全 文 ：植物病理学报
ＡＣＴＡ ＰＨＹＴＯＰＡＴＨＯＬＯＧＩＣＡ ＳＩＮＩＣＡ ４５(５): ４７６￣４８５(２０１５)
收稿日期: ２０１４￣０７￣０８ꎻ 修回日期: ２０１５￣０５￣２９
基金项目: 国家转基因重大专项(２０１３ＺＸ０８００９￣００１ꎬ２０１４ＺＸ０８００９０３Ｂ)ꎻ国家重点实验室开放项目 (２０１１Ａ０５２５￣０２)
通讯作者: 朱立煌ꎬ研究员ꎬ主要从事水稻分子遗传学研究ꎻＥ￣ｍａｉｌ:ｌｈｚｈｕ＠ｇｅｎｅｔｉｃｓ.ａｃ.ｃｎ
陈学伟ꎬ教授ꎬ主要从事水稻重大病害抗病机理与应用研究ꎻＥ￣ｍａｉｌ:ｘｗｃｈｅｎ８８＠１６３.ｃｏｍ
共同第一作者: 赵 文ꎬ男ꎬ四川广元人ꎬ硕士研究生ꎬ主要从事水稻病理学研究ꎻＥ￣ｍａｉｌ:ｚｈａｏｗｎ２＠ｑｑ.ｃｏｍ
王 静ꎬ女ꎬ山东威海人ꎬ博士研究生ꎬ主要从事水稻病理学研究ꎻＥ￣ｍａｉｌ:ｗａｎｇｊｉｎｇ＠ｇｅｎｅｔｉｃｓ.ａｃ.ｃｎꎮ
ｄｏｉ:１０.１３９２６ / ｊ.ｃｎｋｉ.ａｐｐｓ.２０１５.０５.００５
应用 ＧＳＴ ｐｕｌｌ￣ｄｏｗｎ技术筛选水稻抗稻瘟病蛋白
ＰＩＤ３互作蛋白的研究
赵 文１ꎬ２＃ꎬ 王 静２＃ꎬ 李伟滔１ꎬ 王 静１ꎬ 李晓兵２ꎬ 朱立煌２∗ꎬ 陈学伟１∗
( １四川农业大学水稻研究所ꎬ成都 ６１１１３０ꎻ ２中国科学院遗传与发育生物学研究所ꎬ北京 １００１０１)
摘要:Ｐｉｄ３是从水稻中克隆获得的编码 ＣＣ￣ＮＢＳ￣ＬＲＲ类蛋白的稻瘟病抗病基因ꎮ 为了更深入地研究 Ｐｉｄ３ 编码蛋白 ＰＩＤ３
介导的稻瘟病抗性的分子调节机制ꎬ我们应用 ＧＳＴ ｐｕｌｌ￣ｄｏｗｎ结合质谱技术ꎬ对水稻抗稻瘟病蛋白 ＰＩＤ３的互作蛋白进行了
鉴定和分析ꎮ 首先ꎬ成功构建了带有 ＧＳＴ 标签且能够表达 ＰＩＤ３ 的 ＣＣ￣ＮＢＳ 结构域的融合蛋白表达载体 ｐＧＥＸ６Ｐ１￣
ＰＩＤ３ＣＣ￣ＮＢＳꎬ经诱导表达和 ＧＳＴ ｂｅａｄｓ纯化后获得 ＧＳＴ￣ＰＩＤ３ＣＣ￣ＮＢＳ融合蛋白ꎮ 我们以 Ｐｉｄ３的转基因水稻纯合株系Ｐｉｄ３￣ＴＰ３０９
为研究材料ꎬ分别用对其致病和不致病的稻瘟病菌生理小种 ＺＢ１３和 ＺＨＯＮＧ￣１０￣８￣１４接种ꎬ然后取叶片分别提取获得两组
总蛋白ꎮ 用纯化后的蛋白 ＧＳＴ￣ＰＩＤ３ＣＣ￣ＮＢＳ分别与两组总蛋白共培养后ꎬ利用 ＧＳＴ ｐｕｌｌ￣ｄｏｗｎ技术获得了分别在抗病、感病反
应中能与 ＰＩＤ３ＣＣ￣ＮＢＳ互作的两组候选蛋白ꎮ 通过质谱技术鉴定这些蛋白的氨基酸序列ꎬ比对分析其在抗病、感病途径中与
ＰＩＤ３结合的差异性ꎬ我们共筛选出 ３１个只在 ＰＩＤ３介导的抗稻瘟病反应中能与其特异结合的 ＰＩＤ３互作蛋白ꎬ这些互作蛋
白包括受体激酶、ＬＲＲ类蛋白、ＡＴＰ酶、磷酸羧化酶和离子通道蛋白等ꎬ广泛参与了调控细胞程序化死亡、胁迫防御反应、物
质与能量代谢和信号传导等多个生物学过程ꎮ 本研究探寻了 ＰＩＤ３介导的抗病信号转导过程的关键因子ꎬ研究结果为揭示
ＰＩＤ３介导的稻瘟病抗病分子机理奠定了良好基础ꎮ
关键词:抗稻瘟病ꎻ ＰＩＤ３ꎻ ＧＳＴ ｐｕｌｌ￣ｄｏｗｎꎻ 互作蛋白ꎻ 稻瘟病菌
Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｏｆ ｒｉｃｅ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｒｉｃｅ ｂｌａｓｔ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ＰＩＤ３ ｂｙ
ＧＳＴ ｐｕｌｌ￣ｄｏｗｎ ＺＨＡＯ Ｗｅｎ１ꎬ２ꎬ ＷＡＮＧ Ｊｉｎｇ２ꎬ ＬＩ Ｗｅｉ￣ｔａｏ１ꎬ ＷＡＮＧ Ｊｉｎｇ１ꎬ ＬＩ Ｘｉａｏ￣ｂｉｎｇ２ꎬ ＺＨＵ Ｌｉ￣
ｈｕａｎｇ２ꎬ ＣＨＥＮ Ｘｕｅ￣ｗｅｉ１ ( １Ｒｉｃｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅꎬ Ｓｉｃｈｕａｎ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙꎬ Ｃｈｅｎｇｄｕ ６１１１３０ꎬ Ｃｈｉｎａꎻ ２ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ
ｏｆ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙꎬ Ｃｈｉｎｅｓｅ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓꎬ Ｂｅｉｊｉｎｇ １００１０１ꎬ Ｃｈｉｎａ)
Ａｂｓｔｒａｃｔ: Ｒｉｃｅ Ｐｉｄ３ꎬ ｅｎｃｏｄｉｎｇ ａ ＣＣ￣ＮＢＳ￣ＬＲＲ ｐｒｏｔｅｉｎ (ＰＩＤ３)ꎬ ｃｏｎｆｅｒｓ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｔｏ ｂｌａｓｔ ｄｉｓｅａｓｅ ｃａｕｓｅｄ ｂｙ
Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ ｏｒｙｚａｅ. Ｈｏｗｅｖｅｒꎬ ｔｈｅ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｅｖｅｎｔｓ ｉｎ ＰＩＤ３￣ｍｅｄｉａｔｅｄ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ａｒｅ ｐｏｏｒｌｙ ｋｎｏｗｎ. Ｈｅｒｅꎬ ｗｅ
ｒｅｐｏｒｔ ｔｈｅ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ＰＩＤ３ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎｓ (Ｐ３ＩＰｓ) ｂｙ ｕｓｉｎｇ ＧＳＴ ｐｕｌｌ￣ｄｏｗｎ ａｐｐｒｏａｃｈ ｆｏｌｌｏｗｅｄ ｂｙ
ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ ａｎａｌｙｓｉｓ. Ｗｅ ｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｌｙ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒ ｏｆ ｐＧＥＸ６Ｐ１￣ＰＩＤ３ＣＣ￣ＮＢＳ ａｎｄ
ｐｕｒｉｆｉｅｄ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ＰＩＤ３ＣＣ￣ＮＢＳ ｗｉｔｈ ＧＳＴ ａｎｔｉｂｏｄｙ. Ｗｅ ｔｈｅｎ ｃｏ￣ｉｎｃｕｂａｔｅｄ ｔｈｅ ＧＳＴ￣ＰＩＤ３ＣＣ￣ＮＢＳ ｐｒｏｔｅｉｎ
ｗｉｔｈ ｔｏｔａｌ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｐｒｅｐａｒｅｄ ｆｒｏｍ ｔｈｅ Ｐｉｄ３ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｐｌａｎｔｓ ｉｎｏｃｕｌａｔｅｄ ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｉｎｃｏｍｐａｔｉｂｌｅ ｂｌａｓｔ
ｉｓｏｌａｔｅ ＺＨＯＮＧ￣１０￣８￣１４ ａｎｄ ｔｈｅ ｃｏｍｐａｔｉｂｌｅ ｂｌａｓｔ ｉｓｏｌａｔｅ ＺＢ１３. Ｔｈｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ ｏｆ ＧＳＴ￣ＰＩＤ３ＣＣ￣ＮＢＳ ｗｅｒｅ
ｐｕｌｌｅｄ ｄｏｗｎ ｂｙ ＧＳＴ ａｎｔｉｂｏｄｙ ａｎｄ ｔｈｅｎ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ ｂｙ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ ａｎａｌｙｓｉｓ. Ｗｅ ｃｏｍｐａｒｅｄ ｔｈｅ ｐｕｌｌｅｄ￣ｄｏｗｎ
ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｂｅｔｗｅｅｎ ｔｈｅ ｉｎｃｏｍｐａｔｉｂｌｅ ａｎｄ ｃｏｍｐａｔｉｂｌｅ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｐｉｄ３￣Ｍ. ｏｒｙｚａｅ ａｎｄ ｏｂｔａｉｎｅｄ ３１ ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｐ３ＩＰｓ
ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｉｎｃｏｍｐａｔｉｂｌｅ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ. Ｔｈｅｓｅ Ｐ３ＩＰｓꎬ ｍａｉｎｌｙ ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｋｉｎａｓｅｓꎬ ｋｉｎａｓｅｓꎬ ＬＲＲ
５期 赵 文ꎬ等:应用 ＧＳＴ ｐｕｌｌ￣ｄｏｗｎ技术筛选水稻抗稻瘟病蛋白 ＰＩＤ３互作蛋白的研究
ｐｒｏｔｅｉｎｓꎬ ＡＴＰａｓｅｓꎬ Ｒｉｂｕｌｏｓｅ ｂｉｓｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅｓꎬ ａｎｄ ｐｏｔａｓｓｉｕｍ ｃｈａｎｎｅｌ ＡＫＴ２ / ３ ｐｒｏｔｅｉｎｓꎬ ａｒｅ ｉｎｖｏｌｖｅｄ
ｉｎ ｍａｎｙ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｐｒｏｃｅｓｓｅｓꎬ ｓｕｃｈ ａｓ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎꎬ ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ ｃｅｌｌ ｄｅａｔｈꎬ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｔｏ ｓｔｒｅｓｓｅｓꎬ ａｎｄ
ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ｏｆ ｍａｓｓ ａｎｄ ｅｎｅｒｇｙ. Ｔａｋｅｎ ｔｏｇｅｔｈｅｒꎬ ｏｕｒ ｓｔｕｄｙ ｕｎｃｏｖｅｒｓ ｓｏｍｅ ｋｅｙ ｆａｃｔｏｒｓ ｔｈａｔ ｒｅｇｕｌａｔｅ ＰＩＤ３￣ｍｅｄｉａ￣
ｔｅｄ ｒｉｃｅ ｄｉｓｅａｓｅ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ａｎｄ ｗｉｌｌ ｐｒｏｖｉｄｅ ｉｎｓｉｇｈｔ ｉｎｔｏ ＮＢＳ￣ＬＲＲ ｐｒｏｔｅｉｎ￣ｍｅｄｉａｔｅｄ ｉｍｍｕｎｅ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ.
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ: ｒｉｃｅ ｂｌａｓｔ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅꎻ ＰＩＤ３ꎻ ＧＳＴ ｐｕｌｌ￣ｄｏｗｎꎻ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎꎻ Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ ｏｒｙｚａｅ
中图分类号: Ｓ４３５.１１１ 文献标识码: Ａ 文章编号: ０４１２￣０９１４(２０１５)０５￣０４７６￣１０
水稻是我国的主要粮食作物之一ꎬ水稻高产是
我国粮食安全的重要保障ꎬ但目前产量和抗性间的
矛盾非常突出ꎮ 稻瘟病是水稻的主要病害之一ꎬ流
行年份使水稻减产 １０％~２０％ꎬ严重时可减产 ４０％
~５０％以上ꎬ甚至绝收[１]ꎮ 目前ꎬ防治农作物病害
的主要手段是培育抗病品种和施用化学农药ꎮ 但
传统方法培育抗病品种所需育种周期长ꎬ化学农药
则严重污染环境ꎮ 而利用水稻自身携带的抗病基
因ꎬ通过分子育种方法培育抗病品种是一种控制稻
瘟病害的经济、有效和环保的方法ꎮ 目前ꎬ从水稻
中已经克隆了 ２４ 个稻瘟病抗性基因ꎬ这些基因介
导的稻瘟病抗性多数为生理小种特异性抗性[２]ꎮ
单个或少数几个抗病基因在育种中的应用很难使
水稻完全免受稻瘟病菌的侵害ꎮ 因此ꎬ很有必要进
行水稻重要抗病基因的分子作用机理的研究ꎬ将有
助于我们深入认识稻瘟病菌与水稻的互作机理ꎬ为
培育高抗和高产的水稻品种奠定坚实的理论基础ꎮ
植物中编码 ＮＢＳ￣ＬＲＲ(ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｂｉｎｄｉｎｇ ｓｉｔｅ￣
ｌｅｕｃｉｎｅ￣ｒｉｃｈ ｒｅｐｅａｔｓ)类蛋白的基因占已克隆的 Ｒ基
因(ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｇｅｎｅ)的 ７０％以上ꎬ其编码产物通常由
Ｃ端的 ＬＲＲ(富亮氨酸重复序列)结构域和中部的
ＮＢＳ(核苷酸结合位点)结构域组成ꎮ 已有的研究表
明ꎬ植物 ＮＢＳ￣ＬＲＲ蛋白的 ＬＲＲ结构域是对病原微
生物小种进行特异性识别和结合的区域ꎬ如水稻抗
稻瘟病基因 Ｐｉｔａ 通过其编码产物中的 ＬＲＲ结构与
Ａｖｒ￣Ｐｉｔａ结合ꎬ其 ＬＲＲ相关位点突变后会丧失识别
和结合 Ａｖｒ￣Ｐｉｔａ的能力ꎬ从而导致 Ｐｉｔａ 基因介导的
抗性丧失[３ꎬ ４]ꎮ 此外ꎬ亚麻抗锈菌蛋白 Ｌ５ 的 ＬＲＲ
结构域能够与无毒蛋白ＡｖｒＬ５６７直接结合[５]ꎮ 根据
编码蛋白 Ｎ末端的 ＴＩＲ( ｔｏｌｌ / ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ￣１受体)结
构和 ＣＣ(螺旋卷曲)结构ꎬ植物 ＮＢＳ￣ＬＲＲ基因可分
为 ＴＩＲ￣ＮＢＳ￣ＬＲＲ和 ＣＣ￣ＮＢＳ￣ＬＲＲ两种类型[５]ꎮ 拟
南芥中的 ＮＢＳ￣ＬＲＲ 基因多数属于 ＴＩＲ￣ＮＢＳ￣ＬＲＲ
类ꎬ而在水稻中还没有发现 ＴＩＲ￣ＮＢＳ￣ＬＲＲ 类的 Ｒ
基因ꎮ 植物 ＮＢＳ￣ＬＲＲ蛋白的 ＣＣ￣ＮＢＳ 和 ＴＩＲ￣ＮＢＳ
结构通常被认为是接收上游抗病信号的关键部位ꎬ
并且也是能够启动下游调控反应的重要结构[５]ꎮ 目
前ꎬ已有研究表明 Ｒ蛋白的 ＣＣ结构的单独表达能
引发自激活反应ꎬ该反应不再依赖无毒蛋白的刺激ꎬ
这说明ＣＣ￣ＮＢＳ￣ＬＲＲ基因中的ＣＣ结构域在引发下
游信号传导中具有重要的作用[６]ꎮ
水稻地谷是一份对稻瘟病菌具有广谱高抗性
的重要抗源ꎬ该抗源已经广泛应用于我国水稻稻瘟
病抗性育种中[７]ꎮ 在水稻地谷中ꎬ成功鉴定并克
隆了水稻抗稻瘟病基因 Ｐｉｄ３[７]ꎮ 研究表明ꎬＰｉｄ３
是位于水稻第 ６ 号染色体上全长为 ２ ９７０ ｂｐ 的单
拷贝基因ꎬ含有 ２ 个外显子ꎬ编码一个由 ９２３ 个氨
基酸组成的ꎬ具有 ＣＣ、ＮＢＳ 和 ＬＲＲ 保守结构域的
ＣＣ￣ＮＢＳ￣ＬＲＲ类抗病蛋白[７ꎬ ８]ꎮ 本研究通过 ＧＳＴ
ｐｕｌｌ￣ｄｏｗｎ技术从水稻中筛选与 ＰＩＤ３ 相互作用的
蛋白(Ｐｉｄ３ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎｓꎬＰ３ＩＰｓ)ꎬ通过质谱分
析鉴定这些蛋白的氨基酸序列并结合生物信息学
预测其功能ꎮ 通过对筛选到的 Ｐ３ＩＰｓ的分析ꎬ揭示
典型的 ＣＣ￣ＮＢＳ￣ＬＲＲ 抗稻瘟病蛋白 ＰＩＤ３ 介导的
抗病反应途径中的关键因子ꎬ为解析水稻抗稻瘟病
的分子机制奠定基础ꎮ
１ 材料和方法
１.１ 水稻材料和供试菌株
抗病基因供体材料 Ｐｉｄ３￣ＴＰ３０９ꎬ它是以粳稻
ＴＰ３０９ ( Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ ｓｕｂｓｐ. ｊａｐｏｎｉｃａ ｃｖ. Ｔａｐｅｉ
３０９)为背景ꎬ转入抗稻瘟病基因 Ｐｉｄ３的水稻材料ꎮ
用于接菌试验的稻瘟病菌株 ＺＨＯＮＧ￣１０￣８￣１４
和 ＺＢ１３ꎮ 其中 ＺＨＯＮＧ￣１０￣８￣１４ 是 Ｐｉｄ３￣ＴＰ３０９ 的
非亲和生理小种ꎬＰｉｄ３ 对其具有小种特异抗性ꎻ而
ＺＢ１３是 Ｐｉｄ３￣ＴＰ３０９ 的亲和生理小种ꎬ能使 Ｐｉｄ３￣
ＴＰ３０９感病ꎮ
１.２ 接菌试验
将保存有菌种的滤纸片在无菌条件下移至
７７４
植物病理学报 ４５卷
ＣＭ培养基ꎬ培养一周(复壮)后转至米糠培养基
２８℃培养ꎮ 待菌丝长满培养基(７ ~ １０ ｄ)ꎬ刮板刺
激产生孢子ꎬ用 Ｔｗｅｅｎ ２０溶液悬浮ꎬ显微镜下观察
孢子浓度ꎬ配置成孢子浓度约为 １×１０５个∙ｍＬ－１的
悬浮液[８]ꎮ 用小喷壶均匀快速的将稻瘟病菌孢子
悬浮液喷洒到稻苗上ꎮ 喷雾接菌后ꎬ用保鲜膜封口
保湿ꎬ用黑色薄膜遮光处理 ２４ ｈꎬ然后光暗交替
(１２ ｈ光 / １２ ｈ暗)ꎬ保温保湿培养稻苗ꎬ待发病ꎮ
１.３ 带有 ＧＳＴ标签的 ＰＩＤ３蛋白的表达和纯化
通过分析 Ｐｉｄ３ 编码蛋白相应的氨基酸序列ꎬ
设计了 ２ 对引物ꎬ以 ｃＤＮＡ 为模板ꎬ采用高保真
ＫＯＤ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ(东洋纺上海生物科技有限
公司) 进行 ＰＣＲ 反应ꎬ分别成功扩增出编码
ＰＩＤ３ＣＣ￣ＮＢＳ￣ＬＲＲ(Ｐｉｄ３￣ＦＬ:Ｐｉｄ３ 能完整表达 ＣＣ￣ＮＢＳ￣
ＬＲＲ 结构的 ｃＤＮＡ 序列ꎬ２ ７６９ ｂｐ)和 ＰＩＤ３ＣＣ￣ＮＢＳ
(Ｐｉｄ３ＣＣ￣ＮＢＳ: Ｐｉｄ３ 能完整表达 ＣＣ￣ＮＢＳ 结构的
ｃＤＮＡ序列ꎬ１ ７３７ ｂｐ)的基因 ｃＤＮＡ序列ꎮ 用限制
内切酶 Ｎｏｔ Ｉ 和 ＥｃｏＲ Ｉ 分别酶切载体 ｐＧＥＸ￣６Ｐ￣１
和 Ｐｉｄ３基因片段得到带有黏性末端的载体和目的
片段ꎮ 用 Ｔ４ ＤＮＡ 连接酶连接后转化ꎬ获得带有
ＧＳＴ标签的 ＰＩＤ３ 融合蛋白表达载体 ｐＧＥＸ６Ｐ１￣
ＰＩＤ３ＣＣ￣ＮＢＳ￣ＬＲＲ和 ｐＧＥＸ６Ｐ１￣ＰＩＤ３ＣＣ￣ＮＢＳꎮ 在大肠杆菌
Ｔｒａｎｓｅｔｔａ(ＤＥ３)中用 ＩＰＴＧ 诱导其表达带有 ＧＳＴ
标签 的 融 合 蛋 白 ＧＳＴ￣ＰＩＤ３ＣＣ￣ＮＢＳ￣ＬＲＲ 和 ＧＳＴ￣
ＰＩＤ３ＣＣ￣ＮＢＳꎬ进一步用 Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ￣Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ｂｅａｄｓ
纯化该融合蛋白ꎮ
１.４ 筛选与 ＰＩＤ３相互作用的水稻蛋白 Ｐ３ＩＰｓ
挑选成熟饱满的种子 Ｐｉｄ３￣ＴＰ３０９ 和 ＴＰ３０９ꎬ
用蒸馏水冲洗数次ꎬ用湿纱布包裹冲洗过的种子ꎬ
将其置于烧杯ꎬ放入 ３７℃的烘箱中待发芽ꎮ ２ ｄ 后
将已发芽的种子移至温室中ꎬ均匀放入栽培盒中ꎬ
待苗长到 ３ 叶期时(２５ ｄ 左右)ꎬ将栽培盒移入接
菌室ꎬ喷雾接菌ꎮ 接菌后按时间点 ０、５、１０、１５ 和
２０ ｈ 取样ꎮ 用剪刀快速剪取距培养土表面约
０.５ ｃｍ以上的植株部分ꎬ并立即用液氮处理ꎬ提取
总蛋白ꎮ 将提取的总蛋白在蛋白提取缓冲液中与
已纯化的融合蛋白 ＧＳＴ￣ＰＩＤ３ＣＣ￣ＮＢＳ(该融合蛋白已
亲和固化在 Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ￣Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ｂｅａｄｓ 上)共孵
育ꎮ 然后ꎬ用蛋白提取缓冲液对共孵育过的 Ｇｌｕｔａ￣
ｔｈｉｏｎｅ￣Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ｂｅａｄｓ 进行清洗ꎮ 最后ꎬ用 ＳＤＳ￣
ＰＡＧＥ电泳分离总蛋白中与 ＧＳＴ￣ＰＩＤ３ＣＣ￣ＮＢＳ相互作
用的蛋白(Ｐ３ＩＰｓ)ꎮ 为了避免融合蛋白中 ＧＳＴ 与
水稻蛋白相互作用而影响试验结果ꎬ本研究同时用
表达纯化后的 ＧＳＴ 蛋白(在 Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ￣Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ
ｂｅａｄｓ上)与提取获得的总蛋白共孵育后的结果作
为对照ꎮ 用 Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ ｂｒｉｌｌｉａｎｔ ｂｌｕｅ Ｇ￣２５０对 ＳＤＳ￣
ＰＡＧＥ染色后切割回收ꎮ
１.５ 分析鉴定筛选出水稻蛋白 Ｐ３ＩＰｓ的序列及生
物学功能
切割并回收与 ＧＳＴ￣ＰＩＤ３ 特异性结合的 Ｐ３ＩＰｓ
蛋白ꎬ利用液质联用质谱( ｌｉｑｕｉｄ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ￣
ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙꎬＬＣ / ＭＳ)技术分析鉴定这些蛋
白的氨基酸序列ꎮ 通过 Ｍａｔｒｉｘ Ｓｃｉｅｎｃｅ 公司的
Ｍａｓｃｏｔ 软件在最新的 ＮＣＢＩ 数据库 ( Ｎａｔｉｏｎａｌ
Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎꎬ ｈｔｔｐ: / / ｗｗｗ.
ｎｃｂｉ.ｎｌｍ.ｎｉｈ.ｇｏｖ)和 ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ / Ｓｗｉｓｓ￣Ｐｒｏｔ 数据库
( ＵｎｉＰｒｏｔ Ｋｎｏｗｌｅｄｇｅｂａｓｅꎬ ｈｔｔｐ: / / ｗｗｗ. ｕｎｉｐｒｏｔ.
ｏｒｇ)中对这些 Ｐ３ＩＰｓ 蛋白进行肽段指纹图谱蛋白
的检索ꎬ分析预测这些蛋白的生物学功能ꎮ
１.６ 验证 Ｐ３ＩＰｓ与 ＰＩＤ３ＣＣ－ＮＢＳ的相互作用
分析编码这些 Ｐ３ＩＰｓ 基因的 ｃＤＮＡ 序列ꎬ挑选
了一个编码与离子转运相关的 Ｐ３ＩＰ蛋白(ｐｏｔａｓｓｉｕｍ
ｃｈａｎｎｅｌ ＡＫＴ２ꎬＰＣＡ２)ꎬ通过构建带 ＨＡ标签的表达
载体ꎬ在原核表达系统进行诱导表达ꎬ获得带有 ＨＡ
标签的 Ｐ３ＩＰ 融合蛋白ꎮ 将已经亲和固化有 ＧＳＴ￣
ＰＩＤ３ＣＣ－ＮＢＳ的 Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ￣Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ｂｅａｄｓ 与带有
ＨＡ标签的 Ｐ３ＩＰｓ融合蛋白进行共孵育ꎮ 然后ꎬ用蛋
白提取缓冲液对共孵育过的 ｂｅａｄｓ清洗后进行 ＳＤＳ￣
ＰＡＧＥ 电 泳ꎮ 最 后ꎬ用 ＨＡ 抗 体 进 行 Ｗｅｓｔｅｒｎ
ｂｌｏｔｔｉｎｇꎬ检测该 Ｐ３ＩＰ与 ＰＩＤ３ＣＣ－ＮＢＳ的相互作用ꎮ
２ 结果与分析
２.１ 接种结果分析
分别用稻瘟病菌生理小种 ＺＨＯＮＧ￣１０￣８￣１４
(Ｐｉｄ３￣ＴＰ３０９的非亲和生理小种)和 ＺＢ１３(Ｐｉｄ３￣
ＴＰ３０９ 的亲和生理小种)以及水 (对照)对水稻
Ｐｉｄ３￣ＴＰ３０９(三叶期)的稻苗进行喷雾接菌试验ꎮ
一周后观察其发病情况ꎬ结果发现ꎬ水稻 Ｐｉｄ３￣
ＴＰ３０９接种 ＺＨＯＮＧ￣１０￣８￣１４ 后表现为抗病ꎬ接种
ＺＢ１３后表现为感病ꎬ用水处理的对照长势正常ꎬ
８７４
５期 赵 文ꎬ等:应用 ＧＳＴ ｐｕｌｌ￣ｄｏｗｎ技术筛选水稻抗稻瘟病蛋白 ＰＩＤ３互作蛋白的研究
而背景材料 ＴＰ３０９接种 ＺＨＯＮＧ￣１０￣８￣１４后表现为
感病(图 １)ꎮ 说明转入的 Ｐｉｄ３基因使 ＴＰ３０９ 获得
了对生理小种 ＺＨＯＮＧ￣１０￣８￣１４的小种特异抗性ꎬ能
有效抵御该生理小种的侵染ꎮ 这一结果表明
ＺＨＯＮＧ￣１０￣８￣１４能激活水稻 ＰＩＤ３介导的免疫信号
通路ꎮ
２.２ 获得带有ＧＳＴ标签的融合蛋白ＧＳＴ￣ＰＩＤ３ＣＣ￣ＮＢＳ
为了研究 Ｐｉｄ３ 编码蛋白 ＰＩＤ３ 介导的稻瘟病
抗性的分子调节机制ꎬ利用相关分子技术筛选和鉴
定与 ＰＩＤ３ 互作的蛋白是必须的ꎮ 基于本研究中
采用的 ＧＳＴ ｐｕｌｌ￣ｄｏｗｎ技术ꎬ我们首先要获得带有
ＧＳＴ标签的 ＰＩＤ３ 融合蛋白ꎮ 利用酶切连接的方
法ꎬ我们成功构建了两个带有 ＧＳＴ 标签融合表达
载 体 ｐＧＥＸ６Ｐ１￣ＰＩＤ３ＣＣ￣ＮＢＳ￣ＬＲＲ 和 ｐＧＥＸ６Ｐ１￣
ＰＩＤ３ＣＣ￣ＮＢＳ(图 ２)ꎮ 将这 ２ 个表达载体转入大肠杆
菌 Ｔｒａｎｓｅｔｔａ(ＤＥ３)中进行大量繁殖后ꎬ用 ＩＰＴＧ 诱
导表达获得 ＧＳＴ￣ＰＩＤ３ 融合蛋白ꎬ结果发现只有
ｐＧＥＸ６Ｐ１￣ＰＩＤ３ＣＣ￣ＮＢＳ融合表达载体能够被诱导成
功ꎬ而经多方面改变诱导条件(温度、诱导时间和
Ｆｉｇ. １ Ｄｉｓｅａｓｅ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ａｆｔｅｒ Ｍａｇ￣
ｎａｐｏｒｔｈｅ ｏｒｙｚａｅ ｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ
Ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｖｅ ｒｉｃｅ ｌｅａｖｅｓ ａｔ ７ ｄｐｉ ( ｄａｙｓ ｐｏｓｔ ｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ) .
Ｆｉｇｕｒｅｓ “１” ｔｏ “ ４” ｄｅｎｏｔｅｄ ｔｈｅ ｌｅａｆ ｓａｍｐｌｅｓ ｆｒｏｍ ＴＰ３０９
ｉｎｏｃｕｌａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｃｏｍｐａｔｉｂｌｅ ｒａｃｅ ＺＨＯＮＧ￣１０￣８￣１４ꎻ
Ｐｉｄ３￣ＴＰ３０９ ｉｎｏｃｕｌａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｃｏｍｐａｔｉｂｌｅ ｒａｃｅ ＺＢ１３ꎻ
Ｐｉｄ３￣ＴＰ３０９ ｉｎｏｃｕｌａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｉｎｃｏｍｐａｔｉｂｌｅ ｒａｃｅ ＺＨＯＮＧ￣
１０￣８￣１４ ａｎｄ Ｐｉｄ３￣ＴＰ３０９ ｔｒｅａｔｅｄ ｗｉｔｈ Ｈ２Ｏꎬ ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ.
Ｆｉｇ. ２ Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒ ｏｆ ＧＳＴ￣ＰＩＤ３
ＰＩＤ３ＣＣ￣ＮＢＳ￣ＬＲＲｃｏｎｔａｉｎｓ ｔｈｅ ｅｎｔｉｒｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｏｆ ＰＩＤ３ ｉｎ ｔｈｅ ｐｒｅｓｅｎｃｅ ｏｆ ＣＣꎬ ＮＢＳꎬ ａｎｄ ＬＲＲ ｄｏｍａｉｎｓꎬ ｗｈｅｒｅａｓ ＰＩＤ３ＣＣ￣ＮＢＳ
ｃｏｎｔａｉｎｓ ｐａｒｔｉａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ＰＩＤ３ ｉｎ ｔｈｅ ｐｒｅｓｅｎｃｅ ｏｆ ＣＣ ａｎｄ ＮＢＳ ｄｏｍａｉｎｓ ｂｕｔ ｎｏｔ ＬＲＲ ｄｏｍａｉｎ.
９７４
植物病理学报 ４５卷
ＩＰＴＧ终浓度)都不能诱导 ｐＧＥＸ６Ｐ１￣ＰＩＤ３ＣＣ￣ＮＢＳ￣ＬＲＲ
载体产生明显的 ＧＳＴ￣ＰＩＤ３ＣＣ￣ＮＢＳ￣ＬＲＲ蛋白(图 ３)ꎮ
Ｆｉｇ. ３ Ｆｕｓｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ ＩＰＴＧ
“１” ｒｅｐｒｅｓｅｎｔｓ ｔｏｔａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓａｍｐｌｅ ｐｒｅｐａｒｅｄ ｆｒｏｍ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ
ｃｏｌｉ ＤＥ３ ｉｎｔｒｏｄｕｃｅｄ ｗｉｔｈ ｐＧＥＸ６Ｐ１￣ＰＩＤ３ＣＣ￣ＮＢＳ￣ＬＲＲ ｐｏｓｔ ＩＰＴＧ
ｉｎｄｕｃｔｉｏｎꎻ “２” ｒｅｐｒｅｓｅｎｔｓ ｔｏｔａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓａｍｐｌｅ ｐｒｅｐａｒｅｄ ｆｒｏｍ
Ｅ. ｃｏｌｉ ＤＥ３ ｉｎｔｒｏｄｕｃｅｄ ｗｉｔｈ ｐＧＥＸ６Ｐ１￣ＰＩＤ３ＣＣ￣ＮＢＳ ｐｏｓｔ ＩＰＴＧ
ｉｎｄｕｃｔｉｏｎꎻ “Ｍ” ｒｅｐｒｅｓｅｎｔｓ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｉｚｅ ｌａｄｄｅｒ.
已有的研究表明ꎬＣＣ￣ＮＢＳ￣ＬＲＲ 蛋白结构中
的ＬＲＲ结构主要负责对无毒蛋白(Ａｖｒ)的感知和
特异性识别ꎬ而ＣＣ￣ＮＢＳ结构主要负责与其它调
控蛋白的相互作用并将免疫信号传递给下游以激
活抗病反应过程[６ꎬ ９ꎬ １０]ꎮ 为了寻找抗稻瘟病蛋白
ＰＩＤ３ 介导的免疫反应中的调控元件ꎬ找出水稻体
内由 ＰＩＤ３介导的抗病反应中的关键因子ꎬ我们通
过诱导表达 ｐＧＥＸ６Ｐ１￣ＰＩＤ３ＣＣ￣ＮＢＳꎬ获得大量融合蛋
白ꎬ然后对融合蛋白进行纯化ꎬ使 ＧＳＴ￣ＰＩＤ３ＣＣ￣ＮＢＳ
融合蛋白亲和固化在 Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ￣Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ｂｅａｄｓꎮ
分别对进行诱导后提取的总蛋白、从总蛋白中离心
获取的上清蛋白和纯化后的 ＰＩＤ３ＣＣ￣ＮＢＳ蛋白进行
ＳＤＳ￣ＰＡＧＥ 电泳ꎬ 然后进行考马斯蓝染色和
Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ 检 测ꎬ 结 果 显 示 Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ￣
Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ｂｅａｄｓ能从诱导表达后提取的上清蛋白中
成功纯化出 ＧＳＴ￣ＰＩＤ３ＣＣ￣ＮＢＳ融合蛋白(图 ４)ꎮ 纯化
后的 ＧＳＴ￣ＰＩＤ３ＣＣ￣ＮＢＳ蛋白能用于后续的 ＧＳＴ ｐｕｌｌ￣
ｄｏｗｎ 试验ꎮ
２.３ ＧＳＴ ｐｕｌｌ￣ｄｏｗｎ及质谱结果分析
以 Ｐｉｄ３ 的转基因水稻纯合株系 Ｐｉｄ３￣ＴＰ３０９
为研究材料ꎬ用稻瘟病菌接种后ꎬ收取叶片分别提
取总蛋白ꎮ 其中一组是非亲和小种 ＺＨＯＮＧ￣１０￣８￣
１４接种后植株发生抗病反应的总蛋白ꎬ另一组是
亲和小种 ＺＢ１３ 接种后植株发生感病反应的总蛋
白ꎮ 将纯化后的带有 ＧＳＴ 标签的 ＰＩＤ３ 融合蛋白
ＧＳＴ￣ＰＩＤ３ＣＣ￣ＮＢＳ与这两组总蛋白分别进行共孵育ꎬ
洗脱后获得了两组能与 ＰＩＤ３ 互作的候选蛋白ꎮ
其中一组是在 ＰＩＤ３ 介导的抗性反应中能与 ＰＩＤ３
互作的蛋白ꎬ另一组是在含有 ＰＩＤ３ 植株的感病反
应中能与 ＰＩＤ３互作的蛋白(图 ５)ꎮ
Ｆｉｇ. ４ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ＧＳＴ￣ＰＩＤ３ＣＣ￣ＮＢＳ ｂｙ Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ
Ａ: Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｗｅｒｅ ｓｅｐａｒａｔｅｄ ｂｙ ＳＤＳ￣ＰＡＧＥ ｆｏｌｌｏｗｅｄ ｂｙ Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ ｂｒｉｌｌｉａｎｔ ｂｌｕｅ Ｇ￣２５０ ｓｔａｉｎｉｎｇꎻ Ｂ: Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ
ｔａｒｇｅｔ ｆｕｓｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ ｂｙ Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ ｕｓｉｎｇ ａｎｔｉ￣ＧＳＴ ａｓ ａ ｐｒｉｍａｒｙ ａｎｔｉｂｏｄｙ. Ｉｎ ｂｏｔｈ Ａ ａｎｄ Ｂꎬ “１” ｒｅｐｒｅｓｅｎｔｓ ｔｏｔａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ
ｅｘｔｒａｃｔ ｆｒｏｍ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＤＥ３ ｗｉｔｈ ｐＧＥＸ６Ｐ１￣ＰＩＤ３ＣＣ￣ＮＢＳ ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ ＩＰＴＧꎻ “２” ｒｅｐｒｅｓｅｎｔｓ ｔｈｅ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｆｒｏｍ ｔｈｅ
ｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔ ｓｅｐａｒａｔｅｄ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｔｏｔａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ ｐｒｅｐａｒｅｄ ｆｒｏｍ “１”ꎻ “３” ｒｅｐｒｅｓｅｎｔｓ ｔｈｅ ｐｕｒｉｆｉｅｄ ｆｕｓｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ
ＧＳＴ￣ＰＩＤ３ＣＣ￣ＮＢＳ ｆｒｏｍ ｓａｍｐｌｅ “２” . Ｉｎ Ｂꎬ ｔｈｅ ａｒｒｏｗ ｒｅｐｒｅｓｅｎｔｓ ｔｈｅ ＧＳＴ￣ＰＩＤ３ＣＣ￣ＮＢＳ ｆｕｓｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ.
０８４
５期 赵 文ꎬ等:应用 ＧＳＴ ｐｕｌｌ￣ｄｏｗｎ技术筛选水稻抗稻瘟病蛋白 ＰＩＤ３互作蛋白的研究
Ｆｉｇ. ５ ＧＳＴ ｐｕｌｌ￣ｄｏｗｎ ａｓｓａｙ ｗｉｔｈ ｔｏｔａｌ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｅｘｔｒａｃｔｅｄ ｆｒｏｍ Ｐｉｄ３￣ＴＰ３０９
ａｔ ｓｅｖｅｒａｌ ｔｉｍｅ ｐｏｉｎｔｓ ｐｏｓｔ ｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ
Ａ: Ｔｏｔａｌ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｅｘｔｒａｃｔｅｄ ｆｒｏｍ Ｐｉｄ３￣ＴＰ３０９ ｐｌａｎｔｓ ａｆｔｅｒ ＺＨＯＮＧ￣１０￣８￣１４ ｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ ｗｅｒｅ ｓｅｐａｒａｔｅｄ ｂｙ ＳＤＳ￣ＰＡＧＥ.
Ａ１ ｔｏ Ａ５ ｒｅｐｒｅｓｅｎｔ ｔｈｅ ｔｏｔａｌ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｅｘｔｒａｃｔｅｄ ｆｒｏｍ Ｐｉｄ３￣ＴＰ３０９ ａｔ ０ꎬ ５ꎬ １０ꎬ １５ ａｎｄ ２０ ｈｒｓ ｐｏｓｔ ｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ (ｈ.ｐ.ｉ.) .
“Ｍ” ｒｅｐｒｅｓｅｎｔｓ ｔｈｅ ｕｎｓｔａｉｎｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｉｚｅ ｌａｄｄｅｒꎻ Ｂ: Ｔｈｅ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｃｏｍｐｌｅｘ ｏｆ ＧＳＴ￣ＰＩＤ３ＣＣ￣ＮＢＳ ｃｏ￣ｉｎｃｕｂａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｔｈｅ
ｔｏｔａｌ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｗｅｒｅ ｓｅｐａｒａｔｅｄ ｂｙ ＳＤＳ￣ＰＡＧＥ ｇｅｌ ｆｏｌｌｏｗｅｄ ｂｙ ａ Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ ｂｒｉｌｌｉａｎｔ ｂｌｕｅ Ｇ￣２５０ ｓｔａｉｎｉｎｇ. Ｂ１ ｔｏ Ｂ５ ｒｅｐｒｅｓｅｎｔ
ｔｈｅ ｃｏｍｐｌｅｘ ｏｆ ＧＳＴ￣ＰＩＤ３ＣＣ￣ＮＢＳ ｆｒｏｍ ０ꎬ ５ꎬ １０ꎬ １５ ａｎｄ ２０ ｈ.ｐ.ｉ.ꎬ ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙꎻ Ｃ: Ｔｈｅ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｃｏｍｐｌｅｘ ｏｆ
ＧＳＴ￣ＰＩＤ３ＣＣ￣ＮＢＳ ｃｏ￣ｉｎｃｕｂａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｔｏｔａｌ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｗｅｒｅ ｓｅｐａｒａｔｅｄ ｂｙ ＳＤＳ￣ＰＡＧＥ ｇｅｌ ｆｏｌｌｏｗｅｄ ｂｙ ａ ｓｉｌｖｅｒ ｓｔａｉｎｉｎｇ.
Ｃ１ ｔｏ Ｃ５ ｒｅｐｒｅｓｅｎｔ ｔｈｅ ｃｏｍｐｌｅｘ ｏｆ ＧＳＴ￣ＰＩＤ３ＣＣ￣ＮＢＳ ｆｒｏｍ ０ꎬ ５ꎬ １０ꎬ １５ ａｎｄ ２０ ｈ.ｐ.ｉ.ꎬ ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ.
利用 ＬＣ￣ＭＳ / ＭＳ质谱技术分析候选 Ｐ３ＩＰｓ 的
氨基酸序列ꎬ在接菌 ＺＨＯＮＧ￣１０￣８￣１４(非亲和生理
小种)的水稻 Ｐｉｄ３￣ＴＰ３０９ 总蛋白中鉴定出一批
Ｐ３ＩＰｓ 的氨基酸序列ꎬ在接菌 ＺＢ１３(亲和生理小
种)的水稻 Ｐｉｄ３￣ＴＰ３０９ 总蛋白中也鉴定出一批
Ｐ３ＩＰｓ的氨基酸序列ꎮ 通过对这些分别在抗病、感
病途径中与 ＰＩＤ３ＣＣ￣ＮＢＳ互作蛋白氨基酸序列的比对
和分析ꎬ最终筛选到只在 ＰＩＤ３ 介导的抗病反应中
与 ＰＩＤ３特异互作的 ３１个 Ｐ３ＩＰｓ(表 １)ꎮ
通过分析这 ３１ 个 Ｐ３ＩＰｓ 的序列信息ꎬ我们发
现编码这些 Ｐ３ＩＰｓ 的基因不仅在水稻基因组范围
内分布广泛ꎬ还有一些编码这些候选 Ｐ３ＩＰｓ的基因
来自水稻叶绿体和线粒体ꎮ 结合前人研究结果和
生物信息学预测分析发现ꎬ这些 Ｐ３ＩＰｓ参与了调控
细胞程序化死亡( Ｉ１ＰＢＭ０:ＬＯＣ＿Ｏｓ０３ｇ２５３６０.１)、
物质与能量代谢 ( Ｐ０Ｃ２Ｚ７: ＬＯＣ ＿ Ｏｓ１０ｇ２１２６６ꎻ
Ｑ０ＤＧ４８: ＬＯＣ ＿ Ｏｓ０５ｇ０５５３０ꎻ Ｉ１Ｐ４Ｖ３: ＬＯＣ ＿
Ｏｓ０２ｇ５３９６０.１)、线粒体(Ｈ５ＺＸＨ７:Ｐｒｏｔｅｉｎ ｏｒｆ ３８９ꎬ
ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉｏｎ ) 和 叶 绿 体 ( Ｄ０ＥＫＬ９: ＣＰ４７
ｃｈｌｏｒｏｐｈｙｌｌ ａｐｏｐｒｏｔｅｉｎ)功能维持、胁迫防御反应
( Ｉ１Ｑ２３４ꎬ Ｉ１ＰＵ５６)和信号传导 (Ｑ１０ＮＷ３:ＬＯＣ＿
Ｏｓ０３ｇ１５１００)等生物学过程ꎮ 其中 Ｑ０ＤＧ４８(ＡＴＰ
ｓｙｎｔｈａｓｅ )、 Ｑ３６６８８ ( ｒｉｂｕｌｏｓｅ ｂｉｓｐｈｏｓｐｈａｔｅ
ｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ )、 Ｇ４Ｎ４Ｔ４ ( ｔＲＮＡ ｌｉｇａｓｅ )、 Ｇ４ＮＧＺ７
(ＲＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ＩＩ Ｅｌｏｎｇａｔｏｒ)、Ｐ０Ｃ２Ｚ７(ＡＴＰ ｓｙｎ￣
ｔｈａｓｅ)、Ａ３ＡＫＨ０(ＲＮＡ￣ｄｉｒｅｃｔｅｄ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ)、
Ｂ９ＥＶＰ５ ( ｂｅｔａ￣Ｄ￣ｘｙｌｏｓｉｄａｓｅ ｆａｍｉｌｙ ３ ｐｒｏｔｅｉｎ )、
Ｉ１ＮＫＡ７( ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｋｉｎａｓｅ)、 Ｉ１Ｐ４Ｖ３ (ＣＸＥ ｃａｒｂｏｘｙ￣
ｌｅｓｔｅｒａｓｅ ) 和 Ｇ４ＭＷＹ５ ( ＣＡＭＫ / ＣＡＭＫＬ / ＫＩＮ４
ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ)等具有酶活特性ꎮ
２.４ ＰＣＡ２与ＧＳＴ￣ＰＩＤ３ＣＣ￣ＮＢＳ体外互作的鉴定结果
从筛选出的 Ｐ３ＩＰｓ 中挑选一个钾离子转运相
关蛋白 ＰＣＡ２ ( ｐｏｔａｓｓｉｕｍ ｃｈａｎｎｅｌ ＡＫＴ２ꎬ ＬＯＣ ＿
Ｏｓ０５ｇ３５４１０.１)ꎬ通过体外验证该蛋白是否确实与
ＧＳＴ￣ＰＩＤ３ＣＣ￣ＮＢＳ发生互作ꎬ我们构建了带有 ＨＡ 标
签的 ＰＣＡ２蛋白原核表达载体ꎬ并在大肠杆菌中诱
导表达ꎬ获得了 ＨＡ￣ＰＣＡ２ 融合蛋白ꎮ 分别用能特
异识别 ＧＳＴ 和 ＨＡ 的抗体检测该融合蛋白ꎬ
Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ结果显示 ＨＡ￣ＰＣＡ２能被特异识别
ＨＡ的抗体检出而不能被识别 ＧＳＴ的抗体检出ꎬ表
明该 ＨＡ￣ＰＣＡ２融合蛋白能正确表达且无 ＧＳＴ 蛋
白的污染 (图 ６￣Ａ)ꎮ 分别用 ＧＳＴ￣ＰＩＤ３ＣＣ￣ＮＢＳ 和
ＧＳＴ与 ＨＡ￣ＰＣＡ２共孵育一定时间ꎬ洗脱后分别用
特异识别 ＧＳＴ 和 ＨＡ 的抗体去检测ꎬ结果显示
ＨＡ￣ＰＣＡ２能特异的与 ＧＳＴ￣ＰＩＤ３ＣＣ￣ＮＢＳ结合而不与
ＧＳＴ结合(图 ６￣Ｂ)ꎮ 由此表明ꎬＧＳＴ ｐｕｌｌ￣ｄｏｗｎ 的
１８４
植物病理学报 ４５卷
结果是可靠的ꎮ
３ 讨论
水稻不仅是用于禾本科植物分子水平研究的
模式生物ꎬ更是一种重要的粮食作物ꎮ 稻瘟病是影
响水稻产量的主要病害之一[１]ꎮ 因此ꎬ探明水稻
和稻瘟病之间的相互作用关系不仅有助于增加社
会经济效益ꎬ还可以为其它非模式作物与病原物之
间相互作用的研究提供理论基础ꎮ 抗病相关基因
分为病原识别基因、信号传导基因和调控抗病反应
的基因ꎬ其中病原识别基因包括编码模式识别受体
( ｐａｔｔｅｒｎ ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ꎬＰＲＲ )的基因和Ｒ基
Ｔａｂｌｅ １ Ｔｈｅ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ Ｐ３ＩＰｓ ｂｙ ＧＳＴ ｐｕｌｌ￣ｄｏｗｎ ａｓｓａｙ
Ｕｎｉｐｒｏ ＩＤ Ｐｒｅｄｉｃｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｆｕｎｃｔｉｏｎ Ｇｅｎｅ ＩＤ (ＲＧＡＰ) ＭＷ/ ｋＤａ
Ａ２Ｘ５Ｖ４ ＡＴＰａｓｅ ａｌｐｈａ / ｂｅｔａ ｃｈａｉｎｓ ｆａｍｉｌｙ Ｕｎｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｅｄ ｇｅｎｅ ９５.０１６
Ａ２Ｙ４Ｘ９ Ｐｏｔａｓｓｉｕｍ ｃｈａｎｎｅｌ ＡＫＴ２ ＬＯＣ＿Ｏｓ０５ｇ３５４１０.１ ９１.０１７
Ａ２ＹＧＲ２ Ｌｅｕｃｉｎｅ Ｒｉｃｈ Ｒｅｐｅａｔ ｆａｍｉｌｙ ｐｒｏｔｅｉｎ ＬＯＣ＿Ｏｓ０６ｇ４８９９０.２ ３７.４０７
Ａ２ＹＸ３８ Ｒｅｔｒｏｔｒａｎｓｐｏｓｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ ＬＯＣ＿Ｏｓ０８ｇ４０７００.１ ５０.２８３
Ａ３ＡＫＨ０ ＲＮＡ－ｄｉｒｅｃｔｅｄ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ＬＯＣ＿Ｏｓ０３ｇ４２２７０.１ ８６.６９１
Ｂ８ＡＣＸ９ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ ＥＦＴｕ / ＥＦ１Ａ ＬＯＣ＿Ｏｓ０１ｇ０２７２０.１ ８６.２４７
Ｂ９ＥＶＰ５ Ｂｅｔａ－Ｄ－ｘｙｌｏｓｉｄａｓｅ ｆａｍｉｌｙ ３ ｐｒｏｔｅｉｎ ＬＯＣ＿Ｏｓ０１ｇ１９２２０.１ ５６.４９９
Ｄ０ＥＫＬ９ ＣＰ４７ ｃｈｌｏｒｏｐｈｙｌｌ ａｐｏｐｒｏｔｅｉｎ Ｕｎｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｅｄ ｇｅｎｅ １３５.４２
Ｇ４ＭＷＹ５ ＣＡＭＫ/ ＣＡＭＫＬ / ＫＩＮ４ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ Ｕｎｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｅｄ ｇｅｎｅ １０４.７８４
Ｇ４Ｎ４Ｔ４ ｔＲＮＡ ｌｉｇａｓｅ Ｕｎｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｅｄ ｇｅｎｅ ３０６.２４９
Ｇ４ＮＥＢ１ Ｕｎｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ Ｕｎｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｅｄ ｇｅｎｅ ９６.２３７
Ｇ４ＮＧＺ７ ＲＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ＩＩ Ｅｌｏｎｇａｔｏｒ ｓｕｂｕｎｉｔ Ｕｎｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｅｄ ｇｅｎｅ ４３.２９
Ｈ５ＺＸＨ７ Ｐｒｏｔｅｉｎ ｏｒｆ ３８９ꎬ ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉｏｎ Ｕｎｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｅｄ ｇｅｎｅ ４４.３６８
Ｉ１ＮＫＡ７ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｋｉｎａｓｅ ＬＯＣ＿Ｏｓ０１ｇ０５９６０.１ １３２.４９７
Ｉ１ＮＹＴ７ Ｕ２ ｓｍａｌｌ ｎｕｃｌｅａｒ ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｐｒｏｔｅｉｎ Ａ ＬＯＣ＿Ｏｓ０２ｇ１３９９０.１ ３１.６３５
Ｉ１Ｐ４Ｖ３ ＣＸＥ ｃａｒｂｏｘｙｌｅｓｔｅｒａｓｅ ＬＯＣ＿Ｏｓ０２ｇ５３９６０.１ ５５.４３６
Ｉ１ＰＢＭ０ Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ ＬＯＣ＿Ｏｓ０３ｇ２５３６０.１ １２.２８４
Ｉ１ＰＵ５６ Ｌｅｕｃｉｎｅ Ｒｉｃｈ Ｒｅｐｅａｔ ｆａｍｉｌｙ ｐｒｏｔｅｉｎ ＬＯＣ＿Ｏｓ０５ｇ２３２５０.１ ４９.９８１
Ｉ１Ｑ２３４ Ｄｉｓｅａｓｅ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ＲＰＭ１ Ｕｎｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｅｄ ｇｅｎｅ ９７.６８
Ｉ１Ｒ０Ｐ５ Ｕｎｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ (Ｆｒａｇｍｅｎｔ) Ｕｎｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｅｄ ｇｅｎｅ ４８.３７７
Ｉ１Ｒ７Ｒ３ ＷＤ４０ / ＹＶＴＮ ｄｏｍａｉｎ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ＬＯＣ＿Ｏｓ１２ｇ４１６２０ ５５.３８９
Ｐ０Ｃ２Ｚ７ ＡＴＰ ｓｙｎｔｈａｓｅ ｓｕｂｕｎｉｔ ｂｅｔａ ＬＯＣ＿Ｏｓ１０ｇ２１２６６ ７９.４５４
Ｑ０ＤＧ４８ ＡＴＰ ｓｙｎｔｈａｓｅ ｓｕｂｕｎｉｔ ｂｅｔａ ＬＯＣ＿Ｏｓ０５ｇ０５５３０ ６１.３８３
Ｑ０ＪＣＰ５ Ｕｎｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ＬＯＣ＿Ｏｓ０４ｇ０４５８４ １０.４３４
Ｑ０ＪＤＦ８ Ｕｎｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ＬＯＣ＿Ｏｓ０４ｇ０４０６３ ９.８７９
Ｑ１０ＮＷ３ Ｕｎｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ＬＯＣ＿Ｏｓ０３ｇ１５１００ ３１.４１３
Ｑ１０Ｔ６２ Ｒｅｔｒｏｔｒａｎｓｐｏｓｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ ＬＯＣ＿Ｏｓ０３ｇ０１０７０ １０１.６７６
Ｑ２ＱＴＤ７ Ｕｎｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ＬＯＣ＿Ｏｓ１２ｇ２００００ ８１.３６３
Ｑ３６６８８ Ｒｉｂｕｌｏｓｅ ｂｉｓｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ ＬＯＣ＿Ｏｓ１２ｇ１７６００ １８.８７
Ｑ７ＸＥＲ８ Ｔｒａｎｓｐｏｓａｂｌｅ ｅｌｅｍｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ＬＯＣ＿Ｏｓ１０ｇ２７０３０ ９６.４５９
Ｑ７ＸＷＬ０ Ｕｎｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ＬＯＣ＿Ｏｓ１０ｇ２２５４０ １２０.９９
Ｑ７Ｙ１９３ Ｒｅｔｒｏｔｒａｎｓｐｏｓｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ ＬＯＣ＿Ｏｓ１０ｇ３７１７０ ４４.９５５
ＯＳ: Ｏｒｇａｎｉｓｍ ｎａｍｅꎻ ＰＥ: Ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｘｉｓｔｅｎｃｅꎻ ＳＶ: Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｖｅｒｓｉｏｎꎻ ＭＧＧ: Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ ｇｒｉｓｅａ.
２８４
５期 赵 文ꎬ等:应用 ＧＳＴ ｐｕｌｌ￣ｄｏｗｎ技术筛选水稻抗稻瘟病蛋白 ＰＩＤ３互作蛋白的研究
Ｆｉｇ. ６ Ｃｏｎｆｉｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ｂｅｔｗｅｅｎ ＨＡ￣ＰＣＡ２ ａｎｄ ＧＳＴ￣ＰＩＤ３ＣＣ￣ＮＢＳ
Ａ: Ｔｈｅ ｆｕｓｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ ＨＡ￣ＰＣＡ２ ｗａｓ ｄｅｔｅｃｔｅｄ ｂｙ ａｎｔｉ￣ＨＡ ｂｕｔ ｎｏｔ ａｎｔｉ￣ＧＳＴ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｉｎ Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ ａｓｓａｙ. “ ＩＮＰＵＴ”
ｒｅｐｒｅｓｅｎｔｓ ｔｈｅ ｌｙｓａｔｅｓ ｆｒｏｍ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ｗｉｔｈ ＨＡ￣ＰＣＡ２ꎻ Ｂ: Ｔｈｅ ｆｕｓｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ ＨＡ￣ＰＣＡ２ ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ
ｗｉｔｈ ＧＳＴ￣ＰＩＤ３ＣＣ￣ＮＢＳ ｂｕｔ ｎｏｔ ＧＳＴ. ＨＡ￣ｔａｇｇｅｄ ｆｕｓｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ (ＨＡ￣ＰＣＡ２ꎬ ４００ μｇ ｉｎ ＰＢＳ) ｗａｓ ｉｎｃｕｂａｔｅｄ ｗｉｔｈ １００ μＬ
ｏｆ ＧＳＴ￣ＰＩＤ３ＣＣ￣ＮＢＳ ｂｅａｄｓ ａｎｄ ＧＳＴ￣ｖｅｃｔｏｒ ｂｅａｄｓꎬ ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙꎬ ｆｏｒ １ ｈｏｕｒ ａｔ ｒｏｏｍ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅꎬ ｔｈｅ ｐｒｏｔｅｉｎｓ
ｗｅｒｅ ｔｈｅｎ ｓｅｐａｒａｔｅｄ ｂｙ ＳＤＳ￣ＰＡＧＥ ｆｏｌｌｏｗｅｄ ｂｙ Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ ａｓｓａｙ ｕｓｉｎｇ ｔｈｅ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｓ ｉｎｄｉｃａｔｅｄ.
因ꎮ 目前ꎬ研究人员己经克隆了 ２４ 个抗稻瘟病基
因ꎬ其中 Ｐｉｂ、 Ｐｉ￣ｔａ、 Ｐｉ２、 Ｐｉｚ￣ｔ、 Ｐｉ９、 Ｐｉ３６、 Ｐｉ３７、
Ｐｉｋ￣ｍ、Ｐｉ５、Ｐｉｄ３、Ｐｉｔ 和 Ｐｉ￣ｓｈ都属于 ＣＣ￣ＮＢＳ￣ＬＲＲ
类 Ｒ基因[１~４ꎬ ７ꎬ ８ꎬ １０ꎬ １１]ꎮ 这些抗稻瘟病基因结构上
的共同性表明抗稻瘟病途径是有相通或者交汇的ꎮ
因此ꎬ可以通过探究典型的 ＣＣ￣ＮＢＳ￣ＬＲＲ 基因信
号传导途径来阐明稻瘟病抗病机制ꎮ
目前ꎬ筛选水稻抗病蛋白的体外互作蛋白的技
术手段主要依靠酵母双杂交和 ＧＳＴ ｐｕｌｌ￣ｄｏｗｎꎮ 前
人正是通过酵母双杂交实验验证了 Ｐｉｔａ 和 ＡＶＲ￣
Ｐｉｔａ的直接互作关系ꎬ并且确定了与 ＡＶＲ￣Ｐｉｔａ 结
合的部位是 Ｐｉｔａ 的 ＬＲＲ 区域[３ꎬ ４]ꎮ Ｐｕｌｌ￣ｄｏｗｎ 是
一种体外验证 ２个已知蛋白相互作用的技术ꎬ也是
筛选与已知蛋白相互作用的未知蛋白的经典技术ꎮ
近年来ꎬＧＳＴ ｐｕｌｌ￣ｄｏｗｎ 在稻瘟病抗病蛋白与其互
作蛋白的研究中得到越来越广泛的应用ꎮ
Ａｋｉｙａｍａ等[１２]和 Ｆｅｎｇ 等[１３]将水稻稻瘟病抗性相
关的碱性几丁质酶基因 ＲＣ２４ 和苜蓿 β￣１ꎬ ３￣葡聚
糖酶基因 β￣１ꎬ ３￣Ｇｌｕ同时导入水稻ꎬ利用 ＧＳＴ ｐｕｌｌ￣
ｄｏｗｎ技术从水稻中分离出一个抗稻瘟病病程相关
蛋白的新的互作蛋白ꎬ该蛋白能迅速降解稻瘟病菌
的细胞壁ꎮ 近期ꎬ国内相关研究人员表达了多个
ＲＬＫ类抗稻瘟病蛋白的激酶区的带有 ＧＳＴ 标签
的融合蛋白ꎬ通过固相磷酸化实验从水稻 ｃＤＮＡ
表达文库中筛选到 ６ 个预测为抗稻瘟病蛋白 ＰＩＤ２
作用底物的蛋白ꎬ并对 ＰＩＤ２ 抗病防卫反应早期的
响应蛋白进行了探索[１４]ꎮ
结合带有绿色荧光标记的( ｇｒｅｅｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ
ｐｒｏｔｅｉｎꎬ ＧＦＰ)稻瘟病菌 ＺＨＯＮＧ￣１０￣８￣１４ 侵染水稻
Ｐｉｄ３￣ＴＰ３０９的显微镜观察和对已知抗病反应相关
基因(ＭＡＰＫ 家族的 ＭＡＰＫ３ / ６ꎬＷＲＫＹ 家族的部
分基因以及与水杨酸、茉莉酸和植保素合成的相关
基因等)的 ＲＴ￣ＰＣＲ 分析结果ꎬ我们发现 ０ ~ ２０ ｈ
这段时间是 ＰＩＤ３ 介导的抗性反应中早期响应的
一个重要时期(待发表结果)ꎮ 因此ꎬ我们的取样
时间设定在 ２０ ｈ 内ꎮ 在接菌后的 ０、５、１０、１５ 和
２０ ｈ这 ５ 个时间点分别取样ꎬ因而ꎬ筛选出的这些
Ｐ３ＩＰｓ是更集中于水稻抗病反应早期与 ＰＩＤ３ 互作
的蛋白ꎬ这样更有利于筛选到在 ＰＩＤ３ 介导的抗性
早期反应中能直接与 ＰＩＤ３ 结合的关键因子ꎮ 在
本研究中ꎬ我们通过对水稻材料 Ｐｉｄ３￣ＴＰ３０９ 接种
稻瘟病菌的不同生理小种 ＺＨＯＮＧ￣１０￣８￣１４ 和
ＺＢ１３后分别提取总蛋白ꎬ以水稻典型的 ＣＣ￣ＮＢＳ￣
ＬＲＲ类抗稻瘟病基因 Ｐｉｄ３ 编码的 Ｒ 蛋白 (ＣＣ￣
ＮＢＳ结构域区域)作为诱饵蛋白ꎬ应用 ＧＳＴ ｐｕｌｌ￣
ｄｏｗｎ技术筛选出 ３１ 个只在抗病途径中特异地与
抗稻瘟病蛋白 ＰＩＤ３ 相互作用的候选蛋白 Ｐ３ＩＰｓꎮ
应用 ＬＣ￣ＭＳ / ＭＳ 质谱技术分析筛选出的这些
Ｐ３ＩＰｓ的氨基酸序列ꎬ结合相关数据库检索和生物
信息学预测进行比对和功能分析ꎬ结果表明ꎬ我们
筛选得到的这些 Ｐ３ＩＰｓ 与已经报道过的水稻和拟
南芥的病程相关蛋白有一定的重合ꎮ 如植物抗性
相关蛋白中的 ＳＮＡＲＥ 蛋白是一类与离子通道蛋
白互作的蛋白ꎬ能与离子通道蛋白形成复合体ꎬ共
同参与调控植物免疫反应中伴随的细胞程序性死
亡(ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ ｃｅｌｌ ｄｅａｔｈꎬ ＰＣＤ)过程ꎬ我们筛选
３８４
植物病理学报 ４５卷
的 Ｐ３ＩＰｓ蛋白中也出现了一个类似 ｉｏｎ ｔｒａｎｓｐｏｒｔ蛋
白(Ａ２Ｙ４Ｘ９: Ｐｏｔａｓｓｉｕｍ ｃｈａｎｎｅｌ ＡＫＴ２) [１５]ꎮ 最新
研究表明ꎬ参与 Ｐ￣核酸葡聚糖水解过程的 ＰＡＲＧ１
(Ｐｏｌｙ ＡＤＰ￣ｒｉｂｏｓｅ ｇｌｙｃｏｈｙｄｒｏｌａｓｅ １)在抵御病原真
菌(Ｂｏｔｒｙｔｉｓ ｃｉｎｅｒｅａ)侵害的抗性反应中有着重要
的作用ꎬ我们筛选的 Ｐ３ＩＰｓ蛋白中也出现了一个类
似的羧酸酯酶蛋白 ( Ｉ１Ｐ４Ｖ３: ＣＸＥ ｃａｒｂｏｘｙｌｅｓｔｅｒ￣
ａｓｅ) [１６]ꎮ 在我们获得 Ｐ３ＩＰｓ 中存在一个 Ｒ 蛋白
ＲＰＭ１( Ｉ１Ｑ２３４:Ｄｉｓｅａｓｅ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ＲＰＭ１)ꎬ
ＲＰＭ１与 Ａｖｒ￣Ｒｐｍ１ 的相互作用是最早在拟南芥
中证明 Ｒ 蛋白“保卫模式”的实验证据[１６]ꎮ 在寄
主植物中ꎬＲＰＭ１与 ＲＩＮ４(ＲＰＭ１ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ
４)以复合体形式存在ꎬＲＩＮ４ 抑制 ＲＰＭ１ 的活性ꎬ
来自 Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｙｒｉｎｇａｅ 的效应因子 Ａｖｒ￣Ｒｐｍ１
能磷酸化 ＲＩＮ４ 进而激活 ＲＰＭ１ 介导的抗性反
应[１７~１９]ꎮ 这些 Ｐ３ＩＰｓ中参与调控细胞程序化死亡
(Ｉ１ＰＢＭ０)、物质与能量代谢(Ｐ０Ｃ２Ｚ７、Ｑ０ＤＧ４８ 和
Ｉ１Ｐ４Ｖ３)、线粒体(Ｈ５ＺＸＨ７)和叶绿体(Ｄ０ＥＫＬ９)
功能维持、胁迫防御反应( Ｉ１Ｑ２３４ꎬＩ１ＰＵ５６)和信号
传导(Ｑ１０ＮＷ３)等生物学过程也早已被报道与植
物抗病性有着直接的联系[２ꎬ ５ꎬ ９ꎬ １１ꎬ １４~１９]ꎮ 通过对
这 ５个时间点样品的鉴定结果进行一致性分析ꎬ我
们发现有些蛋白在这 ５ 个时间点的样品鉴定结果
中都有出现ꎬ 如 Ｇ４ＮＥＢ１、 Ｈ５ＺＸＨ７、 Ｉ１ＰＢＭ０、
Ｉ１Ｒ０Ｐ５和 Ｐ０Ｃ２Ｚ７ 等ꎻ另外一些蛋白仅在这 ５ 个
时间点中的部分时间点被检测到ꎬ如 Ｉ１ＮＫＡ７、
Ｄ０ＥＫＬ９、Ａ２Ｘ５Ｖ４和 Ａ２Ｘ５Ｖ４在 １０、１５和 ２０ ｈ都
能检测到ꎬ但在 ０ ｈ和 ５ ｈ 这两个时间点的样品中
都没有检测到这几个蛋白ꎻＧ４Ｎ４Ｔ４ 在 ０、５、１０ 和
１５ ｈ都能被检测到ꎬ但在 ２０ ｈ 这个时间点没有检
测到ꎮ １５ ｈ和 ２０ ｈ这两个时间点的样品中筛选出
Ｐ３ＩＰｓ占 ６２.５％(２０ / ３２)ꎬ我们推测在 ＰＩＤ３ 介导的
抗性反应中ꎬ存在一个抗病激活的过程ꎬ经过一段
时间的响应之后ꎬ与 ＰＩＤ３ 互作的蛋白不仅在数目
上有所增加ꎬ其功能也呈现出多样化ꎮ 通过分析这
些候选 Ｐ３ＩＰｓꎬ我们发现其中的 Ｉ１Ｒ０Ｐ５、Ｑ０ＤＧ４８、
Ｉ１Ｒ７Ｒ３、Ｉ１Ｒ７Ｒ３、Ｐ０Ｃ２Ｚ７ 和 Ｑ０ＪＣＰ５ 等蛋白与目
前已经揭示的参与抗病反应相关的一些水稻中的
蛋白具有一定的序列相似性和功能重合ꎬ这也表明
了本研究结果的可靠性[２ꎬ １１ꎬ １５ꎬ ２０]ꎮ 然而拟南芥和
水稻中的 Ｒ基因分别因 ＴＩＲ￣ＮＢＳ和 ＣＣ￣ＮＢＳ结构
上的差异导致所依赖的信号传导途径也有所不
同[５ꎬ １７ꎬ １８]ꎮ ＴＩＲ￣ＮＢＳ￣ＬＲＲ 类 Ｒ 基因下游信号传
导途径中关键因子是 ＥＤＳ１( ｅｎｈａｎｃｅｄ ｄｉｓｅａｓｅ ｓｕｓ￣
ｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ)和 ＰＡＤ４ꎬ而 ＣＣ￣ＮＢＳ￣ＬＲＲ 类蛋白信号
通路的顺利表达则依赖于 ＮＤＲ１(ｎｏｎ￣ｒａｃｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃ
ｄｉｓｅａｓｅ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ)和 ＰＢＳ２ 这两个关键因子[１７ꎬ １８]ꎮ
因而我们需要更深刻地去挖掘水稻抗病反应中的
这些关键因子来阐明水稻的抗病机制ꎮ
蛋白体内互作比体外互作的关系更复杂ꎬ所以
体外验证的蛋白互作实验与体内真实互作有一定
差异性ꎮ 而 ＰＩＤ３属于典型的 ＣＣ￣ＮＢＳ￣ＬＲＲ蛋白ꎬ
该类蛋白在植物中分布广泛且结构复杂ꎮ 目前ꎬ研
究这类蛋白的复杂结构及其相应的激活方式一直
是热点ꎮ 我们之前分别构建了 Ｐｉｄ３全长融合 ＧＦＰ
和 ３ｘ ＨＡ的载体ꎬ将其转化水稻材料 ＴＰ３０９ꎬ却始
终不能在获得的阳性植株中检测到该融合蛋白的
表达ꎮ 所以我们推测 Ｐｉｄ３ 在水稻体内存在剪切ꎮ
与前人的研究不同ꎬ我们得到的这些候选 Ｐ３ＩＰｓ 都
是只在水稻抗稻瘟病反应中与 ＰＩＤ３ＣＣ￣ＮＢＳ特异结合
的蛋白ꎮ 在缓冲体系中ꎬ我们用亲和固化在 Ｇｌｕｔａ￣
ｔｈｉｏｎｅ￣Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ｂｅａｄｓ 上的 ＧＳＴ￣ＰＩＤ３ＣＣ￣ＮＢＳ 融
合蛋白作为诱饵蛋白分别与发生抗感反应后提取
的水稻总蛋白进行共孵育后进行 ＧＳＴ ｐｕｌｌ￣ｄｏｗｎꎬ
这在较大程度上保证了这种“互作关系”的真实
性ꎬ避免了单一体外蛋白互作实验的假阳性较高的
问题[２０ꎬ ２１]ꎮ 并且ꎬ我们在体外验证了 ＧＳＴ ｐｕｌｌ￣
ｄｏｗｎ 筛 选 出 的 Ｐ３ＩＰｓ 中 一 个 ＰＣＡ２ 蛋 白
(Ａ２Ｙ４Ｘ９: ｐｏｔａｓｓｉｕｍ ｃｈａｎｎｅｌ ＡＫＴ２)与 ＰＩＤ３的相
互作用ꎮ 下一步我们将通过酵母双杂交和免疫共
沉淀来验证其它候选 Ｐ３ＩＰｓ与 ＰＩＤ３ 蛋白的相互关
系ꎬ并对这些候选 Ｐ３ＩＰｓ进行相关的分子生理功能
和遗传学的研究(获得相关抑制表达和过表达转
基因材料)ꎬ揭示这些蛋白对 ＣＣ￣ＮＢＳ￣ＬＲＲ 蛋白
ＰＩＤ３ 介导的稻瘟病抗性的影响ꎬ较为详细地阐明
ＰＩＤ３介导的稻瘟病抗性的调节机理ꎮ
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责任编辑:李晖
５８４