全 文 ：书藏系绵羊瘤胃细菌数量及其放牧地
牧草养分随季节变化的研究
淡瑞芳１，张海涛１，龙瑞军２，３，丁学智４，张欣５
（１．江苏畜牧兽医职业技术学院，江苏 泰州２２５３００；２．兰州大学青藏高原生态系统管理国际中心，甘肃 兰州７３００２０；３．兰州大学草地农业
科技学院，甘肃 兰州７３００２０；４．中国科学院西北高原生物所，青海 西宁８１０００８；５．天津农学院基础科学系，天津３００３８４）
摘要：试验分别于春、夏、秋和冬季，随机选择３只同群常年放牧健康的藏系绵羯羊（２岁），屠宰后采集瘤胃内容物。
采用瘤胃细菌通用引物和实时定量ＰＣＲ技术，研究瘤胃细菌数量随季节的动态变化。结果表明，１）夏季瘤胃细菌
数量显著（犘＜０．０５）高于其他３个季节，分别是春季、秋季、冬季细菌数量的５．５６，２．３５和２．４９倍；秋、冬季是春季
细菌数量的２．３８和２．２３倍；而秋和冬季瘤胃细菌的数量差异不显著（犘＞０．０５）。２）夏季藏系绵羊采食量分别为
春季、冬季和秋季的１．９８，１．６１和１．８０倍，饲料中的纤维性物质含量增高，采食量也随着降低，瘤胃细菌的数量也
相应降低；３）实时定量ＰＣＲ技术能准确的反映出放牧藏系绵羊瘤胃细菌数量随季节的动态变化。
关键词：实时定量ＰＣＲ；藏系绵羊；季节；瘤胃细菌数量
中图分类号：Ｓ８２６ 文献标识码：Ａ 文章编号：１００４５７５９（２００９）０１０１０００５
在瘤胃微生态环境中，细菌的数量非常大，并在瘤胃发酵中起着决定性作用。反刍动物瘤胃微生态受日粮、
年龄、抗生素、寄主动物的体况及地域、季节和饲养方式的影响。藏系绵羊是一种适应高原的特殊环境下生长的
动物，以自然牧草为唯一的饲料原料，其瘤胃微生物区系及数量随季节变化的研究鲜见报道，仅见姚军等［１］对藏
系绵羊瘤胃纤毛虫种群动态受季节影响的报道。实时定量ＰＣＲ技术是以分子为基础的研究方法，用于重要菌群
和菌种的量化，常用来定量瘤胃细菌的单一菌种［２～４］和瘤胃原虫［５，６］。其原理是利用能特异标记ＰＣＲ产物的荧
光物质，显示ＰＣＲ产物的动态累积，得到Ｓ型的扩增曲线；假设该曲线的前期ＰＣＲ符合指数性扩增，于是在单纯
指数方程的基础上，通过比较产物积累的速度（时间）来间接比较（进而确定）初始模板的分子数。本试验以藏系
绵羊瘤胃细菌为研究对象，通过实时定量ＰＣＲ技术来探讨藏系绵羊瘤胃细菌数量随季节的动态变化，为高寒草
地放牧动物的补饲及瘤胃营养调控提供科学依据。
１ 材料与方法
１．１ 材料
１．１．１ 材料来源 试验羊来自于青海省三角城种羊场。
１．１．２ 标准ＤＮＡ来源及ＰＣＲ扩增引物 标准ＤＮＡ与ＰＣＲ扩增引物均来源于国际原子能机构。ＰＣＲ引物：
前引物：５′ＴＴＣＧＧＴＧＧＡＴＣＤＣＡＲＡＧＲＧＣ３′
后引物：５′ＧＢＡＲＧＴＣＧＷＡＷＣＣＧＴＡＧＡＡＴＣＣ３′
１．２ 试验设计
分别于２００４－２００５年的春季（５月）、夏季（８月）、秋季（１０月）和冬季（１月），随机选择３只同群常年放牧健
康的藏系绵羯羊（２岁），屠宰后采集瘤胃内容物。采集的瘤胃液样品置于－７０℃冻存；分析时，解冻样品，用于
ＤＮＡ的提取；同时采集牧草样本，备测定。
１．３ 主要试剂及仪器
聚乙烯吡咯烷酮（ＰＶＰＰ）、十六烷基三甲溴化胺（ＣＴＡＢ）和琼脂糖购自美国Ｓｉｇｍａ公司、荧光染料（ＴＯＹＯ
１００－１０４
２００９年２月
草 业 学 报
ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ
第１８卷 第１期
Ｖｏｌ．１８，Ｎｏ．１
收稿日期：２００８０５０９；改回日期：２００８１１１２
基金项目：ＩＡＥＡ／ＦＡＯ（ＣＰＲ１２６６６／ＲＯ）资助。
作者简介：淡瑞芳（１９７４），女，山西河曲人，讲师，博士。Ｅｍａｉｌ：ｄａｎｒｅｉｆａｎｇ＠１２６．ｃｏｍ
通讯作者。Ｅｍａｉｌ：ｌｏｎｇｒｕｉｊｕｎ＠ｓｉｎａ．ｃｏｍ
ＢＯＣＯ．，ＬＴＤ．日本）。其他国内生产的化学试剂均为分析纯级、实时定量ＰＣＲ仪（ＢＩＯＲＡＤ，美国）。
１．４ 测定方法
１．４．１ 牧草营养成分的测定 利用放牧前后产草量的差额来计算每只羊的放牧采食量［７］；采用尼龙袋法［８，９］和
产气法［７］测定牧草的消化率，消化能；根据文献［１０］测定方法对牧草样的２种营养成分进行分析［分别是粗蛋白
质（ＣＰ）、酸性洗涤纤维（ＡＤＦ）］。
１．４．２ 瘤胃内容物ＤＮＡ提取及定量ＰＣＲ扩增 ＤＮＡ提取方法：冻融法，具体方法见瘤胃微生物总ＤＮＡ快速
提取法研究［１１］，获得瘤胃微生物总ＤＮＡ。
定量ＰＣＲ扩增：扩增反应总体积为２０μＬ，包含实时定量ＰＣＲ荧光染料混合液（包括荧光染料、Ｔａｑ酶、
ｄＮＴＰ、缓冲液）１０μＬ、引物各（１０μｍｏｌ／Ｌ）０．６μＬ、模板ＤＮＡ４（稀释１００倍后）μＬ、ｄｄＨ２Ｏ４．４８μＬ。
ＰＣＲ循环参数为：９５℃预变性３ｍｉｎ；９５℃变性３０ｓ，６０℃退火３０ｓ，７２℃延伸３０ｓ，４０个循环；７２℃后延伸
７ｍｉｎ。
采用标准曲线法对瘤胃细菌数量进行绝对定量：用ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ?ｓｏｆｔｗａｒｅｖｅｒｓｉｏｎ３．１计算出样品瘤胃细
菌ＤＮＡ的循环值（犆狋），以犆狋值和由不同浓度的标准ＤＮＡ基因质量数的对数为纵坐标和横坐标产生标准曲线。
１．５ 数据分析
采用ＳＰＳＳ１２．０统计软件中ＣｏｍｐａｒｅＭｅａｎｓ法对数据进行单因子方差分析，差异显著时用ＬＳＤ法进行多
重比较。
２ 结果与分析
２．１ 高寒草地牧草营养动态
随季节的变化，牧草营养成分ＣＰ夏季最高，达到１１．０６％，极显著（犘＜０．０１）高于春、冬季，显著（犘＜０．０５）
高于秋季；牧草的ＤＥ含量夏、秋季均显著（犘＜０．０５）高于春季和冬季，而牧草的ＡＤＦ春、冬季分别显著（犘＜
０．０５）、极显著（犘＜０．０１）高于秋季和夏季，ＡＤＦ含量夏季最低，达到３７．７８％，冬、春季节差异不显著（犘＞０．０５）
（表１）。
表１ 不同季节牧草的养分
犜犪犫犾犲１ 犉狅狉犪犵犲狀狌狋狉犻狋犻狅狀犫狔犵狉犪狕犻狀犵狊犺犲犲狆犻狀犱犻犳犳犲狉犲狀狋狆犲狉犻狅犱狊
项目Ｉｔｅｍ 春季Ｓｐｒｉｎｇ 夏季Ｓｕｍｍｅｒ 秋季Ａｕｔｕｍｎ 冬季 Ｗｉｎｔｅｒ
粗蛋白ＣＰ（％） ４．９４±０．６９Ｃ １１．０６±１．２４Ａａ ８．９１±１．３４Ｂｂ ６．３０±０．１８Ｃ
消化能ＤＥ（ＭＪ／ｋｇ） ７．６８±０．３６ｂ ９．４２±１．２９ａ ９．６６±１．３９ａ ７．３２±１．７ｂ
酸性洗涤纤维ＡＤＦ（％） ４２．４７±２．５４Ａａ ３７．７８±２．３４Ｂｃ ４０．６６±４．８４ＡＢｂ ４３．４０±３．３１Ａａ
注：同行数字标注有不同大写字母为差异极显著（犘＜０．０１），不同小写字母为差异显著（犘＜０．０５），相同的大、小写字母为差异不显著（犘＞０．０５）。
下同。
Ｎｏｔｅ：Ｖａｌｕｅｓｓｕｆｆｉｘｅｄｗｉｔｈｄｉｆｆｅｒｅｎｔｃａｐｉｔａｌｌｅｔｔｅｒｓｗｉｔｈｉｎｏｎｅｒｏｗｍｅａｎｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅａｔ犘＜０．０１，ａｎｄｄｉｆｆｅｒｅｎｔｓｍａｌｌｅｔｔｅｒｗｉｔｈｉｎｏｎｅ
ｒｏｗｍｅａｎｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅａｔ犘＜０．０５，ａｎｄｓａｍｅｃａｐｉｔａｌｌｅｔｔｅｒｓａｎｄｓｍａｌｌｅｔｔｅｒｗｉｔｈｉｎｏｎｅｒｏｗｍｅａｎｎｏｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅａｔ犘＞０．０５
（ＬＳＤｔｅｓｔ）．Ｔｈｅｓａｍｅｂｅｌｏｗ．
２．２ 不同季节放牧绵羊采食量动态
放牧藏系绵羊代谢体重夏、秋季显著（犘＜０．０５）高于冬、春季节，秋季显著（犘＜０．０５）高于夏季，而冬季与春
季差异不显著（犘＞０．０５）。但放牧的藏系绵羊采食量的最大值是在夏季，为１１５．７５ｇ／（ｋｇＷ０．７５·ｄ）（表２），其采
食量分别为春季、冬季和秋季的１．９８，１．６１和１．８０倍。秋季采食量极显著（犘＜０．０１）高于春季和冬季。而在春
季和冬季绵羊的采食量分别为５８．５１和６４．３２ｇ／（ｋｇＷ０．７５·ｄ），这２个季节绵羊的采食量很接近。而各季间，牧
草干物质消化率差异不显著（犘＞０．０５）。由于放牧草场的牧草种类和不同季节牧草养分差异，使的春季到冬季
（从冬春季草场到夏秋草场）放牧绵羊采食量变异系数分别是１２．１９％，１１．１２％，８．００％和１３．３０％。
１０１第１８卷第１期 草业学报２００９年
表２ 放牧绵羊采食量和消化率
犜犪犫犾犲２ 犜犺犲犇犕犻狀狋犪犽犲狊犪狀犱狋犺犲狉犪狋犪狅犳犱犻犵犲狊狋犻犫犻犾犻狋狔犫狔犵狉犪狕犻狀犵狊犺犲犲狆犻狀犱犻犳犳犲狉犲狀狋狊犲犪狊狅狀狊（犇犕）
项目Ｉｔｅｍ 春季Ｓｐｒｉｎｇ 夏季Ｓｕｍｍｅｒ 秋季Ａｕｔｕｍｎ 冬季 Ｗｉｎｔｅｒ
代谢体重 ＭＷ （Ｗ０．７５） １０．６３±０．４８ｃ １３．９８±０．７３ｂ １４．８２±０．６１ａ １０．６２±０．５６ｃ
消化率ＡＤ（％） ４８．８１±８．２５ａ ５２．０７±１．０３ａ ５１．４３±３．０５ａ ５０．２８±１．２３ａ
采食量ＤＭｉｎｔａｋｅｓ（ｇ／ｋｇＷ０．７５·ｄ） ５８．５１±１．０６Ｃ １１５．７５±６．４２Ａ ７１．７１±２．１７Ｂ ６４．３２±２．０６Ｃ
采食量变异系数ＣＶ（％） １２．１９ １１．１２ ８．００ １３．３０
２．３ 瘤胃细菌实时定量ＰＣＲ标准曲线
以犆狋值和由不同浓度的标准ＤＮＡ基因质量数的对数为纵坐标和横坐标产生的标准曲线，二者的回归方程
为：狔＝－３．３５７狓＋１６．８３２，其相关回归系数（狉）为０．９７８，斜率为－３．３５７，ＰＣＲ扩增效率为９８．６％。相关回归系
数（０．９８３）、斜率（－３．３５７）与的理想的标准曲线十分接近。根据该标准曲线，样品定量范围大约在１０－３～１０２
ｎｇ。
２．４ 不同季节瘤胃细菌数量的变化
通过实时定量ＰＣＲ和ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒｓｙｓｔｅｍ技术定量研究瘤胃细菌随季节的变化规律，结果表明，春、夏、秋
和冬季瘤胃细菌扩增循环值（犆狋）分别为１７．８４，１６．６４，１７．９２和１９．０３（图１），瘤胃内细菌质量数分别为（３．０６±
０．０８），（１７．００±０．２０），（６．８１±０．０３）和（７．２４±０．３５）ｎｇ。夏季由于动物采食大量营养丰富的牧草，因而其瘤胃
内细菌数量明显高于其他３个季节，分别是春季、冬季和秋季的５．５６，２．３５和２．４９倍；秋季和冬季瘤胃细菌数量
变化不明显（犘＞０．０５）。
在本次样品测定中，以犆狋值和由不同浓度的标准ＤＮＡ基因质量数的对数为纵坐标和横坐标产生的标准曲
线，二者的回归方程为：狔＝－３．３５６狓＋１６．８１８，其相关回归系数（狉）为０．９８３，斜率为－３．３５６，ＰＣＲ扩增效率为
９８．６％。斜率与理想的标准曲线斜率（－３．３２２）十分接近，说明用该标准曲线对未知浓度样品的定量结果十分可
靠。结果显示，不同模板浓度均获得成功且有效的扩增。说明根据该标准曲线可对在４０ｎｇ～１００ｆｇ内模板量进
行精确有效的定量。
图１ 瘤胃细菌通用引物扩增瘤胃细菌犇犖犃曲线
犉犻犵．１ 犇犻犳犳犲狉犲狀狋犻犪犾犪犿狆犾犻犳犻犮犪狋犻狅狀狅犳狉狌犿犲狀犫犪犮狋犲狉犻犪犇犖犃狋犲犿狆犾犪狋犲狊狑犻狋犺犫狉狅犪犱犫犪犮狋犲狉犻犪狆狉犻犿犲狉狊
２０１ ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ（２００９） Ｖｏｌ．１８，Ｎｏ．１
３ 讨论
３．１ 标准曲线的制备对瘤胃细菌数量的影响
本研究中犆狋值和由不同浓度的标准ＤＮＡ基因质量数的对数为纵坐标和横坐标产生的标准曲线，所得的回
归公式中，相关回归系数（０．９８３）、斜率（－３．３５７）与的理想的标准曲线十分接近。一般理想的标准曲线是，线性
范围广，１３～３３个循环都能测出，相对量覆盖１～１０６。斜率越接近－３．３２２，越理想；ＰＣＲ扩增效率越接近
１００％，越准确；一致系数越接近１．０００，此曲线越可信。一般标准曲线的斜率值在－３．０～－３．６、ＰＣＲ扩增效率
在９０％～１００％、一致系数在０．９０以上，均可接受。
由对数输入和循环阈值产生的标准曲线显示出二者的线性关系，线性范围虽然在１０－３～１０２，但标准点有７
个，使得这个范围内的定量更可靠。这表明该曲线和产生该标准曲线的体系完全符合本试验的要求。
３．２ 不同季节牧草营养对微生物数量的影响
瘤胃中的氨浓度、能量浓度、基质特性、稀释率及能量与氨的同步释放等是影响瘤胃微生物合成强度的主要
因素，而季节对瘤胃微生物的影响实际上仍是饲料对其的影响，由于不同季节的饲料成分不同，从而影响瘤胃微
生物合成强度，导致微生物群落和组成的变化。试验结果表明，夏季瘤胃中的细菌数量是春、秋、冬的５．５６，２．４９
和２．３５倍。这是由于夏季牧草中粗蛋白水平和植物组织中非结构性碳水化合物含量高于秋季和冬季，尤其是禾
本科植物［１２］，放牧藏系绵羊在夏季采食含较高能量（ＤＥ为９．４２ＭＪ／ｋｇ）和蛋白质（ＣＰ为１１．０６％）的牧草，当瘤
胃中有充足的易利用的碳水化合物时，瘤胃中氨的利用率高，蛋白质合成强度大，微生物生长增殖速度快。随着
季节的变化，秋、冬季由于动物采食的饲草养分含量低（ＤＥ分别为９．６６和７．３２ＭＪ／ｋｇ，ＣＰ含量分别为８．９１％
和６．３０％），不能供给瘤胃细菌足够的能量和蛋白质，影响能量和氨的同步释放，抑制了微生物的生长繁殖，因而
细菌数量明显低于夏季。
３．３ 采食量和饲料的物理状态对微生物数量的影响
采食量和饲料的物理状态，能影响瘤胃的排空速度和发酵类型，因而影响瘤胃中微生物的生长增殖和数量。
随着牧草日渐成熟，牧草的消化率及被放牧家畜的采食量都会下降［１３，１４］。试验中，藏系绵羊干物质的平均采食
量，夏季草场分别为春、冬和秋季的１．９８，１．６１和１．８０倍。与上述资料报道相一致。这主要是由于春、秋、冬、季
牧场牧草处于枯黄期，牧草消化能、粗蛋白质含量都较低，当饲粮中粗蛋白质含量低于８％时，反刍动物的采食量
即会降低［１５，１６］。当纤维性物质含量增高（春、秋、冬的ＡＤＦ含量分别为４２．４７％，４０．６６％和４３．４０％），使得牧场
牧草干物质消化率低，质硬，适口性差，这可能是干物质采食量低的原因之一。由此可看出，随着藏系绵羊采食饲
料中的纤维性物质含量增高，采食量也随着降低，瘤胃细菌的数量变化也相应降低（图１），夏季瘤胃内细菌数量
分别是春、冬和秋季的５．５６，２．３５和２．４９倍；秋季和冬季瘤胃细菌数量变化不明显（犘＞０．０５）。冬季寒冷，也是
影响采食量的因素之一［１７，１８］。据报道，在冷应激状态下，温度每下降１℃，绵羊对干物质的消化率下降
０．３１％［１６］，这也是导致秋、冬季节瘤胃微生物数量低于夏季的一个原因。
３．４ 实时定量ＰＣＲ技术对微生物数量的监测
通过实时定量ＰＣＲ技术定量研究瘤胃细菌随季节的变化规律，表明春、夏、秋和冬季瘤胃内细菌质量数分别
为３．０６，１７．００，６．８１和７．２４ｎｇ，证明实时定量ＰＣＲ技术能准确的反映出放牧藏系绵羊瘤胃细菌数量随季节的
动态变化，夏季其瘤胃内细菌数量明显高于其他３个季节，秋季和冬季瘤胃细菌数量变化不明显，而冬春瘤胃细
菌数量低；从研究结果看，对于高寒草地放牧的藏系绵羊，在冬、春季节应给予补饲。
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犳犻犫狉犻狊狅犾狏犲狀狊犢犈４４ｉｎｔｈｅｒｕｍｅｎｏｆｃａｔｔｌｅｆｅｄｈｉｇｈｇｒａｉｎｄｉｅｔｓ［Ｊ］．ＪｏｕｒｎａｌＡｐｐｌｉｅｄＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，２００３，９５：６２１６３０．
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犛犲犪狊狅狀犪犾狊犺犻犳狋狅犳狉狌犿犲狀犫犪犮狋犲狉犻犪狇狌犪狀狋犻狋狔狅犳犵狉犪狕犻狀犵犜犻犫犲狋犪狀狊犺犲犲狆犪狀犱犳狅狉犪犵犲狀狌狋狉犻狋犻狅狀犫狔犵狉犪狕犻狀犵狊犺犲犲狆
ＤＡＮＲｕｉｆａｎｇ１，ＺＨＡＮＧＨａｉｔａｏ１，ＬＯＮＧＲｕｉｊｕｎ２，３，ＤＩＮＧＸｕｅｚｈｉ４，ＺＨＡＮＧＸｉｎ５
（１．ＪｉａｎｇｓｕＡｎｉｍａｌＨｕｓｂａｎｄｒｙ＆ＶｅｔｅｒｉｎａｒｙＣｏｌｅｇｅ，Ｔａｉｚｈｏｕ２２５３００，Ｃｈｉｎａ；２．ＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＣｅｎｔｒｅｆｏｒ
ＴｉｂｅｔａｎＥｃｏｓｙｓｔｅｍＭａｎａｇｅｍｅｎｔ，ＬａｎｚｈｏｕＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｌａｎｚｈｏｕ７３００２０，Ｃｈｉｎａ；３．ＣｏｌｅｇｅｏｆＰａｓｔｏｒａｌ
ＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅＳｃｉｅｎｃｅａｎｄＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＬａｎｚｈｏｕＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｌａｎｚｈｏｕ７３００２０，Ｃｈｉｎａ；４．Ｎｏｒｔｈｗｅｓｔ
ＰｌａｔｅａｕＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＢｉｏｌｏｇｙ，ＣｈｉｎｅｓｅＡｃａｄｅｍｙｏｆＳｃｉｅｎｃｅ，Ｘｉｎｉｎｇ８１０００１，Ｃｈｉｎａ；５．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ
ｏｆＢａｓｉｃＳｃｉｅｎｃｅ，ＴｉａｎｊｉｎＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｔｉａｎｊｉｎ３００３８４，Ｃｈｉｎａ）
犃犫狊狋狉犪犮狋：Ｉｎｔｈｉｓｓｔｕｄｙ，ｒｅａｌｔｉｍｅＰＣＲｗｅｒｅｕｓｅｄｔｏｍｏｎｉｔｏｒｃｈａｎｇｅｄｑｕａｎｔｉｔｙｏｆｂａｃｔｅｒｉａｉｎｒｕｍｅｎｓｏｆ１２Ｔｉｂｅｔ
ａｎｓｈｅｅｐｗｉｔｈｓｅａｓｏｎａｌｓｈｉｆｔ，ｂｙｃｏｌｅｃｔｉｎｇｒｕｍｅｎｃｏｎｔｅｎｔｏｆｇｒａｚｉｎｇＴｉｂｅｔａｎｓｈｅｅｐｉｎａｌｐｉｎｅｍｅａｄｏｗｉｎｓｐｒｉｎｇ，
ｓｕｍｍｅｒ，ａｕｔｕｍｎａｎｄｗｉｎｔｅｒ，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．１）ＴｈｅｑｕａｎｔｉｔｙｏｆｂａｃｔｅｒｉａｉｎｇｒａｚｉｎｇＴｉｂｅｔａｎｓｈｅｅｐｒｕｍｅｎｄｉｄｎｏｔ
ｈａｖｅａｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｃｈａｎｇｅｂｅｔｗｅｅｎｗｉｎｔｅｒａｎｄａｕｔｕｍｎ，ａｎｄｔｈａｔｏｆｓｐｒｉｎｇｄｅｃｒｅａｓｅｄ２．３８，２．２３ｆｏｌｄｏｆａｕｔｕｍｎ
ａｎｄｗｉｎｔｅｒ，ｍｅａｎｗｈｉｌｅ，ｔｈａｔｏｆｓｕｍｍｅｒｗａｓｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｈｉｇｈｅｒ５．５６ｆｏｌｄ，２．３５ｆｏｌｄａｎｄ２．４９ｆｏｌｄｔｈａｎｔｈａｔｏｆ
ａｕｔｕｍｎ，ｗｉｎｔｅｒａｎｄｓｐｒｉｎｇ；２）Ｉｎｔａｋｅｏｆｔｈｅｇｒａｚｉｎｇｓｈｅｅｐｉｎｓｕｍｍｅｒｗａｓｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｈｉｇｈｅｒ１．９８ｆｏｌｄ，１．６１
ｆｏｌｄａｎｄ１．８０ｆｏｌｄｔｈａｎｔｈａｔｏｆｓｐｒｉｎｇ，ｗｉｎｔｅｒ，ａｕｔｕｍｎ．Ｉｎｔａｋｅｏｆｔｈｅｇｒａｚｉｎｇｓｈｅｅｐａｎｄｑｕａｎｔｉｔｙｏｆｂａｃｔｅｒｉａｉｎ
ｒｕｍｅｎｓｏｆｔｈｅｇｒａｚｉｎｇｓｈｅｅｐｗｅｒｅｄｅｃｒｅａｓｅｄｗｉｔｈｆｉｂｒｅｉｎｃｒｅａｓｅｄｏｆｆｏｄｄｅｒ．Ｔｈｅｑｕａｎｔｉｔｙｏｆｂａｃｔｅｒｉａｉｎｒｕｍｅｎｓ
ｏｆＴｉｂｅｔａｎｓｈｅｅｐｃｈａｎｇｅｄ，ｗｈｉｃｈｒｅｓｕｌｔｆｒｏｍｆｏｄｄｅｒ，ｓｅａｓｏｎｓｈｉｆｔ．３）ＲｅａｌｔｉｍｅＰＣＲｖａｌｉｄａｔｅｄｆｏｒｓｐｅｃｉｆｉｃｄｅｔｅｃ
ｔｉｏｎａｎｄｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｂａｃｔｅｒｉａｉｎｒｕｍｅｎｓｏｆＴｉｂｅｔａｎｓｈｅｅｐｗｉｔｈｓｅａｓｏｎａｌｓｈｉｆｔ．
犓犲狔狑狅狉犱狊：ｒｅａｌｔｉｍｅＰＣＲ；Ｔｉｂｅｔａｎｓｈｅｅｐ；ｓｅａｓｏｎ；ｒｕｍｅｎｂａｃｔｅｒｉａ
４０１ ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ（２００９） Ｖｏｌ．１８，Ｎｏ．１