全 文 ：书犇犗犐：１０．１１６８６／犮狔狓犫２０１５４６６ 犺狋狋狆：／／犮狔狓犫．犾狕狌．犲犱狌．犮狀
侯莉娟，齐晓，齐冬梅，陈双燕，刘公社．用于羊草基因分型的ＳＮＰ分子标记技术研究．草业学报，２０１６，２５（２）：１０５１１３．
ＨＯＵＬｉＪｕａｎ，ＱＩＸｉａｏ，ＱＩＤｏｎｇＭｅｉ，ＣＨＥＮＳｈｕａｎｇＹａｎ，ＬＩＵＧｏｎｇＳｈｅ．ＡｓｔｕｄｙｏｆＳＮＰｍｏｌｅｃｕｌａｒｍａｒｋｅｒｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙｆｏｒ犔犲狔犿狌狊犮犺犻狀犲狀狊犻狊ｇｅｎ
ｏｔｙｐｉｎｇ．ＡｃｔａＰｒａｔａｃｕｌｔｕｒａｅＳｉｎｉｃａ，２０１６，２５（２）：１０５１１３．
用于羊草基因分型的犛犖犘分子标记技术研究
侯莉娟１，齐晓２，３，齐冬梅１，陈双燕１，刘公社１
（１．中国科学院植物研究所北方资源植物重点实验室，北京１０００９３；２．中国农业科学院草原研究所，
内蒙古 呼和浩特０１００１０；３．全国畜牧总站，北京１００１２５）
摘要：以我国广泛分布的多年生优势禾本科牧草羊草为研究材料，针对羊草目前尚无ＳＮＰ标记技术的报道，基于
实验室已有的转录组数据，挖掘其中的ＳＮＰ分子标记，建立一种利用高分辨率熔解曲线（ｈｉｇｈｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎｍｅｌｔｉｎｇ，
ＨＲＭ）进行羊草ＳＮＰ基因分型的方法。结果表明，从羊草转录组数据中获得４１８４３个ＳＮＰｓ，转换的数量是颠换数
量的２倍；建立了基于ＳＮＰ的 ＨＲＭ基因分型方法，设计了１１２对ＳＮＰ引物，其中有９８对（８７．５％）能扩增出明亮
单一条带，扩增条带大小符合预期的有７２对（６４．２９％），适宜进行 ＨＲＭ 基因分型的引物有４６对，占４１．０７％；用
其中的７对引物可将羊草４８份种质区分开，并绘制出指纹图谱。通过对部分 ＨＲＭ基因分型结果进行测序验证，
表明测序分析的基因型结果与 ＨＲＭ基因分型结果一致，证明 ＨＲＭ 基因分型结果是可靠的。本研究首次建立的
基于ＳＮＰ的 ＨＲＭ基因分型方法，可用于羊草种质资源的指纹图谱绘制、育种亲本的选配、基因关联分析、分子标
记辅助育种、功能分子标记开发、新品种的保护等育种工作。
关键词：羊草；转录组；ＳＮＰ标记；ＨＲＭ基因分型；指纹图谱
犃狊狋狌犱狔狅犳犛犖犘犿狅犾犲犮狌犾犪狉犿犪狉犽犲狉狋犲犮犺狀狅犾狅犵狔犳狅狉犔犲狔犿狌狊犮犺犻狀犲狀狊犻狊犵犲狀狅狋狔狆犻狀犵
ＨＯＵＬｉＪｕａｎ１，ＱＩＸｉａｏ２，３，ＱＩＤｏｎｇＭｅｉ１，ＣＨＥＮＳｈｕａｎｇＹａｎ１，ＬＩＵＧｏｎｇＳｈｅ１
１．犓犲狔犔犪犫狅狉犪狋狅狉狔狅犳犘犾犪狀狋犚犲狊狅狌狉犮犲狊，犐狀狊狋犻狋狌狋犲狅犳犅狅狋犪狀狔，犜犺犲犆犺犻狀犲狊犲犃犮犪犱犲犿狔狅犳犛犮犻犲狀犮犲狊，犅犲犻犼犻狀犵１０００９３，犆犺犻狀犪；２．犐狀狊狋犻狋狌
狋犲狅犳犌狉犪狊狊犾犪狀犱犚犲狊犲犪狉犮犺狅犳犆犺犻狀犲狊犲犃犮犪犱犲犿狔狅犳犃犵狉犻犮狌犾狋狌狉犪犾犛犮犻犲狀犮犲狊，犎狅犺犺狅狋０１００１０，犆犺犻狀犪；３．犖犪狋犻狅狀犪犾犃狀犻犿犪犾犎狌狊犫犪狀犱狉狔
犛犲狉狏犻犮犲，犅犲犻犼犻狀犵１００１２５，犆犺犻狀犪
犃犫狊狋狉犪犮狋：犔犲狔犿狌狊犮犺犻狀犲狀狊犻狊，ｉｓａｗｉｄｅｌｙｄｉｓｔｒｉｂｕｔｅｄａｎｄｏｆｔｅｎｅｃｏｌｏｇｉｃａｌｙｄｏｍｉｎａｎｔｐｅｒｅｎｎｉａｌｇｒａｓｓｉｎＣｈｉｎａ，
ｆｒｅｑｕｅｎｔｌｙｕｓｅｄａｓｒｅｓｅａｒｃｈｍａｔｅｒｉａｌ．Ｂｅｃａｕｓｅｗｅｋｎｏｗｏｆｎｏｐｒｅｖｉｏｕｓｒｅｐｏｒｔｓｏｆｍａｒｋｅｒｓｉｎ犔．犮犺犻狀犲狀狊犻狊，ｗｅ
ｐｅｒｆｏｒｍｅｄｓｉｎｇｌｅｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ（ＳＮＰ）ｍｉｎｉｎｇｏｆ４８ｇｅｎｏｔｙｐｅｓ，ｂａｓｅｄｏｎｔｈｅｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅｄａｔａｉｎ
ｔｈｅｌａｂｏｒａｔｏｒｙａｎｄｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄａｍｅｔｈｏｄｕｓｉｎｇｈｉｇｈｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎｍｅｌｔｉｎｇ（ＨＲＭ）ｃｕｒｖｅｓｆｏｒ犔．犮犺犻狀犲狀狊犻狊ＳＮＰ
ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ．Ａｔｏｔａｌｏｆ４１８４３ＳＮＰｓｗｅｒｅｄｅｔｅｃｔｅｄｆｒｏｍｔｈｅｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅｄａｔａｂｙｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓａｎａｌｙｓｉｓ．
Ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎｓｗｅｒｅｎｅａｒｌｙｔｗｉｃｅａｓｆｒｅｑｕｅｎｔａｓｔｒａｎｓｖｅｒｓｉｏｎｓ．Ａｍｏｎｇ１１２ｐａｉｒｓｏｆｄｅｓｉｇｎｅｄＳＮＰｐｒｉｍｅｒｓ，９８ＳＮＰ
ｐｒｉｍｅｒｐａｉｒｓ（８７．５％）ｗｅｒｅａｂｌｅｔｏａｍｐｌｉｆｙｂｒｉｇｈｔｓｉｎｇｌｅｂａｎｄｓ，７２ｐｒｉｍｅｒｐａｉｒｓ（６４．２９％）ｈａｄａｓｕｉｔａｂｌｅａｍ
ｐｌｉｆｉｅｄｂａｎｄｓｉｚｅ，ａｎｄ４６ＳＮＰｐｒｉｍｅｒｐａｉｒｓ（４１．０７％）ｗｅｒｅｓｕｉｔａｂｌｅｆｏｒＨＲＭｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ．Ｔｈｅ４８ｇｅｒｍｐｌａｓｍ
ｇｅｎｏｔｙｐｅｓｏｆ犔．犮犺犻狀犲狀狊犻狊ｃｏｕｌｄｂｅｓｅｐａｒａｔｅｄｂｙ７ｐｒｉｍｅｒｐａｉｒｓａｎｄｔｈｅｆｉｎｇｅｒｐｒｉｎｔｏｆｅａｃｈｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ．Ｔｈｅｐａｒｔｉａｌ
第２５卷 第２期
Ｖｏｌ．２５，Ｎｏ．２
草 业 学 报
ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ
１０５－１１３
２０１６年２月
收稿日期：２０１５０９２９；改回日期：２０１５１０２６
基金项目：国家草品种区域试验项目－羊草新品种“三性”测试（农财发［２０１５］３６号）和国家重点基础研究发展计划（９７３计划）项目
（２０１４ＣＢ１３８７０４）资助。
作者简介：侯莉娟（１９８９），女，山西太原人，硕士。Ｅｍａｉｌ：ｊｅｎｎｉｆｅｒ＿ｈｏｕ７６２＠１６３．ｃｏｍ。齐晓（１９８２），男，河北泊头人，硕士。Ｅｍａｉｌ：ｔｑ０７ｍｍｓ
＠ｓｉｎａ．ｃｏｍ。共同第一作者Ｔｈｅｓｅａｕｔｈｏｒｓｃｏｎｔｒｉｂｕｔｅｄｅｑｕａｌｙｔｏｔｈｉｓｗｏｒｋ．
通信作者Ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇａｕｔｈｏｒ．Ｅｍａｉｌ：ｓｙｃｈｅｎ＠ｉｂｃａｓ．ａｃ．ｃｎ，ｌｉｕｇｓ＠ｉｂｃａｓ．ａｃ．ｃｎ
ＨＲＭｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇｒｅｓｕｌｔｓｗｅｒｅｖｅｒｉｆｉｅｄｂｙｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ．Ｔｈｅｒｅｓｕｌｔｓｏｆｇｅｎｏｔｙｐｅｂｙｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇａｎａｌｙｓｉｓｗｅｒｅｃｏｎ
ｓｉｓｔｅｎｔｗｉｔｈｔｈｅｒｅｓｕｌｔｓｏｆＨＲＭｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ，ｓｏｃｏｎｆｉｒｍｉｎｇｔｈａｔｔｈｅＨＲＭｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇｗａｓｒｅｌｉａｂｌｅ．ＨＲＭｆｏｒ
ＳＮＰｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇｆｉｒｓｔｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄｉｎｔｈｉｓｓｔｕｄｙｃａｎａｌｓｏｂｅｕｓｅｄｉｎｏｔｈｅｒｂｒｅｅｄｉｎｇｗｏｒｋｗｉｔｈ犔．犮犺犻狀犲狀狊犻狊，ｉｎｃｌｕ
ｄｉｎｇｐａｒｅｎｔｓｅｌｅｃｔｉｏｎ，ｇｅｎｅｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎａｎａｌｙｓｉｓ，ｍｏｌｅｃｕｌａｒｍａｒｋｅｒａｓｓｉｓｔｅｄｂｒｅｅｄｉｎｇ，ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｏｆｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ
ｍｏｌｅｃｕｌａｒｍａｒｋｅｒｓａｎｄｎｅｗｖａｒｉｅｔｙｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ．
犓犲狔狑狅狉犱狊：犔犲狔犿狌狊犮犺犻狀犲狀狊犻狊；ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅ；ＳＮＰｍａｒｋｅｒ；ＨＲＭｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ；ｆｉｎｇｅｒｐｒｉｎｔ
单核苷酸多态性（ｓｉｎｇｌｅｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓ，ＳＮＰｓ）指在个体基因组上任何一个核苷酸的变异形成
的ＤＮＡ序列多态性［１］。与其他分子标记（如ＳＳＲ）相比［２］，ＳＮＰ分子标记具有明显的优势。ＳＮＰｓ数量多，分布
广泛，多态性丰富，密度高。在植物基因组内，平均每２１ｂｐ就出现一个ＳＮＰ。一般只有两种碱基组成，是二等位
基因，只需＋／－的分析，适于快速、规模化筛查基因组。某些位于基因内部的ＳＮＰ有可能直接影响蛋白质结构
或表达水平。ＳＮＰ等位基因频率容易估计，易于基因分型，遗传稳定性比ＳＳＲ高，能够进行高通量自动化基因分
型检测［３５］。因此，ＳＮＰ被认为是应用前景最好的遗传标记之一。
随着新一代测序技术的发展，转录组测序已经成为鉴定非模式植物ＳＮＰ多态性分子标记的重要数据源。基
于转录组挖掘ＳＮＰ分子标记具有显著的优点，因为这些ＳＮＰ变异位于功能基因上，可能直接与植物表型相关。
目前基于转录组测序开发ＳＮＰ标记已在水稻（犗狉狔狕犪狊犪狋犻狏犪）、玉米（犣犲犪犿犪狔狊）、高粱（犛狅狉犵犺狌犿犫犻犮狅犾狅狉）、大麦
（犎狅狉犱犲狌犿狏狌犾犵犪狉犲）、小麦（犜狉犻狋犻犮狌犿犪犲狊狋犻狏狌犿）等作物以及苜蓿（犕犲犱犻犮犪犵狅狊犪狋犻狏犪）、高羊茅（犉犲狊狋狌犮犪犪狉狌狀犱犻狀犪
犮犲犪）和白三叶（犜狉犻犳狅犾犻狌犿狉犲狆犲狀狊）等牧草中广泛开展，开发的ＳＮＰ被广泛应用于遗传图谱构建和遗传多样性分
析中［６１３］。高分辨率熔解曲线（ｈｉｇｈｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎｍｅｌｔｉｎｇ，ＨＲＭ）是在ＰＣＲ基础上通过测定ＤＮＡ双链熔解曲线
变化来检测ＳＮＰ变异的方法。ＨＲＭ 操作简便，在ＰＣＲ结束后添加ＬＣＧｒｅｅｎ染料，通过监测升温过程中荧光
染料与ＰＣＲ扩增产物的结合情况来实现的，在升温过程中，双链解开，荧光染料从解链的分子上释放，同时荧光
强度降低，所以通过荧光强度和曲线的变化上就可以进行ＳＮＰ基因分型。该方法高度灵敏、简单有效［１４］，已经
在多倍体苜蓿、多年生黑麦草（犔狅犾犻狌犿狆犲狉犲狀狀犲）、土豆（犛狅犾犪狀狌犿狋狌犫犲狉狅狊狌犿）等物种中应用，进行基因分型和定位
性状［５，１５１６］。
羊草（犔犲狔犿狌狊犮犺犻狀犲狀狊犻狊）是我国广泛分布的具有优势的多年生禾本科牧草，目前在种质资源的精细评价和
创新利用方面还比较薄弱，亟须采用新一代ＳＮＰ分子标记技术对这些丰富的资源进行精细评价，以便发掘其中
有价值的资源，加速牧草育种工作进程。针对羊草目前尚无单核苷酸多态性ＳＮＰ标记技术的报道，本研究基于
实验室建立的羊草转录组数据，挖掘其中的ＳＮＰ分子标记，首次建立了一种基于ＳＮＰ标记的 ＨＲＭ 分析方法，
用于羊草种质资源的基因分型和精细评价。
１ 材料与方法
１．１ 材料
本研究所用到的羊草材料取自中国科学院植物研究所羊草种质资源圃，于２０１４－２０１５年进行实验。
１．２ 药品和试剂
广谱植物基因组ＤＮＡ快速提取试剂盒购自北京博迈德基因技术有限公司；ＰＣＲ扩增ｋｉｔ购自北京全式金
公司；ＬＣＧｒｅｅｎ饱和荧光染料（美国Ｉｄａｈｏ公司，货号ＢＣＨＭＡＳＹ０００５），购自思博全科技有限公司；ＬｉｇｈｔＳｃａｎ
ｎｅｒ专用矿物油为Ｓｉｇｍａ公司产品；ｐＭＤ１９Ｔｓｉｍｐｌｅ载体购自ＴａＫａＲａ公司。ＳａｎＰｒｅｐ柱式ＤＮＡ 胶回收试剂
盒购自生工生物工程上海（股份）有限公司；引物合成和克隆测序由北京诺赛基因组研究中心有限公司完成；其他
所用普通化学试剂均为国产分析纯。
１．３ 方法
１．３．１ 发掘羊草ＳＮＰ 根据实验室前期获得的羊草转录组数据，包含了丰富的组织器官和各种胁迫处理的
材料［１７２０］。采用生物信息学技术发掘羊草ＳＮＰ，首先使用ＢＷＡ软件将所有Ｃｌｅａｎｒｅａｄｓ定位到８７２１４条 Ｕｎｉ
６０１ ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ（２０１６） Ｖｏｌ．２５，Ｎｏ．２
ｇｅｎｅ上，然后利用ｓａｍｔｏｏｌｓ去ｃａｌＳＮＰ，ＢＷＡ和ｓａｍｔｏｏｌｓ均使用软件推荐的参数［２１］。
１．３．２ 设计ＳＮＰ引物 根据生物信息学分析发掘的ＳＮＰ位点，利用ＤＮＡＭＡＮ软件设计ＳＮＰ引物。具体
方法如下：首先确定ＳＮＰ位点所在序列的方向，如果序列是反向的，需要进行反向互补，然后与水稻基因组（ｈｔ
ｔｐ：／／ｒｉｃｅ．ｐｌａｎｔｂｉｏｌｏｇｙ．ｍｓｕ．ｅｄｕ／）进行ＢＬＡＳＴＮ比较，确认序列的结构，避免扩增片段跨越两个外显子。在
ＳＮＰ位点的上下游分别设计正向引物和反向引物，引物设计的参数为引物长度１８～２４ｂｐ；Ｔｍ６２～６６℃，尽可
能保证上下游引物的Ｔｍ值一致，一般不超过２℃；ＧＣ含量４０％～６０％，４５％～５５％最佳；产物大小为５０～２００ｂｐ。
１．３．３ 建立高分辨率熔解曲线方法 该方法的建立包括以下条件的摸索：筛选有效扩增的ＳＮＰ引物对，确定
ＨＲＭ－ＰＣＲ反应体系与程序，确定适宜的ＤＮＡ模板，分析ＬＣＧｒｅｅｎ染料是否对ＰＣＲ扩增有影响，优化 ＨＲＭ
熔解曲线分析。具体步骤为：首先在ＰＣＲ扩增仪（ＢｉｏＲａｄＴ１００）上进行ＰＣＲ反应，之后在反应体系内加入ＬＣ
Ｇｒｅｅｎ饱和荧光染料，并在ＰＣＲ仪内进行１ｍｉｎ短暂的错配反应，然后将ＰＣＲ产物（９６／孔板）插入ＬｉｇｈｔＳｃａｎｎｅｒ
仪器上进行ＨＲＭ分析。
１．３．４ ＨＲＭ用于羊草种质基因分型 利用建立的ＨＲＭ方法对４８份羊草种质材料进行基因分型。具体步
骤如下：以羊草基因组ＤＮＡ为模板，采用待检测ＳＮＰ引物进行ＰＣＲ扩增。ＰＣＲ反应体系１０μＬ：４０ｎｇ模板
ＤＮＡ、１．５ｍｍｏｌ／ＬＭｇ２＋、４００μｍｏｌ／ＬｄＮＴＰｓ、０．５ＵＴａｑＤＮＡ 聚合酶、１μｍｏｌ／Ｌ引物及１０×ＰＣＲｂｕｆｆｅｒ。
ＰＣＲ反应程序：９４℃预变性２ｍｉｎ；然后９４℃变性３０ｓ，７２℃复性３０ｓ，７２℃延伸３０ｓ（复性温度从７２℃到５８℃每
个循环降落１℃），然后进行３０个循环９４℃变性３０ｓ，５８℃复性３０ｓ，７２℃延伸３０ｓ，最后７２℃延伸５ｍｉｎ。之后
在ＰＣＲ扩增产物中加入１μＬＬＣＧｒｅｅｎ，然后进行９５℃３０ｓ，２５℃３０ｓ。此程序结束后，将反应产物放在Ｌｉｇｈｔ
Ｓｃａｎｎｅｒ仪器上进行 ＨＲＭ分析，对羊草不同种质进行基因分型。
１．３．５ 测序验证ＨＲＭ分型结果 选择 ＨＲＭ熔解峰和熔解曲线较理想的部分ＳＮＰ引物对扩增产物进行测
序，以验证ＨＲＭ分型结果是否可靠。具体步骤如下：将待测序ＳＮＰ引物的 ＨＲＭ不同基因分型的ＰＣＲ产物连
接到ｐＭＤ１９Ｔ载体上，转化大肠杆菌ＤＨ５α，利用ＡＢＩ３７３０测序仪进行测序，根据测序峰图和等位基因出现的
频率确定基因型，并与 ＨＲＭ基因分型结果进行比较，以验证引物基因分型的准确性。
２ 结果与分析
２．１ 从羊草转录组数据中发掘ＳＮＰ
通过对羊草转录组数据进行生物信息学分析，如
表１所示，共获得４１７８１个 ＳＮＰｓ，其中碱基颠换
（ｔｒａｎｓｖｅｒｓｉｏｎ，即嘌呤与嘧啶之间的替代）有８种形式
（ＡＣ／ＡＴ／ＣＡ／ＣＧ／ＧＣ／ＧＴ／ＴＡ／ＴＧ），共计１３０５３个；
转换（ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ，即嘌呤与嘌呤，或嘧啶与嘧啶之间的
替换）有４种形式（ＡＧ／ＧＡ／ＣＴ／ＴＣ），共计２８７２８个；
转换的数量约是颠换的２倍，符合一般规律。在８种
形式颠换和４种形式转换ＳＮＰ变异中各选取一些
ＳＮＰ位点设计引物，共设计了１１２对引物，包含１１２
个ＳＮＰ位点。
２．２ 建立 ＨＲＭ分析方法
２．２．１ ＰＣＲ体系和扩增程序 ＨＲＭ 基因分型对
模板ＤＮＡ比较敏感，为了保证模板ＤＮＡ的均质化，
表１ 羊草犛犖犘类型及引物设计情况
犜犪犫犾犲１ 犞犪狉犻狅狌狊狋狔狆犲狊狅犳犛犖犘犪狀犱犱犲狊犻犵狀犲犱
狆狉犻犿犲狉狊犻狀犔．犮犺犻狀犲狀狊犻狊
ＳＮＰ变异类型
ＴｙｐｅｓｏｆＳＮＰ
ｖａｒｉａｎｔ
ＳＮＰ变异
数目
Ｎｕｍｂｅｒｏｆ
ＳＮＰｖａｒｉａｎｔ
设计引物数目
Ｎｕｍｂｅｒｏｆ
ｄｅｓｉｇｎｅｄ
ｐｒｉｍｅｒｓ
ＡＣ或ＡＴ颠换 ＡＣｏｒＡＴｔｒａｎｓｖｅｒｓｉｏｎ ３１８４ ７
ＣＡ或ＣＧ颠换ＣＡｏｒＣＧｔｒａｎｓｖｅｒｓｉｏｎ ３３９２ １０
ＧＣ或ＧＴ颠换 ＧＣｏｒＧＴｔｒａｎｓｖｅｒｓｉｏｎ ３３７８ ７
ＴＡ或ＴＧ颠换ＴＡｏｒＴＧｔｒａｎｓｖｅｒｓｉｏｎ ３０９９ ３
ＡＧ或ＧＡ转换 ＡＧｏｒＧＡｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ １３８８５ ３８
ＣＴ或ＴＣ转换ＣＴｏｒＴＣｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ １４８４３ ４７
总数 Ｔｏｔａｌ ４１７８１ １１２
本实验所有ＤＮＡ样品采用统一试剂盒提取和纯化，然后将所有ＤＮＡ的浓度调至统一的标准浓度（本研究以浓
度４０ｎｇ／μＬ为标准）。结果发现ＤＮＡ浓度在４０～１２０ｎｇ／μＬ的范围内都能扩增出清晰明亮的条带。为了节省
ＤＮＡ量，达到多次使用的目的，将ＰＣＲ反应体系中ＤＮＡ模板浓度设定为４０ｎｇ／μＬ。ＰＣＲ反应体系中引物浓
度为１μｍｏｌ／Ｌ，与常规ＰＣＲ要求的一致，但是对于个别引物，扩增产物中如果有引物二聚体或非特异性扩增条
７０１第２５卷第２期 草业学报２０１６年
带，则将引物浓度降低至０．２５μｍｏｌ／Ｌ，可降低引物二
图１ 循环数对犘犆犚扩增产物的影响
犉犻犵．１ 犈犳犳犲犮狋狅犳犮狔犮犾犲狀狌犿犫犲狉狋狅犘犆犚狆狉狅犱狌犮狋狊
Ｍ，Ｔｒａｎｓ２ＫＰｌｕｓＩＩＤＮＡ Ｍａｒｋｅｒ；１和２，降落ＰＣＲ之后再进行２０
个循环的ＰＣＲ产物；３和４，降落ＰＣＲ之后再进行３０个循环的ＰＣＲ产
物。Ｍ，Ｔｒａｎｓ２ＫＰｌｕｓＩＩＤＮＡ Ｍａｒｋｅｒ；１ａｎｄ２，ＰＣＲｐｒｏｄｕｃｔｓｏｆ２０
ｃｙｃｌｅｓａｆｔｅｒｔｏｕｃｈｄｏｗｎＰＣＲ；３ａｎｄ４，ＰＣＲｐｒｏｄｕｃｔｓｏｆ３０ｃｙｃｌｅｓａｆｔｅｒ
ｔｏｕｃｈｄｏｗｎＰＣＲ．
聚体。
由于各引物对的Ｔｍ值和适宜退火温度不一致，
摸索每对引物的适宜退火温度比较繁琐，同时为了提
高实验效率，需要确定一个广谱稳定的ＰＣＲ扩增程
序，适合所有引物对的扩增。本研究经过摸索，设定了
１５个循环的降落ＰＣＲ，退火温度每个循环降落１℃，
从７２℃降落到５８℃，之后在５８℃的退火温度下再进
行３０个循环的扩增比较合适（图１），扩增产物清晰明
亮，提高了引物的扩增效率。
２．２．２ ＳＮＰ引物对的筛选 为了验证所合成的
ＳＮＰ引物对能否扩增出目的条带，对其进行了ＰＣＲ
扩增及电泳检测，结果如表２所示。１１２对ＳＮＰ引物
中，能够扩增出清晰明亮单一条带的引物有９８对，占８７．５％；其中，扩增条带大小符合预期的引物有７２对，占
６４．２９％。然后对７２对引物进行 ＨＲＭ 分析，以便筛选出能够用于 ＨＲＭ 基因分型的ＳＮＰ引物对。通过观察
ＨＲＭ的熔解曲线和熔解峰，发现ＨＲＭ熔解曲线有明显拐角，熔解峰高耸、单一的引物可以用于 ＨＲＭ 分析（图
２），共挑选出４６对引物可用于ＨＲＭ基因分型（表２）。
图２ 可用于犎犚犕分析的犛犖犘引物的熔解曲线和熔解峰示例
犉犻犵．２ 犈狓犪犿狆犾犲狅犳犿犲犾狋犻狀犵犮狌狉狏犲狊犪狀犱犿犲犾狋犻狀犵狆犲犪犽狊狅犳犛犖犘狆狉犻犿犲狉狆犪犻狉狊犳狅狉犎犚犕犪狀犪犾狔狊犻狊
表２ 犛犖犘引物对的筛选
犜犪犫犾犲２ 犛犮狉犲犲狀犻狀犵狅犳犛犖犘狆狉犻犿犲狉狆犪犻狉狊
项目
Ｉｔｅｍ
引物对
Ｐｒｉｍｅｒｐａｉｒｓ
单一扩增条带
Ｓｉｎｇｌｅａｍｐｌｉｆｉｅｄｂａｎｄ
单一目的条带
Ｓｉｎｇｌｅｔａｒｇｅｔｂａｎｄ
可用于 ＨＲＭ分型
ＵｓｅｄｆｏｒＨＲＭｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ
数目Ｎｕｍｂｅｒ（引物对Ｐｒｉｍｅｒｐａｉｒｓ） １１２ ９８ ７２ ４６
百分数Ｐｅｒｃｅｎｔａｇｅ（％） ８７．５０ ６４．２９ ４１．０７
８０１ ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ（２０１６） Ｖｏｌ．２５，Ｎｏ．２
２．２．３ ＬＣＧｒｅｅｎ对ＰＣＲ扩增的影响 为了检验
图３ 犔犆犌狉犲犲狀对犘犆犚扩增产物的影响
犉犻犵．３ 犈犳犳犲犮狋狊狅犳犔犆犌狉犲犲狀狅狀犘犆犚犪犿狆犾犻犮狅狀狊
Ｍ，Ｔｒａｎｓ２ＫＰｌｕｓＩＩＤＮＡＭａｒｋｅｒ；Ａ，阴性对照；Ｂ，不加染料；Ｃ，ＰＣＲ
反应前加染料；Ｄ，ＰＣＲ反应之后加染料。Ｍ，Ｔｒａｎｓ２ＫＰｌｕｓＩＩＤＮＡ
Ｍａｒｋｅｒ；Ａ，Ｎｅｇａｔｉｖｅｃｏｎｔｒｏｌ；Ｂ，Ｎｏｄｙｅ；Ｃ，ＡｄｄｉｎｇｄｙｅｂｅｆｏｒｅＰＣＲ；
Ｄ，ＡｄｄｉｎｇｄｙｅａｆｔｅｒＰＣＲ．
ＬＣＧｒｅｅｎ染料对ＰＣＲ扩增是否有影响，以确定加入
染料的时间点，本研究设置了４个ＰＣＲ反应，即不加
模板对照（Ａ）不加染料（Ｂ）、ＰＣＲ反应之前加染料（Ｃ）
和ＰＣＲ反应之后加染料（Ｄ），４个ＰＣＲ反应同时进
行，只是在染料添加的顺序上有区别。结果表明（图
３），“Ｂ”管和“Ｄ”管的电泳结果均可看到清晰明亮的条
带，而ＰＣＲ反应之前加染料“Ｃ”管的条带消失。说明
ＰＣＲ反应前加入ＬＣＧｒｅｅｎ染料对ＰＣＲ扩增结果有
影响。因此，ＬＣＧｒｅｅｎ应该在ＰＣＲ反应结束之后加
入，然后在ＰＣＲ仪中进行错配反应（９５℃３０ｓ；２５℃
３０ｓ）。
２．２．４ ＬｉｇｈｔＳｃａｎｎｅｒ检测时熔解温度范围的设定
在运行ＨＲＭ检测前，需要选择熔解温度范围，仪器
默认设置为６５～９５℃。但是对于某些引物对来说，如果将９５℃设定为右边界，熔解峰还没有绘制完，反应就结束
了。对于这样的引物对，需要增大熔解温度右边界的值，保证熔解峰的完整和分析的可靠性。仪器的最大温度为
９８℃，因此在 ＨＲＭ分析时，可以将熔解温度范围设定的尽量大一些（设定为６５～９８℃），以保证所有引物对的熔
解峰都能绘制完全。图４所示为两对代表性引物的熔解峰，Ａ代表了绝大多数引物对的ＨＲＭ熔解峰情况，在仪
器默认熔解温度范围内，而Ｂ代表了个别引物对熔解峰出现较晚的情况。
图４ 两对代表性引物对１２个犇犖犃进行犎犚犕分析的熔解峰
犉犻犵．４ 犕犲犾狋犻狀犵狆犲犪犽狊狅犳狋犺犲狋狑狅狉犲狆狉犲狊犲狀狋犪狋犻狏犲狆狉犻犿犲狉狆犪犻狉狊犳狅狉犎犚犕犪狀犪犾狔狊犻狊狋狅１２犇犖犃狊
Ａ，代表大多数引物对的ＨＲＭ熔解峰，熔解温度在８０～８５℃；Ｂ，代表个别引物，其熔解峰出现较晚。Ａ，Ｍｅｌｔｉｎｇｐｅａｋｏｆｔｈｅｍｏｓｔｐｒｉｍｅｒｐａｉｒｓｆｏｒ
ＨＲＭａｎａｌｙｓｉｓａｎｄｔｈｅｍｅｌｔｉｎｇｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅｒａｎｇｅｄｆｒｏｍ８０℃ｔｏ８５℃；Ｂ，Ｏｎｂｅｈａｌｆｏｆｉｎｄｉｖｉｄｕａｌｐｒｉｍｅｒａｎｄｉｔｓｌａｔｅｍｅｌｔｉｎｇｐｅａｋ．
２．３ 基于ＳＮＰ的ＨＲＭ对羊草种质基因分型
利用上述筛选的４６对ＨＲＭ引物对，利用其中７对引物（代表基因分型少，４组；基因分型中等，５～７组；基
９０１第２５卷第２期 草业学报２０１６年
因分型较多，８组）对羊草４８个种质进行了基因分型，结果表明使用这７对引物就可以将羊草４８个种质区分开，
绘制出指纹图谱。如图５所示，不同引物对的分型结果用不同的颜色区分；同一引物对的分型结果用数据条长短
区分，数据条长度相同的种质，基因型一致，数据条长度不同的种质，表明在基因分型时被分到不同的组别。举例
来说，ＹＣ１和ＹＣ２两份种质，除了ＳＮＰ４２引物变异位点存在差异之外，其余６个ＳＮＰ引物变异位点均没有差
异，表明这两份种质的差异较小；而ＹＣ２２和ＹＣ２３两份种质，７个ＳＮＰ引物的变异位点均存在差异，表明它们的
差异较大。
图５ 利用７对犛犖犘引物对羊草４８个种质绘制的指纹图谱
犉犻犵．５ 犉犻狀犵犲狉狆狉犻狀狋狊狅犳４８犔．犮犺犻狀犲狀狊犻狊犇犖犃狌狊犻狀犵７犛犖犘狆狉犻犿犲狉狆犪犻狉狊
２．４ 测序验证ＨＲＭ分型结果
根据上述 ＨＲＭ 分型结果，挑选了３对代表性ＳＮＰ引物，对其扩增产物进行测序以验证 ＨＲＭ 分型结果。
从每对引物的每个分组（代表一个基因型）中挑选一个样品进行测序，通过对测序克隆峰图的分析及克隆间的序
列比对，统计ＳＮＰ位点的碱基及其频率，确定其对应的基因型。测序结果发现（表３），除了目标ＳＮＰ位点的变异
０１１ ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ（２０１６） Ｖｏｌ．２５，Ｎｏ．２
外，还出现了其他位点的ＳＮＰ变异；对每对引物所扩增产物的ＳＮＰ变异位点基因型进行分析，发现不同羊草种
质的基因型都不一致，这与 ＨＲＭ 分型结果一致。以ＳＮＰ２为例，ＨＲＭ 将羊草种质ＹＣ３，ＹＣ５和ＹＣ１２分型到
ａ，ｂ和ｃ组中，而测序结果表明，３个种质的目标位点６７基因型一致，但其他变异位点６３和６９的基因型有差异。
因此，测序数据证明ＨＲＭ分型结果是可靠的。
表３ ３对引物扩增产物犛犖犘变异位点的基因型
犜犪犫犾犲３ 犌犲狀狅狋狔狆犲狊狅犳犛犖犘犿狌狋犪狋犻狅狀狊犻狋犲狊犳狉狅犿狋犺犲犪犿狆犾犻犳犻犲犱狆狉狅犱狌犮狋狊狅犳狋犺狉犲犲狆狉犻犿犲狉狆犪犻狉狊
ＳＮＰ引物
ＳＮＰｐｒｉｍｅｒ
ｐａｉｒｓ
产物大小
Ｐｒｏｄｕｃｔｓｉｚｅ
（ｂｐ）
羊草种质
犔．犮犺犻狀犲狀狊犻狊
ｇｅｒｍｐｌａｓｍ
ＨＲＭ分型结果
ＨＲＭｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ
ｒｅｓｕｌｔｓ
目标ＳＮＰ位点基因型
Ｇｅｎｏｔｙｐｅｓｏｆｔａｒｇｅｔ
ＳＮＰｓｉｔｅ
其他变异位点基因型
Ｇｅｎｏｔｙｐｅｓｏｆｏｔｈｅｒ
ｍｕｔａｔｉｏｎｓｉｔｅｓ
ＳＮＰ２ １００ ＹＣ３ ａ 位点Ｓｉｔｅ６７（Ｇ－Ｔ）ＧＧＧＴ 无变异 Ｎｏｖａｒｉａｔｉｏｎ
ＹＣ５ ｂ 位点Ｓｉｔｅ６７（Ｇ－Ｔ）ＧＧＧＴ 位点Ｓｉｔｅ６３（Ａ－Ｔ）ＡＡＡＴ
ＹＣ１２ ｃ 位点Ｓｉｔｅ６７（Ｇ－Ｔ）ＧＧＧＴ 位点Ｓｉｔｅ６３（Ａ－Ｔ）ＡＡＡＴ
位点Ｓｉｔｅ６９（Ｔ－Ｇ）ＴＴＴＧ
ＳＮＰ１４ １４２ ＹＣ１０ ａ 位点Ｓｉｔｅ３８（Ｃ－Ｔ）ＣＣＣＴ 位点Ｓｉｔｅ９８（Ｇ－Ｃ）ＧＧＧＣ
ＹＣ３ ｂ 位点Ｓｉｔｅ３８（Ｃ－Ｔ）ＣＣＣＣ 无变异 Ｎｏｖａｒｉａｔｉｏｎ
ＹＣ３１ ｃ 位点Ｓｉｔｅ３８（Ｃ－Ｔ）ＣＣＣＣ 位点Ｓｉｔｅ９８（Ｇ－Ｃ）ＣＣＣＣ
ＹＣ２８ ｄ 位点Ｓｉｔｅ３８（Ｃ－Ｔ）ＣＣＣＴ 位点Ｓｉｔｅ９８（Ｇ－Ｃ）ＧＧＧＣ
位点Ｓｉｔｅ４７（Ｃ－Ｔ）ＣＣＴＴ
ＹＣ１８ ｅ 位点Ｓｉｔｅ３８（Ｃ－Ｔ）ＣＣＣＴ 位点Ｓｉｔｅ９８（Ｇ－Ｃ）ＧＣＣＣ
位点Ｓｉｔｅ８７（Ｇ－Ａ）ＧＡＡＡ
ＹＣ３５ ｆ 位点Ｓｉｔｅ３８（Ｃ－Ｔ）ＣＴＴＴ 位点Ｓｉｔｅ９８（Ｇ－Ｃ）ＧＧＧＣ
ＹＣ２４ ｇ 位点Ｓｉｔｅ３８（Ｃ－Ｔ）ＣＴＴＴ 位点Ｓｉｔｅ９８（Ｇ－Ｃ）ＧＧＧＣ
位点Ｓｉｔｅ８７（Ｇ－Ａ）ＧＧＧＡ
ＹＣ３０ ｈ 位点Ｓｉｔｅ３８（Ｃ－Ｔ）ＣＣＴＴ 位点Ｓｉｔｅ９８（Ｇ－Ｃ）ＧＧＣＣ
ＳＮＰ４１ １４１ ＹＣ４ ａ 位点Ｓｉｔｅ１１１（Ｇ－Ｃ）ＣＣＣＣ 无变异 Ｎｏｖａｒｉａｔｉｏｎ
ＹＣ２２ ｂ 位点Ｓｉｔｅ１１１（Ｇ－Ｃ）ＧＧＧＣ 无变异 Ｎｏｖａｒｉａｔｉｏｎ
ＹＣ１２ ｃ 位点Ｓｉｔｅ１１１（Ｇ－Ｃ）ＧＧＣＣ 位点Ｓｉｔｅ３３（Ｃ－Ｇ）ＣＣＧＧ
ＹＣ２９ ｄ 位点Ｓｉｔｅ１１１（Ｇ－Ｃ）ＧＧＣＣ 位点Ｓｉｔｅ８１（Ｇ－Ａ）ＧＧＡＡ
ＹＣ３７ ｅ 位点Ｓｉｔｅ１１１（Ｇ－Ｃ）ＣＣＣＣ 位点Ｓｉｔｅ５７（Ｇ－Ｔ）ＧＧＴＴ
ＹＣ８ ｆ 位点Ｓｉｔｅ１１１（Ｇ－Ｃ）ＧＧＣＣ 位点Ｓｉｔｅ３３（Ｃ－Ｇ）ＣＣＧＧ
位点Ｓｉｔｅ７８（Ｃ－Ｔ）ＣＣＴＴ
位点Ｓｉｔｅ６０（Ｔ－Ｃ）ＴＴＴＣ
ＹＣ２３ ｇ 位点Ｓｉｔｅ１１１（Ｇ－Ｃ）ＣＣＣＣ 位点Ｓｉｔｅ２７（Ｇ－Ｔ）ＧＧＴＴ
ＹＣ７ ｈ 位点Ｓｉｔｅ１１１（Ｇ－Ｃ）ＧＧＧＣ 位点Ｓｉｔｅ３３（Ｃ－Ｇ）ＣＧＧＧ
位点Ｓｉｔｅ７８（Ｃ－Ｔ）ＣＣＣＴ
３ 讨论
近年来随着高通量测序技术的飞速发展，各类生物信息学软件的开发，使得ＳＮＰ分子标记的开发更便捷。
对于多倍体或没有参考基因组的物种来说，利用新一代高通量转录组测序技术可大量鉴定ＳＮＰ［２２］。目前，利用
转录组测序技术已经在水稻、玉米、高粱、大麦和小麦等农作物以及苜蓿、高羊茅和白三叶等牧草中鉴定到大量的
ＳＮＰ［６１３］。本研究通过生物信息学分析从羊草转录组测序数据中挖掘出４１８４３个ＳＮＰｓ，表明转录组测序是从多
倍体非模式植物中获得大量ＳＮＰ的有效方法。
１１１第２５卷第２期 草业学报２０１６年
ＨＲＭ分析是一种快速扫描ＰＣＲ扩增产物内ＳＮＰ变异的高度灵敏、简单有效的方法［１４］。该技术已经成功
应用于同源四倍体植物苜蓿和土豆的ＳＮＰ基因分型和多态性检测，并且在发现变异、分析候选基因、比较和关联
定位的基因分型等育种工作中也有很好地应用潜力［５，１６］。本研究利用羊草转录组中发掘的ＳＮＰ，在ＳＮＰ引物的
设计，ＨＲＭ－ＰＣＲ反应体系与程序，ＬＣＧｒｅｅｎ染料对ＰＣＲ扩增的影响，ＨＲＭ熔解曲线分析等方面进行了摸索
与优化，建立了基于ＥＳＴ－ＳＮＰ的羊草ＨＲＭ分型方法，与前人研究相比［５，１６］，本研究最大的特点是确定了一个
广谱稳定的ＰＣＲ扩增程序，提高了实验效率，并且利用 ＨＲＭ 分析成功对羊草进行了ＳＮＰ基因分型，通过测序
验证ＨＲＭ分型是可靠的。
羊草是异源四倍体，假设基因内某一位点的碱基出现变异，例如Ｃ突变成Ｔ，则这一位点理论上有５种基因
型：ＣＣＣＣ、ＣＣＣＴ、ＣＣＴＴ、ＣＴＴＴ、ＴＴＴＴ。因此对于有１个ＳＮＰ变异位点的引物对来说，其扩增产物在ＳＮＰ位
点的基因型理论上是５种。如果一对ＳＮＰ引物有２个ＳＮＰ变异位点（每个变异位点理论上有５种基因型），理
论上能区分５２＝２５个羊草基因型。本研究通过测序发现，ＳＮＰ２、ＳＮＰ１４和ＳＮＰ４１引物对扩增产物中，除了转录
组数据中发掘的目标ＳＮＰ位点外，还有其他ＳＮＰ变异位点，分别有３，４和７个ＳＮＰ变异位点，因此，理论上可
以区分５３，５４ 和５７ 个羊草基因型。但是，由于受供检测的羊草基因型的限制，以及 ＨＲＭ 软件最大分组的限制
（最高分组为８组，超过８组的基因型被分在未知组中），ＨＲＭ实际基因分型能力远远没有达到理论水平。随着
ＨＲＭ软件的改进，该技术在基因分型能力上可大大提高。
ＳＮＰ在育种中的应用非常广泛，包括遗传多样性分析、等位基因挖掘、高分辨率遗传连锁图谱构建、ＱＴＬ定
位、标记辅助选择、品种鉴定等。本研究所获得的ＳＮＰ来源于羊草转录本，对应基因，可利用这些ＳＮＰ与田间表
型性状进行关联分析，发现与重要性状关联的ＳＮＰ标记。还可以用来进行羊草亲本选配、发展功能分子标记、用
于羊草分子标记辅助育种、构建指纹图谱及用于羊草育成新品种的保护等，从而推进羊草分子育种工作的进程。
犚犲犳犲狉犲狀犮犲狊：
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ｉｎｈｅｘａｐｌｏｉｄｂｒｅａｄｗｈｅａｔ（犜狉犻狋犻犮狌犿犪犲狊狋犻狏狌犿Ｌ．）．ＰｌａｎｔＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙＪｏｕｒｎａｌ，２０１１，９（９）：１０８６１０９９．
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（犉犲狊狋狌犮犪犪狉狌狀犱犻狀犪犮犲犪Ｓｃｈｒｅｂ）．ＢＭＣＧｅｎｏｍｉｃｓ，２０１２，１３：２１９．
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ｈｏｍｅｏｌｏｇｓｐｅｃｉｆｉｃｓｉｎｇｌｅｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓｉｎａｌｏｔｅｔｒａｐｌｏｉｄｗｈｉｔｅｃｌｏｖｅｒ．ＢＭＣＧｅｎｏｍｉｃｓ，２０１３，１４：１００．
２１１ ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ（２０１６） Ｖｏｌ．２５，Ｎｏ．２
［１４］ ＣｈｏＭ Ｈ，ＣｉｕｌａＤ，ＫｌａｎｄｅｒｍａｎＢＪ，犲狋犪犾．Ｈｉｇｈｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎｍｅｌｔｉｎｇｃｕｒｖｅａｎａｌｙｓｉｓｏｆｇｅｎｏｍｉｃａｎｄｗｈｏｌｅｇｅｎｏｍｅａｍｐｌｉｆｉｅｄ
ＤＮＡ．ＣｌｉｎｉｃａｌＣｈｅｍｉｓｔｒｙ，２００８，５４：２０５５２０５８．
［１５］ ＳｔｕｄｅｒＢ，ＪｅｎｓｅｎＬ，ＦｉｌＡ，犲狋犪犾．‘‘Ｂｌｉｎｄ’’ｍａｐｐｉｎｇｏｆｇｅｎｉｃＤＮＡｓｅｑｕｅｎｃｅｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓｉｎ犔狅犾犻狌犿狆犲狉犲狀狀犲Ｌ．ｂｙｈｉｇｈ
ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎｍｅｌｔｉｎｇｃｕｒｖｅａｎａｌｙｓｉｓ．ＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｒｅｅｄｉｎｇ，２００９，２４：１９１１９９．
［１６］ ｄｅＫｏｅｙｅｒＤ，ＤｏｕｇｌａｓｓＫ，ＭｕｒｐｈｙＡ，犲狋犪犾．ＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｏｆｈｉｇｈｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎＤＮＡｍｅｌｔｉｎｇｆｏｒｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇａｎｄｖａｒｉａｎｔｓｃａｎｎｉｎｇ
ｏｆｄｉｐｌｏｉｄａｎｄａｕｔｏｔｅｔｒａｐｌｏｉｄｐｏｔａｔｏ．ＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｒｅｅｄｉｎｇ，２０１０，２５：６７９０．
［１７］ ＣｈｅｎＳＹ，ＨｕａｎｇＸ，ＹａｎＸＱ，犲狋犪犾．Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅａｎａｌｙｓｉｓｉｎｓｈｅｅｐｇｒａｓｓ：ａｄｏｍｉｎａｎｔｐｅｒｅｎｎｉａｌｇｒａｓｓｏｆｔｈｅＥｕｒａｓｉａｎ
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ｖａｌｕａｂｌｅｒｅｓｏｕｒｃｅｆｏｒｕｎｄｅｒｓｔａｎｄｉｎｇｔｈｅｍｅｃｈａｎｉｓｍｓｏｆｐｏａｃｅａｅｓｅｌｆｉｎｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ．ＢＭＣＧｅｎｏｍｉｃｓ，２０１４，１５：３９９．
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３１１第２５卷第２期 草业学报２０１６年