全 文 ：书连作马铃薯根际干腐病优势病原菌荧光定量
犘犆犚快速检测及在根际的动态变化
李瑞琴１，２，刘星１，３，邱慧珍１，３，４，张文明１，３，４，张春红１，３，４，
王蒂３，４，５，张俊莲３，４，５，沈其荣６
（１．甘肃农业大学资源与环境学院，甘肃 兰州７３００７０；２．甘肃省农业科学院畜草与绿色农业研究所，甘肃 兰州７３００７０；３．甘肃省
干旱生境作物学重点实验室，甘肃兰州７３００７０；４．甘肃省作物遗传改良与种质创新重点实验室，甘肃 兰州７３００７０；
５．甘肃农业大学农学院，甘肃 兰州７３００７０；６．南京农业大学资源与环境学院，江苏 南京２１００９５）
摘要：为了解根际土壤中土传病害病原菌的积累与连作障碍之间的关系，进一步寻求缓解和克服马铃薯连作障碍
土传病害的有效途径，本研究建立了以马铃薯根际土壤为研究对象的干腐病病原菌荧光定量ＰＣＲ快速检测体系。
结果显示，研究建立优化的荧光定量ＰＣＲ检测方法，对引起马铃薯干腐病的优势病原菌茄病镰孢菌和接骨木镰孢
菌进行快速检测和绝对定量，主要优化参数为：上下游引物各０．４μＬ（１０ｍｍｏｌ／Ｌ），ＤＮＡ模板３μＬ，退火温度
６０℃。连作马铃薯根际土壤茄病镰孢菌和接骨木镰孢菌随连作年限的动态变化趋势均表现为随连作年限的递增
呈现上升趋势，其中ＣＰ５ 的累积量最大，为１．４５×１０４ 拷贝／ｇ，比ＣＫ增加了２７．８倍。ＣＰ４、ＣＰ３、ＣＰ２、ＣＰ１ 根际病
原菌累积量分别比对照增加了１０．５，１６．３１，８．３２，３．５１倍。由此可见，茄病镰孢菌和接骨木镰孢菌的数量均随连
作年限的递增呈上升趋势。根际镰刀菌随生育进程的动态变化因病原菌种类而异，茄病镰孢菌以收获期累积量最
大，平均为１．２×１０４ 拷贝／ｇ，随生育进程的推进呈上升趋势。而接骨木镰刀菌是播前累积量最大，平均为
１．５５×１０４ 拷贝／ｇ，随生育进程的推进呈下降趋势。因此，研究区马铃薯根际土壤中镰刀菌的大量积累可能是导致
马铃薯连作障碍发生的主要原因之一。
关键词：马铃薯干腐病优势病原菌；连作根际土壤；实时荧光定量ＰＣＲ；动态变化趋势
中图分类号：Ｓ５３２；Ｓ４３６．３２ 文献标识码：Ａ 文章编号：１００４５７５９（２０１３）０６０２３９１０
犇犗犐：１０．１１６８６／ｃｙｘｂ２０１３０６３０
马铃薯（犛狅犾犪狀狌犿狋狌犫犲狉狅狊狌犿）是重要的粮菜兼用型作物，也是优良的饲料作物［１］。随着加工业的发展和产
业结构调整，马铃薯已成为西部贫困地区稳产、增收的优势农作物，栽培面积不断扩大，导致马铃薯的连作种植越
来越广泛。甘肃省是中国马铃薯种植面积最大的地区，但病害的发生制约着本省马铃薯产业的深入发展［２］。其
中约７０％的马铃薯采收以后要经过３～６个月的贮藏，以延长供应期并为淀粉加工提供原料。然而，块茎在贮藏
过程中的烂损较为严重，这不仅造成较大的经济损失，而且会明显降低淀粉含量［３］。马铃薯镰刀菌干腐病（ｐｏｔａ
ｔｏ犉狌狊犪狉犻狌犿ｄｒｙｒｏｔ）是马铃薯贮藏期最常见的真菌性病害，给广大的马铃薯加工企业及农户造成了巨大的经济
损失，严重影响了马铃薯的产量和品质［４５］。
国内外对马铃薯干腐病进行过一些研究，报道的病原菌各不相同［６１２］，Ｓｅｐｐａｎｅｎ［１３］对引起芬兰马铃薯干腐
病的镰刀菌种类进行了研究，证实１４种镰刀菌种为马铃薯干腐病病原，以燕麦镰刀菌（犉狌狊犪狉犻狌犿犪狏犲狀犪犮犲狌犿）和
茄病镰刀菌（犉．狊狅犾犪狀犻ｖａｒ．犮狅犲狉狌犾犲狌犿）为优势病原，其次为黄色镰刀菌（犉．犮狌犾犿狅狉狌犿）和硫色镰孢菌（犉．狊狌犾
狆犺狌狉犲狌犿）。叶琪明和王拱辰［１４］报道了浙江省马铃薯干腐病镰刀菌９个种和变种，其中，致病力较强的种类有茄
病镰孢及其变种、串珠镰孢（犉．犿狅狀犻犾犻犳狅狉犿犲）及其变种和拟丝孢镰孢（犉．狋狉犻犮犺狅狋犺犲犮犻狅犻犱犲狊）。何苏琴等［１５］通过种
类鉴定，发现硫色镰刀菌（犉．狊狌犾狆犺狌狉犲狌犿）为甘肃省定西市的马铃薯干腐病病原。陈彦云［１６］报道了宁夏西吉县
第２２卷 第６期
Ｖｏｌ．２２，Ｎｏ．６
草 业 学 报
ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ
２３９－２４８
２０１３年１２月
收稿日期：２０１３０３１３；改回日期：２０１３０４２８
基金项目：农业部公益性行业（农业）科研专项（２０１１０３００４），甘肃省科技重大专项（１１０２ＮＫＤＭ０２５）和国家科技支撑计划（２０１２ＢＡＤ０６Ｂ０３）资助。
作者简介：李瑞琴（１９６９），女，甘肃庆阳人，高级实验师，在读博士。Ｅｍａｉｌ：ｌｉｒｕｉｑｉｎ＿５２４＠１６３．ｃｏｍ
通讯作者。Ｅｍａｉｌ：ｈｚｑｉｕ＠ｇｓａｕ．ｅｄｕ．ｃｎ，ｗａｎｇｄ＠ｇｓａｕ．ｅｄｕ．ｃｎ
马铃薯干腐病主要病原为茄病镰孢蓝色变种（犉．狊狅犾犪狀犻）和接骨木镰孢。河北省马铃薯干腐病主要由茄病镰孢
和半裸镰孢（犉．狊犲犿犻狋犲犮狋狌犿）引起［１７］。黑龙江省马铃薯干腐病主要病原有６个种和变种，茄病镰孢和接骨木镰孢
就在其中［１８］。华北地区贮藏期马铃薯有４种真菌病害和３种细菌病害，其中，引起马铃薯干腐病的病原菌就有
接骨木镰刀菌和茄类镰刀菌［１９］。李金花等［２０］从甘肃省６个采样区共分离到２９３株镰刀菌株，参照Ｎｅｌｓｏｎ镰刀
菌分类系统进行鉴定和致病性测定，发现以接骨木镰刀菌和茄病镰刀菌出现频率高，是甘肃马铃薯镰刀菌干腐病
的优势病原菌。
已有的大多研究认为，由镰刀菌引起的干腐病只是一种窖藏病害，在马铃薯生长期间不发病，病原菌可在土
壤中长期存活［１２２０］，但不少的研究指出，土壤中镰刀菌的大量积累可能是马铃薯连作障碍发生的原因之一。孟品
品等［２１］采用大田试验与变性梯度凝胶电泳（ＤＧＧＥ）相结合的方法，研究了马铃薯连作对根际土壤真菌种群结构
的影响及其生物效应，结果表明，随着连作年限的增加，马铃薯根际土壤土传病害病原菌尖孢镰刀菌和茄病镰刀
菌的数量明显增加。牛秀群等［２２］采用根残体分离法，研究了甘肃省干旱灌区马铃薯连作根际土壤镰刀菌分布与
马铃薯连作之间的关系，连作１～３年的优势种均为茄病镰孢，分离频率分别为３０．７８％，３７．７０％和４５．４８％。
孟品品等［２１］的研究仅仅分析了收获期根际土壤的情况，牛秀群等［２２］是从马铃薯根茬中分离的病原菌，研究对象
也仅仅只有１～３年的连作，本研究的目的之一是看看马铃薯连作１～５年根际土壤镰刀菌在整个生育期的动态
变化。
由于镰刀菌在自然界中分布广泛，已有研究发现镰刀菌分生孢子（特别是大分生孢子）、分生孢子座、产孢细
胞形态及培养性状等方面具有多样性，且易受环境影响产生变异，鉴定和识别不同镰刀菌种类比较复杂和困
难［２３］。通常是通过田间观察发病植株、平板分离病原菌、免疫学检测和鉴定的传统方法对病原真菌进行鉴别，病
原真菌的计数往往采用 ＭＰＮ平板培养计数的方法。这些方法不仅耗时长，效率和灵敏度较低，而且经验性强。
近年来，分子生物学技术的发展为土壤微生物的准确检测提供了方便，而不再单纯依赖于平板培养等传统技
术［２４２５］。２０世纪９０年代中期发展起来的实时荧光定量ＰＣＲ（ｒｅａｌｔｉｍｅＰＣＲ）技术可以对靶标核酸进行定量检
测，是一种方便、快速、准确的非培养的检测方法［２６３０］。但是这一方法是否适合于马铃薯种植土壤中镰刀菌干腐
病的定量研究尚未见报道，为此以马铃薯连作１～５年根际土壤为研究对象，建立优化马铃薯根际土壤干腐病镰
刀菌的实时荧光定量ＰＣＲ检测体系，并对马铃薯连作根际土壤进行检测和定量分析，以探明马铃薯根际土壤中
干腐病镰刀菌随生育时期和种植年限的动态变化趋势，为揭示马铃薯干腐病优势病原菌的积累与连作年限之间
的关系提供依据，进而寻求缓解和克服马铃薯连作障碍土传病害的有效途径。
１ 材料与方法
１．１ 研究区概况
选择位于甘肃省中部沿黄灌区的白银市景泰条山农场常年种植马铃薯的连作马铃薯田为试验田。供试区域
属温带干旱大陆性气候，年均气温９．１℃，年均降水量１８６ｍｍ，无霜日１４１ｄ，年均日照时数２７１３ｈ，日照百分率
６２％，海拔１２７４ｍ。供试土壤为灰钙土，有机质１０．１ｇ／ｋｇ，全氮０．７１ｇ／ｋｇ，全磷１．３４ｇ／ｋｇ，全钾３５．３１ｇ／ｋｇ，
碱解氮６６ｍｇ／ｋｇ、速效磷１４ｍｇ／ｋｇ，速效钾１９３ｍｇ／ｋｇ，ｐＨ８．０８（水土比５∶１）。当地水源充足，农业灌溉条件
良好。
１．２ 试验设计
在条山农场马铃薯种植区域内选择不同连作年限的相邻地块进行田间试验，以前茬为玉米（犣犲犪犿犪狔狊）的轮
作地块为对照（即连作０年，用ＣＫ表示），其余依次为连作１年（ＣＰ１）、２年（ＣＰ２）、３年（ＣＰ３）、４年（ＣＰ４）和５年
（ＣＰ５）。所选地块地势平坦、肥力均匀，具有代表性。每处理３个重复，小区面积９．０ｍ×６．１ｍ，采用宽垄双行
覆膜种植，播种前１ｄ切种薯，用 ＫＭｎＯ４ 浸泡消毒，垄宽１．３５ｍ，行距７０ｃｍ，株距１７ｃｍ，种植密度８４０７５
株／ｈｍ２。播种和施肥过程均采用机械化１次进行，而后由人工覆膜。不施用有机肥，化肥用１５１５１５的复合肥、
尿素和硫酸钾，Ｎ∶Ｐ２Ｏ５∶Ｋ２Ｏ＝１．４∶１．０∶２．０，氮肥用量为２１０ｋｇＮ／ｈｍ２。所有化肥均在播种时一次性基
施，田间管理措施同当地大田。４月２５日播种，８月２５日收获。供试品种为当地主栽的加工型马铃薯品种“大西
洋”，由条山农场提供。
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１．３ 样品采集
起垄前采集土壤基础土样，用于测定土壤的基本理化性状。分别在播前（５月４日）、块茎膨大期（７月３０
日）、收获期（８月２５日）采集根际土壤样品，每小区５株［２９］，将土样充分混合后装入无菌的聚乙烯袋中，保存在
－７０℃冰箱中用于土壤微生物总ＤＮＡ的提取。
１．４ 供试菌株培养及基因组ＤＮＡ提取
供试标准菌株马铃薯接骨木镰孢菌、茄病镰孢菌由甘肃农业大学李金花教授提供，晚疫病菌由甘肃省农业科
学院植物保护研究所李继平研究员提供，其余菌株由甘肃农业大学陈秀蓉教授提供。供试菌株经单孢分离纯化
后，在液体完全培养基中２４～２６℃摇培３～５ｄ后，收集菌丝团，用于提取基因组ＤＮＡ，采用植物真菌ＤＮＡ提取
试剂盒提取真菌ＤＮＡ（Ｏｍｅｇａ）［２９］。
１．５ 测定项目与方法
１．５．１ 土壤总ＤＮＡ提取和真菌转录间隔区（ＩＴＳ）序列的扩增 采用土壤总微生物ＤＮＡ提取试剂盒（Ｐｏｗｅｒ
ＳｏｉｌＴＭ ＤＮＡＩｓｏｌａｔｉｏｎｋｉｔ，ＭＯＢＩＯＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ，美国）提取土壤总ＤＮＡ，用１％琼脂糖凝胶电泳后经ＥＢ（溴
化乙锭）染色检查提取的ＤＮＡ质量。采用ＢＩＯＲＡＤ公司的Ｓ１０００ＴＭ ＴｈｅｒｍａｌＣｙｃｌｅ型ＰＣＲ仪，选用可扩增真
菌１８ＳｒＲＮＡ部分片段通用引物ＮＳ１（５′ＧＴＡＧＴＣＡＴＡＴＧＣＴＴＧＴＣＴＣ３′）和ＧＣＦｕｎｇｉ（５′ＧＣｃｌａｍｐＡＴＴＣ
ＣＣＣＧＴＴＡＣＣＣＧＴＴＧ３′）。
１．５．２ 马铃薯干腐病病原菌ＰＣＲ引物筛选和特异性验证 依据ＧｅｎＢａｎｋ中登录的马铃薯干腐病优势病原菌
茄病镰孢菌和接骨木镰孢菌及其近缘菌株ｒＤＮＡ的ＩＴＳ区的序列差异，参照文献，经多重比对试验后筛选的３
对ＰＣＲ引物（表１），对参试的６个标准病原菌ＤＮＡ琼脂糖凝胶电泳产物进行ＰＣＲ扩增，观察是否有特异性条
带，判断得到的是否是预期长度的ＤＮＡ片段，进行引物的特异性验证。
表１ 马铃薯干腐病菌犘犆犚引物筛选
犜犪犫犾犲１ 犜犺犲犘犆犚狆狉犻犿犲狉狊犲犾犲犮狋犻狅狀狅犳狆犪狋犺狅犵犲狀狊犮犪狌狊犻狀犵犉狌狊犪狉犻狌犿犱狉狔狉狅狋狅犳狆狅狋犪狋狅
类别Ｔａｒｇｅｔ 引物Ｐｒｉｍｅｒ 序列Ｓｅｑｕｅｎｃｅ（５′ｔｏ３′） 退火温度Ａｎｎｅａｌｉｎｇｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ（℃） ＤＮＡ片段长度Ａｍｐｌｉｃｏｎ（ｂｐ）
犉狌狊犪狉犻狌犿 Ｆ．ｓ ５′ＣＴＣＴＧＧＣＡＡＧＴＣＧＡＣＣＡＣＴＧＴ３′ ６０ １４７～１７０
Ｆ．ｓ ５′ＣＧＡＴＧＧＴＴＣＧＣＴＴＧＴＣＧＡＴＡ３′
犉．狊犪犿犫狌犮犻狀狌犿 ＥＦ１Ｈ ５′ＡＴＧＧＧＴＡＡＧＧＡＡＧＡＣＡＡＧＡＣ３′ ６３ ６６０
ＥＦ１ ＥＦ２Ｔ ５′ＧＧＡＡＧＴＡＣＣＡＧＴＧＡＴＣＡＴＧＴＴ３
ＩＴＳ１１８ｓＩＴＳ２ ＩＴＳ ５′ＣＡＡＧＣＡＴＴＧＴＣＧＣＣＡＣＴＣ３′
５′ＧＴＴＴＧＧＣＴＣＴＡＣＣＧＧＧＡＣＴＧ３′ ６２ １０００
１．５．３ 荧光定量ＰＣＲ检测体系的优化 荧光定量ＰＣＲ仪器为ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ７５００实时定量ＰＣＲ仪（美
国应用生物系统公司）。反应体系配制须在超净工作台及冰上且避光。
荧光定量ＰＣＲ预实验得知在反应体系中引物浓度过高会有引物二聚体产生，过低影响扩增效率，因此，设置
引物浓度范围为０．２～０．４μＬ（１０ｍｍｏｌ／Ｌ），根据溶解曲线和扩增效率确定适宜的引物浓度。
模板浓度过高或过低也会影响溶解曲线的峰值，即扩增效率的大小，因此，设置ＤＮＡ模板浓度范围为２～４
μＬ（１０ｍｍｏｌ／Ｌ），观察不同浓度的模板ＤＮＡ对扩增效率及荧光吸收强度的影响，确定最合适的ＤＮＡ模板浓度。
退火温度的高低也会影响定量ＰＣＲ反应的特异性和准确性，设置退火温度为５８，６０，６２℃。
反应体系：ＳＹＢＲ＠ＰｒｅｍｉｘＴａｑＭａｎＰＣＲＭａｓｔｅｒＭｉｘ（ＡＢＩ公司）混合液１０μＬ，ＢｏｘⅡ（荧光染料）０．４μＬ，上
下游引物０．２～０．４μＬ（１０ｍｍｏｌ／Ｌ），ＤＮＡ模板２～４μＬ，ｄｄＨ２Ｏ补足２０μＬ。
反应程序：９５℃预变性３０ｓ，９５℃变性５ｓ，５８～６０℃退火３４ｓ，４０个循环，９５℃延伸１５ｓ，６０℃６０ｓ，９５℃
１５ｓ，６０℃１５ｓ。在每一循环的退火阶段收集荧光，实时检测反应并且记录荧光信号的变化，绘制扩增产物的熔
解曲线。
１４２第２２卷第６期 草业学报２０１３年
１．５．４ 重组质粒荧光定量ＰＣＲ标准曲线建立 将茄病镰孢菌和接骨木镰孢菌特异引物扩增后的ＰＣＲ产物纯
化后，连接至ＰＵＣ１８Ｔ载体上，转化至大肠杆菌中，挑取转化后平板上的白色单克隆提取质粒ＤＮＡ，测序确定插
入的片段是否正确。测定质粒ＤＮＡ浓度，绘制标准曲线。
１．６ 连作马铃薯根际土壤茄病镰孢菌和接骨木镰孢菌随连作年限、生育进程的动态变化趋势
应用优化的荧光定量ＰＣＲ扩增条件对连作马铃薯根际土壤在不同连作年限、不同生育进程的茄病镰孢菌和
接骨木镰孢菌进行定量检测，分析茄病镰孢菌和接骨木镰孢菌随连作年限和生育进程动态变化趋势。
１．７ 数据分析
采用Ｅｘｃｅｌ和ＤＰＳ１０．０数据分析软件进行数据统计分析和作图。
２ 结果与分析
２．１ ＰＣＲ引物筛选及特异性验证
经多重比对试验后筛选确定马铃薯干腐病病原菌茄病镰孢菌和接骨木镰孢菌的ＰＣＲ引物为共同的１对，
Ｆ．ｓＦ：５′ＣＴＣＴＧＧＣＡＡＧＴＣＧＡＣＣＡＣＴＧＴ３′，Ｆ．ｓＲ：５′ＣＧＡＴＧＧＴＴＣＧＣＴＴＧＴＣＧＡＴＡ３′，采用该引物对，以
扩增条件优化试验筛选出的退火温度６０℃，对土壤总ＤＮＡ琼脂糖凝胶电泳产物进行ＰＣＲ扩增，除马铃薯茄病
镰孢菌和接骨木镰孢菌能扩增出１４７～１７０ｂｐ大小的特异性条带外，其他供试菌株马铃薯立枯丝核菌、晚疫病
菌、甜瓜枯萎病和棉花枯萎病菌均无扩增产物，说明所筛选的引物是马铃薯干腐病茄病镰孢菌和接骨木镰孢菌的
专用引物（表２）。
表２ 供试菌株的常规犘犆犚特异性引物扩增结果
犜犪犫犾犲２ 犜犺犲狉犲狊狌犾狋狊狅犳狊狆犲犮犻犳犻犮犻狋狔犪狊狊犪狔犫狔犮狅狀狏犲狀狋犻狅狀犪犾犘犆犚
供试菌株Ｔｅｓｔｅｄｓｔｒａｉｎｓ 寄主 Ｈｏｓｔ 常规ＰＣＲＣｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌＰＣＲ 荧光定量ＰＣＲＲｅａｌｔｉｍｅＰＣＲ
马铃薯干腐病菌茄病镰孢菌犉狌狊犪狉犻狌犿狊狅犾犪狀犻 马铃薯Ｐｏｔａｔｏ ＋ ＋
马铃薯干腐病菌接骨木镰孢菌犉狌狊犪狉犻狌犿狊犪犿犫狌犮犻狀狌犿 马铃薯Ｐｏｔａｔｏ ＋ ＋
马铃薯立枯丝核菌犚犺犻狕狅犮狋狅狀犻犪狊狅犾犪狀犻 马铃薯Ｐｏｔａｔｏ — —
马铃薯晚疫病菌犘犺狔狋狅狆犺狋犺狅狉犪犻狀犳犲狊狋犪狀狊 马铃薯Ｐｏｔａｔｏ — —
甜瓜枯萎病菌犉狌狊犪狉犻狌犿狅狓狔狊狆狅狉狌犿ｆ．ｓｐ．Ｍｅｌｏｎ 甜瓜 Ｍｅｌｏｎ — —
棉花枯萎病菌犉狌狊犪狉犻狌犿狅狓狔狊狆狅狉狌犿ｆ．ｓｐ．ｖａｓｉｎｆｅｃｔｕｍ 棉花Ｃｏｔｔｏｎ — —
注：用“＋”表示可进行ＰＣＲ扩增；“—”表示未能进行ＰＣＲ扩增。
Ｎｏｔｅ：Ｕｓｅｔｈｅ“＋”ｉｎｄｉｃａｔｅｓｔｈａｔｉｔｃａｎｂｅａｍｐｌｉｆｉｅｄｂｙＰＣＲ；Ｕｓｅｔｈｅ“—”ｉｎｄｉｃａｔｅｓｔｈａｔｉｔｃａｎｎｏｔｂｅａｍｐｌｉｆｉｅｄｂｙＰＣＲ．
２．２ 荧光定量ＰＣＲ检测体系的优化
２．２．１ 重组质粒荧光定量ＰＣＲ标准曲线的建立 分别将茄病镰孢菌和接骨木镰孢菌ＰＣＲ产物纯化、连接并转
化至大肠杆菌中，提取质粒ＤＮＡ。选择范围在１０－３～１０－８ｃｆｕ／ｍＬ之间的模板浓度梯度进行反应，确定阈值和
基线，绘制出标准曲线。调整阈值和基线的配比，确定Ｃｔ值（每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历
的循环数，ｃｙｃｌｅｔｈｒｅｓｈｏｌｄ），经转换得出标准曲线（图１），最终得出的标准曲线方程分别为接骨木镰孢菌：
狔＝－３．４９０１狓＋３４．８１１，茄病镰孢菌：狔＝－３．４９２５狓＋３６．６８８，横坐标为病原菌浓度（拷贝数）的ｌｇ值，纵坐标为
荧光定量ＰＣＲ测得的Ｃｔ值。通过测得的Ｃｔ值，计算待测样品中病原菌的拷贝数。标准曲线相关系数犚２ 达到
０．９９８以上，可以作为此方法的标准曲线。
２．２．２ 反应条件优化 实验最终确定的引物浓度为上下游引物各０．４μＬ（１０ｍｍｏｌ／Ｌ），ＤＮＡ模板浓度２μＬ，
退火温度为６０℃。荧光定量ＰＣＲ与常规ＰＣＲ引物相同。荧光定量ＰＣＲ扩增结果显示（图２），质粒模板的Ｓ型
扩增曲线光滑平稳，且指数增长期、线性增长期及平台期明显，扩增效率较高，溶解曲线单峰，没有出现非特异性
扩增的杂峰及引物二聚体的低矮小峰，符合定量检测要求，表明该引物的特异性较强且反应条件得到优化。
２．２．３ 方法可行性验证 应用优化的ＳＹＢＲＧＲＥＥＮ荧光染料ＰＣＲ定量法对根际土壤中的优势病原真菌马铃
薯茄病镰孢菌和接骨木镰孢菌进行定量检测（图３）。将马铃薯茄病镰孢菌和接骨木镰孢菌标准质粒进行１０倍
梯度依次稀释后，选取１０－３～１０－８ｃｆｕ／ｍＬ的稀释样品作为模板进行荧光定量ＰＣＲ反应，３个重复之间的Ｃｔ值
２４２ ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ（２０１３） Ｖｏｌ．２２，Ｎｏ．６
标准偏差小于０．２０，变异系数（ＣＶ）在规定范围内，说明标准曲线具有较好的精确度和良好的重复性，同时表明
研究建立的荧光定量ＰＣＲ检测方法可以作为马铃薯干腐病优势病原菌茄病镰孢菌和接骨木镰孢菌的定量检测
方法（表３）。
图１ 荧光定量犘犆犚马铃薯干腐病优势病原菌标准曲线
犉犻犵．１ 犚犲犪犾狋犻犿犲犘犆犚狊狋犪狀犱犪狀犱犮狌狉犲狅犳狅犳犪犱狏犪狀狋犪犵犲狆犪狋犺狅犵犲狀犻犮犳狌狀犵犻狅犳狆狅狋犪狋狅犱狉狔狉狅狋
左图为茄病镰孢菌的标准曲线，右图为接骨木镰孢菌的标准曲线。ＴｈｅｌｅｆｔｐｉｃｔｕｒｅｉｓｒｅａｌｔｉｍｅＰＣＲｓｔａｎｄａｎｄｃｕｒｅｏｆｏｆ犉．狊狅犾犪狀犻，ｔｈｅｒｉｇｈｔｉｓｔｈａｔ
ｏｆ犉．狊犪犿犫狌犮犻狀狌犿．
图２ 茄病镰孢菌的溶解曲线和扩增曲线
犉犻犵．２ 犇犻狊狊狅犮犻犪狋犻狅狀犮狌狉狏犲犪狀犱犱犲犾狋犪犚狀狏狊犮狔犮犾犲狅犳犉．狊狅犾犪狀犻犪狊狊犪狔犱犲狋犲犮狋犲犱犫狔狉犲犪犾狋犻犿犲犘犆犚
图３ 接骨木镰孢菌的溶解曲线和扩增曲线
犉犻犵．３ 犇犻狊狊狅犮犻犪狋犻狅狀犮狌狉狏犲犪狀犱犱犲犾狋犪犚狀狏狊犮狔犮犾犲狅犳犉．狊狌犿犫狌犮犻狀狌犿犪狊狊犪狔犱犲狋犲犮狋犲犱犫狔狉犲犪犾狋犻犿犲犘犆犚
３４２第２２卷第６期 草业学报２０１３年
表３ 马铃薯干腐病优势病原菌质粒浓度荧光定量犘犆犚检测的精密度
犜犪犫犾犲３ 犘狉犲犮犻狊犻狅狀狅犳犱犻犳犳犲狉犲狀狋犮狅狀犮犲狀狋狉犪狋犻狅狀狊狊狋犪狀犱犪狉犱狆犾犪狊犿犻犱狊犱犲狋犲犮狋犲犱犫狔狉犲犪犾狋犻犿犲犘犆犚
质粒稀释倍数
Ｐｌａｓｍｉｄ
ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ
茄病镰刀菌犉．狊狅犾犪狀犻
Ｃｔ值平均值及标准偏差Ｃｔａｖｅｒａｇｅｖａｌｕｅ
ａｎｄｓｔａｎｄａｒｄｄｅｖｉａｔｉｏｎ（Ｍｅａｎ±ＳＤ）
变异系数Ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔ
ｏｆｖａｒｉａｔｉｏｎ（％）
接骨木镰刀菌犉．狊犪犿犫狌犮犻狀狌犿
Ｃｔ值平均值及标准偏差Ｃｔａｖｅｒａｇｅｖａｌｕｅ
ａｎｄｓｔａｎｄａｒｄｄｅｖｉａｔｉｏｎ（Ｍｅａｎ±ＳＤ）
变异系数Ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔ
ｏｆｖａｒｉａｔｉｏｎ（％）
１０－８ ３１．９０±０．１０ ０．３１ ３２．１６±０．１４ ０．４２
１０－７ ２９．０９±０．０８ ０．２６ ２８．３１±０．０８ ０．２７
１０－６ ２５．５０±０．０７ ０．２８ ２４．４４±０．０６ ０．２６
１０－５ ２２．１１±０．０８ ０．３６ ２１．１９±０．１３ ０．６１
１０－４ １８．１８±０．０５ ０．２９ １７．４３±０．１２ ０．７０
１０－３ １４．２８±０．０７ ０．５２ １４．０９±０．１１ ０．７９
２．３ 马铃薯干腐病优势病原菌在连作根际土壤随连作年限动态变化趋势
２．３．１ 播前随连作年限动态变化趋势 播前，根际茄病镰孢菌的累积量总体上低于接骨木镰孢菌，连作年限间
的增长幅度也是茄病镰孢菌小于接骨木镰孢菌。其中茄病镰孢菌ＣＰ５ 根际平均累积量为７．２２×１０３ 拷贝／ｇ，比
ＣＫ增加了３４．７倍；ＣＰ４，ＣＰ３，ＣＰ２，ＣＰ１ 的比ＣＫ分别增加了１９．０，６６．８，１１．６，４．４倍。接骨木镰孢菌ＣＰ５ 根际
平均累积量为３．６４×１０４ 拷贝／ｇ，比ＣＫ增加了３１．８倍；ＣＰ４，ＣＰ３，ＣＰ２，ＣＰ１ 的比ＣＫ分别增加了１０．０，１８．５，
１１．０，４．４倍（图４）。
图４ 马铃薯连作根际土壤干腐病优势病原菌
随连作年限变化趋势
犉犻犵．４ 犜犺犲犱狔狀犪犿犻犮犮犺犪狀犵犻狀犵狋狉犲狀犱狅犳犪犱狏犪狀狋犪犵犲狆犪狋犺狅犵犲狀犻犮
犳狌狀犵犻狅犳狆狅狋犪狋狅犱狉狔狉狅狋犫狔犮狅狀狋犻狀狌狅狌狊犮狉狅狆狆犻狀犵狔犲犪狉狊
犻狀狉犺犻狕狅狊狆犺犲狉犲狊狅犻犾狅犳犮狅狀狋犻狀狌狅狌狊犮狉狅狆狆犻狀犵狅犳狆狅狋犪狋狅
２．３．２ 块茎膨大期随连作年限动态变化趋势 块茎膨大期，根际茄病镰孢菌的累积量总体上低于接骨木镰孢
菌，但是二者之间的累积量和增长率接近，茄病镰孢菌和接骨木镰孢菌的数量均随连作年限的递增呈上升趋势。
其中茄病镰孢菌ＣＰ５ 根际平均累积量为８．０３×１０３ 拷贝／ｇ，比ＣＫ增加了２９．５倍 ；ＣＰ４，ＣＰ３，ＣＰ２，ＣＰ１ 的比ＣＫ
分别增加了１２．９，４３．９，６．８，２．２倍。接骨木镰孢菌ＣＰ５ 根际平均累积量为２．６２×１０４ 拷贝／ｇ，比ＣＫ增加了
４４２ ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ（２０１３） Ｖｏｌ．２２，Ｎｏ．６
２９．８倍 ；ＣＰ４，ＣＰ３，ＣＰ２，ＣＰ１ 的比ＣＫ分别增加了１３．９，２４．３，９．８，４．０倍。
２．３．３ 收获期病原菌和产量随连作年限动态变化趋势 收获期，根际茄病镰孢菌的累积量总体上高于接骨木镰
孢菌，其累积量和增长率远远高出接骨木镰孢菌。茄病镰孢菌和接骨木镰孢菌的数量均随连作年限的递增呈上
升趋势。其中茄病镰孢菌ＣＰ５ 根际平均累积量为２．８２×１０４ 拷贝／ｇ，比ＣＫ增加了２９．７倍；ＣＰ４、ＣＰ３、ＣＰ２、ＣＰ１
的比ＣＫ分别增加了９．１，２５．０，６．０，２．８倍。接骨木镰孢菌ＣＰ５ 根际平均累积量为３．５９×１０３ 拷贝／ｇ，比ＣＫ增
加了５．２倍；ＣＰ４，ＣＰ３，ＣＰ２，ＣＰ１ 的比ＣＫ分别增加了２．４，０．４，１．２，１．０倍。
３ 结论与讨论
本研究建立优化的荧光定量ＰＣＲ快速检测体系，实现了不通过病薯、病残体及土壤常规分离培养方法，仅通
过定量检测土壤微生物总ＤＮＡ，就可掌握马铃薯生长期间病原菌在根际土壤中的累积状况，至于根际土壤病原
菌累积量与马铃薯干腐病发生流行之间的关系，有待下一步研究。
本研究发现，马铃薯干腐病优势病原菌茄病镰孢菌和接骨木镰孢菌在马铃薯连作根际土壤中的变化动态是
随连作年限的递增呈上升趋势。这可能是由于马铃薯干腐病优势病原菌茄病镰孢菌和接骨木镰孢菌可以在土壤
中存活数年，连续重茬种植会引起病原菌的累积。这个结果与孟品品等［２１］、牛秀群等［２２］的研究结论相符。孟品
品等［２１］研究表明随着连作年限的增加，马铃薯收获期根际土壤土传病害病原菌尖孢镰刀菌和茄病镰孢菌的数量
明显增加。牛秀群等［２２］研究认为在１～３年连作中，随着连作年限的增加，马铃薯根茬中分离的镰刀菌数量呈上
升趋势。
同时，由２种优势病原菌的绝对量变化趋势可以看出，轮作的根际土壤病原菌几乎没有积累，到连作第３年，
累积量达到１×１０４ 拷贝／ｇ，到第４年略有下降，连作第５年又呈上升趋势。这说明病原菌的累积量在连作３年
有１个阈值。有研究对土壤中的烟草疫霉（犘犺狔狋狅狆犺狋犺狅狉犪狀犻犮狅狋犻犪狀犪犲）进行定量分析时发现，可以通过检测土壤
菌量阈水平范围，进行预测性的诊断试验，如果某块田地土壤中病原菌的菌量超过了阈值，就可以确定其为高发
病的田地［２８］。在进行杀菌剂剂量选择时，可以将土壤中的真菌繁殖体的阈水平作为依据。例如在柑橘类植物
中，如果对于根茎而言，疫霉的数量高于１５～２０个繁殖体／ｇ土时确定为易感的，并且高于３０个繁殖体／ｇ土时确
定为有抗性的，在这种标准下确定杀菌剂的施用方案也更为经济合理［２７］。至于马铃薯干腐病病原菌累积绝对量
阈值与发病率之间的关系有待进一步研究。
随着连作年限的递增，２种病原菌呈几十倍递增的结果导致了土壤微生物种群结构发生改变，土壤真菌数量
增加，相应地也增加了马铃薯干腐病的感病机率。从病原菌的累积和产量的双重变化趋势分析，连作２年以下对
马铃薯产量无显著影响，而连作３年以上会严重降低块茎产量，这与各连作年限间根际土壤病原菌累积量的增长
结果一致，揭示了研究区马铃薯连作的阈值可能为３年。这也与孟品品等［２１］用变性梯度凝胶电泳（ＤＧＧＥ）所做
的研究结论相一致。由此可以初步断定连作马铃薯根际土壤中镰刀菌的大量积累可能是导致马铃薯连作障碍发
生的主要原因之一。
马铃薯干腐病的２种优势病原菌随生育进程变化动态明显不同，其中马铃薯根际土壤茄病镰孢菌的数量随
生育进程的推进呈上升趋势，接骨木镰刀菌则相反，随生育进程的推进呈下降趋势，这主要是因为二者的生物学
特性对土壤温度的要求不同。据气候资料，研究区４月即播前的月平均气温为１０℃左右，８月即块茎膨大期的月
平均气温为２０℃左右，９月即收获期的月平均气温为１５℃左右。另据有关报道［２０，２４２５，３３］，茄病镰孢菌的生长适温
为２０～２５℃，而接骨木镰刀菌生长的最适温度为１０～１５℃。Ｔｈｅｒｏｎ和 Ｈｏｌｚ［３３］研究发现，茄病镰孢菌喜欢适当
的高温，在２５℃时生长速率最快，在１０～１５℃时生长缓慢，而接骨木镰刀菌生长的最适温度是１０～１５℃。李金
花等［２０］研究发现，茄病镰孢菌在３０℃的生长速率较２５℃时大，而接骨木镰刀菌则相反，在２５℃的生长速率大于
在３０℃的生长速率，这说明在生长特性方面，茄病镰孢菌比接骨木镰刀菌更能适应偏高的环境温度。由此可见，
２种优势病原菌随生育进程变化趋势是病原菌的生物学特性与环境条件相适应的结果。
建立并优化马铃薯干腐病病原菌茄病镰孢菌和接骨木镰孢菌的荧光定量ＰＣＲ检测方法体系及反应程序。
主要优化参数为：上下游引物各０．４μＬ（１０ｍｍｏｌ／Ｌ），ＤＮＡ模板３μＬ，退火温度６０℃。扩增效率为０．９３３～
０．９３４，在０．９～１．２之间；Ｃｔ值标准偏差为０．０５～０．１４，小于０．２；标准曲线相关系数犚２ 为０．９９９～０．９９８；曲线
５４２第２２卷第６期 草业学报２０１３年
斜率为－３．４９３～－３．４９０，在－３～３．５之间，各项指标均在行业标准（ＳＮＴ２５８９２０１０）规定范围之内，可检测到
根际土壤中浓度为１×１０２ 拷贝／ｇ土的马铃薯干腐病茄病镰孢菌和接骨木镰孢菌，对马铃薯干腐病茄病镰孢菌
和接骨木镰孢菌实现了快速检测和绝对定量。
本研究还发现茄病镰孢菌和接骨木镰孢菌在播前至块茎膨大期呈缓慢变化的趋势，而在块茎膨大期至收获
期的变化幅度较大。由此可见，生育前期，是马铃薯干腐病菌进入潜伏侵染的关键时期，在这一时期采取相应措
施控制病原菌的积累对干腐病的防治是十分必要的。这也与马铃薯干腐病病原菌的潜伏侵染规律相吻合，据报
道［２１，２３］，马铃薯干腐病病原菌初期潜伏在土壤或种薯中，通过由其他病菌、昆虫或农事操作造成的伤口侵入生长
期间的块茎，然后在贮藏期逐渐发展成为干腐病。
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狀犻狌犿犮狌犮狌狉犫犻狋犪犮犲犪狉狌犿ａｎｄ犕狅狀狅狊狆狅狉犪狊犮狌狊犮犪狀狀狅狀犫犪犾犾狌狊ｏｎｍｕｓｋｍｅｌｏｎ［Ｊ］．ＳｕｂｔｒｏｐｉｃａｌＰｌａｎｔＳｃｉｅｎｃｅ，１９９９，５１：２３２８．
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ｔｅｄｆｒｏｍｐｏｔａｔｏｔｕｂｅｒｓａｎｄｔｈｅｉｒｔｏｘｉｃｉｔｙｔｏｂｒｉｎｅｓｈｒｉｍｐｓ（犃狉狋犲犿犻犪狊犪犾犻狀犪）［Ｊ］．ＭｙｃｏｔｏｘｉｎＲｅｓｅａｒｃｈ，１９８９，５：６１６７．
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ｔａｔｏＲｅｓｅａｒｃｈ，１９９０，３３（１）：１０９１１７．
７４２第２２卷第６期 草业学报２０１３年
犆犺犪狀犵犲狊犻狀狋犺犲犱狅犿犻狀犪狀狋狆犪狋犺狅犵犲狀狊犮犪狌狊犻狀犵犉狌狊犪狉犻狌犿犱狉狔狉狅狋狅犳狆狅狋犪狋狅犻狀狉犺犻狕狅狊狆犺犲狉犻犮狊狅犻犾
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ＬＩＲｕｉｑｉｎ１，２，ＬＩＵＸｉｎｇ１，３，ＱＩＵＨｕｉｚｈｅｎ１，３，４，ＺＨＡＮＧＷｅｎｍｉｎｇ１，３，４，ＺＨＡＮＧＣｈｕｎｈｏｎｇ１，３，４，
ＷＡＮＧＤｉ３，４，５，ＺＨＡＮＧＪｕｎｌｉａｎ３，４，５，ＳＨＥＮＱｉｒｏｎｇ６
（１．ＣｏｌｅｇｅｏｆＲｅｓｏｕｒｃｅｓａｎｄＥｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ，ＧａｎｓｕＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｌａｎｚｈｏｕ７３００７０，
Ｃｈｉｎａ；２．ＧａｎｓｕＡｃａｄｅｍｙｏｆＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ，ＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＧｒｅｅｎＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌａｎｄＡｎｉｍａｌ＆
ＰａｓｔｕｒｅＩｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ，Ｌａｎｚｈｏｕ７３００７０，Ｃｈｉｎａ；３．ＧａｎｓｕＰｒｏｖｉｎｃｅＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＡｒｉｄｌａｎｄ
ＣｒｏｐＳｃｉｅｎｃｅ，Ｌａｎｚｈｏｕ７３００７０，Ｃｈｉｎａ；４．ＧａｎｓｕＰｒｏｖｉｎｃｅＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＣｒｏｐＧｅｎｅｔｉｃ＆
ＧｅｒｍｐｌａｓｍＥｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ，Ｌａｎｚｈｏｕ７３００７０，Ｃｈｉｎａ；５．ＣｏｌｅｇｅｏｆＡｇｒｏｎｏｍｙ，Ｇａｎｓｕ
ＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｌａｎｚｈｏｕ７３００７０，Ｃｈｉｎａ；６．ＣｏｌｅｇｅｏｆＲｅｓｏｕｒｃｅｓ
ａｎｄＥｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ，ＮａｎｊｉｎｇＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ
Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｎａｎｊｉｎｇ２１００９５，Ｃｈｉｎａ）
犃犫狊狋狉犪犮狋：Ｔｈｅｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｂｅｔｗｅｅｎｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓｃｒｏｐｐｉｎｇｏｂｓｔａｃｌｅｓａｎｄａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎｏｆｐａｔｈｏｇｅｎｓｉｎｒｈｉｚｏｓｐｈｅｒ
ｉｃｓｏｉｌｗａｓｅｖａｌｕａｔｅｄ，ａｎｄｔｈｅｍｅｃｈａｎｉｓｍｓｏｆｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓｐｏｔａｔｏｃｒｏｐｐｉｎｇｏｂｓｔａｃｌｅｓｅｘｐｌｏｒｅｄ，ｕｓｉｎｇａｎｏｐｔｉｍｉｚｅｄ
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ｃｈｅｃｋｓａｎｄｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆ犉狌狊犪狉犻狌犿狊犪犿犫狌犮犻犿ａｎｄ犉．狊狅犾犪狀犻ｉｎｓｏｉｌｓｉｎｆｅｓｔｅｄｗｉｔｈｐｏｔａｔｏ犉狌狊犪狉犻狌犿ｄｒｙｒｏｔ
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ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓｌｙｃｒｏｐｐｅｄｐｏｔａｔｏ．Ｔｈｅｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｏｆｐｒｉｍｅｒｓｗａｓ０．４μＬ（１０ｍｍｏｌ／Ｌ），ｏｆＤＮＡｔｅｍｐｌａｔｅｗａｓ３
μＬ，ａｎｄｔｈｅａｎｎｅａｌｉｎｇｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅｗａｓ６０℃．Ｗｉｔｈａｎｉｎｃｒｅａｓｅｉｎｙｅａｒｓｏｆｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓｃｒｏｐｐｉｎｇｐｏｔａｔｏ，ｔｈｅ
ｎｕｍｂｅｒｓｏｆ犉．狊狅犾犪狀犻ａｎｄ犉．狊犪犿犫狌犮犻犿ｉｎｒｈｉｚｏｓｐｈｅｒｉｃｓｏｉｌｓｈｏｗｅｄａｎｕｐｗａｒｄｔｒｅｎｄ．Ｔｈｅｌａｒｇｅｓｔａｍｏｕｎｔ
（１．４５×１０４ｃｏｐｉｅｓ／ｇ）ｏｆ犉．狊狅犾犪狀犻ａｃｃｕｍｕｌａｔｅｄｄｕｒｉｎｇｔｈｅｓｑｕａｒｉｎｇｐｅｒｉｏｄｏｆｆｉｖｅｙｅａｒｓａｎｄｉｔｉｎｃｒｅａｓｅｄ２７．８
ｔｉｍｅｓｃｏｍｐａｒｅｄｗｉｔｈｔｈｅｃｏｎｔｒｏｌｇｒｏｕｐ（ＣＫ）．犉．狊狅犾犪狀犻ｃｕｍｕｌａｎｔｓＣＰ４，ＣＰ３，ＣＰ２，ＣＰ１ｗｅｒｅｍｏｒｅｔｈａｎｔｈｏｓｅ
ｏｆＲＰａｎｄｉｎｃｒｅａｓｅｄｂｙ１１．４，３５．５，６．９ａｎｄ２．８ｔｉｍｅｓｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ｔｈｅｌａｒｇｅｓｔａｍｏｕｎｔｏｆ犉．狊犪犿犫狌犮犻犿ｃｕｍｕ
ｌａｎｔｓ（２．２１×１０４ｃｏｐｉｅｓ／ｇ）ｗａｓａｌｓｏｄｕｒｉｎｇｔｈｅｓｑｕａｒｉｎｇｐｅｒｉｏｄｏｆｆｉｖｅｙｅａｒｓａｎｄｃｏｍｐａｒｅｄｔｏｔｈｅＣＫｔｈｅｙｉｎ
ｃｒｅａｓｅｄ２５．０ｔｉｍｅｓ．Ｔｈｅ犉．狊犪犿犫狌犮犻犿ｃｕｍｕｌａｎｔｓＣＰ４，ＣＰ３，ＣＰ２，ＣＰ１ｗｅｒｅｍｏｒｅｔｈａｎｔｈｏｓｅｏｆｔｈｅＣＫａｎｄｉｎ
ｃｒｅａｓｅｄｂｙ１０．５，１６．３１，８．３２ａｎｄ３．５１ｔｉｍｅｓｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎｏｆｒｈｉｚｏｓｐｈｅｒｉｃ犉狌狊犪狉犻狌犿ｍａｙｂｅｏｎｅ
ｏｆｔｈｅｍａｉｎｒｅａｓｏｎｓｆｏｒｔｈｅｏｃｃｕｒｒｅｎｃｅｏｆｏｂｓｔａｃｌｅｓｔｏｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓｐｏｔａｔｏｃｒｏｐｐｉｎｇ．
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ｃｒｏｐｐｉｎｇｓｙｓｔｅｍｓ；ｒｅａｌｔｉｍｅＰＣＲ；ｄｙｎａｍｉｃｃｈａｎｇｉｎｇｔｒｅｎｄ
８４２ ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ（２０１３） Ｖｏｌ．２２，Ｎｏ．６