全 文 ：书农杆菌介导的犔狔狕犌犉犘基因对匍匐翦股颖
犘犲狀狀犃１转化和表达的研究
安惠惠１，２，３，马晖玲１，２，３，李坚４，白生军１，３，马祥１，３
（１．草业生态系统教育部重点实验室 甘肃农业大学，甘肃 兰州７３００７０；２．甘肃省草业工程实验室，甘肃 兰州７３００７０；３．中美草地畜牧业
可持续发展研究中心，甘肃 兰州７３００７０；４．陆地水循环及地表过程重点实验室 中国科学院地理科学与资源研究所，北京１００１０１）
摘要：以匍匐翦股颖ＰｅｎｎＡ１成熟胚为供试材料，建立了其植株高效再生体系。利用农杆菌介导法将溶菌酶与绿
色荧光蛋白ＬｙｚＧＦＰ双元基因转入匍匐翦股颖ＰｅｎｎＡ１胚性愈伤组织中，经培养获得抗病转基因植株。并对
ＬｙｚＧＦＰ双元基因转化ＰｅｎｎＡ１的适宜条件进行了研究。研究结果表明，在２．０ｍｇ／Ｌ２，４Ｄ＋０．１ｍｇ／Ｌ６ＢＡ
的 ＭＳ培养基上ＰｅｎｎＡ１愈伤组织诱导率最高，可达３６％，且质量最好。愈伤组织在ＭＳＯ＋０．５ｍｇ／ＬＮＡＡ上分
化率最高，达４２．５％；浓度为３００ｍｇ／Ｌ的头孢霉素（Ｃｅｆ）可抑制农杆菌ＬＢＡ４４０４的生长；ＰｅｎｎＡ１胚性愈伤组织
经携有ｐＢＩ１２１ＬｙｚＧＦＰ的农杆菌ＬＢＡ４４０４（ＯＤ６００值０．３～０．５）侵染１０～１５ｍｉｎ，共培养３ｄ后，转化愈伤组织生
长状况良好，转化率达１２．５％，且在后期的生长和转化苗的再生中有良好的表现，转化苗再生率为２７．５％；转化
植株有较强的荧光表达量，并经ＰＣＲ检测，获得的２株匍匐翦股颖ＰｅｎｎＡ１转化植株中均扩增出７５０ｂｐ的目标
基因片断。
关键词：匍匐翦股颖；基因转化；溶菌酶Ｌｙｚ基因；绿色荧光蛋白ＧＦＰ基因
中图分类号：Ｓ５４３＋．９０３；Ｑ９４３．２ 文献标识码：Ａ 文章编号：１００４５７５９（２０１２）０２０１４１０８
匍匐翦股颖（犃犵狉狅狊狋犻狊狊狋狅犾狅狀犻犳犲狉犪）为禾本科翦股颖属多年生草本植物，原产欧亚大陆，在我国甘肃、河北、浙
江、江西、贵州、云南等地均有分布。它具有较强的耐寒性、耐旱性、耐瘠性、耐荫性，横向蔓延能力强，能迅速覆盖
地面形成密度大的草坪，耐低修剪，能形成一个细致、植株密度高、均一的高质量草坪。被广泛用于高尔夫球场果
岭、发球盘、保龄球场等，亦可用于一般园林绿化、厂矿区绿化等各类草坪。随着国外草种的大量引进、绿地面积
的不断扩大及草坪集约化管理程度的提高，草坪病害成为当今影响草坪利用价值、遏制当今草坪业发展的主要因
素之一［１］。草坪真菌病害是草坪草上的主要病害，占病害总数的８０％以上［２］。其中匍匐翦股颖抗病性较差，尤
其在盛夏高温潮湿环境下极易感病，如立枯病、钱斑病、褐斑病、白粉病等［３］。近年来在草坪建植中广泛使用的匍
匐翦股颖Ｐｅｎｎ系列品种之一ＰｅｎｎＡ１所形成的草坪密度高，色泽美，草质优，但其对币斑病（由犛犮犾犲狉狅狋犻狀犻犪犺狅
犿狅犲狅犮犪狉狆犪所致）比较敏感，易感染。植物病害给草坪生产和经营带来极大损失，因此培育匍匐翦股颖抗病新品
种迫在眉睫。
传统育种周期长、病原小种的更新速度远高于新品种培育速度。随着生命科学和生物技术不断取得重大突
破，生物经济将在提高人民健康水平、保障粮食安全、缓解能源压力、改善生态环境等方面发挥着重要的、不可替
代的作用，亦将成为新科技革命的重要推动力［４］。运用转基因技术将外源基因导入植物体获得转基因植株也已
成为目前改良草坪草包括匍匐翦股颖的重要手段。Ｃｈａｉ等［５］首次在匍匐翦股颖、细弱翦股颖（犃犵狉狅狊狋犻狊狋犲狀狌犻狊）
和结缕草（犣狅狔狊犻犪犼犪狆狅狀犻犮犪）上进行试验，用农杆菌介导法成功地获得了转基因植株。随后，国内外一些研究小组
相继报道了在匍匐翦股颖基因转化和改良上所取得的成果［６１２］。
溶菌酶（ｌｙｓｏｚｙｍｅ）是一种广谱性抗病基因，专门作用于微生物细胞壁的水解酶，又称细胞壁溶解酶。是一类
抗菌蛋白，具有几丁质酶的活力，能选择性地分解细菌或真菌细胞壁组分中多糖的β１，４糖苷键，从而破坏细菌
第２１卷 第２期
Ｖｏｌ．２１，Ｎｏ．２
草 业 学 报
ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ
１４１－１４８
２０１２年４月
收稿日期：２０１０１２０１；改回日期：２０１１０１０５
基金项目：草业生态系统教育部重点实验室（甘肃农业大学）开放课题（ＣＹＺＳ２０１１００２）和甘肃省作物遗传改良与种质创新重点实验室项目
匍匐翦股颖抗病转基因植株的选育（０３３１６０）资助。
作者简介：安惠惠（１９８３），女，甘肃天水人，硕士。Ｅｍａｉｌ：ａｎｈｈ２００４＠１６３．ｃｏｍ
通讯作者。Ｅｍａｉｌ：ｍａｈｌ＠ｇｓａｕ．ｅｄｕ．ｃｎ
细胞壁的致密网状结构，以抵御病原菌的侵染［１３］，将溶菌酶基因植入植物细胞中，使其表达，最终可获得抗病植
株。目前溶菌酶基因已被较广泛的应用到植物基因转化中并获得了一批抗病植株，１９９３年 Ｄǜｒｉｎｇ等［１４］将Ｔ４
噬菌体溶菌酶基因导入马铃薯（犛狅犾犪狀狌犿狋狌犫犲狉狅狊狌犿），获得抵抗胡萝卜欧氏杆菌（犈狉狑犻狀犪犮犪狉狅狋狅狏狅狉犪）引起病害的
转基因植株。１９９５年Ｎａｋａｊｉｍａ等［１５］将鸡蛋清溶菌酶基因或人溶菌酶基因导入烟草（犖犻犮狅狋犻犪狀犪狋犪犫犪犮狌犿），获得
的转基因植株对病原细菌和真菌均表现出抗性［１６］，许明辉等［１７］将Ｔ４噬菌体的溶菌酶基因导入滇型杂交稻恢复
系南２９的基因组，转基因材料较受体对照具有明显的抗性。然而溶菌酶基因在匍匐翦股颖中的转化还未见有报
道。
绿色荧光蛋白（ｇｒｅｅｎｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔｐｒｏｔｅｉｎ，ＧＦＰ）来源于水母，当其受到紫外或蓝光激发时，绿色荧光蛋白发
射绿色荧光。目前，ＧＦＰ作为一种新型的报告分子广泛应用于生命科学的众多领域，尤其在基因表达和定位等
方面更具优越性［１８］。
本研究建立了匍匐翦股颖ＰｅｎｎＡ１高效再生体系，为后继的基因转化研究奠定了基础。同时将绿色荧光蛋
白（ＧＦＰ蛋白）作为报告基因，利用农杆菌介导法首次将ＬｙｚＧＦＰ双元基因成功导入匍匐翦股颖ＰｅｎｎＡ１中，摸
索出基因转化的适宜条件，并获得翦股颖转基因植株，检测到转基因植株的表达情况。
１ 材料与方法
１．１ 材料
植物材料：匍匐翦股颖ＰｅｎｎＡ１种子由北京克劳沃集团提供。
ｐＢＩ１２１ＬｙｚＧＦＰ表达载体由柴燕文等［１９］构建。该质粒载体含有ＣａＭＶ３５Ｓ启动子及其控制下的Ｌｙｚ基因
和ＧＦＰ标记基因。
１．２ 方法
本试验于２００９年５月－２０１０年９月期间进行。
１．２．１ 种子消毒及培养条件 挑选匍匐翦股颖ＰｅｎｎＡ１成熟种子，将种子包在纱布中，自来水室温浸泡１２ｈ，
在超净工作台中用７０％酒精浸泡１～２ｍｉｎ，无菌水洗涤３～４次，再用０．１％的升汞浸泡１０ｍｉｎ，无菌水洗涤５
次。用无菌滤纸吸干种子并接种到诱导培养基中。于２５℃暗培养箱培养５０ｄ左右，将诱导出的愈伤组织转到继
代培养基上（同诱导培养基），培养条件相同，继代培养周期为２１ｄ。
１．２．２ 愈伤组织的诱导与分化 以 ＭＳ为基本培养基，添加０．１ｍｇ／Ｌ的６ＢＡ，另附加不同浓度的２，４Ｄ
（１．０，２．０，３．０，４．０，５．０，６．０ｍｇ／Ｌ）进行愈伤组织的诱导，每个处理５个重复。在超净工作台中将消毒好的
种子接种在诱导培养基上，每皿接５０个种子。暗培养５０ｄ后统计愈伤组织出愈率。
以 ＭＳＯ（ＭＳ大量＋ＭＳ微量＋ＭＳ铁盐＋Ｂ５有机＋蔗糖＋琼脂）、ＭＳ为诱导芽分化培养基，将继代培养２
次的愈伤组织添加不同浓度ＮＡＡ（萘乙酸）（０．３，０．５，０．７，１．０ｍｇ／Ｌ），每皿接１０块愈伤组织，每个处理５个重
复，３０ｄ后统计分化率。培养条件：白天（２５±２）℃，夜晚（１８±２）℃，光照强度１０００～２５００ｌｘ，光周期为光照
１６ｈ，黑暗８ｈ。
待分化出的小苗长至１～２ｃｍ时转入生根培养基，以 ＭＳＯ、１／２ＭＳ培养基为诱导生根培养基，分别添加０．３
ｍｇ／ＬＮＡＡ。
以上培养基中均附加３０ｇ／Ｌ的蔗糖，７ｇ／Ｌ琼脂粉，ｐＨ值５．８。
１．２．３ 抗菌素及其抑菌浓度的设定 选取头孢霉素（Ｃｅｆ）和羧苄青霉素（Ｃａｒｂ）２种抗菌素作为ＬＢＡ４４０４抑菌
素。分别设１２个浓度梯度（５０，１００，１５０，２００，２５０，３００，３５０，４００，４５０，５００，５５０，６００ｍｇ／Ｌ），取含供试质粒
ｐＢＩ１２１ＬｙｚＧＦＰ的农杆菌ＬＢＡ４４０４液１００μＬ于含有不同抗菌素种类及浓度的６ｍＬ液体发根农杆菌培养基
（ＹＥＢ）中，２８℃，２００ｒ／ｍｉｎ，暗培养２４ｈ摇床过夜培养。取不同抗生素及不同抗生素浓度梯度的ＹＥＢ液体培养
基各２ｍＬ，用紫外分光光度计测定其紫外吸收值ＯＤ６００，每个处理３个重复。以未加菌液的液体ＹＥＢ为空白，未
加抗生素的液体ＹＥＢ为对照。
１．２．４ 农杆菌ＬＢＡ４４０４侵染条件的确立 －８０℃保存的含ｐＢＩ１２１ＬｙｚＧＦＰ质粒的ＬＢＡ４４０４农杆菌在固体
ＹＥＰ［含５０ｍｇ／Ｌ卡那霉素（Ｋａｎ）、２０ｍｇ／Ｌ利福平（Ｒｉｆ）］培养基上划线，正面放置３０ｍｉｎ后倒置于２５℃培养箱
２４１ ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ（２０１２） Ｖｏｌ．２１，Ｎｏ．２
暗培养２ｄ后，挑取其上单克隆菌落于ＹＥＰ（含相同抗生素）液体培养基上２８℃、２００ｒ／ｍｉｎ摇床过夜培养。
取ＰｅｎｎＡ１继代培养７ｄ质地良好的胚性愈伤组织，用上述活化的农杆菌（设置ＯＤ６００为０．３～０．５）浸泡待
转化的愈伤组织一定时间（分别设置为５，１０，１５和２０ｍｉｎ），共培养３ｄ后转入含３００ｍｇ／Ｌ头孢霉素的分化培
养基。２０ｄ后观察愈伤组织生长情况。
１．２．５ 再生植株的炼苗和移栽 待根长至１．０～２．５ｃｍ、苗高５～８ｃｍ时准备移栽，打开封口炼苗７ｄ后，洗净
根部固体培养基，剪掉发黄的叶片并修剪植株高度为５ｃｍ左右，移栽到装有珍珠岩、营养土、蛭石（用前高温灭
菌）按１∶１∶１的比例拌匀的花盆中。
１．２．６ 荧光检测 取匍匐翦股颖ＰｅｎｎＡ１转化植株及非转化植株的叶片组织以及根进行压片，在ＯＬＹＰＵＳ
ＢＸ５１／ＢＸ５２型荧光显微镜下，用蓝光激发组织，观察并照相。
１．２．７ ＤＮＡ提取和ＰＣＲ分子检测 采用植物试剂盒提取ＤＮＡ。引物序列由柴燕文等［１９］设计，上海生工生物
工程公司合成。ＧＦＰ基因的序列设计扩增引物序列：Ｐ１（５′ＣＧＣＧＧＡＴＣＣＡＴＧＡＧＴＡＡＡＧＧＡＧＡＡＧＡＡＣ
３′），Ｐ２（５′ＧＣＧＣＣＣＧＧＧＴＴＴＧＴＡＴＡＧＴＴＣＡＴＣＣＡＴ３′）。ＰＣＲ反应条件：９４℃预变性４ｍｉｎ；９４℃变性３０ｓ，
６０℃退火３０ｓ，７２℃延伸１ｍｉｎ，３０个循环；７２℃延伸７ｍｉｎ。保持电流８０ｍＡ，１％琼脂糖凝胶电泳。电泳４０ｍｉｎ
后，紫外透射仪下观察结果并照相。
２ 结果与分析
２．１ 胚性愈伤组织的诱导及分化效果
大量研究表明，在禾草类植物中，２，４Ｄ诱导愈伤组织的效果最好，其与６ＢＡ配合使用会大大提高愈伤组
织诱导率。本试验在不同的２，４Ｄ浓度下添加０．１ｍｇ／Ｌ的６ＢＡ，进行了ＰｅｎｎＡ１愈伤组织的诱导培养（图
１）。在２．０ｍｇ／Ｌ２，４Ｄ＋０．１ｍｇ／Ｌ６ＢＡ的 ＭＳ培养基上，ＰｅｎｎＡ１愈伤组织诱导率最高，且质量最好，诱导
率达３６％，其他次之。
在 ＭＳＯ培养基上，ＰｅｎｎＡ１愈伤组织分化率普遍高于 ＭＳ培养基（图２），在 ＭＳＯ＋０．５ｍｇ／ＬＮＡＡ培养
基上ＰｅｎｎＡ１愈伤组织分化率高达４２．５％。
图１ 不同２，４犇浓度对犘犲狀狀犃１愈伤组织诱导率的影响
犉犻犵．１ 犜犺犲犲犳犳犲犮狋狅犳２，４犇犮狅狀犮犲狀狋狉犪狋犻狅狀狊
狅狀犮犪犾犻犻狀犱狌犮狋犻狅狀狉犪狋犲
图２ 不同培养基及犖犃犃浓度对愈伤组织分化的影响
犉犻犵．２ 犜犺犲犲犳犳犲犮狋狅犳犿犲犱犻犪犪狀犱犖犃犃犮狅狀犮犲狀狋狉犪狋犻狅狀
狅狀犱犻犳犳犲狉犲狀狋犻犪狋犻狅狀狅犳犮犪犾犻
ＭＳＯ培养基与１／２ＭＳ培养基在诱导生根时没有明显的区别，均在苗长至３ｃｍ左右时开始生根。此阶段
可添加０．３ｍｇ／ＬＮＡＡ促进生根。
图３显示了匍匐翦股颖ＰｅｎｎＡ１愈伤组织的形成及植株再生过程。
２．２ 适宜抗菌素及抑菌浓度的确定
针对特定的农杆菌菌株，选择合适的抗生素类型及适宜的浓度是植物基因转化过程中非常重要的一个环
３４１第２１卷第２期 草业学报２０１２年
节［２０］。研究结果显示（图４），当头孢霉素（Ｃｅｆ）的浓度为３００ｍｇ／Ｌ时，就已经抑制了农杆菌ＬＢＡ４４０４的生长，
而同等浓度下羧苄青霉素（Ｃａｒｂ）的ＯＤ６００还处于０．２左右，只有当羧苄青霉素的浓度达到５００ｍｇ／Ｌ时，才能抑
制住农杆菌的生长。且添加不同浓度的羧苄青霉素可造成愈伤组织褐化和后期污染，在共培养后的脱菌培养中，
２种抗生素的抑菌效果差异较大，故在后续的脱菌过程中，选择３００ｍｇ／Ｌ的头孢霉素来抑制农杆菌ＬＢＡ４４０４的
生长。
图３ 匍匐翦股颖犘犲狀狀犃１愈伤组织及再生苗生长的不同时期
犉犻犵．３ 犇犻犳犳犲狉犲狀狋犵狉狅狑狋犺狊狋犪犵犲狊犳狉狅犿犮犪犾犻狋狅狉犲犵犲狀犲狉犪狋犲犱狊犲犲犱犾犻狀犵狊犻狀犘犲狀狀犃１
Ａ：继代３次的匍匐翦股颖愈伤组织；Ｂ：分化出芽的愈伤组织；Ｃ：分化出的小苗；Ｄ：ＰｅｎｎＡ１根的生长。Ａ：ｃａｌｉｏｆＰｅｎｎＡ１ａｆｔｅｒ３ｔｉｍｅｓｏｆｓｕｂ
ｃｕｌｔｕｒｅ；Ｂ：ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅｄｃａｌｉｗｉｔｈｓｐｒｏｕｔｓ；Ｃ：ｒｅｇｅｎｅｒａｔｅｄｓｅｅｄｌｉｎｇｓ；Ｄ：ｒｏｏｔｇｒｏｗｔｈｏｆＰｅｎｎＡ１．
图４ 不同抗生素对农杆菌犔犅犃４４０４的抑制效果
犉犻犵．４ 犜犺犲狉犲狊狋狉犪犻狀犻狀犵犲犳犳犲犮狋狅犳狋狑狅犪狀狋犻犫犻狅狋犻犮狊狅狀犪犵狉狅犫犪犮狋犲狉犻犪
２．３ 适宜的基因转化条件的确立
农杆菌侵染时间过短，不利于菌体附着在伤口
表面，ＴＤＮＡ不能有效整合，大大降低转化效率，
侵染时间太长，农杆菌繁殖过多，不易除菌甚至导致
植物培养材料的死亡。本研究结果表明，ＬＢＡ４４０４
对匍匐翦股颖ＰｅｎｎＡ１最佳侵染时间为１０～１５
ｍｉｎ。侵染５ｍｉｎ时农杆菌与供体材料接触时间短，
农杆菌不能很好地附着在愈伤组织表面，而侵染２０
ｍｉｎ时，则污染严重。
当ＬＢＡ４４０４菌液ＯＤ６００在０．１时，ＰｅｎｎＡ１愈
伤组织成活率虽高达７０％（表１），共培养３ｄ后材
料表面几乎没有菌迹，但转化率低。ＯＤ６００在０．３～
０．５时，愈伤组织成活率在４６％～５３％，共培养后，
愈伤组织周围可见淡淡菌迹。ＯＤ６００＞０．７后，污染
十分严重，愈伤组织成活率低于１０％。本研究发现
ＰｅｎｎＡ１对农杆菌比较敏感，且后期农杆菌污染严
重。
根据上述试验结果，在农杆菌介导的ＬｙｚＧＦＰ
双元基因对匍匐翦股颖ＰｅｎｎＡ１的转化中，选择
ＬＢＡ４４０４的ＯＤ６００为０．３～０．５、浸泡１０～１５ｍｉｎ为
宜。在这样的转化条件下可获得转化苗，最终经荧
光检测得知，转化率最高可达１２．５％。
２．４ 转基因植株再生苗的炼苗和移栽
表１ 农杆菌犔犅犃４４０４对犘犲狀狀犃１愈伤组织成活率的影响
犜犪犫犾犲１ 犜犺犲犲犳犳犲犮狋狅犳犪犵狉狅犫犪犮狋犲狉犻犪犮狅狀犮犲狀狋狉犪狋犻狅狀狊
狅狀狊狌狉狏犻狏犪犾狉犪狋犻狅狅犳犮犪犾犻
项目Ｉｔｅｍ 菌液浓度ＯＤ６００
ＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎＯＤ６００
０．１ ０．３ ０．５ ０．７ ０．９
外植体数Ｎｕｍｂｅｒｏｆｅｘｐｌａｎｔｓ（Ｎｏ．） ３０ ３０ ３０ ３０ ３０
成活数Ｎｕｍｂｅｒｏｆｌｉｖｅｓ（Ｎｏ．） ２１ １６ １４ ３ ２
成活率Ｌｉｖｅｒａｔｅ（％） ７０．０ ５３．３ ４６．７ ８．６ ３．１
把继代培养２～５次的胚性愈伤组织经农杆菌侵染且共培养３ｄ后，转移至有抗生素的分化培养基中，３０ｄ
左右分化出再生小苗，再生苗苗高５～８ｃｍ、根长至１．０～２．５ｃｍ时移栽。本实验共侵染１７９块愈伤组织，经后
４４１ ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ（２０１２） Ｖｏｌ．２１，Ｎｏ．２
续分化培养，２／３转化愈伤组织被农杆菌侵蚀而死亡，存活５９块转化组织。愈伤组织的分化率为２７．５％，共获得
１６株转化苗。研究表明，再生苗培养时间太长，根、茎、叶明显老化，移栽不易成活，待根长至１．０～２．５ｃｍ时移
栽最佳。春天移栽有助于匍匐翦股颖的生长，夏季高温对其不利，生长缓慢。
２．５ ＰｅｎｎＡ１转基因植株荧光检测分析
本课题组先期将溶菌酶基因和具有发光机制的ＧＦＰ基因共同插入到同一植物表达载体上，获得重组质粒
ｐＢＩ１２１ＬｙｚＧＦＰ［１９］。本研究利用农杆菌介导法将其导入匍匐翦股颖ＰｅｎｎＡ１植株。在获得的ＰｅｎｎＡ１转基
因植株中，ＧＦＰ作为报告基因，随时表达出荧光活性，实现植物组织中基因的活体定位，通过荧光检测手段，可在
基因转化早期方便地检测到含有目的基因的转基因植株。在本研究中经荧光定量分析，１６株转化苗中有２株表
现了强烈的荧光表达。含重组质粒ｐＢＩ１２１ＬｙｚＧＦＰ的匍匐翦股颖ＰｅｎｎＡ１的叶片组织和根均在显微镜（蓝光
激发）下呈现出黄绿色荧光（图５），初步确定外源基因ＬｙｚＧＦＰ转入翦股颖植株中。
图５ 匍匐翦股颖犘犲狀狀犃１转基因植株不同部位的犌犉犘基因的荧光表达图
犉犻犵．５ 犉犾狌狅狉犲狊犮犲狀狋犲狓狆狉犲狊狊犻狅狀犿犪狆狊狅犳犌犉犘犵犲狀犲狋犪犽犲狀犳狉狅犿狏犪狉犻狅狌狊狆犪狉狋狊狅犳狋狉犪狀狊犵犲狀犻犮狆犾犪狀狋狅犳犮狉犲犲狆犻狀犵犫犲狀狋犵狉犪狊狊
Ａ：叶片细胞组织ＧＦＰ基因荧光表达；Ａ０：未转化植株叶组织的阴性对照；Ｂ：根组织中的ＧＦＰ基因荧光表达；Ｂ０：未转化植株根组织中的阴性对
照。Ａ：ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＧＦＰｇｅｎｅｉｎｔｈｅｌｅａｆｃｅｌｓ；Ａ０：ｎｅｇａｔｉｖｅｃｏｎｔｒｏｌｉｎｌｅａｆｃｅｌｓ；Ｂ：ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＧＦＰｇｅｎｅｉｎｒｏｏｔｓ；Ｂ０：
ｎｅｇａｔｉｖｅｃｏｎｔｒｏｌｉｎｒｏｏｔｓ．
２．６ 匍匐翦股颖ＰｅｎｎＡ１转基因植株的ＰＣＲ扩增
图６ 转基因匍匐翦股颖犘犲狀狀犃１的犌犉犘基因犘犆犚扩增图
犉犻犵．６ 犘犆犚犱犲狋犲犮狋犻狅狀犿犪狆狅犳犌犉犘犵犲狀犲犳狉狅犿
狋狉犪狀狊犵犲狀犻犮狆犾犪狀狋狅犳犘犲狀狀犃１
Ｍ：ＤＮＡ分子量标准ＤＬ２０００；１：阳性对照；２：阴性对照；３，４：Ｐｅｎｎ
Ａ１转基因植株；箭头示目的片段。Ｍ：ＤＮＡｍａｒｋｅｒＤＬ２０００；１：ｐｏｓｉ
ｔｉｖｅｃｏｎｔｒｏｌ；２：ｎｅｇａｔｉｖｅｃｏｎｔｒｏｌ；３，４：ＰＣＲｏｆｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄＧＦＰｇｅｎｅｉｎ
ＰｅｎｎＡ１；ａｒｒｏｗｉｎｄｉｃａｔｅｓｆｒａｇｍｅｎｔ．
为进一步确定目的基因是否成功整合到匍匐翦股
颖细胞基因组中，排除可能出现的假阳性，选取荧光检
测显示阳性的再生植株，分别提取ＤＮＡ进行ＰＣＲ扩
增分析。结果显示，２株荧光检测为阳性的植株均扩
增出预期大小为７５０ｂｐ的ＧＦＰ基因条带，而未转化
的对照再生植株均无扩增的条带出现（图６）。可见外
源基因ＬｙｚＧＦＰ已成功转入匍匐翦股颖ＰｅｎｎＡ１再
生植株中。
３ 讨论
３．１ 匍匐翦股颖ＰｅｎｎＡ１植株高效再生的影响因素
分析
成功的基因转化首先依赖于良好的植物受体系统
的建立［２１］，大量文献表明，愈伤组织再生体系是基因
转化最理想、最常用的再生体系之一［２２］。对不同的草
坪草，基因型的差异对其愈伤组织的诱导有极大影响［２３］。在本课题组进行的匍匐翦股颖Ｐｅｎｎ系列品种的愈伤
组织诱导和分化研究中，与其他Ｐｅｎｎ系列品种相比，ＰｅｎｎＡ１的种子萌发率和愈伤组织诱导率均比较低。这可
能是品种基因型所致。
本试验选择ＭＳ培养基加２．０ｍｇ／Ｌ２，４Ｄ＋０．１ｍｇ／Ｌ６ＢＡ作为匍匐翦股颖ＰｅｎｎＡ１愈伤组织诱导的最
５４１第２１卷第２期 草业学报２０１２年
佳激素组合，其诱导率可达３６％，这与孙榕江等［２４］在研究匍匐翦股颖ＰｅｎｎＡ１愈伤组织诱导所用２，４Ｄ浓度
一致。
愈伤组织继代培养的目的，除了愈伤组织扩繁外，还在于将非胚性愈伤转为胚性愈伤组织［２５］。而诱导胚性
愈伤组织是建立高效的植株再生体系的首要条件［２６］，在上述激素配比下，诱导出的愈伤组织大部分是胚性愈伤
组织，可作为后续的基因转化受体材料。本试验从匍匐翦股颖成熟种子诱导出胚性愈伤组织，并进一步使之形成
体细胞胚，其分化率高达４２．５％。研究发现，色泽鲜黄、质地较硬、干爽且不松散的愈伤组织更容易分化，而愈伤
组织表面水渍化、无限增殖质地松散的愈伤组织，则失去分化能力。激素配比不佳可能会造成愈伤组织的水渍
化，影响愈伤组织的生长和分化。而愈伤组织质地松散可能与继代生长时间过长、愈伤组织失去胚性有关。
３．２ 适宜的农杆菌侵染条件的确定
根癌农杆菌对植物的侵染过程是受到植物伤口分泌的酚类化合物诱导，菌体先吸附于组织表面，然后将Ｔｉ
质粒上的ＴＤＮＡ转移并整合进植物基因组中［２２］。侵染时间过短或过长均不利于基因的转化，太短不利菌体附
着降低转化效率，太长农杆菌繁殖过多导致外植体死亡。大量文献表明，农杆菌菌液浓度和侵染时间的确定由受
体植物品种和取材的部位而决定［２７］，应针对不同的菌株类型，不同供试材料建立相应的转化条件。本研究表明，
农杆菌ＬＢＡ４４０４的ＯＤ６００为０．３～０．５、侵染１０～１５ｍｉｎ可作为ＰｅｎｎＡ１适宜的侵染条件。ＰｅｎｎＡ１愈伤组织
与农杆菌共培养后，其表面可见淡淡菌迹。并在后续培养中ＰｅｎｎＡ１表现出对农杆菌极强的敏感性，农杆菌侵
蚀致使２／３植物材料死亡。匍匐翦股颖ＰｅｎｎＡ１对农杆菌ＬＢＡ４４０４具有较高的敏感性，这是否与其较低的转
化率有关尚待探索。本课题组正在继续实施相关的研究，以求探索出减少农杆菌ＬＢＡ４４０４对匍匐翦股颖Ｐｅｎｎ
Ａ１生长和分化的影响的措施和方法。
农杆菌和外植体共培养的时间是整个转化过程非常重要的环节，ＴＤＮＡ的转移以及整合都在共培养时间
内完成。共培养时间过短则不能完成复杂的转化过程，影响转化率，时间过长农杆菌对受体材料毒害严重，影响
其分化甚至停止生长。本试验以３ｄ作为共培养时间，共培养后受体材料及周围有淡淡菌斑，后续分化阶段施加
３００ｍｇ／Ｌ头孢霉素抑菌则不会影响愈伤组织的生长。
３．３ ｐＢＩ１２１ＬｙｚＧＦＰ表达载体的优越性
为了方便转化植株的鉴定、降低后期检测工作量，常插入选择标记基因和报告基因作为初期筛选检测的手
段。ＧＵＳ（βＤ葡糖醛酸酶）基因作为报告基因，其表达量通过细胞组织化学方式而得以检测。然而ＧＵＳ作为标
记的一个主要局限在于检测时对材料的破坏性，这对需要进一步进行基因表达的材料来说极不方便［２８］，由于植
物细胞其他因素的干扰，以及有些植物材料本身也能产生内源ＧＵＳ活性，反应颜色的深浅有时不能说明ＧＵＳ
活性高低或有无［２９］。
本研究所用植物表达载体ｐＢＩ１２１Ｌｙｚ恰好去除了载体中的ＧＵＳ基因，代之以Ｌｙｚ基因，并在该目的基因片
段后面插入报告基因ＧＦＰ［１９］。ＧＦＰ作为报告基因具有诸多优点：１）材料无需前处理，可以活体观察。２）不需任
何反应底物和辅助因子。３）植物本身不含ＧＦＰ，不会出现假阳性结果。４）无毒害，ＧＦＰ生活的细胞基本无毒害，
对目的基因的功能也没有影响，转化后细胞仍可以连续传代。５）ＧＦＰ的表达几乎不受属种范围的限制，ＧＦＰ没
有细胞种类和位置上的限制，在各个部位都可以表达发出荧光［１９］。本研究将ｐＢＩ１２１ＬｙｚＧＦＰ双元基因转入匍
匐翦股颖ＰｅｎｎＡ１，以ＧＦＰ作为报告基因对转化植株进行初期鉴定和筛选，在２株转化苗中均灵敏地检测到
ＧＦＰ基因的荧光表达，方便地活体定位到目的基因在转化植株中的存在及其荧光表达部位，充分体现了ＧＦＰ作
为报告基因的优越性。
３．４ 匍匐翦股颖转化植株的筛选
本研究所采用的ｐＢＩ１２１ＬｙｚＧＦＰ表达载体有新霉素磷酸转移酶基因（ｎｐｔⅡ）筛选标记基因。研究结果表
明，卡那霉素对匍匐翦股颖转化植株的筛选效果甚微。王渭霞等［１２］在匍匐翦股颖转ＣＢＦ１基因的研究中指出禾
本科植物本身对卡那霉素具有较高的天然抗性，陈智勇等［２３］也认为卡那霉素不适于作为匍匐翦股颖转化植株的
筛选剂。本研究所用的上述表达载体在对匍匐翦股颖的基因转化中还有一定的欠缺处，即在前期作业中无法通
过卡那霉素选择压进行匍匐翦股颖转基因植株的筛选，致使后期检测工作量加大，因此，本研究所用的ｐＢＩ１２１
６４１ ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ（２０１２） Ｖｏｌ．２１，Ｎｏ．２
ＬｙｚＧＦＰ表达载体还需进一步改造和完善。本课题组拟将在之后的研究中用抗除草剂的ｂａｒ基因作为选择标记
基因，用以筛选禾草类转基因植株。
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犻狀犮狉犲犲狆犻狀犵犫犲狀狋犵狉犪狊狊狏犪狉犻犲狋狔犘犲狀狀犃１
ＡＮＨｕｉｈｕｉ１，２，３，ＭＡＨｕｉｌｉｎｇ１，２，３，ＬＩＪｉａｎ４，ＢＡＩＳｈｅｎｇｊｕｎ１，３，ＭＡＸｉａｎｇ１，３
（１．ＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＧｒａｓｓｌａｎｄＥｃｏｓｙｓｔｅｍ，ＧａｎｓｕＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｌａｎｚｈｏｕ７３００７０，Ｃｈｉｎａ；
２．ＭｉｎｉｓｔｒｙｏｆＥｄｕｃａｔｉｏｎ，ＰｒａｔａｃｕｌｔｕｒａｌＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＧａｎｓｕＰｒｏｖｉｎｃｅ，Ｌａｎｚｈｏｕ７３００７０，
Ｃｈｉｎａ；３．ＳｉｎｏＵ．Ｓ．ＣｅｎｔｅｒｓｆｏｒＧｒａｚｉｎｇｌａｎｄＥｃｏｓｙｓｔｅｍＳｕｓｔａｉｎａｂｉｌｉｔｙ，Ｌａｎｚｈｏｕ７３００７０，Ｃｈｉｎａ；
４．ＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＷａｔｅｒＣｙｃｌｅａｎｄＲｅｌａｔｅｄＬａｎｄＳｕｒｆａｃｅＰｒｏｃｅｓｓｅｓ，ＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＧｅｏｇｒａｐｈｉｃ
ＳｃｉｅｎｃｅｓａｎｄＮａｔｕｒａｌＲｅｓｏｕｒｃｅｓＲｅｓｅａｒｃｈ，ＣＡＳ，Ｂｅｉｊｉｎｇ１００１０１，Ｃｈｉｎａ）
犃犫狊狋狉犪犮狋：Ｍａｔｕｒｅｅｍｂｒｙｏｓｏｆｂｅｎｔｇｒａｓｓ（犃犵狉狅狊狋犻狊狊狋狅犾狅狀犻犳犲狉犪）ＰｅｎｎＡ１ｗｅｒｅｕｓｅｄｔｏｅｓｔａｂｌｉｓｈａｈｉｇｈｌｙｅｆｆｉ
ｃｉｅｎｔｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎｓｙｓｔｅｍ．ＴｈｅｄｕａｌｇｅｎｅｓＬｙｚＧＦＰ（Ｌｙｓｏｚｙｍｅｇｅｎｅａｎｄｇｒｅｅｎｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｐｒｏｔｅｉｎｇｅｎｅ）ｗｅｒｅ
ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄｉｎｔｏｅｍｂｒｙｏｎｉｃｃａｌｉｏｆｃｒｅｅｐｉｎｇｂｅｎｔｇｒａｓｓｂｙａｎａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｍｅｄｉａｔｉｏｎｍｅｔｈｏｄｔｏｏｂｔａｉｎｔｒａｎｓ
ｇｅｎｉｃｐｌａｎｔｓｗｉｔｈｄｉｓｅａｓｅｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｃａｐａｂｉｌｉｔｙ．ＴｈｅｂｅｓｔｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓｆｏｒｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｏｆｔｈｅＬｙｚＧＦＰｇｅｎｅｓｉｎ
ＰｅｎｎＡ１ｗｅｒｅｓｔｕｄｉｅｄ．ＴｈｅｃａｌｕｓｉｎｄｕｃｔｉｏｎｒａｔｉｏｏｆＰｅｎｎＡ１ｗａｓｈｉｇｈｅｓｔａｔ３６％ｏｎＭＳｍｅｄｉｕｍｓｕｐｐｌｅｍｅｎ
ｔｅｄｗｉｔｈ２．０ｍｇ／Ｌ２，４Ｄａｎｄ０．１ｍｇ／Ｌ６ＢＡ，ａｎｄｔｈｅｃａｌｉｈａｄｔｈｅｏｐｔｉｍｕｍｇｒｏｗｔｈｓｔａｔｕｓ．Ｔｈｅｈｉｇｈｅｓｔｄｉｆ
ｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎｒａｔｉｏｗａｓ４２．５％ｏｎＭＳＯｍｅｄｉｕｍｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｅｄｗｉｔｈ０．５ｍｇ／ＬＮＡＡ．Ｔｈｅｓｔｕｄｙａｌｓｏｓｈｏｗｅｄｔｈａｔ
ｇｒｏｗｔｈｏｆａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍＬＢＡ４４０４ｗａｓｒｅｓｔｒａｉｎｅｄｂｙ３００ｍｇ／Ｌｃｅｆｏｔａｘｉｍｅ（Ｃｅｆ）．Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄｃａｌｉｐｅｒｆｏｒｍｅｄ
ｗｅｌｉｎｌａｔｅｒｇｒｏｗｔｈｐｅｒｉｏｄｓａｓｗｅｌａｓｉｎｔｈｅｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎｏｆｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｐｌａｎｔｓａｆｔｅｒｉｎｆｅｃｔｉｏｎｗｉｔｈａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ
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ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｒａｔｉｏｏｆｃａｌｉｗａｓ１２．５％；ｔｈｅｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎｒａｔｉｏｏｆｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｐｌａｎｔｓｗａｓ２７．５％；ｔｈｅｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ
ｐｌａｎｔｓｓｔｒｏｎｇｌｙｅｘｐｒｅｓｓｅｄｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ，ａｎｄｔｈｅ７５０ｂｐｔａｒｇｅｔｆｒａｇｍｅｎｔｓｏｆｔｈｅＧＦＰｇｅｎｅｗｅｒｅａｍｐｌｉｆｉｅｄｂｙ
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ｔｅｉｎｇｅｎｅ
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