全 文 ：书农杆菌介导的假俭草遗传转化体系的建立
张芳，王舟，宗俊勤，刘建秀，佘建明
（江苏省中国科学院植物研究所，江苏 南京２１００１４）
摘要：以假俭草优良种质‘Ｅ１２６’为受体材料，以 犎犘犜基因为报告基因，通过农杆菌介导法转入犣犼犇犚犈犅１基因。
研究了转化体系中筛选剂和抑菌素对胚性愈伤组织生长和绿苗分化的影响，以及菌液浓度、侵染时间和共培养时
间对转化效率的影响。结果表明，愈伤筛选和再生苗筛选的最佳潮霉素浓度均为３０ｍｇ／Ｌ，头孢霉素作为抑菌素
的最佳浓度为４００ｍｇ／Ｌ；菌液ＯＤ６００值为０．３，侵染３０ｍｉｎ，共培养３ｄ为最优转化条件。经ＰＣＲ检测，初步获得
１０株转基因植株。
关键词：假俭草；农杆菌介导；犣犼犇犚犈犅１；遗传转化体系；建立
中图分类号：Ｓ５４３．０３２；Ｑ９４３．１　　文献标识码：Ａ　　文章编号：１００４５７５９（２０１１）０２０１８４０９
　 假俭草（犈狉犲犿狅犮犺犾狅犪狅狆犺犻狌狉狅犻犱犲狊）又称百足草、蜈蚣草，是禾本科蜈蚣草属多年生宿根性优良草坪植物，起源
于我国中部和南部地区［１，２］。该草以耐瘠薄、病虫害，养护水平低及再生能力强而著称，是国外公认的起源于中
国的最好的暖季型草坪草，可广泛地用于庭院草坪、休憩草坪及护坡草坪的建植，特别适合于水土保持和大面积
景观建设，是世界三大暖季型草坪草之一［３５］。但是，假俭草的抗寒性在三大暖季型草坪草中位居末位，绿期也较
短，而且枯黄的叶片不是金黄色，而是黄中带褐，降低了假俭草的观赏价值和景观效应［１，６，７］，因此长期以来假俭
草并未在亚热带北部和暖温带地区草坪生产和景观绿化中得到大面积的应用。
随着生物技术的发展，转基因技术日趋成熟，可将特定的目的基因进行遗传转化，提高育种效率。在各种植
物转基因方法中，由于农杆菌介导法具有易操作、低费用、高效率、插入片段确定性好和转基因拷贝数低等独特优
点，已成为转基因策略中的首选方法［８１１］。农杆菌介导的基因转化已广泛应用于双子叶植物，随着研究的深入，
许多单子叶植物转化也获得了成功［１２］。Ｒｏｓｓｅｌｔ等［１３］最早用农杆菌介导法成功转化多年生黑麦草（犔狅犾犻狌犿狆犲
狉犲狀狀犲）和多花黑麦草（犔狅犾犻狌犿犿狌犾犻犳犾狅狉狌犿），标志着这种转化方法在草坪草转基因育种中的突破。到目前为止，
转基因草的研究主要集中在匍匐翦股颖（犃犵狉狅狊狋犻狊狊狋狅犾狅狀犻犳犲狉犪）［１４］、细弱翦股颖（犃犵狉狅狊狋犻狊狋犲狀狌犻狊）［１５］、高羊茅（犉犲
狊狋狌犮犪犪狉狌狀犱犻狀犪犮犲犪）［１６］、多年生黑麦草［１７］、结缕草（犣狅狔狊犻犪犼犪狆狅狀犻犮犪）［１８］、草地早熟禾（犘狅犪狆狉犪狋犪狀狊犻狊）［１９］等禾本科
草坪草和牧草。其中，转犇犚犈犅／犆犅犉（脱水响应元件结合因子）基因［２０］的报道见于高羊茅［２１］、多年生黑麦草［２２］、
多花黑麦草［２３］、结缕草［２４］、中华结缕草（犣狅狔狊犻犪狊犻狀犻犮犪）［２５］、匍匐翦股颖［１４］、草地早熟禾［２６］、百喜草（犘犪狊狆犪犾狌犿
狀犪狋犪狋狌犿）［２７］，但尚未见应用于假俭草中。禾本科植物的自身特点使得许多草坪草和牧草的组织培养和再生体系
不完善，遗传转化率低。因此，草坪草的转基因研究大多处于遗传转化体系的建立和完善阶段，转基因操作与应
用研究进行的相对较少。要突破这个瓶颈，就需要优化转化条件，建立高效的再生和转化体系。目前，有关假俭
草遗传转化的研究报道较少。
在作者所在实验室已建立的假俭草再生体系［２８，２９］的基础上，首次通过农杆菌（犃犵狉狅犫犪犮狋犲狉犻狌犿狋狌犿犲犳犪犮犻犲狀狊）
介导法，将实验室克隆的源于结缕草的犣犼犇犚犈犅１基因导入假俭草的胚性愈伤组织，建立了农杆菌介导的假俭草
遗传转化体系，并分析了影响假俭草遗传转化频率的因素。通过对各种转化条件的优化组合，以取得最佳的转化
效率。本研究对假俭草的基因工程育种具有重要的指导意义，为获得抗寒优质的假俭草新品系奠定了基础，为进
一步扩大草坪建植区域提供了新种质材料及良好的技术平台。
１８４－１９２
２０１１年４月
　　　草　业　学　报　　　
　　　ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ　　　
第２０卷　第２期
Ｖｏｌ．２０，Ｎｏ．２
 收稿日期：２０１００９１５；改回日期：２０１０１１０１
基金项目：江苏省科技支撑项目（ＢＥ２００８４０３）和江苏省科技公共服务平台项目（ＢＭ２００９９０５）资助。
作者简介：张芳（１９８６），女，河南陕县人，在读硕士。Ｅｍａｉｌ：ｚｈａｎｇｆａｎｇ３３＠１２６．ｃｏｍ
通讯作者。Ｅｍａｉｌ：ｔｕｒｆｕｎｉｔ＠ｙａｈｏｏ．ｃｏｍ．ｃｎ
１　材料与方法
１．１　试验材料
图１　重组质粒狆犆犃犕犅犐犃１３０１犣犼犇犚犈犅１图谱
犉犻犵．１　犕犪狆狅犳狆犆犃犕犅犐犃１３０１狑犻狋犺犣犼犇犚犈犅１狌狊犲犱
犳狅狉狆犾犪狀狋狋狉犪狀狊犳狅狉犿犪狋犻狅狀
１．１．１　植物材料　材料为假俭草种质‘Ｅ１２６’的茎
段，来源于江苏省中国科学院植物研究所草业中心的
草坪草种质资源圃。根据对１６５份假俭草种源连续３
年的动态评价，综合坪用价值为营养繁殖假俭草中最
高的种源［２８，２９］。
１．１．２　农杆菌菌株及表达载体　质粒及农杆菌菌株：
供试质粒ｐＣＡＭＢＩＡ１３０１（含ＣａＭＶ３５Ｓ启动子及潮
霉素磷酸转移酶基因 犎犘犜）和农杆菌菌株ＬＢＡ４４０４
由南京农业大学花卉遗传育种与分子生物学研究室提
供；犣犼犇犚犈犅１基因（ＧｅｎＢａｎｋ登录号ＧＱ８４８０９６）由作
者所在实验室克隆，重组质粒的结构如图１所示。
１．１．３　生化试剂及酶　生化试剂及酶包括：预混型ＤＮＡ聚合酶（ＰｒｅｍｉｘＴａｑ? Ｖｅｒｓｉｏｎ２．０）（ＴａＫａＲａ公司）；
ＤＮＡ分子量标准（ＤＮＡＬａｄｄｅｒＭａｒｋｅｒ）（ＴａＫａＲａ公司）；新型广谱植物基因组ＤＮＡ快速提取试剂盒（北京盖宁
金诺生物技术有限责任公司）；卡那霉素（Ｋａｎ）、利福平（Ｒｉｆ）、潮霉素（Ｈｙｇ）、头孢霉素（Ｃｅｆ）、乙酰丁香酮（ＡＳ）
（上海生工生物工程有限公司）；引物合成及测序均由上海英骏生物技术有限公司合成完成。常规化学药品及组
织培养所用试剂均为国产ＡＲ级分析纯。
１．１．４　培养基的配制　试验用基本培养基成分列于表１中。
表１　用于植株再生和农杆菌培养的基本培养基
犜犪犫犾犲１　犕犲犱犻犪狌狊犲犱犳狅狉狆犾犪狀狋狉犲犵犲狀犲狉犪狋犻狅狀犪狀犱犮狌犾狋狌狉犲狅犳犃．狋狌犿犲犳犪犮犻犲狀狊
培养基 Ｍｅｄｉｕｍ 组分Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ
侧芽诱导培养基
Ｔｈｅｍｅｄｉｕｍｏｆａｘｉｌａｒｙｂｕｄｉｎｄｕｃｔｉｏｎ
ＭＳ＋６苄氨基嘌呤２．０ｍｇ／Ｌ＋１萘乙酸０．８ｍｇ／Ｌ＋蔗糖３０ｇ／Ｌ＋琼脂粉８ｇ／ＬＭＳ＋６ＢＡ２．０
ｍｇ／Ｌ＋ＮＡＡ０．８ｍｇ／Ｌ＋ｓｕｃｒｏｓｅ３０ｇ／Ｌ＋ａｇａｒ８ｇ／Ｌ
愈伤诱导及继代培养基
Ｔｈｅｍｅｄｉｕｍｏｆｃａｌｕｓｉｎｄｕｃｔｉｏｎａｎｄ
ｓｕｂｃｕｌｔｕｒｅ
ＭＳ＋２，４二氯苯氧乙酸１．５ｍｇ／Ｌ＋６苄氨基嘌呤０．１ｍｇ／Ｌ＋甘露醇３０ｍｇ／Ｌ＋椰子汁５０ｍＬ／Ｌ＋
蔗糖３０ｇ／Ｌ＋琼脂粉８ｇ／ＬＭＳ＋２，４Ｄ１．５ｍｇ／Ｌ＋６ＢＡ０．１ｍｇ／Ｌ＋ｍａｎｎｉｔｏｌ３０ｍｇ／Ｌ＋ｃｏｃｏｎｕｔ
ｍｉｌｋ５０ｍＬ／Ｌ＋ｓｕｃｒｏｓｅ３０ｇ／Ｌ＋ａｇａｒ８ｇ／Ｌ
愈伤分化培养基
Ｔｈｅｍｅｄｉｕｍｏｆｃａｌｕｓｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ
ＭＳ＋细胞分裂素２．０ｍｇ／Ｌ＋蔗糖３０ｇ／Ｌ＋琼脂粉８ｇ／ＬＭＳ＋ＫＴ２．０ｍｇ／Ｌ＋ｓｕｃｒｏｓｅ３０ｇ／Ｌ＋ａｇａｒ
８ｇ／Ｌ
芽生长培养基
Ｔｈｅｍｅｄｉｕｍｏｆｂｕｄｇｒｏｗｔｈ
ＭＳ＋６苄氨基嘌呤２．０ｍｇ／Ｌ＋１萘乙酸０．８ｍｇ／Ｌ＋蔗糖３０ｇ／Ｌ＋琼脂粉８ｇ／ＬＭＳ＋６ＢＡ２．０
ｍｇ／Ｌ＋ＮＡＡ０．８ｍｇ／Ｌ＋ｓｕｃｒｏｓｅ３０ｇ／Ｌ＋ａｇａｒ８ｇ／Ｌ
生根培养基
Ｔｈｅｍｅｄｉｕｍｏｆｒｏｏｔｇｒｏｗｔｈ
ＭＳ＋１萘乙酸０．６ｍｇ／Ｌ＋蔗糖３０ｇ／Ｌ＋琼脂粉８ｇ／ＬＭＳ＋ＮＡＡ０．６ｍｇ／Ｌ＋ｓｕｃｒｏｓｅ３０ｇ／Ｌ＋ａｇａｒ８
ｇ／Ｌ
农杆菌培养基ＹＥＰ
Ｔｈｅｍｅｄｉｕｍｏｆ犃．狋狌犿犲犳犪犮犻犲狀狊
胰蛋白胨５ｇ／Ｌ＋酵母提取物１ｇ／Ｌ＋ＭｇＳＯ４·７Ｈ２Ｏ０．５ｇ／Ｌ＋蔗糖５ｇ／Ｌ＋牛肉浸膏５ｇ／Ｌ（固体培
养基再加１５ｇ／Ｌ琼脂粉）Ｔｒｙｐｔｏｎｅ５ｇ／Ｌ＋Ｙｅａｓｔｅｘｔｒａｃｔ１ｇ／Ｌ＋ＭｇＳＯ４·７Ｈ２Ｏ０．５ｇ／Ｌ＋ｓｕｃｒｏｓｅ５
ｇ／Ｌ＋ｂｅｅｆｅｘｔｒａｃｔ５ｇ／Ｌ（＋ａｇａｒ１５ｇ／Ｌｆｏｒｓｏｌｉｄｍｅｄｉｕｍ）
１．２　试验方法
１．２．１　假俭草愈伤的诱导和继代培养　２００９年５月从江苏省中国科学院植物研究所草坪草种质资源基地选取
健壮的嫩茎，参照Ｙｕａｎ等［２８］的方法，进行愈伤诱导和继代培养。
１．２．２　抗生素敏感性试验　头孢霉素（Ｃｅｆ）抑菌浓度的确定：将经农杆菌菌液浸泡３０ｍｉｎ的愈伤，分别接种于
含０，１００，２００，３００，４００和５００ｍｇ／ＬＣｅｆ的愈伤继代培养基上，每个梯度设置３个重复，观察抑菌情况。３０ｄ后
５８１第２０卷第２期 草业学报２０１１年
统计愈伤分化率，确定最适抑菌浓度。
潮霉素（Ｈｙｇ）筛选浓度的确定：将假俭草胚性愈伤组织分别接种于含０，２０，３０，４０和５０ｍｇ／ＬＨｙｇ的继代
培养基上，２０ｄ后转至分化培养基，３０ｄ后统计愈伤组织分化率和成苗率，初步确定潮霉素愈伤筛选浓度。将假
俭草分化苗分别接种于含０，２０，３０，４０和５０ｍｇ／ＬＨｙｇ的芽生长培养基上，２０ｄ后观察分化苗的存活率，初步确
定潮霉素幼苗筛选浓度。在此基础上，将假俭草胚性愈伤组织经农杆菌侵染后，接种于含０，２０，３０，４０和５０
ｍｇ／ＬＨｙｇ的继代培养基（含Ｃｅｆ）上，２０ｄ后转至分化培养基（含Ｃｅｆ），３０ｄ统计愈伤组织分化率和成苗率。以
上每个梯度均设置３个重复。
１．２．３　农杆菌的保存及培养与活化　将－７０℃用１５％甘油保存的农杆菌菌液常温化冻后于ＹＥＰ＋５０ｍｇ／Ｌ
Ｋａｎ＋５０ｍｇ／ＬＲｉｆ固体培养基划板培养，培养条件为２８℃，４８ｈ，挑取单克隆接种于１００ｍＬＹＥＰ＋５０ｍｇ／Ｌ
Ｋａｎ＋５０ｍｇ／ＬＲｉｆ液体培养基震荡培养，培养温度为２８℃，震荡速度２００～２２０ｒ／ｍｉｎ，至农杆菌长到ＯＤ６００为
０．５左右时，取１ｍＬ至上述培养基中继续震荡培养到ＯＤ６００为０．１左右备用。
１．２．４　农杆菌介导的遗传转化、抗性愈伤的筛选和植株再生　参考佘建明等［１９］、李雪［３０］的方法，并加以改进。
１）预培养：转化前，取黄色颗粒状胚性愈伤组织，在继代培养基上预培养７ｄ。
２）侵染：无菌条件下，将ＯＤ６００为０．１左右的农杆菌悬浮液倒入盛有假俭草胚性愈伤组织的灭菌培养瓶中，
轻轻摇晃使菌液与愈伤组织充分接触，浸泡３０ｍｉｎ。
３）共培养：取出侵染后的愈伤置于底层铺有若干灭菌滤纸的培养皿上，上层再次覆盖１层滤纸，风机干燥后，
将愈伤组织转入铺有１层灭菌滤纸的共培养培养基（ＭＳ＋２，４Ｄ１．５ｍｇ／Ｌ＋甘露醇３０ｍｇ／Ｌ＋椰子汁５０ｍＬ／Ｌ
＋蔗糖３０ｇ／Ｌ＋琼脂粉８ｇ／Ｌ＋乙酰丁香酮１００μｍｏｌ／Ｌ＋头孢霉素４００ｍｇ／Ｌ）上，于２５℃黑暗培养３ｄ。
４）抗性愈伤的筛选：将共培养后的愈伤用无菌水清洗３～４次，充分震荡，再用含Ｃｅｆ（４００ｍｇ／Ｌ）的无菌水清
洗２遍，以除去附于愈伤组织表面的农杆菌菌液，然后放在无菌滤纸上沥干，转入愈伤筛选培养基（ＭＳ＋２，４Ｄ
１．０ｍｇ／Ｌ＋甘露醇３０ｍｇ／Ｌ＋椰子汁５０ｍＬ／Ｌ＋蔗糖３０ｇ／Ｌ＋琼脂粉８ｇ／Ｌ＋头孢霉素４００ｍｇ／Ｌ＋潮霉素３０
ｍｇ／Ｌ）于２５℃黑暗培养２０ｄ。
５）诱导分化：将存活愈伤转入分化培养基上生长，光照培养直到愈伤分化。切取长至２ｃｍ左右的分化芽，转
入苗筛选培养基（ＭＳ＋ＫＴ２．０ｍｇ／Ｌ＋蔗糖３０ｇ／Ｌ＋琼脂粉８ｇ／Ｌ＋头孢霉素２００ｍｇ／Ｌ＋潮霉素３０ｍｇ／Ｌ），
继续培养２０ｄ，得到再生苗。
６）生根：分化出的再生苗转入生根培养基，待根系形成后，即获得生根抗性苗。小苗长至１０ｃｍ左右时，打开
瓶盖炼苗３ｄ，自来水洗净根上的琼脂，移栽到穴盘中。
１．２．５　转化条件的选择　农杆菌菌液浓度的选择分别用ＯＤ６００为０．１，０．３，０．５，０．７的农杆菌悬浮液浸泡愈伤
组织３０ｍｉｎ，每个梯度设置３个重复，无菌滤纸沥干残留的菌液。共培养、筛选、分化和生根培养同上。
农杆菌侵染时间的选择：用ＯＤ６００为０．１的农杆菌悬浮液浸泡愈伤，侵染时间分别设为１０，２０，３０和４０ｍｉｎ。
每个梯度设置３个重复。共培养、筛选、分化和生根培养同上。
共培养时间的筛选：用ＯＤ６００为０．１的农杆菌悬浮液侵染３０ｍｉｎ，无菌滤纸沥干残留的菌液，置于愈伤继代
培养基上２５℃黑暗培养，时间分别设为１，２，３，４ｄ，每个梯度设置３个重复。筛选、分化和生根培养同上。
以上各因素均以愈伤的分化率、成苗率和分化苗存活率为评定标准。分化率（％）＝愈伤分化数／外植体总数
×１００；成苗率（％）＝分化芽数／外植体总数×１００；分化苗存活率（％）＝绿苗数／外植体总数×１００。
１．２．６　抗性植株的ＰＣＲ检测　取潮霉素抗性植株及未转化植株的嫩叶，采用新型广谱植物基因组ＤＮＡ快速
提取试剂盒提取基因组ＤＮＡ。根据犎犘犜基因两端序列合成扩增反应引物 ＨＰＴＦ（正向序列）和 ＨＰＴＲ（反向
序列），序列为：ＨＰＴＦ：５′ＣＧＴＣＴＧＴＣＧＡＧＡＡＧＴＴＴＣ３′；ＨＰＴＲ：５′ＴＡＣＴＴＣＴＡＣＡＣＡＧＣＣＡＴＣ３′；预期
片段大小为９４７ｂｐ。以上述提取的假俭草基因组ＤＮＡ为模板，表达载体ｐＣＡＭＺｊＤＲＥＢ１质粒ＤＮＡ为阳性对
照，未转基因的假俭草植株ＤＮＡ为阴性对照进行ＰＣＲ扩增。扩增体系为：１２．５μＬＰｒｅｍｉｘＴａｑ，１μＬＤＮＡ模
板，ＨＰＴＦ和ＨＰＴＲ（２０μｍｏｌ／Ｌ）各１μＬ，去离子水补足２５μＬ。扩增条件为：９４℃预变性５ｍｉｎ；９４℃变性
１ｍｉｎ，６０℃退火１ｍｉｎ，７２℃延伸１ｍｉｎ，３３个循环；７２℃延伸１０ｍｉｎ。
６８１ ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ（２０１１） Ｖｏｌ．２０，Ｎｏ．２
２　结果与分析
图２　假俭草犈１２６侧芽诱导愈伤的过程
犉犻犵．２　犆犪犾狌狊犻狀犱狌犮犲犱犳狉狅犿犪狓犻犾犪狉狔犫狌犱狊狅犳狋犺犲
狊犲犾犲犮狋犻狅狀‘犈１２６’狅犳犮犲狀狋犻狆犲犱犲犵狉犪狊狊
Ａ：侧芽生长；Ｂ：新生侧芽诱导愈伤组织；Ｃ：愈伤增殖扩繁
Ａ：Ｇｒｏｗｔｈｏｆｌａｔｅｒａｌｂｕｄ；Ｂ：Ｃａｌｕｓｅｓｗｅｒｅｉｎｄｕｃｅｄ
ｂｙｎｅｗｂｕｄｓ；Ｃ：Ｃａｌｕｓｐｒｏｐａｇａｔｉｏｎ
２．１　假俭草愈伤的诱导
用假俭草种质‘Ｅ１２６’的侧芽诱导愈伤的过程如
图２所示。
２．２　头孢霉素抑菌浓度的确定
头孢霉素浓度为５００ｍｇ／Ｌ时能够完全抑制农杆
菌生长，但同时明显抑制了愈伤组织的分化（表２）；浓
度降低到３００ｍｇ／Ｌ时可获得７３％的愈伤分化率，但
抑菌效果不显著。为了有效抑制农杆菌的生长又不影
响植株的再生，本试验在愈伤筛选培养阶段选用４００
ｍｇ／ＬＣｅｆ抑制农杆菌过度生长，在植株再生阶段逐步
降低到３００和２００ｍｇ／Ｌ。
２．３　潮霉素筛选浓度的确定
假俭草愈伤和幼苗均对潮霉素敏感，潮霉素浓度为５０ｍｇ／Ｌ时愈伤成苗率和分化苗的存活率分别仅有
３．３％和５．３％，愈伤分化及芽生长受到严重抑制，理论上这是比较理想的筛选浓度（表３，４）。但试验表明（表
５），经农杆菌侵染后，在５０和４０ｍｇ／Ｌ的潮霉素筛选压下，愈伤均不能正常分化；潮霉素浓度为３０ｍｇ／Ｌ时，愈
伤的分化率仅为８．７％，这是因为农杆菌的侵染和头孢霉素的添加也对愈伤和分化苗造成了一定的伤害。因此，
本试验中确定愈伤组织选择压和分化苗选择压均为３０ｍｇ／Ｌ。
２．４　转化条件对转化效率的影响
菌液浓度、侵染时间和共培养时间对均转化率有显著的影响（表６～８）。菌液ＯＤ６００为０．３时，侵染３０ｍｉｎ，
愈伤分化率和分化苗的存活率最高。此时，农杆菌开始进入对数生长期，侵染活力强，同时菌液浓度较低，对愈伤
造成的伤害小，转化率最高。随着菌液浓度的增大，愈伤分化率降低，由于农杆菌生长旺盛导致愈伤组织褐化致死。
表２　头孢霉素抑菌效果及对愈伤分化的影响
犜犪犫犾犲２　犈犳犳犲犮狋狊狅犳犆犲犳犮狅狀犮犲狀狋狉犪狋犻狅狀狅狀犫犪犮狋犲狉犻狅狊狋犪狊犻狊犪狀犱犮犪犾狌狊犱犻犳犳犲狉犲狀狋犻犪狋犻狅狀
头孢霉素浓度
Ｃｅｆ（ｍｇ／Ｌ）
接种数
Ｎｏ．ｏｆｅｘｐｌａｎｔ
细菌生长情况
Ｇｒｏｗｔｈｏｆｂａｃｔｅｒｉａ
愈伤分化率
Ｒａｔｅｏｆｃａｌｕｓｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ（％）
０ １００ 菌落布满容器Ａｌｓｕｒｖｉｖｅ ０．０
１００ １００ 菌落布满愈伤边缘Ａｌｓｕｒｖｉｖｅａｒｏｕｎｄｔｈｅｃａｌｕｓ ０．０
２００ １００ 大量菌落散布愈伤边缘 Ｍａｊｏｒｉｔｙｓｕｒｖｉｖｅａｒｏｕｎｄｔｈｅｃａｌｕｓ ０．０
３００ １００ 少量菌落散布愈伤边缘Ａｆｅｗｓｕｒｖｉｖｅａｒｏｕｎｄｔｈｅｃａｌｕｓ ７３．０
４００ １００ 完全抑制Ｒｅｓｔｒａｉｎｅｄｃｏｍｐｌｅｔｅｌｙ ６２．０
５００ １００ 完全抑制Ｒｅｓｔｒａｉｎｅｄｃｏｍｐｌｅｔｅｌｙ ３８．０
表３　潮霉素对愈伤组织分化的影响（筛选２０犱）
犜犪犫犾犲３　犈犳犳犲犮狋狊狅犳犎狔犵犮狅狀犮犲狀狋狉犪狋犻狅狀狅狀犮犪犾狌狊犱犻犳犳犲狉犲狀狋犻犪狋犻狅狀（狊犮狉犲犲狀犻狀犵犳狅狉２０犱）
潮霉素浓度
Ｈｙｇ（ｍｇ／Ｌ）
接种愈伤数
Ｎｏ．ｏｆｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ
分化愈伤数
Ｎｏ．ｏｆｃａｌｕｓｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ
分化率
Ｒａｔｅｏｆｃａｌｕｓｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ（％）
成苗愈伤数
Ｎｏ．ｏｆｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ
成苗率
Ｒａｔｅｏｆｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ（％）
０ １５０ １４８ ９８．７ １４４ ９６．０
２０ １５０ １３０ ８６．７ １１７ ７８．０
３０ １５０ ８５ ５６．７ ５７ ３８．０
４０ １５０ ２７ １８．０ １４ ９．３
５０ １５０ ８ ５．３ ５ ３．３
７８１第２０卷第２期 草业学报２０１１年
侵染时间过短，外植体上农杆菌附着不足，愈伤转化率
低；侵染时间过长，外植体上农杆菌附着过多，对愈伤
组织造成过度的伤害，不利于抗性愈伤的获得。共培
养时间短，农杆菌侵染不足，ＴＤＮＡ不能有效地向植
物细胞转移和表达。延长共培养时间可以保证 Ｔ
ＤＮＡ向植物细胞有效地转移，但是随共培养时间的延
长，愈伤组织吸附的农杆菌量增多，对愈伤组织的损伤
增加，抑菌难度也随之增大。结果表明，菌液ＯＤ６００为
０．３时，侵染３０ｍｉｎ，共培养３ｄ，愈伤分化率、成苗率
和分化苗的存活率最高，即为最优转化条件。
表４　潮霉素对分化苗的影响（筛选２０犱）
犜犪犫犾犲４　犈犳犳犲犮狋狊狅犳犎狔犵犮狅狀犮犲狀狋狉犪狋犻狅狀狅狀犱犻犳犳犲狉犲狀狋犻犪狋犲犱
狊犲犲犱犾犻狀犵狊（狊犮狉犲犲狀犻狀犵犳狅狉２０犱）
潮霉素浓度
Ｈｙｇ（ｍｇ／Ｌ）
接种数Ｎｏ．
ｏｆｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ
存活数Ｎｏ．
ｏｆｓｕｒｖｉｖａｌ
存活率Ｒａｔｅ
ｏｆｓｕｒｖｉｖａｌ（％）
０ ７５ ７５ １００．０
２０ ７５ ６１ ８１．３
３０ ７５ ３２ ４２．７
４０ ７５ ９ １２．０
５０ ７５ ４ ５．３
表５　潮霉素对经农杆菌侵染的愈伤组织再生的影响
犜犪犫犾犲５　犈犳犳犲犮狋狅犳犎狔犵犮狅狀犮犲狀狋狉犪狋犻狅狀狅狀狉犲犵犲狀犲狉犪狋犻狅狀狅犳犮犪犾狌狊犫狔犃．狋狌犿犲犳犪犮犻犲狀狊
潮霉素浓度
Ｈｙｇ（ｍｇ／Ｌ）
接种愈伤数
Ｎｏ．ｏｆｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ
分化愈伤数
Ｎｏ．ｏｆｃａｌｕｓｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ
分化率
Ｒａｔｅｏｆｃａｌｕｓｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ（％）
成苗愈伤数
Ｎｏ．ｏｆｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ
成苗率
Ｒａｔｅｏｆｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ（％）
０ １５０ ８７ ５８．０ ７９ ５２．７
２０ １５０ ５４ ３６．０ ４７ ３１．３
３０ １５０ １９ １２．７ １３ ８．７
４０ １５０ ６ ４．０ ０ ０
５０ １５０ ０ ０ ０ ０
表６　菌液浓度对愈伤转化效率的影响
犜犪犫犾犲６　犈犳犳犲犮狋狊狅犳犫犪犮狋犲狉犻犪犾犮狌犾狋狌狉犲犗犇６００狅狀狋狉犪狀狊犳狅狉犿犪狋犻狅狀
菌液浓度
ＢａｃｔｅｒｉａｌｃｕｌｔｕｒｅＯＤ６００
接种愈伤数
Ｎｏ．ｏｆｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ
愈伤分化率
Ｒａｔｅｏｆｃａｌｕｓｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ（％）
愈伤成苗率
Ｒａｔｅｏｆｃａｌｕｓｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ（％）
分化苗存活率
Ｒａｔｅｏｆｓｅｅｄｌｉｎｇｓｕｒｖｉｖａｌ（％）
０．１ ２５０ ８．４ ４．４ ２．４
０．３ ２５０ ８．８ ５．６ ３．６
０．５ ２５０ ２．８ ０．８ ０．４
０．７ ２５０ １．６ ０．８ ０
表７　侵染时间对愈伤转化效率的影响
犜犪犫犾犲７　犈犳犳犲犮狋狅犳犻狀犳犲犮狋犻狅狀狋犻犿犲狅狀狋狉犪狀狊犳狅狉犿犪狋犻狅狀
侵染时间
Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｔｉｍｅ（ｍｉｎ）
接种愈伤数
Ｎｏ．ｏｆｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ
愈伤分化率
Ｒａｔｅｏｆｃａｌｕｓｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ（％）
愈伤成苗率
Ｒａｔｅｏｆｃａｌｕｓｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ（％）
分化苗存活率
Ｒａｔｅｏｆｓｅｅｄｌｉｎｇｓｕｒｖｉｖａｌ（％）
１０ ２５０ ２．８ ０．８ ０．４
２０ ２５０ ５．２ ２．０ １．２
３０ ２５０ ８．４ ３．６ ３．２
４０ ２５０ ０．４ ０．４ ０
２．５　转基因抗性植株的获得
假俭草愈伤组织在携带表达载体ｐＣＡＭＺｊＤＲＥＢ１质粒的农杆菌ＬＢＡ４４０４中侵染后，经过２轮潮霉素的筛
选，共获得４４株抗性苗（图３），抗性苗获得率为３．６％。
８８１ ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ（２０１１） Ｖｏｌ．２０，Ｎｏ．２
表８　共培养时间对愈伤转化效率的影响
犜犪犫犾犲８　犈犳犳犲犮狋狅犳犮狅犮狌犾狋犻狏犪狋犻狅狀狋犻犿犲狅狀狋狉犪狀狊犳狅狉犿犪狋犻狅狀
共培养时间
Ｃｏｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎｔｉｍｅ（ｄ）
接种愈伤数
Ｎｏ．ｏｆｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ
愈伤分化率
Ｒａｔｅｏｆｃａｌｕｓｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ（％）
愈伤成苗率
Ｒａｔｅｏｆｃａｌｕｓｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ（％）
分化苗存活率
Ｒａｔｅｏｆｓｅｅｄｌｉｎｇｓｕｒｖｉｖａｌ（％）
０ ２５０ １．２ ０．４ ０
１ ２５０ ３．２ ２．０ ０．８
２ ２５０ ５．２ ２．８ ２．０
３ ２５０ ８．４ ５．２ ３．２
４ ２５０ ０ ０ ０
图３　农杆菌介导的假俭草遗传转化及植株再生
犉犻犵．３　犃犵狉狅犫犪犮狋犲狉犻狌犿犿犲犱犻犪狋犲犱狋狉犪狀狊犳狅狉犿犪狋犻狅狀狅犳犮犲狀狋犻狆犲犱犲犵狉犪狊狊犪狀犱狉犲犵犲狀犲狉犪狋犻狅狀狅犳狋犺犲狋狉犪狀狊犳狅狉犿犲犱狆犾犪狀狋犾犲狋
　Ａ：胚性愈伤组织；Ｂ：共培养时期；Ｃ：愈伤组织筛选前；Ｄ：愈伤组织筛选后；Ｅ：抗性愈伤的分化；Ｆ：分化苗筛选前；Ｇ：分化苗筛选后；Ｈ：抗性苗生
长；Ｉ：抗性苗生根；Ｊ：抗性苗移入穴盘Ａ：Ｅｍｂｒｙｏｇｅｎｉｃｃａｌｕｓ；Ｂ：Ｃｏｃｕｌｔｕｒｅｔｉｍｅ；Ｃ：Ｃａｌｕｓｂｅｆｏｒｅｓｃｒｅｅｎｉｎｇ；Ｄ：Ｃａｌｕｓａｆｔｅｒｓｃｒｅｅｎｉｎｇ；Ｅ：Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａ
ｔｉｏｎｏｆｒｅｓｉｓｔａｎｔｃａｌｕｓ；Ｆ：Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅｄｓｅｅｄｌｉｎｇｓｂｅｆｏｒｅｓｃｒｅｅｎｉｎｇ；Ｇ：Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅｄｓｅｅｄｌｉｎｇｓａｆｔｅｒｓｃｒｅｅｎｉｎｇ；Ｈ：Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｅｄｒｅｓｉｓｔａｎｔｐｌａｎｔｌｅｔｓ；Ｉ：
Ｒｏｏｔｅｄｐｌａｎｔｌｅｔｓ；Ｊ：Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔｅｄｐｌａｎｔｌｅｔｓ
２．６　抗性植株的ＰＣＲ检测
对经农杆菌侵染，潮霉素筛选获得的４４株抗性植株进行ＰＣＲ鉴定，用质粒ＤＮＡ为模板做阳性对照，以未
转化植株ＤＮＡ为模板做阴性对照。结果显示，有１０株抗性植株在近９４７ｂｐ处扩增出一条清晰的条带，与阳性
对照扩增长度相等，未转化株则没有扩增出相应的条带（图４）。初步证实外源基因已成功转入假俭草中，获得了
１０株ＰＣＲ阳性单株。
图４　转基因抗性苗的犘犆犚检测
犉犻犵．４　犘犆犚犪狀犪犾狔狊犻狊狅犳狋犺犲狉犲狊犻狊狋犪狀狋狋狉犪狀狊犵犲狀犻犮狊犲犲犱犾犻狀犵狊
３－１２：转基因植株；２：阳性对照；１：阴性对照；Ｍ：ＤＮＡ分子量标准
３－１２：Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｐｌａｎｔｓ；２：Ｐｏｓｉｔｉｖｅｃｏｎｔｒｏｌ；１：Ｎｅｇａｔｉｖｅｃｏｎｔｒｏｌ；Ｍ：ＤＮＡｌａｄｄｅｒｍａｒｋｅｒ
９８１第２０卷第２期 草业学报２０１１年
３　讨论
犎犘犜基因是植物基因工程研究中常用的筛选标记基因，确定合适的选择压力和选择时期是获得转化植株
的关键［３１］。潮霉素对植物的生长发育有抑制作用，植物对潮霉素的敏感程度不同。在已报道的高羊茅遗传转化
研究中，即使受体材料相同，不同研究者使用的潮霉素浓度从５０ｍｇ／Ｌ到２５０ｍｇ／Ｌ相差很大［１６，３２，３３］。Ｂａｊａｊ
等［３４］在多年生黑麦草的遗传转化中使用５０和８０ｍｇ／Ｌ的 Ｈｙｇ作为愈伤阶段的２轮筛选，而在植株再生阶段降
至２５ｍｇ／Ｌ，所获得的抗性苗经ＧＵＳ组织化学染色证明全部为转基因植株。其他草坪草如匍匐翦股颖为２００
ｍｇ／Ｌ［３５］，草地早熟禾为３０～１００ｍｇ／Ｌ［２６］。通过对不同潮霉素浓度梯度的敏感性试验，本研究发现假俭草组织
愈伤组织和再生植株对潮霉素敏感。经农杆菌侵染后，潮霉素浓度为３０ｍｇ／Ｌ时，愈伤组织褐化严重，分化率和
成苗率明显降低，大部分分化苗白化，生长速度明显减慢，部分植株死亡；潮霉素浓度为４０ｍｇ／Ｌ，愈伤组织失去
分化和成苗能力，部分褐化死亡，分化苗大多数白化死亡。因此根据本试验结果推断，转化植株适宜的潮霉素筛
选浓度应在３０和４０ｍｇ／Ｌ之间。本实验所用的筛选浓度为３０ｍｇ／Ｌ，采用了高选择压长时间筛选愈伤组织，无
选择压恢复分化和生长，再高选择压筛选分化苗的筛选方法，ＰＣＲ检测的阳性植株率为２２．７％。所以，建议以后
尝试使用３５ｍｇ／Ｌ的潮霉素筛选浓度。
在农杆菌介导转化中，使用抑菌素以抑制共培养后筛选和植株再生阶段农杆菌的过度繁殖，对于获得转基因
植株也至关重要。本研究中所使用的抑菌素为头孢霉素，其对愈伤组织的分化也有一定影响。前人研究表明，头
孢霉素降低了草地早熟禾愈伤组织的分化率［１６］，但对匍匐翦股颖的再生没有显著影响［３６］，这是由于不同植物对
抗生素的反应不同所致。抑菌素会对愈伤组织的再生产生影响，因此在植株再生阶段应降低抑菌素的使用。本
研究发现４００ｍｇ／ＬＣｅｆ能抑制农杆菌过度生长，同时也能保证假俭草愈伤组织的分化。本实验采用在愈伤筛选
培养阶段时使用４００ｍｇ／ＬＣｅｆ，之后逐步降低到３００和２００ｍｇ／Ｌ的抑菌方法。
农杆菌能否有效附着并侵染外植体也是转化成功与否的关键。在其他植物的农杆菌介导遗传转化中所应用
的菌液浓度多为ＯＤ６００＝０．５～１．０，侵染时间１５～４０ｍｉｎ，共培养时间为２～４ｄ［３４，３７４０］。转化条件与所选择的受
体系统（外植体种类、状态）和农杆菌菌株有关。本研究表明，适宜假俭草愈伤组织的农杆菌转化条件为菌液浓度
ＯＤ６００＝０．３，侵染时间为３０ｍｉｎ，共培养３ｄ。本研究认为低浓度菌液能够减少菌体对愈伤组织的伤害，只要菌体
在侵染过程中能够进入到受体细胞内并整合即可。菌液浓度高，侵染时间长，所需用的抑菌素浓度就会相应的增
大，而抑菌素对愈伤组织的再生有不利影响。
转化效率低一直是农杆菌介导法转化草坪草的一大难题。有研究报道，在农杆菌侵染过程中，采用负压处
理［４１］和干燥处理［４２］有助于提高转化效率。本研究分别尝试了２种处理，结果发现负压处理（抽真空）容易引起空
气中霉菌的污染；干燥处理效果比较理想，能显著降低农杆菌的污染率，同时提高愈伤分化率。此外，影响农杆菌
介导法转化效率的因素还有很多，如预培养培养基的配方，预培养时间，共培养时乙酰丁香酮浓度（对单子叶植
物）和ｐＨ值［４３］等有待于进一步研究。近年来，在提高遗传转化效率方面发展了一些新技术，如超声波辅助农杆
菌介导法、负压与农杆菌介导结合法以及基因枪与农杆菌介导结合法等，均可增强农杆菌浸染，提高转化效率，在
植物遗传转化方面有一些成功的报道［４１，４４，４５］。这些新方法，新技术也有待于在假俭草遗传转化上得以应用，以在
提高转化率方面取得突破性的进展，为假俭草的基因工程育种奠定基础。
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犃犵狉狅犫犪犮狋犲狉犻狌犿狋狌犿犲犳犪犮犻犲狀狊［Ｊ］．ＪｏｕｒｎａｌｏｆＰｌａｎｔＰｈｙｓｉｏｌｏｇｙａｎｄＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，２００５，３１：１４９１５９．
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狊狆狅狀狋犪狀犲狌犿Ｌ．ｉｎｔｕｒｆａｎｄｆｏｒａｇｅｇｒａｓｓ（犘犪狊狆犪犾狌犿狀狅狋犪狋狌犿 Ｆｌｕｇｇｅ）ｅｎｈａｎｃｅｓａｂｉｏｔｉｃｓｔｒｅｓｓｔｏｌｅｒａｎｃｅ［Ｊ］．ＴｒａｎｓｇｅｎｉｃＲｅ
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ｇｒａｓｓ［犈狉犲犿狅犮犺犾狅犪狅狆犺犻狌狉狅犻犱犲狊（Ｍｕｎｒｏ．）Ｈａｃｋ］［Ｊ］．ＳｃｉｅｎｔｉａＨｏｒｔｉｃｕｌｔｕｒａｅ，２００９，１２０：９６１００．
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１９１第２０卷第２期 草业学报２０１１年
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２９１ ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ（２０１１） Ｖｏｌ．２０，Ｎｏ．２