全 文 ：书一株纤维素分解菌的鉴定及对两种草坪草
凋落物分解活性的研究
芦光新１，２，陈秀蓉１，杨成德１，薛莉１，刘雯１，卞静１
（１．甘肃农业大学草业学院 草业生态系统教育部重点实验室 中－美草地畜牧业可持续发展研究中心，甘肃 兰州７３００７０；
２．青海大学农牧学院草业科学系，青海 西宁８１００１６）
摘要：对１株分离筛选自东祁连山高寒草地土壤真菌菌株Ｆ１ 的分类学地位及对多年生黑麦草和白三叶凋落物的
分解活性进行了研究。采用形态学和ｒＤＮＡＩＴＳ分子生物学相结合的方法，对菌株Ｆ１ 的分类学地位进行了确定，
初步鉴定为犕犻犮狉狅犱狅犮犺犻狌犿犫狅犾犾犲狔犻；应用摇瓶液体发酵法，通过接种和不接种处理，分别以２种草坪草凋落物为底
物，于２５℃，１５０ｒ／ｍｉｎ震荡培养４２ｄ，测定了２种草坪草凋落物诱导真菌分泌木质纤维素酶活力动态变化和草坪
草凋落物细胞壁物质（ＣＷＭ）的降解率。结果表明，１）接种处理后，２种草坪草细胞壁非水溶性物质（ＩＣＷＭ）的量
显著减少（犘＜０．０５）；２）漆酶出现最早，其次是纤维素酶和木聚糖酶，邻苯二酚氧化酶和愈创木酚氧化酶出现最晚；
３）与白三叶凋落物为底物的发酵体系相比，黑麦草凋落物ＩＣＷＭ和ＣＷＭ降解率高，且差异显著（犘＜０．０５）；４）除
漆酶之外，以黑麦草凋落物诱导菌株Ｆ１ 分泌的滤纸酶、羧甲基纤维素酶、木聚糖酶、邻苯二酚氧化酶和愈创木酚氧
化酶活力比白三叶诱导相应的酶活力高（犘＜０．０５）。
关键词：高寒草地土壤真菌；草坪草凋落物；细胞壁物质；分解活性
中图分类号：Ｓ８１２．２；Ｓ１５４．３ 文献标识码：Ａ 文章编号：１００４５７５９（２０１１）０６０１７０１０
草坪草调落物是草坪草死亡或者组织凋落后有机物质的总称，是城市绿地生态系统重要的组成部分。近年
来，随着全球应对气候变化、节能减排和低碳经济所面临的压力，作为城市绿地生态系统碳循环的重要组成部分，
对草坪草调落物分解的研究引起了学者们的关注和重视。
凋落物有机质的主要成分是纤维素类物质，占细胞壁物质干重的３５％～５０％［１］。Ｈａｍｍｅｌ［２］指出，在自然界
中，只有当植物有机残体落入土壤并进一步降解后，才能够再生和维持地球碳循环。纤维素类物质的降解关系到
陆地生态系统的物质循环过程、植物的养分利用和全球气候变化，在生态系统碳素循环中占有重要位置［３］，但凋
落物有机质在自然状态下极难分解［４］。
土壤微生物是维持生态系统平衡重要的组成部分［５］，在自然界营养元素的生物地球化学循环中扮演着重要
的角色［６］，尤其是一些具有纤维素分解功能的土壤微生物在凋落物分解过程中占支配地位［７］。研究证实，纤维素
分解菌是自然物质循环不可缺少的成员，担负着分解动植物残体的重要作用，尤其是分泌的一些纤维素分解酶类
物质［８］，在生态系统纤维素类物质的分解及碳素循环中发挥着重要作用［９］。已有的研究表明，富含木质纤维素以
及木质素衍生复合物的土壤中生存着一些能够降解木质素、纤维素的微生物，它们对碳循环同样起着不可替代的
作用［１０］，微生物参与凋落物的分解作用对土壤层内部的物质与能量循环和全球碳循环乃至全球变化具有较高的
贡献率。因此，研究土壤微生物对凋落物的分解作用，对于了解生态系统的碳流过程及研究生态系统碳源与碳汇
的议题均具有积极的意义。
当今环境情况及地质史对物种空间分布的相对影响进行定量分析成为微生物生态学上的一个重大的挑
战［１１，１２］，因此，不同地域及特殊生境蕴涵着具有一定功能的微生物物种和基因。东祁连山高寒草地地处青藏高
原的东缘，由于地理位置特殊、气候条件独特、生物种类多样，独特的生态环境孕育了功能多元化的草地土壤微生
１７０－１７９
２０１１年１２月
草 业 学 报
ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ
第２０卷 第６期
Ｖｏｌ．２０，Ｎｏ．６
收稿日期：２０１１０６２３；改回日期：２０１１０７１８
基金项目：国家自然科学基金项目（３０４７１２３２）资助。
作者简介：芦光新（１９７４），男，青海湟中人，教授，在读博士。Ｅｍａｉｌ：ｌｕｇｘ７４＠ｑｑ．ｃｏｍ
通讯作者。Ｅｍａｉｌ：ｃｈｅｎｘｉｕｒｏｎｇ＠ｇｓａｕ．ｅｄｕ．ｃｎ
物。已有的研究发现，微生物与其生态环境协同进化，形成一种适应性表现［１３］，东祁连山高寒草地土壤真菌多样
性较丰富［１４］，该地区形成了地域性的具有特殊功能的微生物资源。因此，挖掘该地区土壤中纤维素类降解菌种
资源对研究高寒地区凋落物的分解具有重要的意义。
人们对农业生态系统中微生物功能群及其生态系统功能早有成熟的认识［１５］，认为纤维素分解功能菌资源在
草业生态系统界面中有一定的利用潜势［１６］。为进一步从草业生态系统草丛－地境界面上认识和了解土壤中具
有纤维素分解功能的微生物与凋落物分解之间的相互关系，在东祁连山高寒草地土壤纤维素分解菌的筛选基础
上，选用１株高产木质纤维素酶真菌菌株，拟对２种草坪草凋落物降解过程中诱导真菌产生木质纤维素酶活力的
变化规律和凋落物细胞壁物质的降解程度进行研究，旨在揭示菌株Ｆ１ 分解草坪草凋落物过程中，所产生木质素
酶和纤维素酶的动力学机制以及与底物降解率的相互关系，为进一步研究凋落物降解和土壤微生物的相互关系
以及草坪草凋落物降解过程中微生物机理提供一定的科学理论依据。
１ 材料与方法
１．１ 供试菌株
菌株Ｆ１ 由本课题组从东祁连山高寒草地土壤中分离筛选获得，保存于４℃冰箱。经初步测定，菌株Ｆ１ 具有
分解纤维素的能力。
１．２ 草坪草凋落物及处理
以多年生黑麦草（犔狅犾犻狌犿狆犲狉犲狀狀犲）和白三叶（犜狉犻犳狅犾犻狌犿狉犲狆犲狀狊）的凋落物作为底物。凋落物采自甘肃农业
大学校园草坪地，采样时期为２０１０年１月。试验前将凋落物用蒸馏水清洗３次，８０℃烘１２ｈ，剪成３～５ｃｍ，备
用。
１．３ 培养基
马铃薯葡萄糖琼脂培养基（ＰＤＡ）：马铃薯２００ｇ，葡萄糖２０ｇ，琼脂１０ｇ，蒸馏水１０００ｍＬ，用于菌种的活化
和转接；马铃薯蔗糖液体培养基（ＰＳ）：马铃薯２００ｇ，蔗糖２０ｇ，蒸馏水１０００ｍＬ，用于菌丝体的培养，提取菌株
Ｆ１ 基因组ＤＮＡ；发酵产酶培养基：ＮａＮＯ３２．５ｇ，ＫＨ２ＰＯ４１ｇ，ＣａＣｌ２·６Ｈ２Ｏ０．１ｇ，ＭｇＳＯ４０．３ｇ，ＮａＣｌ０．１ｇ，
ＦｅＣｌ３０．０１ｇ，草坪草凋落物０．５ｇ，蒸馏水１０００ｍＬ，ｐＨ自然。
１．４ 方法
１．４．１ 菌株活化 将保存的供试菌种接种于ＰＤＡ平板培养基，２５℃恒温培养７～８ｄ后，连续转接２～３次，直
到菌丝生长良好。
１．４．２ 菌株鉴定 按真菌显微形态观察的常规方法［１７］，挑取供试菌株在ＰＤＡ培养基上培养７～８ｄ的培养物
进行制片，在光学显微镜（４００×）下观察孢子形态，并拍照，对培养物的菌落和菌丝体形态加以描述。
经活化、纯化的菌株挑取少量菌丝接种于ＰＳ液体培养基中，于２５℃，１５０ｒ／ｍｉｎ摇床振荡培养，直至形成足
量的菌丝体，过滤后收集菌丝体，采用试剂盒法提取基因组ＤＮＡ。以基因组ＤＮＡ为模板，利用１对ｒＤＮＡ－
ＩＴＳ通用引物（ＩＴＳ１、ＩＴＳ４）进行ＰＣＲ扩增，扩增产物纯化后，送样测定ＤＮＡ序列。将测序获得的ＩＴＳ序列通
过与ＧｅｎＢａｎｋ中的核酸数据库序列进行Ｂｌａｓｔｎ分析，采用ＣＬＵＳＴＡＬ软件进行多重序列比对［１８］，并用 ＭＥＧＡ
４．０软件采用 ＮｅｉｇｈｂｏｒＪｏｉｎｉｎｇ法和 ＵＰＧＭＡ法构建系统发育树［１９，２０］。ＩＴＳ１：５′ＧＴＡＧＧＴＧＡＡＣＣＴＧＣＧＧ
３′，ＩＴＳ４：５′ＴＣＣＴＣＣＧＣＴＴＡＴＴＧＡＴＡＴＧＣ３′。ＰＣＲ反应程序：预变性９５℃５ｍｉｎ，变性９５℃１ｍｉｎ，复性
５０℃１ｍｉｎ，延伸７２℃１ｍｉｎ，３５个循环，最终７２℃延伸１０ｍｉｎ。基因组ＤＮＡ提取试剂盒（ＳＫ１３７５）、引物合成、
序列测定均由上海生工生物工程有限公司完成。
１．４．３ 粗酶液的制备 将活化的菌株Ｆ１ 接种于已灭菌的盛有５０ｍＬ发酵产酶培养基的１５０ｍＬ锥形瓶中，以
不接菌为对照，于２５℃，１５０ｒ／ｍｉｎ震荡培养４２ｄ，每个处理重复３次。自试验第１天起，每隔２ｄ用灭菌的１０００
μＬ移液器枪头，在无菌操作的条件下，吸取２ｍＬ上清液，于４℃，１００００ｒ／ｍｉｎ，离心１０ｍｉｎ，取上清液制备粗酶
液，每次吸取２ｍＬ上清液后，用２ｍＬ灭菌水将发酵产酶培养基补足至原体积数。
１．４．４ 木质纤维素酶活力的测定 漆酶活力的测定采用邻联甲苯胺作为氧化底物，吸取粗酶液０．２ｍＬ，分别以
１ｍＬ含有１％邻联甲苯胺的柠檬酸缓冲液（ｐＨ＝５．５，终浓度为０．１ｍｏｌ／Ｌ）和２ｍＬ蒸馏水共同组成共３．２ｍＬ
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的反应体系，反应在３０℃恒温水浴锅中进行，保温３０ｍｉｎ，在６００ｎｍ波长下测定光密度值；同样的方法，愈创木
酚氧化酶活性测定采用愈创木酚作为氧化底物，在４９０ｎｍ波长下测定光密度值；联苯二胺氧化酶活性测定采用
邻苯二酚作为氧化底物，在４００ｎｍ波长下测定光密度值。空白对照用等体积热变性的粗酶液代替新鲜的粗酶
液。反应３０ｍｉｎ测得的光密度值的变化来衡量酶活力大小。
纤维素酶活力测定：吸取２份体积为０．２ｍＬ的粗酶液，分别以１ｍＬ含足量滤纸（新华１号）、０．５％的羧甲
基纤维素钠（ＣＭＣＮａ）为反应底物的柠檬酸缓冲液（ｐＨ＝５．５，终浓度为０．１ｍｏｌ／Ｌ）组成反应体系，在３７℃恒温
水浴锅中保温６０ｍｉｎ或３０ｍｉｎ，采用ＤＮＳ法（３，５二硝基水杨酸）［２１］测定最终反应产物在５４０ｎｍ波长下的吸
光值。空白对照用等体积热变性的粗酶液代替新鲜的粗酶液，以测得的光密度的变化值来衡量酶活力大小。
木聚糖酶活力的测定：吸取粗酶液０．２ｍＬ，与１ｍＬ含０．５％的桦木木聚糖为反应底物的柠檬酸缓冲液（ｐＨ
＝５．５，终浓度为０．１ｍｏｌ／Ｌ）组成反应体系，反应在３７℃恒温水浴锅中进行，保温３０ｍｉｎ，采用ＤＮＳ法［２１］在５４０
ｎｍ波长下测定光密度值。空白对照用等体积热变性的粗酶液代替新鲜的粗酶液。以测得的光密度的变化值来
衡量酶活力大小。
１．４．５ 凋落物细胞壁物质的降解及降解率测定 以提取的粗酶液与对照培养基液体的颜色变化、凋落物的分解
程度为定性指标，以凋落物细胞壁物质（ｃｅｌｗａｌｍａｔｅｒｉａｌ，ＣＷＭ）量的变化，包括细胞壁水溶性物质（ｗａｔｅｒｓｏｌｕ
ｂｌｅｃｅｌｗａｌｍａｔｅｒｉａｌ，ＷＳＣＷＭ）和细胞壁非水溶性物质（ｉｎｓｏｌｕｂｌｅｃｅｌｗａｌ ｍａｔｅｒｉａｌ，ＩＣＷＭ）的量的变化，以及
凋落物ＣＷＭ和ＩＣＷＭ的降解率为定量指标，作为衡量菌株Ｆ１ 分解草坪草凋落物能力。
发酵产酶结束后，比较接种菌株Ｆ１ 后提取的粗酶液与对照培养基液体的颜色变化、凋落物分解程度，并将摇
瓶内全部水相和草相混合物经烘干称重的新华１号滤纸过滤，收集残留的凋落物，８０℃下烘至恒重后称重，取平
均值进行统计分析。采用下列公式计算样品的降解率。
ＷＳＣＷＭ的降解率（％）＝［（不接种处理样品初始干物质量－不接种处理样品分解后干物质量）／不接种处
理样品初始干物质量］×１００％
真菌对ＣＷＭ的降解率（％）＝［（接种处理样品的初始干物质量－接种处理样品分解后干物质量）／接种处理
初始干物质量］×１００％
真菌对ＩＣＷＭ 的降解率（％）＝［（不接种处理样品的ＩＣＷＭ－接种处理样品的ＩＣＷＭ）／不接种处理样品
ＩＣＷＭ］×１００％
凋落物ＣＷＭ量为凋落物样品在８０℃烘至恒重的重量，凋落物 ＷＳＣＷＭ的量就是对照样品的减重值，凋落
物ＣＷＭ总量等于凋落物 ＷＳＣＷＭ的量和凋落物ＩＣＷＭ的量之和。
１．４．６ 酶活力比较 平均产酶活力：整个试验期内酶活力的平均值；产酶活力指数（犈犐）＝∑犈狋／犇狋；式中，犈狋为
在时间狋日的酶活力；犇狋为相应的产酶日数；最大酶活力：整个试验期内，真菌产生最高酶活力。
１．５ 统计分析
所有数据均用 ＭｉｃｒｏｓｏｆｔＥｘｃｅｌ录入并作图，采用ＤＰＳ６．５５进行数据分析，采用２组平均数的Ｓｔｕｄｅｎｔ狋检
验分析各处理间的差异显著性［２２］。
２ 结果与分析
２．１ 菌株Ｆ１ 的鉴定
菌株Ｆ１ 在ＰＤＡ培养基上的菌落表面白色，背面淡黄色或褐色。菌落圆形或近规则圆形，稍隆起，略高于平
板，中央区域厚，边缘薄且渗入到培养基中，在２５～３０℃生长速度较快，培养７ｄ后菌落直径达５５．０９～５９．７８
ｃｍ；菌丝绒毛状，质地比较疏松（图１Ａ）；分生孢子新月形，孢子大小为５～９μｍ（图１Ｂ）。
以提取的供试菌株的基因组ＤＮＡ为模板、ＩＴＳ１ＩＴＳ４为引物进行ＰＣＲ扩增，扩增产物经０．８％琼脂糖凝
胶电泳检测，扩增片段为５００～７５０ｂｐ；测序结果表明，供试菌株的ＩＴＳ序列长度为５３９ｂｐ，Ｇ＋Ｃ含量为４５．９％，
将该序列在ＧｅｎＢａｎｋ中进行ＢＬＡＳＴ同源性比较，发现与ＧｅｎＢａｎｋ中报道的３株犕犻犮狉狅犱狅犮犺犻狌犿犫狅犾犾犲狔犻（登录
号：ＡＪ２７９４５４、ＧＵ５６６２９８、ＡＭ５０２２６４）和２株犕犻犮狉狅犱狅犮犺犻狌犿ｓｐ．（ＡＭ５０２２５８、ＡＭ５０２２５７）ＩＴＳ序列的同源性达
到１００％。为了进一步确定目标菌株的分类地位，采用ＮｅｉｇｈｂｏｒＪｏｉｎｉｎｇ法（图２Ａ）和 ＵＰＧＭＡ法（图２Ｂ）分别
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图１ 菌株犉１ 的形态特征
犉犻犵．１ 犕狅狉狆犺狅犾狅犵狔犮犺犪狉犪犮狋犲狉犻狊狋犻犮狅犳狊狋狉犪犻狀犉１
Ａ：菌株Ｆ１的菌落特征Ｃｏｌｏｎｙｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ；Ｂ：菌株Ｆ１的孢子形态Ｓｐｏｒｅｓｆｏｒｍ．
图２ 菌株犉１ 系统发育树的构建
犉犻犵．２ 犆狅狀狊狋狉狌犮狋犻狅狀狅犳狆犺狔犾狅犵犲狀犲狋犻犮狋狉犲犲狅犳狊狋狉犪犻狀犉１
Ａ、Ｂ分别为基于ＮｅｉｇｈｂｏｒＪｏｉｎｉｎｇ法和ＵＰＧＭＡ法的系统发育树。Ａ，ＢｉｓｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃｔｒｅｅｂａｓｅｄｏｎＮｅｉｇｈｂｏｒＪｏｉｎｉｎｇ
ｍｅｔｈｏｄａｎｄｔｈｅＵＰＧＭＡｍｅｔｈｏｄ，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．
图３ 不同处理条件下以多年生黑麦草和白三叶凋落物为底物发酵液的颜色变化
犉犻犵．３ 犆狅犾狅狉犮犺犪狀犵犲狅犳犳犲狉犿犲狀狋犪狋犻狅狀犾犻狇狌犻犱犳狅狉狆犲狉犲狀狀犻犪犾狉狔犲犵狉犪狊狊犪狀犱狑犺犻狋犲犮犾狅狏犲狉
犾犻狋狋犲狉犪狊狊狌犫狊狋狉犪狋犲狌狀犱犲狉狋犺犲犮狅狀犱犻狋犻狅狀狅犳犻狀狅犮狌犾犪狋犻狅狀犪狀犱狀狅犻狀狅犮狌犾犪狋犻狅狀
图４ 多年生黑麦草和白三叶凋落物２种草坪草凋落物的分解程度
犉犻犵．４ 犇犲犮狅犿狆狅狊犻狋犻狅狀犱犲犵狉犲犲狅犳狆犲狉犲狀狀犻犪犾狉狔犲犵狉犪狊狊犪狀犱狑犺犻狋犲犮犾狅狏犲狉犾犻狋狋犲狉
Ａ、Ｂ分别代表黑麦草和白三叶为底物反应体系中凋落物的分解程度。Ａ，Ｂｉｓｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙｆｏｒ
ｄｅｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｄｅｇｒｅｅｏｆｐｅｒｅｎｎｉａｌｒｙｅｇｒａｓｓａｎｄｗｈｉｔｅｃｌｏｖｅｒ．
３７１第２０卷第６期 草业学报２０１１年
构建系统发育树，结果显示，菌株Ｆ１ 在２种系统发育树中的结果一致，即与登录号为 ＡＪ２７９４５４、ＧＵ５６６２９８、
ＡＭ５０２２６４的３个菌株的亲缘关系最近，支持率高达１００％。结合供试菌的形态特征和ｒＤＮＡＩＴＳ序列分析结
果，菌株Ｆ１ 初步鉴定为：犕．犫狅犾犾犲狔犻。
２．２ 发酵液的颜色变化和凋落物的分解程度
菌株Ｆ１ 能在以多年生黑麦草和白三叶为底物的液体发酵基质上生长。发酵结束后，与对照培养基液体的颜
色相比，接种菌株Ｆ１ 后发酵液颜色变浅，白三叶组的发酵液表现得更明显（图３）。
接种菌株Ｆ１ 后，多年生黑麦草和白三叶的凋落物分解比较充分，锥形瓶中多年生黑麦草和白三叶的凋落物
经菌株Ｆ１ 分解后，基本看不到完整的凋落物形状；而在对照中，凋落物没有被分解，可以看到凋落物原有的形状
（图４）。
２．３ 菌株Ｆ１ 对细胞壁物质降解率比较
与对照相比，接种菌株Ｆ１ 后２种草坪草凋落物ＩＣＷＭ量减少，且差异显著（犘＜０．０５），说明菌株Ｆ１ 对２种
草坪草凋落物ＩＣＷＭ均有降解作用（表１）；菌株Ｆ１ 对黑麦草凋落物ＣＷＭ和ＩＣＷＭ降解率分别为７３．２８６％和
５３．３６５％，对白三叶凋落物ＣＷＭ和ＩＣＷＭ降解率分别为６１．００９％和２９．３６８％，黑麦草凋落物ＣＷＭ和ＩＣＷＭ
降解率显著高于白三叶凋落物（犘＜０．０５）。菌株Ｆ１ 对２种草坪草凋落物ＣＷＭ 降解程度的差异主要表现在对
凋落物ＩＣＷＭ的降解。
表１ ２种草坪草凋落物细胞壁物质（犆犠犕）的降解率比较
犜犪犫犾犲１ 犆狅犿狆犪狉犻狊狅狀狅狀犱犲犵狉犪犱犪狋犻狅狀狉犪狋犲狅犳犆犠犕犳狅狉狋狑狅犽犻狀犱狊狅犳犾犪狑狀犵狉犪狊狊犾犻狋狋犲狉
处理 Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ 项目Ｉｔｅｍ 黑麦草犔．狆犲狉犲狀狀犲 白三叶犜．狉犲狆犲狀狊
不接种 凋落物细胞壁物质总量 Ｗｅｉｇｈｔｏｆｃｅｌｗａｌｍａｔｅｒｉａｌ（ｇ） ０．５０１５±０．００９ａ ０．５０７９±０．００７ａ
Ｎｏｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ 细胞壁水溶性物质的量 Ｗｅｉｇｈｔｏｆｗａｔｅｒｓｏｌｕｂｌｅｃｅｌｗａｌｍａｔｅｒｉａｌ（ｇ） ０．２１１０±０．００９ａ ０．２３５０±０．００７ａ
细胞壁非水溶性物质的量 ＷｅｉｇｈｔｏｆＩｎｓｏｌｕｂｌｅｃｅｌｗａｌｍａｔｅｒｉａｌ（ｇ） ０．２９０７±０．００８ａ ０．２８０３±０．００８ａ
接种
Ｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ
凋落物细胞壁物质总量 Ｗｅｉｇｈｔｏｆｃｅｌｗａｌｍａｔｅｒｉａｌ（ｇ） ０．５０５６±０．００２ａ ０．５０４８±０．００２ａ
细胞壁物质的减少量 Ｗｅｉｇｈｔｌｏｓｓｏｆｃｅｌｗａｌｍａｔｅｒｉａｌ（ｇ） ０．３７００±０．００９ａ ０．３０８０±０．０１６ｂ
细胞壁非水溶性物质的量 Ｗｅｉｇｈｔｏｆｉｎｓｏｌｕｂｌｅｃｅｌｗａｌｍａｔｅｒｉａｌ（ｇ） ０．１３５６±０．００７ａ ０．１９６８±０．０１６ｂ
降解率
Ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎｒａｔｅ
（％）
真菌对细胞壁物质的降解率Ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎｒａｔｅｏｆｃｅｌｗａｌｍａｔｅｒｉａｌ ７３．２８６±１．６５５ａ ６１．００９±３．３２３ｂ
真菌对细胞壁非水溶性物质的降解率
Ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎｒａｔｅｏｆｉｎｓｏｌｕｂｌｅｃｅｌｗａｌｍａｔｅｒｉａｌ
５３．３６５±２．１７６ａ ２９．３６８±７．６４９ｂ
数据为平均值±标准误（狀＝３）；同行不同小写字母表示差异显著（犘＜０．０５）。表示同列差异显著（犘＜０．０５），表示同列差异极显著（犘＜
０．０１）。
Ｍｅａｎ±ＳＤｆｏｒ３ｒｅｐｌｉｃａｔｅｄｔｅｓｔｓ．Ｔｈｅｄｉｆｆｅｒｅｎｔｓｍａｌｌｅｔｔｅｒｓｉｎｔｈｅｓａｍｅｒｏｗｍｅａｎｔｈｅｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅａｔ犘＜０．０５．ａｎｄ ｍｅａｎｔｈｅｓｉｇｎｉｆ
ｉｃａｎｔｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｆｏｒｔｈｅｓａｍｅｃｏｌｕｍｎａｔ犘＜０．０５ａｎｄ犘＜０．０１，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．
２．４ 菌株Ｆ１ 分泌木质素纤维素酶活力的变化动态
２种草坪草凋落物诱导菌株Ｆ１ 分泌的６种酶的变化规律基本一致，在整个试验期内，漆酶出现最早，纤维素
酶和木聚糖酶次之，邻苯二酚氧化酶和愈创木酚氧化酶出现最晚（图５～１０）。另外，黑麦草凋落物为底物的发酵
体系中，邻苯二酚氧化酶和愈创木酚氧化酶在发酵开始后的第１５天出现了一个小高峰，但酶活力较低，在白三叶
为底物的发酵体系中没有出现这种现象。
２．５ ２种草坪草凋落物诱导真菌木质纤维素酶活力比较
与白三叶凋落物为底物的发酵粗酶液相应的酶相比较，以多年生黑麦草凋落物为底物诱导菌株Ｆ１ 分泌
ＦＰＡ酶、ＣＭＣａｓｅ、邻苯二酚氧化酶和愈创木酚氧化酶的平均酶活力、最大酶活力和产酶活力指数高（犘＜０．０５）；
漆酶的平均酶活力、产酶活力指数和最大酶活力低（犘＜０．０５）；木聚糖酶的平均酶活力和产酶活力指数活力高
（犘＜０．０５），但最大酶活力差异不显著（表２）。
４７１ ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ（２０１１） Ｖｏｌ．２０，Ｎｏ．６
图５ 漆酶活力的变化
犉犻犵．５ 犆犺犪狀犵犲狅犳犾犪犮犮犪狊犲犪犮狋犻狏犻狋狔
图６ 邻苯二酚氧化酶活力的变化
犉犻犵．６ 犆犺犪狀犵犲狅犳狆狔犮狅犮犪狋犲犮犺狅犾狅狓犻犱犪狊犲犪犮狋犻狏犻狋狔
图７ 愈创木酚氧化酶活力的变化
犉犻犵．７ 犆犺犪狀犵犲狅犳犵狌犪犻犮犮犪犾狅狓犻犱犪狊犲犪犮狋犻狏犻狋狔
图８ 滤纸酶活力的变化
犉犻犵．８ 犆犺犪狀犵犲狅犳犉犘犃犪狊犲犪犮狋犻狏犻狋狔
图９ 羧甲基纤维素酶活力的变化
犉犻犵．９ 犆犺犪狀犵犲狅犳犆犕犆犪狊犲犪犮狋犻狏犻狋狔
图１０ 木聚糖酶活力的变化
犉犻犵．１０ 犆犺犪狀犵犲狅犳狓狔犾犪狀犪狊犲犪犮狋犻狏犻狋狔
３ 讨论
３．１ 凋落物细胞壁物质（ＣＷＭ）的降解
凋落物的分解过程指的是调落物细胞壁物质中各种大分子有机物变成小分子有机物及无机物的过程，在这
些化合物中，有些是水溶性物质，有些是非水溶性物质，其中非水溶性物质的组分主要是木质纤维素类物质，在本
试验中，摇瓶液体发酵的结果显示，接种菌株Ｆ１ 后，２种草坪草凋落物ＩＣＷＭ的量减少，说明菌株Ｆ１ 对２种草坪
５７１第２０卷第６期 草业学报２０１１年
草凋落物木质纤维素类物质具有降解作用。菌株Ｆ１ 对２种草坪草凋落物ＣＷＭ 和ＩＣＷＭ 的降解率不同，尤其
表现在对ＩＣＷＭ的降解率的差异上，这可能的原因是由于不同种类草坪草凋落物中木质纤维类物质的组分和结
构不同，其构成植物表皮和细胞壁成分以及纤维素类物质的镶嵌结构的不同，导致与真菌分泌纤维素酶作用的底
物存在差异，诱导真菌分泌的木质纤维素酶活力不同，因此引起不同降解效果。
表２ ２种草坪草凋落物诱导真菌分泌木质纤维素酶活力比较
犜犪犫犾犲２ 犆狅犿狆犪狉犻狊狅狀狅狀犲狀狕狔犿犲犪犮狋犻狏犻狋狔犻狀犱狌犮犲犱犫狔狋狑狅犽犻狀犱狊狅犳犾犻狋狋犲狉
指标Ｉｔｅｍ 分组 Ｇｒｏｕｐ
菌株Ｆ１分泌酶的类型 ＴｙｐｅｏｆｅｎｚｙｍｅｓｅｃｒｅｔｅｄｂｙｓｔｒａｉｎｓＦ１
滤纸酶
ＦＰＡ
羧甲基纤维素酶
ＣＭＣａｓｅ
木聚糖酶
Ｘｙｌａｎａｓｅ
邻苯二酚氧化酶
Ｐｙｃｏｃａｔｅｃｈｏｌｏｘｉｄａｓｅ
愈创木酚氧化酶
Ｇｕａｉｃｃａｌｏｘｉｄａｓｅ
漆酶
Ｌａｃｃａｓｅ
平均酶活力 Ａｖｅｒａｇｅ
ｏｆｅｎｚｙｍｅａｃｔｉｖｉｔｙ
黑麦草犔．狆犲狉犲狀狀犲０．４６０±０．０１０Ａ０．３４８±０．０１４Ａ０．６２１±０．００４ａ０．１５９±０．００３Ａ ０．１０４±０．００３Ａ０．０６０±０．００２Ａ
白三叶犜．狉犲狆犲狀狊 ０．３５０±０．００７Ｂ０．２１４±０．００５Ｂ０．５６６±０．０１３ｂ０．１３２±０．００２Ｂ ０．０６８±０．００２Ｂ０．１０２±０．００６Ｂ
最大酶活力 Ｍａｘｉｍｕｍ
ｏｆｅｎｚｙｍｅａｃｔｉｖｉｔｙ
黑麦草犔．狆犲狉犲狀狀犲１．１３８±０．０８５Ａ０．６３８±０．０１５Ａ１．６１２±０．０２５ａ０．５４５±０．０１２ａ ０．３２２±０．０１４Ａ０．２０７±０．００８ａ
白三叶犜．狉犲狆犲狀狊 ０．６４９±０．０３３Ｂ０．５０４±０．００４Ｂ１．４４０±０．０７０ａ０．６１０±０．０１２ｂ ０．４３０±０．０１３Ｂ０．５４６±０．０５６ｂ
产酶活力指数Ｅｎｚｙｍｅ
ａｃｔｉｖｉｔｙｉｎｄｅｘ
黑麦草犔．狆犲狉犲狀狀犲０．４１４±０．００９Ａ０．３１２±０．０１０Ａ０．６９６±０．００４Ａ０．０８８±０．００２Ａ ０．０６６±０．００３Ａ０．１２９±０．００２Ａ
白三叶犜．狉犲狆犲狀狊 ０．３０５±０．００１Ｂ０．１８５±０．００７Ｂ０．６１１±０．００７Ｂ０．０５９±０．００１Ｂ ０．０３２±０．００１Ｂ０．１８５±０．００７Ｂ
注：数据为平均值±标准误（狀＝３）；不同小写字母表示差异显著（犘＜０．０５），不同大写字母表示差异极显著（犘＜０．０１）。
Ｎｏｔｅ：Ｍｅａｎ±ＳＤｆｏｒ３ｒｅｐｌｉｃａｔｅｄｔｅｓｔｓ．Ｔｈｅｄｉｆｆｅｒｅｎｔｓｍａｌｌｅｔｔｅｒｓｍｅａｎｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｄｉｆｆｅｒｅｎｔ（犘＜０．０５），ｔｈｅｄｉｆｆｅｒｅｎｔｃａｐｉｔａｌｓｍｅａｎｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ
ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ（犘＜０．０１）．
３．２ 分解过程中几种酶活力的动力学变化
为了解菌株Ｆ１ 以２种草坪草凋落物为底物液体发酵分泌的木质纤维素酶活力的变化，试验中测定了４２ｄ
内发酵粗酶液的漆酶、邻苯二酚氧化酶、愈创木酚氧化酶、ＦＰＡ酶、ＣＭＣａｓｅ和木聚糖酶共６种酶活力的变化。由
测定的结果可以看出，在试验期内能够检测到６种酶活力，但不同类型的酶出现的早晚以及酶活力不同。相对于
木质素酶，纤维素酶和木聚糖酶出现较早，邻苯二酚氧化酶、愈创木酚氧化酶的产生较晚，这一点和王宜磊
等［２３，２４］在研究糙皮侧耳（犘犾犲狌狉狅狋狌狊狅狊狋狉犲犪狋狌狊）多糖木质素降解酶时得出的结论一致，但因菌种和底物的不同，各
个酶在试验期出现的早晚、维持的时间长短、酶活力达到最大值的时间以及酶活力不同。
在试验中发现，ＦＰＡ和ＣＭＣａｓｅ活力继邻苯二酚氧化酶、愈创木酚氧化酶产生之后还维持一定的水平，可以
推断这可能是菌株Ｆ１ 脱木质化后，再次以凋落物细胞壁中纤维素为底物分泌纤维素酶，这一过程中纤维素酶和
木质素酶协同发生作用。菌株Ｆ１ 对２种草坪草凋落物细胞壁物质的分解可以分为２个阶段：第１阶段菌株Ｆ１
主要分泌漆酶，脱木质化是要经过解聚作用［２］，然后才能降解利用木质素，漆酶出现的较早，可能为后期木质素解
聚和降解奠定了基础；第２阶段主要是纤维素酶和木聚糖酶起主导作用，降解凋落物细胞壁中的纤维素和半纤维
素；第３阶段菌株Ｆ１ 开始分泌木质素酶，并且与纤维素酶和半纤维素一并参与凋落物细胞壁物质的分解。郝杰
杰等［２５］对马尾松（犘犻狀狌狊犿犪狊狊狅狀犻犪狀犪）落叶分解的研究中也发现，链格孢（犃犾狋犲狉狀犪狉犻犪ｓｐ．），青霉（犘犲狀犻犮犻犾犾犻狌犿
ｓｐ．），头孢霉（犆犲狆犺犪犾狅狊狆狅狉犻狌犿ｓｐ．），木霉（犜狉犻犮犺犲狉犱犲狉犿犪ｓｐ．），拟盘多毛孢菌（犘犲狊狋犪犾狅狋犻狅狆狊犻狊ｓｐ．）和烟曲霉
（犃狊狆犲狉犵犻犾犾狌狊犳狌犿犻犵犪狋狌狊）等６种半知菌前期的降解主要依赖于ＣＭＣａｓｅ和ＦＰＡ酶活性的高低，后期则由木质素
酶和纤维素酶协同作用来决定，本研究结论与此一致。研究发现凋落物或秸秆的纤维素通常与木质素紧密链
接［２６］，Ｔａｋａｓｈｉｍａ等［２７］及Ｂｏｏｍｉｎａｔｈａｎ和Ｒｅｅｄｙ［２８］指出，只有脱木质化后的纤维素才能够被微生物降解，在本
研究中，脱木质化过程主要出现在菌株Ｆ１ 对凋落物分解的第３阶段。在黑麦草为底物的发酵体系中，邻苯二酚
氧化酶和愈创木酚氧化酶在发酵开始后的第１５天出现了一个小高峰，可能的原因是在第２阶段中黑麦草诱导菌
株Ｆ１ 分泌纤维素酶、木聚糖酶以及木质素酶协同性较高，对纤维素和半纤维素物质利用较充分，脱木质化过程可
能略早于白三叶。
６７１ ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ（２０１１） Ｖｏｌ．２０，Ｎｏ．６
在本试验条件下，接种后发酵液颜色较对照中培养基的颜色浅，说明菌株Ｆ１ 能够降解２种草坪草中的木质
纤维素成分以及其中的一些有色复合物。试验中检测到了菌株分泌的漆酶活力，这可能是菌株Ｆ１ 发酵提取液颜
色变浅的原因，因为漆酶能够应用于染料的脱色和降解［２９，３０］。
３．３ 酶活力与凋落物细胞壁物质降解率的关系
通过２种草坪草凋落物为底物的发酵液各种类型酶活力比较，发现以多年生黑麦草凋落物为底物诱导真菌
产生的木质纤维素酶活力均高于白三叶诱导的相应酶的产酶活力指数，因此推断真菌分泌酶活力的高低和凋落
物细胞壁物质降解率之间在一定程度上存在因果关系。
２种草坪草凋落物为底物诱导真菌分泌木质纤维素酶的过程是一个动态过程，从酶活力比较的结果看出，６
种类型酶的平均产酶活力和产酶活力指数表现为一致的结果，而木聚糖酶的最大酶活力的结果和上述２个指标
的结果不一致。由于最大酶活力反映的是某一时刻的酶活力值，很难反映整个试验期内真菌分泌的酶活力大小，
而平均产酶活力和产酶活力指数能够反映酶活力和时间的关系，因此，具有更可靠的价值。但是，这２个指标是
否能够作为证实整个试验期内真菌分泌的酶活力的有力指标，有待于进一步研究。
４ 结论
在本试验条件下，分离筛选自东祁连山高寒草地土壤中的１株纤维素分解菌，对２种草坪草凋落物细胞壁物
质，尤其是木质纤维素类物质具有分解能力，但因凋落物种类的不同而使分解程度不同；在凋落物的分解过程中，
漆酶出现早，其次是木聚糖酶，再次是纤维素酶，邻苯二酚氧化酶和愈创木酚氧化酶出现较晚；与白三叶凋落物为
底物的发酵体系相比，菌株Ｆ１ 对黑麦草凋落物ＩＣＷＭ和ＣＷＭ降解率高，可能的原因是以黑麦草凋落物诱导菌
株Ｆ１ 分泌的木质纤维素酶的酶活力高。
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狅狉狔狕犪犲ａｎｄｔｈｅｉｒｅｎｚｙｍａｔｉｃｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ［Ｊ］．ＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙＬｅｔｔｅｒ，１９９８，６５：１６３１７１．
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犐犱犲狀狋犻犳犻犮犪狋犻狅狀狅犳犮犲犾狌犾狅狊犲犱犲犮狅犿狆狅狊犻狀犵犳狌狀犵犻狊狋狉犪犻狀犉１犪狀犱犱犲犮狅犿狆狅狊犻狋犻狅狀
犪犮狋犻狏犻狋狔狋狅狋狑狅犽犻狀犱狊狅犳犾犪狑狀犵狉犪狊狊犾犻狋狋犲狉
ＬＵＧｕａｎｇｘｉｎ１，２，ＣＨＥＮＸｉｕｒｏｎｇ１，ＹＡＮＧＣｈｅｎｇｄｅ１，ＸＵＥＬｉ１，ＬＩＵ Ｗｅｎ１，ＢＩＡＮＪｉｎｇ１
（１．ＰｒａｔａｃｕｌｔｕｒａｌＣｏｌｅｇｅ，ＧａｎｓｕＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，ＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＧｒａｓｓｌａｎｄＥｃｏｓｙｓｔｅｍＭｉｎｉｓｔｒｙ
ｏｆＥｄｕｃａｔｉｏｎ，ＳｉｎｏＵ．Ｓ．ＣｅｎｔｅｒｓｆｏｒＧｒａｚｉｎｇｌａｎｄＥｃｏｓｙｓｔｅｍＳｕｓｔａｉｎａｂｉｌｉｔｙ，ＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，
Ｌａｎｚｈｏｕ７３００７０，Ｃｈｉｎａ；２．ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＧｒａｓｓｌａｎｄＳｃｉｅｎｃｅ，ＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅａｎｄＡｎｉｍａｌ
ＨｕｓｂａｎｄｒｙＣｏｌｅｇｅ，ＱｉｎｇｈａｉＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｘｉｎｉｎｇ８１００１６，Ｃｈｉｎａ）
犃犫狊狋狉犪犮狋：Ａｆｕｎｇａｌｉｓｏｌａｔｅ（ｓｔｒａｉｎＦ１）ｗａｓｉｓｏｌａｔｅｄｆｒｏｍｅａｓｔｐａｒｔｏｆｇｒａｓｓｌａｎｄｓｏｉｌｉｎＱｉｌｉａｎａｌｐｉｎｅ．Ｔａｘｏｎｏｍｉｃ
ｓｔａｔｕｓａｎｄｄｅｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎａｃｔｉｖｉｔｙｔｏｔｗｏｋｉｎｄｓｏｆｌａｗｎｇｒａｓｓｌｉｔｔｅｒｗｅｒｅｓｔｕｄｉｅｄｉｎｔｈｉｓｓｔｕｄｙ．Ｃｏｍｂｉｎａｔｅｄｍｏｒ
ｐｈｏｌｏｇｙｗｉｔｈｒＤＮＡＩＴＳｍｏｌｅｃｕｌａｒｂｉｏｌｏｇｙｍｅｔｈｏｄｓ，ｔｈｅｆｕｎｇｕｓｗａｓ犕犻犮狉狅犱狅犮犺犻狌犿犫狅犾犾犲狔犻．Ｔｈｅｄｙｎａｍｉｃｓｏｆ
ｌｉｇｎｏｃｅｌｕｌｏｌｙｔｉｃｅｎｚｙｍｅｓｓｅｃｒｅｔｅｄｂｙ犕．犫狅犾犾犲狔犻ａｎｄｃｅｌ ｗａｌ ｍａｔｅｒｉａｌ（ＣＷＭ）ｄｅｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｏｆｐｅｒｅｎｎｉａｌ
ｒｙｅｇｒａｓｓ（犔狅犾犻狌犿狆犲狉犲狀狀犲）ａｎｄｗｈｉｔｅｃｌｏｖｅｒ（犜狉犻犳狅犾犻狌犿狉犲狆犲狀狊）ｌｉｔｔｅｒｗｅｒｅｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｄｆｏｒ４２ｄａｔ２５℃ｏｎａ
ｒｏｔａｒｙｓｈａｋｅｒａｔ１５０ｒ／ｍｉｎｉｎｆｌａｓｋｌｉｑｕｉｄｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎｍｅｔｈｏｄ．１）Ｉｎｓｏｌｕｂｌｅｃｅｌｗａｌｍａｔｅｒｉａｌ（ＩＣＷＭ）ｏｆｔｗｏ
ｋｉｎｄｓｏｆｌａｗｎｇｒａｓｓｌｉｔｔｅｒｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｒｅｄｕｃｅｄａｆｔｅｒｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎｓｔｒａｉｎＦ１（犘＜０．０５）；２）Ｗｈｅｎｔｗｏｋｉｎｄｓｏｆ
ｌａｗｎｇｒａｓｓｌｉｔｔｅｒａｃｔｓａｓｓｕｂｓｔｒａｔｅｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ，ｔｈｅｌａｃｃａｓｅｓｅｃｒｅｔｅｄｂｙｓｔｒａｉｎＦ１ａｐｐｅａｒｓｆｉｒｓｔ，ｆｏｌｏｗｅｄｂｙｔｈｅ
ｃｅｌｕｌａｓｅｅｎｚｙｍｅａｎｄｘｙｌａｎａｓｅ，ｃａｔｅｃｈｏｌｏｘｉｄａｓｅａｎｄｇｕａｉａｃｏｌｏｘｉｄａｓｅｏｃｃｕｒｓａｔｔｈｅｌａｔｅｓｔ；３）Ｐｅｒｅｎｎｉａｌｒｙｅｇｒａｓｓ
ｃｏｍｐａｒｅｄｗｉｔｈｗｈｉｔｅｃｌｏｖｅｒ，ｔｈｅｉｎｓｏｌｕｂｌｅｃｅｌｗａｌｍａｔｅｒｉａｌ（ＩＣＷＭ）ａｎｄｃｅｌｗａｌ ｍａｔｅｒｉａｌ（ＣＷＭ）ｄｅｇｒａｄａ
ｔｉｏｎｒａｔｅｏｆｐｅｒｅｎｎｉａｌｒｙｅｇｒａｓｓｌｉｔｔｅｒｗａｓｈｉｇｈｅｒ（犘＜０．０５）；４）ＴｈｅＦＰＡａｓｅ，ＣＭＣａｓｅ，ｘｙｌａｎａｓｅ，ｐｙｃｏｃａｔｅｃｈｏｌ
ｏｘｉｄａｓｅａｎｄｇｕａｉａｃｏｌｏｘｉｄａｓｅａｃｔｉｖｉｔｙｅｘｃｅｐｔｆｏｒｔｈｅｌａｃｃａｓｅｓｅｃｒｅｔｅｄｂｙ犕．犫狅犾犾犲狔犻ｉｎｐｅｒｅｎｎｉａｌｒｙｅｇｒａｓｓｌｉｔｔｅｒ
ｗｅｒｅｈｉｇｈｅｒｔｈａｎｔｈｏｓｅｉｎｗｈｉｔｅｃｌｏｖｅｒｌｉｔｔｅｒ（犘＜０．０５）．
犓犲狔狑狅狉犱狊：ａｌｐｉｎｅｍｅａｄｏｗｓｏｉｌｆｕｎｇｉ；ｌａｗｎｇｒａｓｓｌｉｔｔｅｒ；ｃｅｌｗａｌｍａｔｅｒｉａｌｓ；ｄｅｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎａｃｔｉｖｉｔｙ
９７１第２０卷第６期 草业学报２０１１年