全 文 ：书犇犗犐：１０．１１６８６／犮狔狓犫２０１５０４４ 犺狋狋狆：／／犮狔狓犫．犾狕狌．犲犱狌．犮狀
陈晶，韩贵清，尚晨，张海玲，李佶恺，刘慧莹，张月学．去除紫花苜蓿叶片高丰度蛋白的方法及其应用．草业学报，２０１５，２４（７）：１３１１３８．
ＣｈｅｎＪ，ＨａｎＧＱ，ＳｈａｎＣ，ＺｈａｎｇＨＬ，ＬｉＪＫ，ＬｉｕＨＹ，ＺｈａｎｇＹＸ．Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｍｅｔｈｏｄｓｆｏｒｒｅｍｏｖｉｎｇｈｉｇｈａｂｕｎｄａｎｃｅｐｒｏｔｅｉｎｓｉｎａｌｆａｌｆａｌｅａｆ．Ａｃｔａ
ＰｒａｔａｃｕｌｔｕｒａｅＳｉｎｉｃａ，２０１５，２４（７）：１３１１３８．
去除紫花苜蓿叶片高丰度蛋白的方法及其应用
陈晶１，韩贵清１，２，尚晨２，张海玲２，李佶恺２，刘慧莹２，张月学２
（１．哈尔滨师范大学生命科学与技术学院，黑龙江 哈尔滨１５００２５；２．黑龙江省农业科学院草业研究所，黑龙江 哈尔滨１５００８０）
摘要：紫花苜蓿叶片中大量的高丰度蛋白（核酮糖ｌ，５二磷酸羧化／加氧酶，Ｒｕｂｉｓｃｏ）干扰了蛋白质的动态分辨率，
严重影响蛋白质组学研究中功能蛋白的检测与鉴定。为了探究去除高丰度蛋白的适宜方法，本研究利用 Ｍｇ／ＮＰ
４０与聚乙二醇（ＰＥＧ）预分离紫花苜蓿叶片蛋白，通过双向凝胶电泳法比较了不同浓度ＰＥＧ对叶片高丰度蛋白的
分离情况。电泳图谱显示０，１５％，１７．５％，２０％ＰＥＧ处理的蛋白质中分别可以检测到（３３５±１７），（４１７±３），（４４５±
７），（４５９±１１）个蛋白质点，０，１５％，１７．５％处理组间差异显著（犘＜０．０５），１７．５％和２０％ＰＥＧ 处理组间没有差异
（犘＜０．０５）。然而，１７．５％ＰＥＧ能够检测到更多的差异蛋白质点，证明其更能有效沉淀高丰度蛋白，便于检测被
Ｒｕｂｉｓｃｏ遮盖的蛋白质点。将该方法应用于紫花苜蓿叶片响应低温胁迫的蛋白质组学研究中检验其应用效果，与
三氯乙酸／丙酮法提取的全蛋白相比，去除高丰度蛋白后鉴定出８个新的蛋白质差异点，证明该方法适用于实际的
蛋白质组学研究。可见，Ｍｇ／ＮＰ４０与１７．５％ＰＥＧ法是最适宜去除紫花苜蓿叶片高丰度蛋白的方法。
关键词：高丰度蛋白；核酮糖ｌ，５二磷酸羧化／加氧酶；聚乙二醇；紫花苜蓿；蛋白质组学　　
犘狉狅狋犲狅犿犻犮犿犲狋犺狅犱狊犳狅狉狉犲犿狅狏犻狀犵犺犻犵犺犪犫狌狀犱犪狀犮犲狆狉狅狋犲犻狀狊犻狀犪犾犳犪犾犳犪犾犲犪犳
ＣＨＥＮＪｉｎｇ１，ＨＡＮＧｕｉＱｉｎｇ１，２，ＳＨＡＮＣｈｅｎ２，ＺＨＡＮ ＨａｉＬｉｎｇ２，ＬＩＪｉＫａｉ２，ＬＩＵ ＨｕｉＹｉｎｇ２，ＺＨＡＮＧ
ＹｕｅＸｕｅ２
１．犆狅犾犾犲犵犲狅犳犔犻犳犲犛犮犻犲狀犮犲狊犪狀犱犜犲犮犺狀狅犾狅犵狔，犎犪狉犫犻狀犖狅狉犿犪犾犝狀犻狏犲狉狊犻狋狔，犎犪狉犫犻狀１５００２５，犆犺犻狀犪；２．犐狀狊狋犻狋狌狋犲狅犳犌狉犪狊狊犚犲狊犲犪狉犮犺，
犎犲犻犾狅狀犵犼犻犪狀犵犃犮犪犱犲犿狔狅犳犃犵狉犻犮狌犾狋狌狉犲犛犮犻犲狀犮犲狊，犎犪狉犫犻狀１５００８０，犆犺犻狀犪
犃犫狊狋狉犪犮狋：Ｔｈｅｈｉｇｈｅｒｃｏｎｔｅｎｔｏｆｈｉｇｈａｂｕｎｄａｎｃｅｐｒｏｔｅｉｎｓ（Ｒｉｂｕｌｏｓｅｌ，５ｂｉｓｐｈｏｓｐｈａｔｅｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ／ｏｘｙｇｅｎａｓｅ；
ＲｕＢｉｓＣｏ）ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｓｗｉｔｈｔｈｅｄｙｎａｍｉｃｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎｏｆｐｒｏｔｅｉｎｓｉｎｔｗｏｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ（２ＤＥ），ａｆｆｅｃｔ
ｉｎｇｔｈｅｄｅｔｅｃｔｉｏｎａｎｄｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｐｒｏｔｅｉｎｓｉｎｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ．Ｔｏｅｘｐｌｏｒｅｓｕｉｔａｂｌｅｍｅｔｈｏｄｓｆｏｒｒｅｍｏ
ｖｉｎｇｈｉｇｈａｂｕｎｄａｎｃｅｐｒｏｔｅｉｎ，Ｍｇ／ＮＰ４０ａｎｄｄｉｆｆｅｒｅｎｔｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓｏｆｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ（ＰＥＧ）ｗｅｒｅｕｓｅｄ
ｆｏｒｐｒｏｔｅｉｎｐｒｅｆｒａｃｔｉｏｎａｔｉｏｎａｎｄｔｈｅｔｒｅａｔｍｅｎｔｓ’ｉｎｆｌｕｅｎｃｅｏｎｔｈｅｓｅｐａｒａｔｉｏｎｏｆｐｒｏｔｅｉｎｓｉｎａｌｆａｌｆａｌｅａｆｗａｓｃｏｍ
ｐａｒｅｄ．Ｔｈｅｒｅｓｕｌｔｓｉｎｄｉｃａｔｅｄｔｈａｔ（３３５±１７），（４１７±３），（４４５±７）ａｎｄ（４５９±１１）ｓｐｏｔｓｗｅｒｅｄｅｔｅｃｔｅｄｉｎｔｒｅａｔ
ｍｅｎｔｓｏｆ０，１５％，１７．５％ ａｎｄ２０％ ＰＥＧｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ｔｈｅｒｅｗｅｒｅｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓｂｅｔｗｅｅｎｔｈｅ０－
１７．５％ｔｒｅａｔｍｅｎｔｓｂｕｔｎｏｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓｗｅｒｅｆｏｕｎｄｂｅｔｗｅｅｎｔｈｅ１７．５％ａｎｄ２０％ｔｒｅａｔｍｅｎｔｓ．Ｍｏｒｅ
ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｐｒｏｔｅｉｎｓｐｏｔｓｗｅｒｅｄｅｔｅｃｔｅｄｉｎｔｈｅ１７．５％ｔｒｅａｔｍｅｎｔ，ｗｈｉｃｈｔｈｕｓｐｒｏｖｅｄｔｈｅｍｏｓｔｅｆｆｅｃｔｉｖｅｗａｙｏｆ
ｒｅｍｏｖｉｎｇＲｕＢｉｓＣｏｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｉｎｏｒｄｅｒｔｏｉｎｓｐｅｃｔｔｈｅａｐｐｌｉｃａｂｉｌｉｔｙｏｆｔｈｉｓｒｅｓｕｌｔ，ａｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓｔｕｄｙｏｆａｌｆａｌｆａｉｎ
ｒｅｓｐｏｎｓｅｔｏｌｏｗｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅｓｗａｓｕｎｄｅｒｔａｋｅｎ．ＣｏｍｐａｒｅｄｗｉｔｈｔｏｔａｌｐｒｏｔｅｉｎｓｅｘｔｒａｃｔｅｄｂｙＴＣＡ／ａｃｅｔｏｎｅ，ｅｉｇｈｔ
第２４卷　第７期
Ｖｏｌ．２４，Ｎｏ．７
草　业　学　报
ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ
２０１５年７月
Ｊｕｌｙ，２０１５
收稿日期：２０１５０１２１；改回日期：２０１５０４０９
基金项目：黑龙江省博士后特殊基金项目（ＬＢＨＴＺ１２０９）和“十二五”支撑项目（２０１１ＢＡＤ１７Ｂ０４２）资助。
作者简介：陈晶（１９８４），女，黑龙江哈尔滨人，在读博士。Ｅｍａｉｌ：ｃｃｙｊ１５＠１６３．ｃｏｍ
通讯作者Ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇａｕｔｈｏｒ．Ｅｍａｉｌ：ｃｃｙｊ２００＠１６３．ｃｏｍ
ｎｅｗｐｒｏｔｅｉｎｓｐｏｔｓｗｅｒｅｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄａｆｔｅｒＰＥＧｔｒｅａｔｍｅｎｔｔｏｒｅｍｏｖｅｈｉｇｈａｂｕｎｄａｎｃｅｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｔｈｅｒｅｓｅａｒｃｈｔｈｕｓ
ｉｎｄｉｃａｔｅｓｔｈａｔｐｒｅｆｒａｃｔｉｏｎａｔｉｏｎｗｉｔｈＭｇ／ＮＰ４０ａｎｄ１７．５％ＰＥＧｉｓｓｕｉｔａｂｌｅｆｏｒｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓｔｕｄｉｅｓｏｆａｌｆａｌｆａ．
犓犲狔狑狅狉犱狊：ｈｉｇｈａｂｕｎｄａｎｃｅｐｒｏｔｅｉｎ；Ｒｕｂｉｓｃｏ；ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ；ａｌｆａｌｆａ；ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ
蛋白质组学是２１世纪的前沿热点领域之一。近十年来，其从高度专业化转变为常规的技术手段应用于植物
学研究［１］。大量蛋白质数据的挖掘在植物基因功能分析和特殊蛋白质鉴定上发挥了重要作用，也在一定程度上
为基因组和代谢组间构建了“沟通”桥梁［２］。紫花苜蓿（犕犲犱犻犮犪犵狅狊犪狋犻狏犪）是多年生豆科牧草，其丰富的蛋白质含
量及优良的适应性为草业和畜牧业的可持续发展提供了有利条件［３］。对其非生物性（低温、盐碱、干旱、药害等）
逆境因子应答反应和抗、耐性机理的蛋白质组学研究具有重要意义。但紫花苜蓿叶片中大量高丰度蛋白［如，核
酮糖ｌ，５二磷酸羧化／加氧酶（Ｒｕｂｉｓｃｏ）］的存在降低了蛋白质的动态分辨率，极大地影响了逆境应答和代谢过程
中功能蛋白的分析与鉴定。
Ｒｕｂｉｓｃｏ作为一种“超大量”蛋白，普遍存在于绿色植物中。在对拟南芥（犃狉犪犫犻犱狅狆狊犻狊狋犺犪犾犻犪狀犪）和水稻（犗狉狔
狕犪狊犪狋犻狏犪）叶片的蛋白质组学研究中发现，其高丰度蛋白Ｒｕｂｉｓｃｏ及其变体分别占蛋白总量的１２％和３５．３％，极
易遮盖邻近蛋白，使一些低丰度蛋白无法被识别［４５］。近年来，国内外科学家一直致力于寻求提高低丰度蛋白分
辨率的方法。Ｃｅｌａｒ等［６］利用Ｒｕｂｉｓｃｏ免疫耗竭柱去除了叶片组织中９０％～９８％的Ｒｕｂｉｓｃｏ，增强了低丰度蛋白
的检测和鉴定；但该方法复杂、耗时且费用较高。Ｃｈｏ等［７］发现高浓度二硫苏糖醇（ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｔｉｏｌ，ＤＴＴ）可以有
效去除水稻叶片中的Ｒｕｂｉｓｃｏ酶，提高双向凝胶电泳的分辨率；但ＤＴＴ沉淀法原理及其在其他作物中的有效性
还需要进一步研究和检验［８］。另外，也有研究发现肌醇六磷酸钠结合钙离子法可以去除植物叶片中的大部分
Ｒｕｂｉｓｃｏ酶，其在不同植物中有效性及适宜的反应温度也需要检验和筛选［８９］。ＰＥＧ是一种直链大分子聚合物，
能够破坏蛋白质分子表面的水化层而使蛋白发生沉淀作用，最早应用于一些细菌和病毒蛋白的提纯［１０１１］。Ｋｉｍ
等［１２］在２００１年采用聚乙二醇（ＰＥＧ）沉淀法预分离了水稻叶片蛋白，去除了大部分Ｒｕｂｉｓｃｏ。此后该方法又被成
功应用于拟南芥［１３］、水稻［１４１５］和甜瓜（犆狌犮狌犿犻狊）［１６］的蛋白质组学研究中，有效提高了低丰度蛋白的分辨率，也是
目前应用最多的去除植物高丰度蛋白的方法。与其他方法相比，ＰＥＧ沉淀法更加快捷、简单、费用低廉且具有较
广的适用性。到目前为止，尚没有探究紫花苜蓿高丰度蛋白去除方法的相关报道。因此，本试验在前人的基础
上，利用不同浓度的ＰＥＧ预分离紫花苜蓿叶片蛋白，旨在筛选去除高丰度蛋白的适宜方法；并将该方法应用于紫
花苜蓿响应低温的蛋白质组学研究中，检测其可应用性。
１　材料与方法
１．１　材料
紫花苜蓿 ＷＬ５２５ＨＱ种子由黑龙江省农业科学院草业研究所提供。２０１４年，紫花苜蓿种子播种于混有草炭
土∶蛭石＝２∶１的塑料花盆中，置于昼／夜温度２５℃／２０℃，光周期１６ｈ／８ｈ，湿度约为８０％，光照强度１２０００ｌｘ
的人工气候箱中。培养至６０ｄ苗龄，移至温度４℃，其他条件相同的恒温箱中处理１２ｈ。于低温处理０和１２ｈ
时分别剪取紫花苜蓿叶片若干，液氮速冻，－８０℃保存备用。
１．２　高丰度蛋白的去除
１．２．１　蛋白质提取　　取冻存叶片（低温４℃处理０ｈ）２ｇ，于液氮中研磨成粉末后加入８ｍＬ预冷的 Ｍｇ／ＮＰ
４０蛋白提取液［０．５ｍｏｌ／ＬｐＨ８．３ＴｒｉｓＨＣｌ，２％（ｖ／ｖ）ＮＰ４０，０．０２ｍｏｌ／Ｌ氯化镁，０．００１ｍｍｏｌ／Ｌ乙二胺四乙
酸（ｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅｔｅｔｒａａｃｅｔｉｃａｃｉｄ，ＥＤＴＡ），０．０２ｍｏｌ／ＬＤＴＴ，０．００１ｍｏｌ／Ｌ苯甲基磺酰氟（ｐｈｅｎｙｌｍｅｔｈａｎｅ
ｓｕｌｆｏｎｙｌｆｌｕｏｒｉｄｅ，ＰＭＳＦ）］［５］，在冰上研磨１０ｍｉｎ。４℃，１２０００ｒ／ｍｉｎ离心３０ｍｉｎ后取上清液，弃沉淀。上清液
分为４组，分别加入适量５０％（ｗ／ｖ）ＰＥＧ４０００至终浓度为０，１５％，１７．５％，２０％，充分混匀后冰浴３０ｍｉｎ。以
ＰＥＧ终浓度０为对照（Ｃｏｎｔｒｏｌ，ＣＫ），其余３组４℃，１２０００ｒ／ｍｉｎ离心１ｈ，分别取上清记为Ｓ１、Ｓ２、Ｓ３，相对应沉
淀记为Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３，加入３倍体积量－２０℃预冷的１０％ （ｗ／ｖ）三氯乙酸／丙酮，混匀，－２０℃过夜。４℃，１２０００
ｒ／ｍｉｎ离心１ｈ，弃上清，沉淀中加入３倍体积量－２０℃预冷丙酮，重悬后置于－２０℃１ｈ。４℃，１２０００ｒ／ｍｉｎ离心
２３１ 草　业　学　报 第２４卷
３０ｍｉｎ，弃上清，沉淀冻干成粉末。
１．２．２　聚丙烯酰胺凝胶（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）电泳检测　　蛋白质干粉中加入裂解液［７ｍｏｌ／Ｌ尿素，２ｍｏｌ／Ｌ硫脲，
４％（ｗ／ｖ）３［３（胆酰胺丙基）二甲氨基］丙磺酸内盐（３［（３ｃｈｏｌａｍｉｄｏｐｒｏｐｙｌ）ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｏ］ｐｒｏｐａｎｅｓｕｌ
ｆｏｎａｔｅ，ＣＨＡＰＳ），０．０４ｍｏｌ／ＬＤＴＴ］，振荡均匀后置于摇床上持续振荡１ｈ，使蛋白完全溶解。２ＤＱｕａｎｔ试剂盒
进行蛋白质定量，留取相应体积蛋白溶液，其余－８０℃冰箱冻存。配制１２％分离胶和５％浓缩胶用于ＳＤＳ－
ＰＡＧＥ电泳检测。电泳结束后，考马斯亮蓝Ｒ２５０染色，乙醇冰乙酸脱色至条带清晰。白光扫描仪扫描凝胶，分
析蛋白质分离情况。
１．２．３　双向电泳检测　　选用１３ｃｍＩＰＧ（ｐＨ４～７）胶条，蛋白质上样量为６５０μｇ，加入水化液［８ｍｏｌ／Ｌ尿素，
２％（ｗ／ｖ）ＣＨＡＰＳ，０．３％（ｗ／ｖ）ＤＴＴ，１％（ｖ／ｖ）ＩＰＧｂｕｆｆｅｒ］稀释至２５０μＬ。第一向等电聚焦程序为：３０Ｖ，１２ｈ；
２００Ｖ，１ｈ；５００Ｖ，１ｈ；１０００Ｖ，２ｈ；８０００Ｖ，３ｈ；８０００Ｖ，４５０００Ｖｈ；１０００Ｖ，任意。第二向１２．５％聚丙烯酰胺凝
胶电泳程序为：１０ｍＡ／胶条，０．５ｈ；４０ｍＡ／胶条，２．５～４ｈ。双向电泳后，考马斯亮蓝Ｒ２５０染色，１０％（ｖ／ｖ）冰
醋酸脱色后，白光扫描仪扫描凝胶，使用ＩｍａｇｅＭａｓｔｅｒ２ＤＰｌａｔｉｎｕｍ凝胶分析软件进行比对分析。
１．３　ＰＥＧ沉淀法的应用性验证
１．３．１　蛋白质提取　　叶片全蛋白提取用传统方法三氯乙酸／丙酮提取法。取冻存叶片（低温４℃处理０，１２ｈ）
各０．５ｇ置于预冷的研钵中，加入液氮充分研磨后转移至５０ｍＬ离心管中并加入三倍体积－２０℃预冷的蛋白提
取液［含１０％（ｗ／ｖ）三氯乙酸、０．０７％（ｖ／ｖ）β巯基乙醇、１％（ｖ／ｖ）蛋白酶抑制剂的丙酮溶液］，－２０℃沉淀过夜。
４℃，１２０００ｒ／ｍｉｎ离心１ｈ，弃去上清，保留沉淀。用三倍于沉淀体积的含有０．０７％（ｖ／ｖ）的β巯基乙醇的冷丙酮
将沉淀重悬，－２０℃沉淀１ｈ以上。４℃，１２０００ｒ／ｍｉｎ离心１ｈ，弃去上清，保留沉淀。将沉淀冻干成粉末，－８０℃
保存备用。
低丰度蛋白提取用 Ｍｇ／ＮＰ４０＋ＰＥＧ法，ＰＥＧ浓度为１７．５％ （详见１．２．１）。
１．３．２　双向电泳　　选用２４ｃｍＩＰＧ（ｐＨ４～７）胶条，蛋白质上样量为１０００μｇ，上样体积为４５０μＬ。第一向等
电聚焦程序为：３０Ｖ，１２ｈ；２００Ｖ，２ｈ；５００Ｖ，２ｈ；１０００Ｖ，２ｈ；８０００Ｖ，３ｈ；８０００Ｖ，６５０００Ｖｈ；１０００Ｖ，任意。第
二向１２．５％聚丙烯酰胺凝胶电泳程序为：１Ｗ／胶条，１ｈ；１３Ｗ／胶条，３．５～４ｈ。双向电泳后，考马斯亮蓝Ｒ２５０
染色，１０％（ｖ／ｖ）冰醋酸脱色后，白光扫描仪扫描凝胶，
　图１　不同浓度犘犈犌处理下蛋白质样品犛犇犛－犘犃犌犈电泳图
犉犻犵．１　犛犇犛－犘犃犌犈犪狀犪犾狔狊犻狊狅犳狆狉狅狋犲犻狀狊犳狉狅犿
狋犺犲犘犈犌犳狉犪犮狋犻狅狀犪狋犻狅狀
　　　Ｐ１～Ｐ３ 为ＰＥＧ浓度１５％，１７．５％，２０％ 蛋白样品的沉淀部分；Ｓ１～
Ｓ３ 为ＰＥＧ浓度１５％，１７．５％，２０％ 蛋白样品的上清部分。Ｐ１－Ｐ３ｓｔａｎｄ
ｆｏｒｐｒｏｔｅｉｎｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎｏｆｔｒｅａｔｍｅｎｔｗｉｔｈ１５％，１７．５％ａｎｄ２０％ＰＥＧ，
ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ｓ１－Ｓ３ｓｔａｎｄｆｏｒｐｒｏｔｅｉｎｓｕｐｅｒｎａｔｅｏｆｔｒｅａｔｍｅｎｔｗｉｔｈ
１５％，１７．５％ａｎｄ２０％ＰＥＧ，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．
使用ＩｍａｇｅＭａｓｔｅｒ２ＤＰｌａｔｉｎｕｍ凝胶分析软件进行比
对分析。
１．３．３　差异蛋白质点的鉴定　　筛选出的差异点通
过 ＭＡＤＬＩ＿ＴＯＦ／ＴＯＦ 进行鉴定，所得结果利用
ＭＡＳＣＯＴ 软件搜索 ＮＣＢＩ犕犲犱犻犮犪犵狅、ＮＣＢＩＶｉｒｉ
ｄｉｐｌａｎｔａｅ和Ｕｎｉｐｒｏｔ数据库。
１．４　统计分析
本试验中，所有处理３次重复，相关数据通过软件
ＤＰＳ进行差异显著度分析。
２　结果与分析
２．１　不同浓度ＰＥＧ处理下ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳分析结
果
为探究不同浓度ＰＥＧ对紫花苜蓿叶片高丰度蛋
白的分离情况，对各处理下蛋白质的沉淀和上清部分
进行了ＳＤＳ－ＰＡＧＥ检测。图１是以ＰＥＧ浓度０％
为对照组（ｃｏｎｔｒｏｌ），不同浓度ＰＥＧ处理蛋白样品后沉
淀和上清部分的ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳分析对比图。其
３３１第７期 陈晶　等：去除紫花苜蓿叶片高丰度蛋白的方法及其应用
中Ｐ１～Ｐ３与Ｓ１～Ｓ３分别对应ＰＥＧ浓度１５％，１７．５％，
图２　不同浓度犘犈犌处理下２犇犈对比图像
犉犻犵．２　犆狅犿狆犪狉犪狋犻狅狀狅犳２犇犈犵犲犾狊犳狉狅犿狋犺犲
犘犈犌犳狉犪犮狋犻狅狀犪狋犻狅狀
　　　右侧图像为双向电泳图中红框内蛋白质点的３Ｄ图像３Ｄｉｍａｇｅｓｏｎ
ｔｈｅｒｉｇｈｔｓｈｏｗｉｎｇｐｒｏｔｅｉｎｓｐｏｔｓｉｎｔｈｅｒｅｄｂｏｘｏｆ２ＤＥｇｅｌｓ．
２０％ 蛋白样品的沉淀和上清部分。图中对照组高丰
度蛋白条带清晰，聚集在５５ｋＤ左右处。而ＰＥＧ处理
后，沉淀样Ｐ１～Ｐ３ 可见清晰的高丰度蛋白条带，并且
Ｒｕｂｉｓｃｏ分散为５５ｋＤ左右大亚基（ｌａｒｇｅｓｕｂｕｎｉｔｏｆ
Ｒｕｂｉｓｃｏ，ＬＳＲ）和１４．４ｋＤ左右小亚基（ｓｍａｌｓｕｂｕｎｉｔ
ｏｆＲｕｂｉｓｃｏ，ＳＳＲ）；上清样Ｓ１～Ｓ３ 高丰度蛋白条带减
弱，其中Ｓ２ 和Ｓ３ 中高丰度蛋白下降更明显，低丰度蛋
白条带清晰稳定。可见，ＰＥＧ可以沉淀富集紫花苜蓿
叶片中的Ｒｕｂｉｓｃｏ，１７．５％，２０％的ＰＥＧ均可用于去
除高丰度。
２．２　不同浓度ＰＥＧ处理下双向电泳图像分析结果
图２显示不同浓度ＰＥＧ处理下蛋白质样品上清
部分的双向电泳图像。图中红框内为高丰度蛋白点，
用３Ｄ图像显示丰度。对照和Ｓ１ 可见大量高丰度蛋
白点，Ｓ２ 和Ｓ３ 中高丰度蛋白明显减少。而随着ＰＥＧ
浓度的升高可检测出的蛋白质点数目增多（表１），与
对照组重叠的点数减少，１７．５％和２０％的ＰＥＧ处理
均可获得较多蛋白质点，且二者没有显著差异（犘＜
０．０５）；与对照组相比差异点数变化较大，差异率分别
为（３３．３３±０．７２）％，（５６．６２±０．２２）％，（５２．２８±
０．７２）％，差异显著（犘＜０．０５）。可见，１７．５％和２０％
的ＰＥＧ均可用于提取低丰度蛋白，与ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分
析结果一致，但１７．５％ＰＥＧ处理下可检测出更多差异
点（表１）。在图２的３Ｄ图像中，Ｓ２ 的蛋白质点形成相
对分离的单峰图像，可观察到清晰的蛋白点和丰度；Ｓ３
则蛋白损失过多，呈现细小尖峰图像。可见，１７．５％
ＰＥＧ更适宜于紫花苜蓿的高丰度蛋白的去除。
２．３　ＰＥＧ沉淀法在响应低温蛋白质组学研究中的应
用
为了验证ＰＥＧ沉淀法在紫花苜蓿响应低温蛋白
质组学研究中的可应用性，紫花苜蓿叶片的蛋白分别
用三氯乙酸／丙酮法和１７．５％ＰＥＧ沉淀法进行提取，
双向电泳后经ＩｍａｇｅＭａｓｔｅｒ２ＤＰｌａｔｉｎｕｍ软件分析确
定响应低温的差异蛋白质点。图３为４℃处理１２ｈ下
紫花苜蓿叶片的双向电泳图谱（Ａ为三氯乙酸／丙酮
法，Ｂ为１７．５％ ＰＥＧ沉淀法），数字分别标注了全蛋
白和低丰度蛋白响应低温的差异蛋白质点。与未处理
的对照组相比，经低温后紫花苜蓿叶片蛋白（Ａ）中有
表１　不同处理下２犇犈图像蛋白点统计分析
犜犪犫犾犲１　犛狋犪狋犻狊狋犻犮犪犾犪狀犪犾狔狊犻狊狅犳狆狉狅狋犲犻狀狊狆狅狋狊犳狉狅犿
狋犺犲犘犈犌犳狉犪犮狋犻狅狀犪狋犻狅狀
ＰＥＧ浓度
Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ
ｏｆＰＥＧ
（％）
蛋白点数
Ｎｕｍｂｅｒｏｆ
ｐｒｏｔｅｉｎ
ｓｐｏｔｓ
重叠点数
Ｎｕｍｂｅｒｏｆ
ｏｖｅｒｌａｐｐｉｎｇ
ｓｐｏｔｓ
差异点数
Ｎｕｍｂｅｒｏｆ
ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ
差异率
Ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ
ｒａｔｉｏ
（％）
０（ＣＫ） ３３５±１７ｃ ３３５±１７ａ ０ ０
１５（Ｓ１） ４１７±３ｂ ２７８±７ｂ １３９±４ｃ ３３．３３±０．７２ｃ
１７．５（Ｓ２） ４４５±７ａ １９３±１０ｃ ２５２±３ａ ５６．６２±０．２２ａ
２０（Ｓ３） ４５９±１１ａ ２１９±２０ｃ ２４０±９ｂ ５２．２８±０．７２ｂ
　注：重叠点数为ＰＥＧ处理后上清液与对照组相重叠点数。同列不同
小写字母表示差异显著（犘＜０．０５）。
　Ｎｏｔｅ：ＯｖｅｒｌａｐｐｉｎｇｓｐｏｔｓｒｅｐｒｅｓｅｎｔｓｐｏｔｓｏｆｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔｆｒｏｍＰＥＧ
ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｉｏｎｏｖｅｒｌａｐｐｉｎｇｗｉｔｈｓｐｏｔｓｏｆｃｏｎｔｒｏｌ．Ｔｈｅｄｉｆｆｅｒｅｎｔｌｅｔｔｅｒｓｉｎ
ｔｈｅｓａｍｅｃｏｌｕｍｎｍｅａｎｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓａｔ犘＜０．０５．
１４个点蛋白质丰度变化在１．５倍以上（图３），而ＰＥＧ去除高丰度蛋白Ｒｕｂｉｓｃｏ后，低丰度蛋白（Ｂ）中发现８个新
的差异点（图３）。经ＭＡＤＬＩ＿ＴＯＦ／ＴＯＦ鉴定，所得结果利用ＭＡＳＣＯＴ软件搜索相关数据库确定其蛋白种类
４３１ 草　业　学　报 第２４卷
图３　紫花苜蓿叶片响应低温的全蛋白（犃）和低丰度蛋白（犅）双向电泳图
犉犻犵．３　２犇犈犵犲犾狊狅犳犺狅犾狅狆狉狅狋犲犻狀（犃）犪狀犱犾狅狑犪犫狌狀犱犪狀犮犲狆狉狅狋犲犻狀（犅）犻狀狉犲狊狆狅狀狊犲狋狅犾狅狑狋犲犿狆犲狉犪狋狌狉犲犻狀犪犾犳犪犾犳犪
数字表示差异点编号 Ｄｉｇｉｔｓｒｅｐｒｅｓｅｎｔｓｐｏｔｓｎｕｍｂｅｒｓ．
表２　响应低温的差异蛋白鉴定结果
犜犪犫犾犲２　犚犲狊狌犾狋狅犳犻犱犲狀狋犻犳犻犲犱狆狉狅狋犲犻狀狊犻狀狉犲狊狆狅狀狊犲狋狅犾狅狑狋犲犿狆犲狉犪狋狌狉犲
蛋白质
点序号
Ｓｐｏｔｓ
Ｎｏ．
蛋白质名称
Ｐｒｏｔｅｉｎｎａｍｅ
ＮＣＢＩ／Ｕｎｉｐｒｏｔ中序列号
ＡｃｃｅｓｓｉｏｎＮｏ．ｉｎ
ＮＣＢＩ／Ｕｎｉｐｒｏｔ
植物种类
Ｐｌａｎｔｓｐｅｃｉｅｓ
蛋白质分子量／等电点
Ｐｒｏｔｅｉｎｍｏｌｅｃｕｌａｒ
ｗｅｉｇｈｔ（Ｄａ）／Ｐｒｏｔｅｉｎ
ｉｓｏｅｌｅｃｔｒｉｃｐｏｉｎｔ
蛋白质
得分
Ｐｒｏｔｅｉｎ
ｓｃｏｒｅ
１ Ｒｕｂｉｓｃｏ活化酶Ｒｕｂｉｓｃｏａｃｔｉｖａｓｅ ｇｉ｜２３３２０７０５ 紫花苜蓿犕犲犱犻犮犪犵狅狊犪狋犻狏犪 ３０１７０．２／５．６３ １００．０００
２ Ｒｕｂｉｓｃｏ活化酶Ｒｕｂｉｓｃｏａｃｔｉｖａｓｅ ｇｉ｜２３３２０７０５ 紫花苜蓿犕犲犱犻犮犪犵狅狊犪狋犻狏犪 ３０１７０．２／５．６３ １００．０００
３ Ｒｕｂｉｓｃｏ活化酶Ｒｕｂｉｓｃｏａｃｔｉｖａｓｅ ＲＣＡＢ＿ＨＯＲＶＵ 大麦犎狅狉犱犲狌犿狏狌犾犵犪狉犲 ４７４２５．８／７．５９ １００．０００
４ Ｒｕｂｉｓｃｏ活化酶Ｒｕｂｉｓｃｏａｃｔｉｖａｓｅ ｇｉ｜２３３２０７０５ 紫花苜蓿犕犲犱犻犮犪犵狅狊犪狋犻狏犪 ３０１７０．２／５．６３ ９８．３０８
５ Ｒｕｂｉｓｃｏ活化酶Ｒｕｂｉｓｃｏａｃｔｉｖａｓｅ ｇｉ｜２２３５３６４８３ 荨麻犚犻犮犻狀狌狊犮狅犿犿狌狀犻狊 ５２１９１．７／５．３５ １００．０００
６ Ｒｕｂｉｓｃｏ大亚基结合蛋白β亚基 Ｒｕｂｉｓｃｏｌａｒｇｅｓｕｂｕｎｉｔｂｉｎｄｉｎｇｐｒｏｔｅｉｎｓｕｂ
ｕｎｉｔｂｅｔａ
ＲＵＢＢ＿ＰＥＡ 豌豆犘犻狊狌犿狊犪狋犻狏狌犿 ６３２８７．４／５．８５ ９９．５５５
７ Ｒｕｂｉｓｃｏ大亚基Ｒｕｂｉｓｃｏｌａｒｇｅｓｕｂｕｎｉｔ ｇｉ｜１２２３７７３ 紫花苜蓿犕犲犱犻犮犪犵狅狊犪狋犻狏犪 ５０６８４．６／６．２２ ９４．２６８
８ 转酮醇酶 Ｔｒａｎｓｋｅｔｏｌａｓｅ ｇｉ｜５０２１２１５２６ 鹰嘴豆犆犻犮犲狉犪狉犻犲狋犻狀狌犿 ８０４１２．５／６ １００．０００
９ 转酮醇酶 Ｔｒａｎｓｋｅｔｏｌａｓｅ ｇｉ｜５０２１２１５２６ 鹰嘴豆犆犻犮犲狉犪狉犻犲狋犻狀狌犿 ７９９０５．７／６．５１ １００．０００
１０ 转酮醇酶 Ｔｒａｎｓｋｅｔｏｌａｓｅ ｇｉ｜５０２１２１５２６ 鹰嘴豆犆犻犮犲狉犪狉犻犲狋犻狀狌犿 ８０４１２．５／６ １００．０００
１１ Ｓ腺苷Ｌ甲硫氨酸合成酶ＳａｄｅｎｏｓｙｌＬｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ ｇｉ｜１３９４７８０６０ 黄花苜蓿犕犲犱犻犮犪犵狅犳犪犾犮犪狋犪 ４３５８８／５．７７ １００．０００
１２ 谷氨酸１半醛转氨酶 Ｇｌｕｔａｍａｔｅ１ｓｅｍｉａｌｄｅｈｙｄｅａｍｉｎｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ ｇｉ｜３４５４５１０３０ 紫花苜蓿犕犲犱犻犮犪犵狅狊犪狋犻狏犪 ５０２６０．５／６．３６ １００．０００
１３ 非典型蛋白ＰＲＥＤＩＣＴＥＤ：ＵｎｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｅｄｐｒｏｔｅｉｎＬＯＣ１０１４９９５０２ ｇｉ｜５０２１４０４１９ 鹰嘴豆犆犻犮犲狉犪狉犻犲狋犻狀狌犿 ３６６８９．６／６．３ １００．０００
１４ 未命名蛋白产物 Ｕｎｎａｍｅｄｐｒｏｔｅｉｎｐｒｏｄｕｃｔ ｇｉ｜２９７７４６４９９ 葡萄犞犻狋犻狊狏犻狀犻犳犲狉犪 ２４３２３．４／７．６３ ９５．９２４
Ｌ１ Ｒｕｂｉｓｃｏ大亚基 Ｒｕｂｉｓｃｏｌａｒｇｅｓｕｂｕｎｉｔ ｇｉ｜４０４２４３９０４ 紫花苜蓿犕犲犱犻犮犪犵狅狊犪狋犻狏犪 ２１７０９．９／５．７８ １００．０００
Ｌ２ 肽基脯氨酰顺反异构酶ＰｅｐｔｉｄｙｌｐｒｏｌｙｌｃｉｓｔｒａｎｓｉｓｏｍｅｒａｓｅＣＹＰ２０３ ｇｉ｜３３４１８６１９８ 拟南芥犃狉犪犫犻犱狅狆狊犻狊狋犺犪犾犻犪狀犪 ２８４０３．２／８．９７ ９９．８３１
Ｌ３ 真核翻译起始因子 Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎｉｎｉｔｉａｔｉｏｎｆａｃｔｏｒ５Ａ２ ｇｉ｜２０１３８６６４ 紫花苜蓿犕犲犱犻犮犪犵狅狊犪狋犻狏犪 １７５０１．７／５．４１ １００．０００
Ｌ４ ２半胱氨酸过氧化物还原酶２ＣｙｓｐｅｒｏｘｉｒｅｄｏｘｉｎＢＡＳ１ｌｉｋｅ ｇｉ｜５０２１１２０９８ 鹰嘴豆犆犻犮犲狉犪狉犻犲狋犻狀狌犿 ３０６９８．１／６．１２ １００．０００
Ｌ５ ２半胱氨酸过氧化物还原酶２ＣｙｓｐｅｒｏｘｉｒｅｄｏｘｉｎＢＡＳ１ｌｉｋｅ ｇｉ｜５０２１１２１０２ 鹰嘴豆犆犻犮犲狉犪狉犻犲狋犻狀狌犿 ２９１４４．１／６．１２ １００．０００
Ｌ６ ５甲基四氢蝶酰三谷氨酸高半胱氨酸甲基转移酶５ｍｅｔｈｙｌｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｐｔｅｒｏｙｌ
ｔｒｉｇｌｕｔａｍａｔｅｈｏｍｏｃｙｓｔｅｉｎｅｍｅｔｈｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ
ＭＥＴＥ＿ＡＲＡＴＨ 拟南芥犃狉犪犫犻犱狅狆狊犻狊狋犺犪犾犻犪狀犪 ８４６４５．６／６．０９ １００．０００
Ｌ７ ５甲基四氢蝶酰三谷氨酸高半胱氨酸甲基转移酶５ｍｅｔｈｙｌｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｐｔｅｒｏｙｌ
ｔｒｉｇｌｕｔａｍａｔｅｈｏｍｏｃｙｓｔｅｉｎｅｍｅｔｈｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅｌｉｋｅ
ｇｉ｜５２５３４５１００ 鹰嘴豆犆犻犮犲狉犪狉犻犲狋犻狀狌犿 ８４５９９．７／６．０１ １００．０００
Ｌ８ 放氧增强蛋白 Ｏｘｙｇｅｎｅｖｏｌｖｉｎｇｅｎｈａｎｃｅｒｐｒｏｔｅｉｎ ｇｉ｜５０２１５３１０８ 鹰嘴豆犆犻犮犲狉犪狉犻犲狋犻狀狌犿 ３５１０６．８／６．２４ １００．０００
　“Ｌ”表示低丰度蛋白。“Ｌ”ｒｅｐｒｅｓｅｎｔｓｌｏｗａｂｕｎｄａｎｃｅｐｒｏｔｅｉｎ．
５３１第７期 陈晶　等：去除紫花苜蓿叶片高丰度蛋白的方法及其应用
（表２）。由鉴定结果可知，紫花苜蓿叶片蛋白和低丰度蛋白中 Ｒｕｂｉｓｃｏ及其变体分别占差异蛋白的５０％和
１２．５％。去除高丰度蛋白后，可检测出原本被遮盖或因共迁移影响的蛋白质，其蛋白种类可见表２。可见，
１７．５％的ＰＥＧ可以清除大部分Ｒｕｂｉｓｃｏ，并可应用于紫花苜蓿响应低温的蛋白质组学研究中。
３　讨论
植物组织中常含有拷贝数众多的高丰度蛋白，例如，Ｒｕｂｉｓｃｏ作为光合作用中固定ＣＯ２ 关键酶，一般占蛋白
总量的３０％～６０％，严重影响邻近蛋白点的识别和其他蛋白点在凝胶电泳中的共同迁移，从而降低了低丰度蛋
白的分辨率［１７１９］。同样的，由于高丰度蛋白占据了样品中的一大部分，使得在双向电泳ＩＰＧ胶条上样容量一定
的情况下，低丰度蛋白的含量受到限制而不易被检测到［２０］。而低丰度蛋白作为细胞或组织中的受体分子、信号
分子等参与基因表达调控，往往具有十分重要的功能［１９］。因此，如何去除高丰度蛋白以便分离鉴定低丰度蛋白
一直是蛋白质组学研究中亟待解决的问题之一。在以往的文献中发现，１５％～２０％ＰＥＧ可以有效去除植物蛋白
中大部分高丰度蛋白，尤其是Ｒｕｂｉｓｃｏ的大亚基，但在不同物种或组织中用于预分离的ＰＥＧ浓度是不同的。在
一定范围内，高浓度ＰＥＧ对蛋白质的沉淀效率高。Ｘｉ等［１３］利用１６％的ＰＥＧ去除了拟南芥中大部分高丰度蛋
白；王莹等［２１］利用２０％ＰＥＧ提取了水稻叶鞘中的低丰度蛋白；钟俐等［１６］研究发现１５％ＰＥＧ更适宜于甜瓜叶片
的低丰度蛋白提取。本研究表明，适宜的ＰＥＧ浓度可以去除紫花苜蓿叶片的高丰度蛋白，且这种筛选是十分必
要的。ＰＥＧ浓度过低无法有效沉淀高丰度蛋白（图２中Ｓ１）；浓度过高则易造成蛋白质过度沉淀，蛋白质点损失
（图２中Ｓ３）。本研究中，１７．５％ＰＥＧ能够清除大部分高丰度蛋白，使原本被遮盖的蛋白质点更易于被检测到；同
时避免了蛋白的过度损失。可见，该浓度最适宜紫花苜蓿叶片高丰度蛋白的去除。
为了验证ＰＥＧ沉淀法在紫花苜蓿蛋白质组学研究中的可行性，比较了三氯乙酸／丙酮法与ＰＥＧ去除叶片高
丰度蛋白后响应低温的差异蛋白变化。三氯乙酸／丙酮法是提取植物蛋白质的常用方法之一［２２２５］，具有降低次生
代谢物质的干扰、减少蛋白降解等优点［２６２７］。与其提取的蛋白相比，１７．５％ＰＥＧ去除了大部分Ｒｕｂｉｓｃｏ，并检测
到８个响应低温的新蛋白质。其中Ｒｕｂｉｓｃｏ大亚基（点Ｌ１）主要参与光合作用过程中ＣＯ２ 的固定；肽酰脯氨酰－
顺反式异构酶（点Ｌ２）和真核翻译起始因子（点Ｌ３）参与蛋白质的翻译和折叠加工［２５，２８３０］；２半胱氨酸过氧化物还
原酶（点Ｌ４ 和Ｌ５）响应低温胁迫下机体内部的氧化还原平衡［３１］；５甲基四氢蝶酰三谷氨酸高半胱氨酸甲基转移
酶（点Ｌ６ 和Ｌ７）是一类甲基转移酶，可为Ｓ甲硫氨酸腺苷途径提供底物；而放氧增强蛋白（点Ｌ８）作为获光复合
体的组成元件，能通过激发叶绿素而获得更多的光能，并把能量转移到光化反应中心，有助于增强低温逆境下的
光合作用效率［３２］。这些新发现的蛋白点在紫花苜蓿叶片中由于高丰度蛋白遮盖而无法检测到。可见，利用
１７．５％ＰＥＧ去除高丰度蛋白在紫花苜蓿蛋白质组学研究中有实际的应用意义，有助于低丰度蛋白的检测。该方
法也可用于紫花苜蓿生长发育或逆境应答的蛋白质组学研究，有助于功能蛋白的分析与鉴定。
４　结论
高丰度蛋白影响了紫花苜蓿叶片中低丰度蛋白的鉴定。本研究采用ＰＥＧ沉淀法，比较了０，１５％，１７．５％和
２０％的ＰＥＧ对高丰度蛋白的分离情况，结果显示，１７．５％的ＰＥＧ最适宜用于紫花苜蓿叶片高丰度蛋白的去除。
此法应用于紫花苜蓿低温应答的差异蛋白鉴定中，获得８个新差异蛋白，证明其适用于紫花苜蓿的蛋白质组学研
究。
犚犲犳犲狉犲狀犮犲狊：
［１］　ＡｎｄｒｅｗＷＣ，ＨｉｒｅｎＪＪ，ＪｏｓｈｕａＬＨ．Ｍａｎａｇｉｎｇｔｈｅｇｒｅｅｎｐｒｏｔｅｏｍｅｓｆｏｒｔｈｅｎｅｘｔｄｅｃａｄｅｏｆｐｌａｎｔｒｅｓｅａｒｃｈ．ＦｒｏｎｔｉｅｒｓｉｎＰｌａｎｔ
Ｓｃｉｅｎｃｅ，２０１３，（４）：５０１．
［２］　ＪｅｎｎｙＲ，ＪｅａｎＦｒａｎｃｏｉｓＨ，ＭｉｃｈａｅｌＥＷ．Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓａｎｄｌｏｗｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅｓｔｕｄｉｅｓ：ｂｒｉｄｇｉｎｇｔｈｅｇａｐｂｅｔｗｅｅｎｇｅｎｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ
ａｎｄｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ．ＰｈｙｓｉｏｌｏｇｉａＰｌａｎｔａｒｕｍ，２００６，１２６：９７１０９．
［３］　ＫａｎｇＪＭ，ＺｈａｎｇＴＪ，ＷａｎｇＭＹ，犲狋犪犾．Ｒｅｓｅａｒｃｈｐｒｏｃｅｓｓｉｎｔｈｅｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅｔｒａｉｔｌｏｃｉ（ＱＴＬ）ａｎｄｇｅｎｏｍｉｃｓｅｌｅｃｔｉｏｎｏｆａｌｆａｌ
ｆａ．ＡｃｔａＰｒａｔａｃｕｌｔｕｒａｅＳｉｎｉｃａ，２０１４，２３（５）：３０４３１２．
［４］　ＧｉａｖａｌｉｓｃｏＰ，ＮｏｒｄｈｏｆｆＥ，ＫｒｅｉｔｌｅｒＴ，犲狋犪犾．Ｐｒｏｔｅｏｍｅａｎａｌｙｓｉｓｏｆ犃狉犪犫犻犱狅狆狊犻狊狋犺犪犾犻犪狀犪ｂｙｔｗｏｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌｇｅｌｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ
６３１ 草　业　学　报 第２４卷
ａｎｄｍａｔｒｉｘａｓｓｉｓｔｅｄｌａｓｅｒｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ／ｉｏｎｉｓａｔｉｏｎｔｉｍｅｏｆｆｌｉｇｈｔｍａｓｓ．Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ，２００５，５：１９０２１９１３．
［５］　ＹａｎＳＰ，ＺｈａｎｇＱＹ，ＴａｎｇＺＣ，犲狋犪犾．Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅｐｒｏｔｅｏｍｉｃａｎａｌｙｓｉｓｐｒｏｖｉｄｅｓｎｅｗｉｎｓｉｇｈｔｓｉｎｔｏｃｈｉｌｉｎｇｓｔｒｅｓｓｒｅｓｐｏｎｓｅｓｉｎ
ｒｉｃｅ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ＆Ｃｅｌｕｌａｒ，２００６，５：４８４４９６．
［６］　ＣｅｌａｒＮＡ，ＫｕｐｐａｎｎａｎＫ，ＬａｎｇｈｏｒｓｔＭＬ，犲狋犪犾．Ｃｒｏｓｓｓｐｅｃｉｅｓａｐｐｌｉｃａｂｉｌｉｔｙｏｆａｂｕｎｄａｎｔｐｒｏｔｅｉｎｄｅｐｌｅｔｉｏｎｃｏｌｕｍｎｓｆｏｒｒｉｂｕ
ｌｏｓｅ１，５ｂｉｓｐｈｏｓｐｈａｔｅｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ／ｏｘｙｇｅｎａｓｅ．ＪｏｕｒｎａｌｏｆＣｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ，２００８，８６１：２９３９．
［７］　ＣｈｏＪＨ，ＷａｎｇＨ，ＣｈｏＭＨ，犲狋犪犾．ＴｈｅｅｆｆｅｃｔｏｆＤＴＴｉｎｐｒｏｔｅｉｎｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎｓｆｏｒｐｒｏｔｅｏｍｉｃａｎａｌｙｓｉｓ：Ｒｅｍｏｖａｌｏｆａｈｉｇｈｌｙａ
ｂｕｎｄａｎｔｐｌａｎｔｅｎｚｙｍｅ，ｒｉｂｕｌｏｓｅｂｉｓｐｈｏｓｐｈａｔｅａｒｂｏｘｙｌａｓｅ／ｏｘｙｇｅｎａｓｅ．ＪｏｕｒｎａｌｏｆＰｌａｎｔＢｉｏｌｏｇｙ，２００８，５１：２９７３０１．
［８］　ＬｉＨＢ，ＫａｎｇＺＳ．ＳｔｕｄｙｏｆａｒａｐｉｄｍｅｔｈｏｄｆｏｒｄｅｐｌｅｔｉｏｎｏｆｈｉｇｈｌｙａｂｕｎｄａｎｔｐｒｏｔｅｉｎＲｕｂｉｓｃｏｅｎｚｙｍｅｆｒｏｍｗｈｅａｔ（犜．犪犲狊狋犻
狏狌犿）ｌｅａｆｆｏｒｐｒｏｔｅｏｍｅａｎａｌｙｓｉｓ．ＪｏｕｒｎａｌｏｆＮｏｒｔｈｗｅｓｔＡ＆ＦＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（ＮａｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅＥｄｉｔｉｏｎ），２０１１，３９（６）：２２３２２８．
［９］　ＫｒｉｓｈｎａｎＨＢ，ＮａｔａｒａｊａｎＳＳ．ＡｒａｐｉｄｍｅｔｈｏｄｆｏｒｄｅｐｌｅｔｉｏｎｏｆＲｕｂｉｓｃｏｆｒｏｍｓｏｙｂｅａｎ（犌犾狔犮犻狀犲犿犪狓）ｌｅａｆｆｏｒｐｒｏｔｅｏｍｉｃａｎａｌｙ
ｓｉｓｏｆｌｏｗｅｒａｂｕｎｄａｎｃｅｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍ，２００９，７０：１９５８１９６４．
［１０］　ＡｔｈａＤＨ，ＩｎｇｈａｍＫＣ．Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｏｆｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎｏｆｐｒｏｔｅｉｎｓｂｙｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌｓ．ＴｈｅＪｏｕｒｎａｌｏｆＢｉｏｌｏｇｙＣｈｅｍｉｓｔｒｙ，
１９８１，２５６：１２１０８１２１１７．
［１１］　ＪｕｃｋｅｓＩＲ．Ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｉｏｎｏｆｐｒｏｔｅｉｎｓａｎｄｖｉｒｕｓｅｓｗｉｔｈｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ．ＢｉｏｃｈｉｍｉｃａｅｔＢｉｏｐｈｙｓｉｃａＡｃｔａ，１９７１，２２９：５３５
５４６．
［１２］　ＫｉｍＳＴ，ＣｈｏＫＳ，ＪａｎｇＹＳ，犲狋犪犾．Ｔｗｏｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｔｉｃａｎａｌｙｓｉｓｏｆｒｉｃｅｐｒｏｔｅｉｎｓｂｙｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌｆｒａｃ
ｔｉｏｎａｔｉｏｎｆｏｒｐｒｏｔｅｉｎａｒｒａｙｓ．Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，２００１，２２：２１０３２１０９．
［１３］　ＸｉＪＨ，ＷａｎｇＸ，ＬｉＳＹ，犲狋犪犾．Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌｆｒａｃｔｉｏｎａｔｉｏｎｉｍｐｒｏｖｅｄｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆｌｏｗａｂｕｎｄａｎｔｐｒｏｔｅｉｎｓｂｙｔｗｏｄｉｍｅｎ
ｓｉｏｎａｌｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓａｎａｌｙｓｉｓｏｆｐｌａｎｔｐｒｏｔｅｏｍｅ．Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２００６，６７：２３４１２３４８．
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８３１ 草　业　学　报 第２４卷