬ由中国农
Ｔａｂｌｅ １ Ｔｈｅ ｔｅｓｔｅｄ ｗｈｅａｔ ｐｏｗｄｅｒｙ ｍｉｌｄｅｗ ｉｓｏｌａｔｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ｓｔｕｄｙ
Ｃｏｄｅ Ｉｓｏｌａｔｅ Ｓｏｕｒｃｅ Ｃｏｄｅ Ｉｓｏｌａｔｅ Ｓｏｕｒｃｅ
１ ０９－１６－１－① Ｑｉｎｚｈｏｕꎬ Ｔｉａｎｓｈｕｉ ２６ Ｚｉ ０９－１６－５－１－② Ｃｈｅｎｇｘｉａｎꎬ Ｌｏｎｇｎａｎ
２ ０９－１６－２－１－① Ｌｉｘｉａｎｇꎬ Ｌｏｎｇｎａｎ ２７ Ｚｉ ０９－１６－５－２－① Ｃｈｅｎｇｘｉａｎꎬ Ｌｏｎｇｎａｎ
３ ０９－１６－３－１－① Ｘｉｈｅꎬ Ｌｏｎｇｎａｎ ２８ Ｚｉ ０９－１６－５－２－③ Ｃｈｅｎｇｘｉａｎꎬ Ｌｏｎｇｎａｎ
４ ０９－１６－４－１－① Ｃｈｅｎｇｘｉａｎꎬ Ｌｏｎｇｎａｎ ２９ Ｚｉ ０９－１６－５－２－④ Ｃｈｅｎｇｘｉａｎꎬ Ｌｏｎｇｎａｎ
５ ０９－１６－４－２－① Ｃｈｅｎｇｘｉａｎꎬ Ｌｏｎｇｎａｎ ３０ Ｚｉ ０９－１６－５－３－① Ｃｈｅｎｇｘｉａｎꎬ Ｌｏｎｇｎａｎ
６ ０９－１６－５－１－① Ｃｈｅｎｇｘｉａｎꎬ Ｌｏｎｇｎａｎ ３１ Ｚｉ ０９－１６－５－３－② Ｃｈｅｎｇｘｉａｎꎬ Ｌｏｎｇｎａｎ
７ ０９－１６－５－２－① Ｃｈｅｎｇｘｉａｎꎬ Ｌｏｎｇｎａｎ ３２ Ｚｉ ０９－１６－６－１－① Ｇａｎｇｕꎬ Ｔｉａｎｓｈｕｉ
８ ０９－１６－５－３－① Ｃｈｅｎｇｘｉａｎꎬ Ｌｏｎｇｎａｎ ３３ Ｚｉ ０９－１６－６－１－② Ｇａｎｇｕꎬ Ｔｉａｎｓｈｕｉ
９ ０９－１６－６－１－① Ｗｕｄｕꎬ Ｌｏｎｇｎａｎ ３４ Ｚｉ ０９－１６－６－２－① Ｇａｎｇｕꎬ Ｔｉａｎｓｈｕｉ
１０ ０９－１６－７－① Ｑｉｎｚｈｏｕꎬ Ｔｉａｎｓｈｕｉ ３５ Ｚｉ ０９－１６－６－２－② Ｇａｎｇｕꎬ Ｔｉａｎｓｈｕｉ
１１ ０９－１６－８－１－① Ｇａｎｇｕꎬ Ｔｉａｎｓｈｕｉ ３６ Ｚｉ ０９－１６－６－３－① Ｇａｎｇｕꎬ Ｔｉａｎｓｈｕｉ
１２ ０９－１６－８－２－① Ｇａｎｇｕꎬ Ｔｉａｎｓｈｕｉ ３７ Ｚｉ ０９－１６－６－３－② Ｇａｎｇｕꎬ Ｔｉａｎｓｈｕｉ
１３ ０９－１６－９－１－① Ｇａｎｇｕꎬ Ｔｉａｎｓｈｕｉ ３８ Ｚｉ ０９－１６－８－１－① Ｈｕｉｘｉａｎꎬ Ｌｏｎｇｎａｎ
１４ ０９－１６－９－２－① Ｇａｎｇｕꎬ Ｔｉａｎｓｈｕｉ ３９ Ｚｉ ０９－１６－８－１－② Ｈｕｉｘｉａｎꎬ Ｌｏｎｇｎａｎ
１５ ０９－１６－１０－１－① Ｗｕｓｈａｎꎬ Ｔｉａｎｓｈｕｉ ４０ Ｚｉ ０９－１６－８－２－① Ｈｕｉｘｉａｎꎬ Ｌｏｎｇｎａｎ
１６ ０９－１６－１０－２－① Ｗｕｓｈａｎꎬ Ｔｉａｎｓｈｕｉ ４１ Ｚｉ ０９－１６－８－２－② Ｈｕｉｘｉａｎꎬ Ｌｏｎｇｎａｎ
１７ ０９－１６－１１－① Ｗｕｓｈａｎꎬ Ｔｉａｎｓｈｕｉ ４２ Ｚｉ ０９－１６－８－３－① Ｈｕｉｘｉａｎꎬ Ｌｏｎｇｎａｎ
１８ Ｚｉ ０９－１６－２－① Ｑｉｎｚｈｏｕꎬ Ｔｉａｎｓｈｕｉ ４３ Ｚｉ ０９－１６－８－３－② Ｈｕｉｘｉａｎꎬ Ｌｏｎｇｎａｎ
１９ Ｚｉ ０９－１６－２－② Ｑｉｎｚｈｏｕꎬ Ｔｉａｎｓｈｕｉ ４４ Ｚｉ ０９－１６－８－４－① Ｈｕｉｘｉａｎꎬ Ｌｏｎｇｎａｎ
２０ Ｚｉ ０９－１６－３－１－① Ｑｉｎｇｓｈｕｉꎬ Ｔｉａｎｓｈｕｉ ４５ Ｚｉ ０９－１６－８－４－② Ｈｕｉｘｉａｎꎬ Ｌｏｎｇｎａｎ
２１ Ｚｉ ０９－１６－３－１－② Ｑｉｎｇｓｈｕｉꎬ Ｔｉａｎｓｈｕｉ ４６ Ｚｉ ０９－１６－９－１－① Ｗｕｄｕꎬ Ｌｏｎｇｎａｎ
２２ Ｚｉ ０９－１６－３－２－① Ｑｉｎｇｓｈｕｉꎬ Ｔｉａｎｓｈｕｉ ４７ Ｚｉ ０９－１６－９－１－② Ｗｕｄｕꎬ Ｌｏｎｇｎａｎ
２３ Ｚｉ ０９－１６－３－２－③ Ｑｉｎｇｓｈｕｉꎬ Ｔｉａｎｓｈｕｉ ４８ Ｚｉ ０９－１６－９－２－① Ｗｕｄｕꎬ Ｌｏｎｇｎａｎ
２４ Ｚｉ ０９－１６－４－① Ｇａｎｇｕꎬ Ｔｉａｎｓｈｕｉ ４９ Ｚｉ ０９－１６－９－２－③ Ｗｕｄｕꎬ Ｌｏｎｇｎａｎ
２５ Ｚｉ ０９－１６－４－② Ｇａｎｇｕꎬ Ｔｉａｎｓｈｕｉ
‘Ｚｉ’ ｉｎｄｉｃａｔｅｓ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｉｓｏｌａｔｅ ｉｓ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｐｕｒｉｆｉｅｄ ｃｏｌｏｎｙ ｏｂｔａｉｎｅｄ ｆｒｏｍ ｄｉｓｃｈａｒｇｅｄ ａｓｃｏｓｐｏｒｅｓ ｗｈｉｌｅ ｔｈｅ ｏｔｈｅｒｓ ａｒｅ ｆｒｏｍ ｐｕｒｉｆｉｅｄ
ａｓｅｘｕａｌ ｉｓｏｌａｔｅｓ.
５１４
植物病理学报 ４４卷
科院植保所白粉病组分离、纯化和保存ꎮ 保存及繁
殖菌种所使用的感病小麦品种 Ｃｈａｎｃｅｌｌｏｒ 及毒性
鉴定所用的 ３８个已知抗病基因品种及 ２个感病对
照也由中国农科院植保所白粉病组繁殖保存(表 ２)ꎮ
１.２ 小麦白粉菌的繁殖
采集的小麦白粉菌标样ꎬ按照 Ｘｉａｎｇ等[ ４]、Ｌｉ[６]的
方法进行子囊孢子的释放及无性分生孢子的分离、纯
化、繁殖ꎬ参照Ｘｕ[７]的方法收集小麦白粉菌分生孢子ꎮ
１.３ 毒性鉴定
在 １８~２４℃的温室中进行小麦白粉菌毒性鉴
定试验ꎬ具体方法参照 Ｓｉ等[ １０ ]ꎮ 将用做鉴别寄主
的 ３８个已知抗白粉病基因的品种和 ２个感病品种
播种在 ３６ ｃｍ×２５ ｃｍ×１０ ｃｍ 的塑料方盒内ꎬ每个
品种播 ５ ~ ７ 粒种子ꎬ套上透明塑料袋(以铁架支
撑)ꎬ扎紧袋口ꎬ防止污染ꎮ 待第一片叶完全展开
后接种新鲜的小麦白粉菌分生孢子ꎬ待供试幼苗的
感病对照品种充分发病时ꎬ记载第一片叶的反应
型ꎮ 反应型的记载采用 Ｓｈｅｎｇ[ １１ ]的标准ꎮ
根据鉴定结果ꎬ分析病菌对各抗病基因的毒性
频率ꎻ将有毒性的菌株记为 “１”ꎬ无毒性的记为
“０”ꎬ利用 ＮＴｓｙｓ－２.１０ｅ 统计分析软件对小麦白粉
菌毒性矩阵进行 ＵＰＧＭＡ聚类分析ꎮ
１.４ 多基因家系分析
１.４.１ 小麦白粉菌基因组 ＤＮＡ 的提取 本试验
采用 ＯＭＥＧＡ Ｆｕｎｇａｌ ＤＮＡ试剂盒提取小麦白粉菌
ＤＮＡꎮ 按照说明书所示的使用方法进行ꎮ
１.４.２ 引物选择 本次实验所用 ５ 个基因的引
物ꎬ其中三对来自于 Ｐａｒｋｓ 等[ １ ２ ]ꎬ另两对是根据
ＮＣＢＩ数据库( ｈｔｔｐ: / / ｗｗｗ. ｎｃｂｉ. ｎｌｍ. ｎｉｈ. ｇｏｖ / )中
发表的基因序列ꎬ利用引物设计软件 Ｐｒｉｍｅｒ Ｐｒｅｍｉ￣
ｅｒ ５.０设计的引物ꎮ 具体序列如表 ３所示ꎮ
Ｔａｂｌｅ ２ Ｔｈｅ ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ(％)ｏｆ ｗｈｅａｔ ｐｏｗｄｅｒｙ ｍｉｌｄｅｗ ｔｏ ｋｎｏｗｎ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｇｅｎｅｓ
Ｃｏｄｅ Ｖａｒｉｅｔｙ
Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ
ｇｅｎｅ (Ｐｍ)
Ｌｏｎｇｎａｎ Ｔｉａｎｓｈｕｉ Ｃｏｄｅ Ｖａｒｉｅｔｙ
Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ
ｇｅｎｅ (Ｐｍ)
Ｌｏｎｇｎａｎ Ｔｉａｎｓｈｕｉ
１ Ｆｕｎｏ － １００ １００ ２１ Ｔｉｍｇａｌｅｎ ６ ８８ ９６
２ Ｕｌｋａ / ８Ｃｃ∗ ２ ２３ ６５ ２２ Ｃｏｋｅｒ ７４７ ６ １００ ９６
３ Ｅｒａ － ３５ ６５ ２３ ＣＩ１４１８９ ７ １００ １００
４ Ｋａｖｋａｚ ８ １００ １００ ２４ Ｗｅｍｂｌｅｙ １２ ０ ０
５ Ｍａｒｉｓ Ｈｕｎｔｓｍａｎ ２＋６ ２３ ５７ ２５ Ｒ４Ａ １３ ２７ ２６
６ Ｂａｉｍｉａｎ ３ ４＋８ ５４ ５７ ２６ Ｂｒｉｇａｎｄ １６ ０ ４
７ Ｘｉａｏｂａｉｄｏｎｇ ｍｌｘｂｄ ２７ １７ ２７ Ａｍｉｇｏ １７ ７３ ６１
８ Ｃｈａｎｃｅｌｌｏｒ － １００ １００ ２８ ＸＸ１８６ １９ ９２ ９６
９ Ａｘｍｉｎｓｔｅｒ / ８Ｃｃ １ ８８ ７８ ２９ Ｙａｎｇ Ｍａｉ ５ / Ｓｕｂ.６Ｖ∗∗ ２１ ０ ０
１０ Ａｓｏｓａｎ / ８Ｃｃ ３ａ ６５ ７８ ３０ Ｃｈｉｙａｃｈａｏ ２４ ６２ ８７
１１ Ｃｈｕｌ / ８Ｃｃ ３ｂ ８１ ７４ ３１ Ｍａｒｉｓ Ｄｏｖｅ ２＋Ｍｌｄ １２ ４３
１２ Ｓｏｎｏｒａ / ８Ｃｃ ３ｃ １００ １００ ３２ Ｍｉｓｓｉｏｎ ４ｂ＋Ｍｌｉ ５０ ７４
１３ Ｋｏｌｉｂｒｉ ３ｄ ６２ ７４ ３３ Ｎｏｒｍａｎｄｉｅ １＋２＋９ １００ １００
１４ Ｍｉｃｈ.Ａｍｂｅｒ / ８Ｃｃ ３ｆ ９６ ９６ ３４ ５Ｐ２７ ３０ ３５ ５７
１５ Ｗ１５０ ３ｅ １００ １００ ３５ ＭＩＮ １８ ０ ０
１６ Ｋｈａｐｌｉ / ８Ｃｃ ４ａ ５０ ５７ ３６ ８１－７２４１ ２３ ４２ ５７
１７ Ａｒｍａｄａ ４ｂ ５０ ７８ ３７ ＮＣＡ５ ２５ ９６ ８７
１８ Ｈｏｐｅ / ８Ｃｃ ５ １００ １００ ３８ ＮＣＤ７ ３４ ６２ ５２
１９ Ａｑｕｉｌａ ５(Ｍｌｉ) ２３ ５２ ３９ ＮＣＤ３ ３５ ５４ ６５
２０ Ｃｏｋｅｒ ９８３ ５＋６ ８５ ８３ ４０ ＴＡＭ１０４ / ＴＨＡＴＣＨＥＲ ２０ ３８ ２６
∗８Ｃｃ ｉｎｄｉｃａｔｅｓ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｃｕｌｔｉｖａｒ ｗａｓ ｂａｃｋｃｒｏｓｓｅｄ ｆｏｒ ８ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎｓ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｌｅ ｐａｒｅｎｔ Ｃｈａｎｃｅｌｌｏｒꎻ ∗∗ Ｓｕｂ.６ｖ ｉｎｄｉｃａｔｅｓ
ｔｈａｔ ｔｈｅ ｃｕｌｔｉｖａｒ ｉｓ ａ ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ ｌｉｎｅ ｂｅｔｗｅｅｎ ｗｈｅａｔ ａｎｄ Ｈａｙｎａｌｄｉａ ｖｉｌｌｏｓａ.
６１４
４期 石琳ꎬ等:甘肃南部小麦白粉菌群体的毒性及多基因片段分析
Ｔａｂｌｅ ３ Ｐｒｉｍｅｒｓ ｕｓｅｄ ｆｏｒ ｍｕｌｔｉｇｅｎｅ ｇｅｎｅａｌｏｇｙ ａｎａｌｙｓｉｓ
Ｐｒｉｍｅｒ Ｇｅｎｅ ｐｒｏｄｕｃｔ Ｐｒｉｍｅｒ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ５′￣３′ Ｐｒｏｄｕｃｔ ｓｉｚｅ / ｂｐ
ＰＰＡ Ｐｒｏｔｅｉｎ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ ｔｙｐｅ ２Ａ
ＰＰＡＦ:ＴＡＧＡＴＧＧＧＴＧＧＡＴＴＧＡＧＡＡＣ
ＰＰＡＲ:ＡＴＣＧＴＣＡＧＧＡＴＣＡＧＡＣＣＡＴＡ
７５９
ＰＫＡ Ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ Ａ
ＰＫＡＦ:ＴＴＴＣＧＧＴＡＧＧＧＴＴＣＡＴＣＴＧＧ
ＰＫＡＲ:ＴＡＣＣＧＴＴＣＣＧＴＣＴＣＴＴＣＡＧＧ
９５８
ＴＵＢ β￣ｔｕｂｕｌｉｎ
ＴＵＢＦ:ＣＡＧＧＧＣＡＡＡＣＡＡＴＴＴＣＴＧＧＴ
ＴＵＢＲ:ＧＣＴＧＡＡＣＡＴＴＴＣＧＣＡＴＣＴＧＡ
１ ０９９
ＡＯＸ Ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ ｏｘｉｄａｓｅ
ＡＯＸＦ:ＣＧＣＡＴＡＧＣＣＣＴＴＴＡＣＴＴＡＧ
ＡＯＸＲ:ＡＴＧＧＡＴＴＴＧＧＧＴＣＣＴＣＧＴＴ
６６７
ＥＦＡ Ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ￣１α
ＥＦＡＦ:ＡＣＡＡＣＡＧＧＴＡＡＴＡＧＧＧＡＣＧ
ＥＦＡＲ:ＣＴＡＡＴＧＴＧＡＡＣＧＣＡＡＧＣＡＡ
５４２
１.４.３ 反应体系及程序 ＰＣＲ 反应体系为:总体
积 ３０ μＬꎬ其中 １０×ＰＣＲ Ｂｕｆｆｅｒ(Ｍｇ２＋ Ｆｒｅｅ)３ μＬꎬ
２５ ｍＭ 的 ＭｇＣｌ２ ３.６ μＬꎬ２.５ μＭ 的 ｄＮＴＰ ３.７５
μＬꎬ２.５ μＭ 的 Ｔａｑ酶 ０.９ μＬꎬ１０ μＭ的引物各 ０.６
μＬꎬ１０ ｎｇ.μｌ－１的 ＤＮＡ 模板 ３ μＬꎬ再补 ｄｄＨ２Ｏ 至
３０ μＬꎮ
ＰＣＲ 反应条件为:９５℃预变性 ５ ｍｉｎꎻ９５℃变
性 ２５ ｓꎬ６１℃退火 ２５ ｓꎬ７２℃延伸 ４５ ｓꎬ共 ３４ 个循
环ꎻ７２℃延伸 ５ ｍｉｎꎮ
ＰＣＲ 反应结束之后ꎬ取 ３ μＬ 扩增产物通过
１.５％的琼脂糖凝胶检测ꎮ ＰＣＲ产物送交六合华大
基因公司进行测序ꎮ
１.４.４ 序列分析 首先用 Ｃｈｒｏｍａｓ(２００１)软件查
看测序峰图ꎬ确定序列的可靠性ꎻ然后用 ＤＮＡＳｔａｒ
软件中的 Ｓｅｑｍａｎ 程序进行序列拼接ꎻ再用 Ｃｌｕｓｔ￣
ａｌＷ进行多序列比对ꎻ最后用 ＭＥＧＡ ４ 分析软件
建立 Ｎｅｉｇｈｂｏｒ－ｊｏｉｎｉｎｇ聚类树ꎬ其中 Ｂｏｏｔｓｔｒａｐ 值设
置为１ ０００次重复ꎬ以检验各分支的置信度ꎮ
２ 结果与分析
２.１ 毒性监测
毒性鉴定结果(表 ２)表明:供试菌株对抗病基
因 Ｐｍ１２、Ｐｍ１６、Ｐｍ１８、Ｐｍ２１ 的毒性频率均低于
１０％ꎬ说明这些基因仍具有良好的抗性ꎬ可以在抗
病育种中加以利用ꎻ除了阿夫和 Ｃｈａｎｃｅｌｌｏｒ 两个感
病对照外ꎬ供试菌株对抗病基因 Ｐｍ８、 Ｐｍ３ｃ、
Ｐｍ３ｅ、Ｐｍ５、Ｐｍ７ 及基因组合 Ｐｍ２＋Ｔａ、Ｐｍ１＋２＋９
的毒性频率均为 １００％ꎬ对抗病基因 Ｐｍ１、Ｐｍ３ｆ、
Ｐｍ６、Ｐｍ１９、Ｐｍ２５及基因组合 Ｐｍ５＋６ 的毒性频率
也达到了 ８０％以上ꎬ说明这些基因已失去应用价
值ꎻ而白粉菌对抗病基因 ｍｌｘｂｄ、Ｐｍ１３、Ｐｍ２０ 和基
因组合 Ｐｍ２＋ｍｌｄ 的毒性频率不到 ４０％ꎬ说明这些
基因还具有一定的抗性ꎬ可以在抗病育种中与其他
基因进行累加利用ꎮ 小麦白粉菌对 Ｐｍ４ｂ 基因的
毒性在陇南已攀升至 ５０％以上ꎮ
用 ＮＴｓｙｓ－２.１０ｅ 统计分析软件对小麦白粉菌毒
性矩阵进行 ＵＰＧＭＡ聚类分析ꎬ结果如图 １所示ꎮ 在
相似系数为 ０.７５２时ꎬ除 １１号菌株之外ꎬ其余菌株聚
为四类ꎮ 第一类及第四类(从上往下)中以天水菌株
居多ꎬ第三类中陇南菌株占多数ꎬ第二类中两地菌株
各占一半ꎬ说明天水菌株的毒性多态性较陇南菌株更
为复杂ꎻ４９个供试菌株的毒性相似系数在 ０.６４~０.９５
之间ꎬ说明这些菌株间存在差异ꎮ
２.２ 多基因片段的序列比对
将供试菌株 ５ 个基因的序列连接起来进行多
序列比对后ꎬ再用 ＭＥＧＡ 软件中的邻接法对所得
序列构建 Ｎｅｉｇｈｂｏｕｒ Ｊｉｏｎｉｎｇ(Ｎ－Ｊ)树(图 ２)ꎬ结果
显示:４９ 个菌株的序列先聚为两类ꎬ次级分成四
类ꎻ第一类和第二类支持率均为 ８１ꎬ第三类和第四
类支持率均为 ９９ꎻ第一类和第三类中陇南菌株较
多ꎬ第二类中天水菌株较多ꎬ而第四类中两市的菌
株各占一半ꎮ 此外ꎬ同地区的菌株常连续出现ꎬ说
明各市菌株存在一定的独立进化ꎻ第一类和第三类
７１４
植物病理学报 ４４卷
Ｆｉｇ. １ ＵＰＧＭＡ ｄｅｎｄｒｏｇｒａｍ ｏｆ Ｂｌｕｍｅｒｉａ ｇｉａｍｉｎｉｓ ｆ.ｓｐ. ｔｒｉｔｉｃｉ ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ ｉｎ
Ｇａｎｓｕ ａｎａｌｙｚｅｄ ｂｙ ＮＴｓｙｓ－２.１０ｅ
中的天水菌株主要来自秦川、甘谷和清水 ３ 个县
(区)ꎬ说明这 ３ 个区县的小麦白粉菌与陇南市的
菌株间存在交流ꎻ第二类及第四类中的陇南菌株主
要来自礼县、成县和徽县ꎬ说明白粉菌在这三地及
天水市菌株间存在迁移ꎻ来自同一个市不同县之间
的菌株可以聚成一类ꎬ说明白粉菌在一个市内的不
同县、乡之间也存在一定交流ꎮ
３ 结论与讨论
根据陇南、天水两市小麦白粉菌群体的毒性监
测结果ꎬ当地有效的已知质量性状抗病基因有
Ｐｍ１２、Ｐｍ１６、Ｐｍ１８ 和 Ｐｍ２１ꎬ其中除 Ｐｍ１８[１３]外均
来自小麦近源植物:Ｐｍ１２、Ｐｍ１６、Ｐｍ２１ 分别来自
拟斯卑尔托山羊草(Ａｅｇｉｌｏｐｓ ｓｐｅｌｔｏｉｄｅｓ) [１ ４ ꎬ１５ ]、野
生二粒小麦 ( Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ｄｉｃｏｃｃｏｉｄｅｓ) [ １６ ] 和簇毛麦
(Ｈａｙｎａｌｄｉａ ｖｉｌｌｏｓａ) [ １７ ]ꎬ来自近源植物的有效抗源
占绝大多数ꎬ说明依靠小麦本身的抗性不足以应对
病原菌的变异ꎬ需要广泛地从小麦近源植物中寻找
对白粉病有效的抗源ꎮ 此外ꎬ利用单个质量性状的
抗病基因也存在缺陷ꎬ因为即使找到或转育成功新
的抗病基因ꎬ单个使用也容易在病菌群体变异中丧
失抗性ꎬ如本试验中的白粉菌群体对 Ｐｍ４ｂ 在陇南
市和天水市的毒性频率分别达到 ５０％和 ７８％ꎬ而
在 ２００８年甘肃群体对 Ｐｍ４ｂ的毒性频率还在 ４０％
以下(平均 ３８.１０％ꎬ未发表数据)ꎮ 此外ꎬ有些抗
病基因还没应用就面临着抗性“丧失”的命运ꎬ例
如 Ｐｍ２５ꎮ Ｐｍ２５是从 Ｔ.ｂｏｅｏｔｉｃｕｍ转育到小麦的一
个抗病基因ꎬ在国内并没有进行过广泛的应用ꎬ但
在本试验中ꎬ表现出对陇南小麦白粉病群体高度感
病ꎮ 其他几个近年纳入毒性监测的基因如 Ｐｍ２３、
Ｐｍ３０、Ｐｍ３４、Ｐｍ３５ 在陇南地区的表现也不如人
意ꎬ需要与其他基因组合使用ꎮ 毒性分析结果还可
以看出基因累加的效果: 白粉病菌对 Ｐｍ２、和 Ｐｍ６
在陇南、天水两市的平均毒性频率分别为 ４４％和
９２％ꎬ但 ２ 者累加后其两市平均毒性频率降至
４０％ꎻ而 Ｐｍ２与 ＰｍＭｌｄ累加后ꎬ两市平均毒性频率
则降至 ２８％ꎮ 通过基因累加或在大面积上布局不
同的、包括数量性状抗性在内的抗病基因势在必
行ꎮ 本研究结果表明ꎬ毒性频率低于 １０％的抗病
基因如Ｐｍ１２、Ｐｍ１６、Ｐｍ１８、Ｐｍ２１为甘肃省陇南、
８１４
４期 石琳ꎬ等:甘肃南部小麦白粉菌群体的毒性及多基因片段分析
Ｆｉｇ. ２ Ｔｈｅ ＮＪ ｔｒｅｅ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｆｉｖｅ ｇｅｎｅ ｆｒａｇｍｅｎｔｓ ｏｆ Ｂｌｕｍｅｒｉａ ｇｉａｍｉｎｉｓ ｆ.ｓｐ.
ｔｒｉｔｉｃｉ ｉｓｏｌａｔｅｓ ｂｙ ｕｓｉｎｇ ＭＥＧＡ ４
●: Ｉｓｏｌａｔｅｓ ｆｒｏｍ Ｔｉａｎｓｈｕｉ ｃｉｔｙꎻ ■: Ｉｓｏｌａｔｅｓ ｆｒｏｍ Ｌｏｎｇｎａｎ ｃｉｔｙ.
天水市的有效抗病基因ꎬ最好能以基因累加ꎬ或同
时推出携带不同基因的品种的方式在生产上进行
利用ꎬ通过增加田间抗病基因的多样性来减少对病
菌的定向选择ꎬ延长抗病基因的使用寿命ꎮ 农家品
种小白冬麦在陇南地区仍然表现良好ꎬ但赤牙糙
(Ｐｍ２４)在陇南地区没有应用价值ꎮ 比较表 ２中的
数据还可以看出ꎬ天水市群体比陇南市群体对多个
抗病基因的毒性频率高ꎬ例如对 Ｐｍ２、Ｐｍ４ｂ、Ｐｍ５
(Ｍｌｉ)、Ｐｍ２４、Ｐｍ３０及基因组合 Ｐｍ２＋６、Ｐｍ２＋Ｍｌｄ
等ꎬ说明天水小麦白粉菌群体的毒谱更宽ꎬ毒性更
复杂ꎮ
将图 １和图 ２进行综合比较ꎬ虽然甘肃省小麦
白粉菌的毒性多态性和 ＤＮＡ 遗传结构均与其地
理来源息息相关ꎬ但揭示出的相互关系却不尽相
同ꎮ 例如来自陇南成县的 ８ 号菌株和来自天水甘
谷县的 ３５号菌株具有相近的毒性(图 １)ꎬ但 ２ 个
菌株在地理和进化关系上(图 ２)相距甚远:８ 号菌
株属于第四类ꎬ而 ３５ 号菌株则属于第二类ꎮ 表明
它们或者在早期存在迁移ꎬ不同地区的菌株具有相
近的毒性ꎬ但在异地的独立进化ꎬ使它们在进化上
产生分歧ꎻ或者ꎬ两地寄主具有相近或相同的抗性ꎬ
因此虽然两地菌株的进化关系较远ꎬ却具有相近的
毒性ꎮ 此外ꎬ２４ 号和 ３０ 号菌株及 ２ 号和 ３５ 号等
菌株在多基因家系分析的结果中相似程度很高ꎬ而
９１４
植物病理学报 ４４卷
在毒性分析结果中则出现在不同的类群中ꎬ说明它
们进化关系较近ꎬ可能有相同或相近的来源ꎬ或者
在早期存在迁移ꎬ但由于小麦品种抗性不同对它们
进行选择的结果ꎬ使它们具有不同的毒性ꎮ 由此看
出ꎬＤｕａｎ[１ ８ ]、Ｌｕｏ[ ５ ]、Ｘｉａｏ等[１ ９ ]、Ｚｈｕ[ ２０ ]等报道的
小麦白粉菌的毒性多态性与其分子标记分析揭示
的遗传结构二者没有密切关系的结果ꎬ其实都与病
菌在进化中经历选择、迁移等因子的作用密切相
关ꎮ
用于小麦白粉菌群体遗传结构研究的分子标
记技术有很多:Ｄｕａｎ[ １ ８ ]、 Ｊｉａ 等[ ８ ]、Ｈｕｏ 等[ ２１ ]、
Ｗａｎｇ[９]分别用 ＲＡＰＤ、ＡＦＬＰ、ＩＳＳＲ 和 ＳＳＲ 等几种
方法对小麦白粉菌进行过遗传结构的研究ꎮ
ＲＡＰＤ稳定性和重复性比较差ꎬ目前国际刊物已基
本不接受该标记研究结果的报道ꎻ ＩＳＳＲ 虽然较
ＲＡＰＤ好ꎬ但也存在一些对其稳定性、重复性的质
疑ꎻＡＦＬＰ虽能揭示较高的多样性ꎬ但对操作者技
术要求较高ꎬ工作强度大ꎬ在样本量较大的群体研
究中应用具有挑战性ꎻＳＳＲ 目前报道的引物较少ꎬ
限制了其应用ꎮ 本实验中ꎬ首次应用多基因家系
法ꎬ通过小麦白粉菌群体中 ＡＯＸ、ＥＦＡ、ＰＫＡ、ＰＰＡ、
ＴＵＢ等 ５个基因片段 ＤＮＡ序列的差异ꎬ分析其群
体遗传结构ꎬ更清楚地反映出陇南各地小麦白粉菌
之间的系统进化关系ꎬ揭示了小麦白粉菌在各地区
独立进化的同时也存在省内的传播交流ꎮ 相对于
以上几种方法来说ꎬ多基因家系法具有操作更简
单ꎬ易掌握ꎬ且多态性也很丰富ꎬ结果更直观等诸多
优点ꎬ具有广阔应用前景ꎮ 但是ꎬ多基因家系法需
要对所获得的 ＤＮＡ 扩增片段进行测序ꎬ因此需要
有强大的资金支持ꎮ
致谢 作者感谢中国农科院植保所刘双女士
在毒性鉴定试验中提供的大力帮助ꎮ
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０２４
４期 石琳ꎬ等:甘肃南部小麦白粉菌群体的毒性及多基因片段分析
ｒｅｃｅｎｔ ｃｏｍｍｏｎ ａｎｃｅｓｔｒｙ ｗｉｔｈ Ｕ.Ｋ. ａｎｄ Ｉｓｒａｅｌｉ ｐｏｐｕｌａ￣
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ｖｉｌｌｏｓａ ６ＶＳ / ６ＡＬ ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ ｌｉｎｅｓ ｓｐｅｃｉｆｙｉｎｇ ｒｅｓｉｓ￣
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责任编辑:李晖
１２４