全 文 ：书假俭草体细胞抗寒突变体的
获得及其犛犚犃犘分子鉴定
袁学军１，２，王志勇１，３，郑轶琦１，刘建秀１，佘建明１
（１．江苏省中科院植物研究所，江苏 南京２１００１４；２．琼州学院生物科学与技术学院，
海南 三亚５７２０００；３．海南大学农学院，海南 儋州５７１７３７）
摘要：假俭草抗寒性差是限制其广泛应用的主要因素之一。本研究目标是以优良假俭草选系Ｅ１２６为材料，经低
温诱导和筛选获得体细胞抗寒突变体。结果表明，假俭草种子诱导的愈伤组织在继代培养的过程中，经０℃的低温
条件下培养２６ｄ，获得了２块存活的愈伤组织，该愈伤组织经过继代增殖后，进行分化、生根和移栽，获得株系１和
株系２。苗期外部形态观察结果表明，假俭草低温诱导的株系１、株系２和对照在叶色、叶毛、叶长和叶宽上均没有
显著性差异。半致死温度分析结果表明，株系１、株系２以及对照叶片半致死温度（ＬＴ５０）分别为－６．６４６，－６．５４６
和－５．３５１℃，处理与对照之间差异显著，且都低于对照，但株系１和株系２之间无显著性差异。ＳＲＡＰ的结果表
明，假俭草低温诱导的株系１和株系２在１１０，２３０以及２４０ｂｐ处均存在相同特征带，表明假俭草体细胞突变体植
株的变异稳定且在分子水平与对照存在差异，但株系１和株系２无差异。因此，株系１和株系２可作为同一体细胞
抗寒突变体株系加以利用。
关键词：假俭草；低温诱导；体细胞变异；形态特征；半致死温度；ＳＲＡＰ
中图分类号：Ｓ５４３＋．９０３．４；Ｑ９４５．７ 文献标识码：Ａ 文章编号：１００４５７５９（２０１１）０６０２３７０８
假俭草（犈狉犲犿狅犮犺犾狅犪狅狆犺犻狌狉狅犻犱犲狊）是禾本科蜈蚣草属多年生草本植物，也是蜈蚣草属中唯一可用作草坪草的
物种［１，２］。它具有强壮的匍匐茎，蔓延力强而迅速，茎秆斜伸，其叶形优美，植株低矮，养护水平低，耐贫瘠，病虫
害少，可广泛地用于庭院草坪、休憩草坪以及水土保持草坪建设中［３，４］。然而，假俭草的抗寒性与狗牙根和结缕
草等相比较弱，因此，限制了其在亚热带北部及温带地区的广泛应用［５８］。筛选抗寒性强的优良假俭草品种对扩
大其应用范围具有重要作用。
关于假俭草种质资源（品系）抗寒性鉴定研究，宣继萍等［９］采用电导法，以２份美国引进品种‘Ｃｏｍｍｏｎ’和
‘ＴｉｆＢｌａｉｒ’为对照，对３８份中国假俭草种源的抗寒性进行了初步鉴定，结果表明，中国假俭草种质资源种内抗寒
性的差异较大，其ＬＴ５０为－１３～－４℃。Ｊｏｈｎｓｏｎ［１０］对７个假俭草品系进行了一系列模拟低温处理后，在温室中
进行生长恢复试验，结果表明，不同的假俭草品系其茎尖死亡率存在明显差异，匍匐茎的ＬＴ５０为－７～－６℃，这
个变化范围远远低于中国假俭草种质资源，可能是由于美国假俭草品种亲缘关系较近，遗传背景狭窄的缘故［２］。
除此之外，假俭草的抗寒性差异在其外部形态特征上也有所体现，即其红茎比黄（绿）茎更耐寒［１１］。
抗寒性改良可采用系统选育、杂交育种等手段，然而，这些手段不仅周期长，工作量大，而且由于育种材料自
身变异的限制，改良幅度有限［１２］。随着生物技术的发展，体细胞无性系变异和筛选技术日趋成熟，可以设置特定
的低温进行体细胞诱变筛选，提高抗寒品种选育的效率。开展植物体细胞变异筛选的基础条件之一，是建立高效
的再生体系。到目前为止，国内外关于假俭草再生体系建立研究的报道比较少。Ｋｒａｎｓ和Ｂｌａｎｃｈｅ［１３］以成熟种
子和幼穗为材料，研究了假俭草的愈伤组织诱导和植株再生条件；Ｍａ等［１４］和张芳等［１５］分别报道了以假俭草种
子为材料进行再生体系的建立。作者已采用Ｅ１２６种子为外植体建立了高效再生体系。
关于植物体细胞抗寒突变体诱导、筛选及其遗传稳定性的研究已有报道：Ｌａｚａｒ等［１６］在没有选择压的前提下
获得了更抗寒的冬小麦体细胞无性系变异体，增强的抗寒性能稳定遗传给后代；Ｅｄｗａｒｄ等［１７］利用液氮，而Ｇａｌｉ
第２０卷 第６期
Ｖｏｌ．２０，Ｎｏ．６
草 业 学 报
ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ
２３７－２４４
２０１１年１２月
收稿日期：２０１０１０１９；改回日期：２０１０１２１６
基金项目：江苏省科技支撑项目（ＢＥ２００８４０３）和江苏省科技厅平台项目（ＢＭ２００９９０５）资助。
作者简介：袁学军（１９６７），男，山东济宁人，副教授，博士。Ｅｍａｉｌ：ｙｕａｎｘｕｅｊ＠１６３．ｃｏｍ
通讯作者。Ｅｍａｉｌ：ｔｕｒｆｕｎｉｔ＠ｙａｈｏｏ．ｃｏｍ．ｃｎ
ｂａ和Ｓｕｔｋａ［１８］利用低温选择小麦（犜狉犻狋犻犮狌犿犪犲狊狋犻狏狌犿）愈伤组织获得抗寒变异植株，其抗寒性能通过有性杂交途
径遗传给子代。对于抗寒突变体的遗传稳定性鉴定，除生理特征鉴定外，通过分子标记的方法可以更加精确进行
分析，目前分子标记技术主要有随机扩增的多态性（ｒａｎｄｏｍａｍｐｌｉｆｉｅｄｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃＤＮＡ，ＲＡＰＤ）、微卫星片段扩
增多态性（ｉｎｔｅｒｓｉｍｐｌｅｓｅｑｕｅｎｃｅｒｅｐｅａｔ，ＩＳＳＲ）、扩增片段长度多态性（ａｍｐｌｉｆｉｅｄｆｒａｇｍｅｎｔｌｅｎｇｔｈｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ，
ＡＦＬＰ）等。其中ＲＡＰＤ方法简单、成本低，但重复性较差、检测位点不多；ＳＳＲ多为共显性、重复性好，但位点较
少、特异性强、引物开发成本高；ＡＦＬＰ谱带多，精确度高，但分析程序复杂、成本高［１９］。一种新型的基于ＰＣＲ技
术的标记———相关序列扩增多态性 （ｓｅｑｕｅｎｃｅｒｅｌａｔｅｄａｍｐｌｉｆｉｅｄｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ，ＳＲＡＰ）可以弥补上述各项技术的
不足之处，并已在马铃薯（犛狅犾犪狀狌犿狋狌犫犲狉狅狊狌犿）、水稻（犗狉狔狕犪狊犪狋犻狏犪）、莴苣（犔犪犮狋狌犮犪狊犪狋犻狏犪）、花椰菜（犅狉犪狊狊犻犮犪狅犾
犲狉犪犮犲犪）、油菜（犅狉犪狊狊犻犮犪犮犪犿狆犲狊狋狉犻狊）、大蒜（犃犾犾犻狌犿狊犪狋犻狏狌犿）、棉花（犌狅狊狊狔狆犻狌犿）、辣椒（犆犪狆狊犻犮狌犿）、野牛草（犅狌犮犺
犾狅犲犱犪犮狋狔犾狅犻犱犲狊）等［２０］植物中使用。到目前为止，本实验室已经成功地建立了对于假俭草ＳＲＡＰ优化反应体系，
可以直接用于抗寒突变体的鉴定。
因此，本研究的目标是：ⅰ）在已有工作基础上，以国产优良假俭草Ｅ１２６种子为外植体，在０℃低温条件下
筛选出存活愈伤，并获得再生植株；ⅱ）对体细胞抗寒突变体和对照苗期的外部形态特征进行初步观测分析；ｉｉ）
利用半致死温度法对体细胞抗寒突变体和对照的抗寒性进行鉴定；ｉｖ）利用ＳＲＡＰ标记对获得的假俭草体细胞抗
寒突变体和对照进行分子鉴定。
１ 材料与方法
１．１ 材料
假俭草优良选系Ｅ１２６，该选系来源于江苏省中国科学院植物研究所草坪草种质资源基地。根据对１６５份
种源连续３年的动态评价，该选系具有最高的综合坪用价值。
１．２ 方法
１．２．１ 体细胞抗寒突变体的筛选 愈伤组织的诱导和培养：选择２００６年收获的饱满种子，用５％的ＮａＯＨ溶液
浸泡１５ｍｉｎ，流水冲洗４０ｍｉｎ，０．１％ ＨｇＣｌ２ 消毒１０ｍｉｎ，７５％乙醇处理５０ｓ，最后再用无菌水冲洗４～５次。将
灭菌种子接种于愈伤组织诱导培养基（ＭＳ＋２，４Ｄ１．０ｍｇ／Ｌ＋甘露醇３０ｇ／Ｌ＋５０ｍＬ／Ｌ椰子汁＋０．７５％琼脂）
上。在温度（２５±１）℃、光照１２ｈ／ｄ和光照强度５０μｍｏｌ／（ｍ
２·ｓ）条件下培养２８ｄ，继代培养１次，选择黄色颗粒
状愈伤组织继代培养２次，继代培养基和愈伤组织诱导培养基相同。
１２０块愈伤用于低温筛选。培养１５ｄ的愈伤组织在０℃的条件下培养２６ｄ，然后将其转接至新的培养基上，
在（２５±１）℃的条件下培养２４ｄ，观察愈伤组织存活情况。存活愈伤组织在继代培养基上继代２次。对照愈伤组
织除不经过低温培养外，其他过程完全相同。
植株再生和移栽：将处理和对照愈伤组织接种在芽分化培养基（ＭＳ＋ＫＴ２．０ｍｇ／Ｌ＋５０ｍＬ／Ｌ椰子汁）上，
培养２８ｄ，分化的芽转至芽生长培养基（ＭＳ＋ＢＡＰ２．０ｍｇ／Ｌ＋ＮＡＡ０．８ｍｇ／Ｌ＋５０ｍＬ／Ｌ椰子汁）上培养２８ｄ，
并且在此培养基上进行继代培养１次；选择３～４ｃｍ长的试管苗，转接到生根培养基（ＭＳ＋ＮＡＡ０．６ｍｇ／Ｌ＋５０
ｍＬ／Ｌ椰子汁）培养２１ｄ。分化和生根阶段光强１００μｍｏｌ／（ｍ
２·ｓ）。生根无菌苗移栽到直径６ｃｍ、加有灭菌园
土的塑料营养钵中，在温室中进行培养。温室的温度为（２５±１）℃，相对湿度为８０％～８５％，光照为自然光。２周
后苗移栽到土盆中培养在自然光照条件下。
１．２．２ 体细胞抗寒突变体植株外部形态指标的观察和测量 测量假俭草幼苗基部的第１片成熟叶的长度和宽
度，总共测量１０株，并目察其叶色（分为蓝绿、深绿、绿、浅绿、黄绿）和叶毛（分为无、微、有、多、密）。
１．２．３ 体细胞突变体的抗寒性鉴定－半致死温度（ＬＴ５０） ２００７年８月５日生根无菌苗移栽入盆，１０月５日将
盆移入不加热的温室，该温室屋顶为玻璃，墙壁为砖墙。于２００７年１０月１０日、１１月１０日和１２月１０日分别进
行半致死温度测定。每次每个处理温度设置３个重复，每个重复１ｇ叶片。参照朱根海和朱培仁［２１］的方法，取假
俭草植株的叶片，自来水冲洗后用去离子水冲洗３次，再用吸水纸吸干表面水分，剪成长度１～２ｃｍ，置于大试管
中，放入低温循环仪（美国ＰｏｌｙＳｃｉｅｎｃｅ公司出品的９６１０型）进行模拟低温处理。温度的设置为：０，－４，－８，－１２
和－１６℃。每一个温度下处理１．５ｈ后取出，每２个温度之间的降温时间为１ｈ，取出后加入２０ｍＬ去离子水，静
８３２ ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ（２０１１） Ｖｏｌ．２０，Ｎｏ．６
置，过夜。在ＤＯＳ３０７型电导仪上测定其冰冻电导率，然后置沸水浴中１５ｍｉｎ，冷却至室温后测定其煮沸电导
率，按下式计算其相对电导率：相对电导率（％）＝冰冻电导率／煮沸电导率×１００。朱根海和朱培仁［２１］研究指出，
低温胁迫下细胞电解质透出率与温度之间的关系呈Ｓ型曲线，与ｌｏｇｉｓｔｉｃ方程犢＝犓／（１＋犪犲－犫犡）具有较好的拟合
度，求该方程的二阶导数，并令其等于０，即可获得曲线的拐点犡＝ｌｎ（１／犪）／犫，即为半致死温度（ＬＴ５０）。
１．２．４ 体细胞抗寒突变体的ＳＲＡＰ分子鉴定 基因组ＤＮＡ的提取和检测：以假俭草叶片为材料，采用ＳＤＳ［２２］
微量法提取基因组ＤＮＡ，并用０．８％琼脂糖电泳检测ＤＮＡ质量完整性。采用琼脂糖凝胶电泳，取５μＬＤＮＡ溶
液，再加入２μＬ０．２５％溴酚蓝，对照为已知浓度的ＤＮＡ样品，上样于０．８％的琼脂糖凝胶，在１×ＴＡＥ（配方）的
电泳缓冲液中进行水平板电泳（ＤＹＹ５型电泳仪，ＤＹＣＰ３４Ａ电泳槽），电泳电压为１００Ｖ，时间９０ｍｉｎ左右，电
泳结束后，用溴化乙锭（ＥＢ）（０．０５％）染色，染色后在自动凝胶图像分析仪（上海培清科技有限公司ＪＳ３８０）观测
分析并照相，根据检测的结果稀释ＤＮＡ，最后确定ＤＮＡ浓度为５０ｎｇ／μＬ，用于本试验的研究。
ＰＣＲ反应条件：制备总体积为２０μＬ的ＰＣＲ反应体系，每管中还含有２μＬ１０×ＰＣＲｂｕｆｆｅｒ和５０ｎｇ模板
ＤＮＡ，从 ６４ 对引物中筛 选出的最佳引物为 Ｍｅ５′ＴＧＡＧＴＣＣＡＡＡＣＣＧＧＧＴＡ３′和 Ｅｍ１５′ＧＡＣＴＧＣＧ
ＴＡＣＧＡＡＴＴＣＡＡ３′组合（ＳＲＡＰ引物购自上海博亚生物技术有限公司）。ＰＣＲ扩增程序为：９４℃预变性４
ｍｉｎ；９４℃变性１ｍｉｎ，３７℃退火１ｍｉｎ，７２℃延伸１０ｓ，５个循环；９４℃变性１ｍｉｎ，５０℃退火１ｍｉｎ，７２℃延伸１０ｓ，
３５个循环；循环结束后７２℃延伸７ｍｉｎ，４℃保存，扩增反应在ＴＣ４１２ＰＣＲ（英国ＴＥＣＨＮＥ公司）仪上进行。取
１０μＬ扩增产物，用１０．０％非变性聚丙烯酰胺凝胶分离（ＤＹＹ８Ｂ型电泳仪，ＪＹＳＣＺ６电泳槽），银染检测。ＤＮＡ
指纹图谱根据ＶｉｓｕａｌＢａｓｉｃ６．０软件并结合人工目测进行构建。
１．３ 统计分析
采用ＳＰＳＳ１３．０软件进行统计分析。
２ 结果与分析
２．１ 假俭草体细胞抗寒突变体的获得
２．１．１ 愈伤组织诱导和继代培养 表面灭菌的假俭
草种子接种在愈伤组织诱导培养基上培养２８ｄ（图
１ａ），转接到相同的培养基上继续培养。诱导出的３种
颜色的愈伤组织：白色、浅黄色和黄色，选择黄色颗粒
状愈伤组织，在继代培养基上继代（图１ｂ）。
２．１．２ 体细胞低温筛选 培养１５ｄ的愈伤组织在
０℃的条件下培养２６ｄ，然后将愈伤组织转接到新的继
表１ 低温对假俭草愈伤组织存活的影响
犜犪犫犾犲１ 犜犺犲犻狀犳犾狌犲狀犮犲狅犳犾狅狑狋犲犿狆犲狉犪狋狌狉犲
狅狀狋犺犲狊狌狉狏犻狏犪犾狅犳犮犪犾狌狊犲狊
温度
Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ
（℃）
接种数
Ｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ
ｎｕｍｂｅｒ
存活数
Ｓｕｒｖｉｖａｌ
ｎｕｍｂｅｒ
平均存活率
Ａｖｅｒａｇｅｓｕｒｖｉｖａｌ
ｒａｔｅ（％）
０ １２０ ２ １．７
２５ １２０ １２０ １００．０
代培养基上，在（２５±１）℃的条件下培养２８ｄ，有２块愈伤组织存活（表１、图１ｃ）。存活的愈伤组织分别继代培
养２次。而未进行低温处理的假俭草愈伤组织成活率为１００％。
２．１．３ 芽的分化和生长 存活增殖的愈伤组织转接到分化培养基上培养２８ｄ（图１ｄ），然后转接到芽生长培养
基上培养２８ｄ，在芽生长培养基上再继代培养１次（图１ｅ）。
２．１．４ 试管苗生根 当试管苗高度达到３～４ｃｍ时，将其转接到生根培养基上，５～７ｄ后根开始形成，培养２１ｄ
时根的数量、长度和直径分别为６～７条，０．９ｃｍ和１．８ｍｍ（图１ｆ）。
２．１．５ 试管苗移栽 生根的试管苗移栽到直径６ｃｍ、园土灭菌的塑料营养钵中，在温室中进行培养。２周后苗
移栽到装有园土的土盆中（图１ｇ）。
２．２ 假俭草体细胞抗寒突变体植株苗期外部形态指标的观察和测量
假俭草体细胞抗寒突变体和对照植株苗期外部形态指标的观察和测量的结果显示，假俭草低温诱导的株系
１、株系２和对照苗期在叶色、叶毛、叶长和叶宽上均没有显著性差异，表明抗寒突变体在叶片形态上与对照没有
变化。也就是说，低温诱导未对假俭草苗期形态产生明显的影响。
２．３ 假俭草低温下体细胞突变体的抗寒性鉴定
根据供试材料在不同温度处理下的电解质外渗率所求得的Ｌｏｇｉｓｔｉｃ方程，其拟合度及半致死温度见表２。
供试材料模拟Ｌｏｇｉｓｔｉｃ方程的拟合度均达到极显著水平，说明试验结果有效。
９３２第２０卷第６期 草业学报２０１１年
图１ 假俭草体细胞抗寒突变体再生植株的过程
犉犻犵．１ 犜犺犲狆犾犪狀狋狊狉犲犵犲狀犲狉犪狋犻狅狀狆狉狅犮犲狊狊犲狊狅犳犮狅犾犱狉犲狊犻狊狋犪狀狋狊狅犿犪狋犻犮
犿狌狋犪狀狋狊狅犳犮犲狀狋犻狆犲犱犲犵狉犪狊狊犈１２６
ａ：种子诱导的愈伤组织Ｓｅｅｄｉｎｄｕｃｅｄｃａｌｕｓ；ｂ：愈伤组织继代培养Ｓｕｂｃｕｌｔｕｒｅｏｆｃａｌ
ｌｕｓ；ｃ：低温筛选出的愈伤组织Ｃａｌｕｓｓｃｒｅｅｎｅｄｕｎｄｅｒｌｏｗｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ；ｄ：芽分化Ｒｅｇｅｎ
ｅｒａｔｅｄｓｈｏｏｔｓ；ｅ：壮苗Ｇｒｏｗｔｈｓｈｏｏｔｓ；ｆ：生根苗Ｒｏｏｔｉｎｇｓｈｏｏｔｓ；ｇ：移栽成活的植株Ｓｕｒ
ｖｉｖａｌｐｌａｎｔａｆｔｅｒｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ．
表２ 假俭草体细胞突变体和对照电导率的犔狅犵犻狊狋犻犮方程参数及半致死温度
犜犪犫犾犲２ 犘犪狉犪犿犲狋犲狉狊狅犳犔狅犵犻狊狋犻犮犲狇狌犪狋犻狅狀狊狅犳犮狅狀犱狌犮狋犻狏犻狋狔犪狀犱犔犜５０狅犳狊狅犿犪狋犻犮犿狌狋犪狀狋狊犪狀犱犮狅狀狋狉狅犾狅犳犮犲狀狋犻狆犲犱犲犵狉犪狊狊
月日
Ｍｏｎｔｈｄａｙ
材料
Ｍａｔｅｒｉａｌ
犪 犫 犽 半致死温度 （ＬＴ５０）
Ｓｅｍｉｌｅｔｈａｌｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ（℃）
拟合度犚２
Ｄｅｇｒｅｅｏｆｆｉｔｔｉｎｇ犚２
１０２５ 株系１Ｓｔｒａｉｎ１ ２４．６７５６ ０．４９１１ ９３．０９２９ －６．５２７８ ０．９９７６
株系２Ｓｔｒａｉｎ２ ２５．３９０４ ０．５０４５ ９３．０３００ －６．４１１１ ０．９９７５
对照ＣＫ １２．６１５９ ０．４８１３ ９２．９２７９ －５．２６６９ ０．９８６５
１１２５ 株系１Ｓｔｒａｉｎ１ １１．６７７５ ０．３８１８ ９５．２６３１ －６．４３７１ ０．９９３５
株系２Ｓｔｒａｉｎ２ １２．２１９２ ０．３７５９ ９６．１７７６ －６．６５８７ ０．９９４９
对照ＣＫ １１．６１０２ ０．４７６３ ９３．４２１２ －５．１４７８ ０．９８４１
１２２５ 株系１Ｓｔｒａｉｎ１ １７．０６８５ ０．４４３２ ９５．２５９１ －６．４０１７ ０．９９４１
株系２Ｓｔｒａｉｎ２ １６．５２５７ ０．４２７１ ９５．６１３９ －６．５６８９ ０．９９３４
对照ＣＫ ３９．５２８１ ０．６５２１ ９３．２７５９ －５．６３８７ ０．９９９２
注：表示拟合度达极显著（犘＜０．０１）。
Ｎｏｔｅ： ｍｅａｎｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅａｔ犘＜０．０１．
采用ＳＰＳＳ１３．０软件对株系１、株系２和对照叶片半致死温度进行多重比较，结果（表３）表明，株系１和株系
２及对照半致死温度分别为－６．６４６，－６．５４６和－５．３５１℃，其中处理和对照之间达到显著性差异，但是株系１和
株系２之间无显著性差异，表明株系１和株系２的抗寒性是一致，且都显著高于对照。
２．４ 假俭草抗寒体细胞突变体ＳＲＡＰ分子鉴定
假俭草低温诱导的株系１、株系２和对照在约１２０，２６０和２９０ｂｐ处均有相同的条带（图２），在１１０，２３０和
２４０ｂｐ处株系１和株系２均有相同的条带，而对照则无以上条带，表明抗寒突变体与对照存在差异，株系１和株
０４２ ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ（２０１１） Ｖｏｌ．２０，Ｎｏ．６
系２ＳＲＡＰＰＣＲ反应体系扩增结果完全相同，表明这
２个株系在分子水平上没有区别，可作为同一株系利
用。
３ 结论与讨论
体细胞突变体筛选是利用植物组织培养过程中出
现的变异，或由物理、化学因素诱发变异，给予一定的
选择压力，可望筛选出符合育种目标的无性系。与传
统的育种方法相比，体细胞突变体筛选具有突出的优
点，一是高效，在离体培养过程中进行选择，可以省去
大量的田间工作，节约人力和土地，又不受生长季节限
表３ 假俭草体细胞突变体和对照叶片半致死温度犔犜５０
犜犪犫犾犲３ 犛狋犪狋犻狊狋犻犮犪犾犪狀犪犾狔狊犻狊狅狀狋犺犲犔犜５０狅犳狊狅犿犪狋犻犮犿狌狋犪狀狋狊
犪狀犱犮狅狀狋狉狅犾狅犳犮犲狀狋犻狆犲犱犲犵狉犪狊狊犈１２６ ℃
材料
Ｍａｔｅｒｉａｌ
半致死温度
Ｓｅｍｉｌｅｔｈａｌｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ（ＬＴ５０）
株系１Ｓｔｒａｉｎ１ －６．６４６±０．０６５ｂ
株系２Ｓｔｒａｉｎ２ －６．５４６±０．１２５ｂ
对照ＣＫ －５．３５１±０．２５６ａ
注：不同小写字母表示差异达犘＜０．０５水平。
Ｎｏｔｅ：Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｌｅｔｔｅｒｓｉｎｄｉｃａｔｅｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ（犘＜０．０５）．
图２ 假俭草体细胞抗寒突变体和对照
犛犚犃犘－犘犆犚反应体系扩增结果
犉犻犵．２ 犃犿狆犾犻犳犻犮犪狋犻狅狀狉犲狊狌犾狋狊狅犳犛犚犃犘－犘犆犚狉犲犪犮狋犻狅狀
狊狔狊狋犲犿犳狅狉犮狅犾犱狉犲狊犻狊狋犪狀狋狊狅犿犪狋犻犮犿狌狋犪狀狋狊
犪狀犱犆犓狅犳犮犲狀狋犻狆犲犱犲犵狉犪狊狊
ＣＫ：对照Ｃｏｎｔｒｏｌ；１：株系１Ｓｔｒａｉｎ１；２：株系２Ｓｔｒａｉｎ２；Ｍ：标准ＤＮＡ
ＤＮＡｍａｒｋ（５０ｂｐ，Ｐｒｏｍｅｇａ）．
制，选择效率高。二是定向培育，由于可在培养过程中
给予培养材料一定的选择压力，如盐类、病菌毒素、除
草剂等，使非目标变异体在再培养过程中被淘汰，而符
合人们要求的变异体得以保留和表现，起到定向培育
作用。当前在植物上，体细胞突变体筛选技术研究主
要应用于抗病、抗盐、抗除草剂、抗低温、抗高温等逆境
胁迫的突变体筛选。
体细胞突变法已在农作物如水稻、玉米（犣犲犪
犿犪狔狊）等的育种上成功地应用，并已获得了抗逆、可遗
传的新品系［２３］。在地被植物和草坪草育种上也有应
用，如Ｓｍｉｔｈ和 Ｑｕｅｓｅｎｂｅｒｒｙ［２４］利用体细胞无性系变
异的方法获得了红三叶（犜狉犻犳狅犾犻狌犿狆狉犪狋犲狀狊犲）的新种
质资源，其再生能力显著提高；Ｃｒｏｕｇｈａｎ等［２５］获得了
狗牙根（犆狔狀狅犱狅狀犱犪犮狋狔犾狅狀）的新种质ＢｒａｚｏｓＲ３，对秋
季黏虫（犛狆狅犱狅狆狋犲狉犪犳狉狌犵犻狆犲狉犱犪）具有显著抗性。目
前，很多草坪草的再生体系已经建立起来，例如结缕草
（犣狅狔狊犻犪犼犪狆狅狀犻犮犪）［２６］、早熟禾（犘狅犪狋狉犻狏犻犪犾犻狊）［２７］、狗
牙根［２８］、黑麦草（犔狅犾犻狌犿ｓｐ．）［２９］、雀稗（犘犪狊狆犪犾狌犿ｓｐ．）［３０］，但是与其相关的体细胞无性系变异的研究报道较少。
而到目前为止，关于假俭草再生体系建立研究的很少［３１，３２］，更未见到有关假俭草体细胞抗寒突变体的筛选报道。
本研究在作者已经建立的假俭草高效再生体系基础上，在国内外首次成功地获得了假俭草体细胞抗寒突变体，这
为假俭草抗寒性改良提供了很好的育种材料。
在组织培养过程中，以往的研究都以－３℃作为胁迫条件，曾在烟草（犖犻犮狅狋犻犪狀犪狊犪狀犱犲狉犪犲）、辣椒、胡萝卜
（犇犪狌犮狌狊犮犪狉狅狋犪）［３３］等作物上得到耐冷愈伤组织系，但都未能分化出再生植株。而Ｊｉｎ等［３４］认为水稻低温体细
胞筛选，以１５℃最为有效。暖季型草坪草最适的生长温度范围为２５～３５℃，低于１５℃就停止生长。在本试验
中，假俭草在０℃低温下进行体细胞筛选并获得再生植株，这说明０℃的低温处理对假俭草抗寒体细胞筛选是有
效的。
本研究所用材料为假俭草优良选系Ｅ１２６，该选系是作者在对１６５份种源连续３年的动态评价基础上筛选
出来的综合坪用价值最高的种源。本研究目的只是希望提高Ｅ１２６的抗寒性，同时不改变其坪用性状。通过对
假俭草体细胞抗寒突变体和对照苗期外部性状观测分析，可以看出，低温筛选并未对假俭草外部性状产生显著的
影响。当然，由于时间限制，本研究只对苗期性状进行了观测分析，今后尚需对假俭草体细胞抗寒突变体和对照
其他性状进行观测评价。
在本试验中，低温筛选出的株系１、２和对照的半致死温度（ＬＴ５０）分别为－６．４８２，－６．５３５和－５．２０７℃，并
１４２第２０卷第６期 草业学报２０１１年
且处理和对照之间差异显著。但是本实验所得到叶片的ＬＴ５０不能作为假俭草种质抗寒性的绝对指标，而只是用
来作为判别种质间抗寒性相对差别的依据。
ＳＲＡＰ是一种新型的基于ＰＣＲ技术的标记－相关序列扩增多态性，具有方法简单、成本低、重复性好、检测
位点多、精确度高等特点［３５］。本研究中利用ＳＲＡＰ－ＰＣＲ技术成功地对假俭草抗寒体细胞突变体和对照进行了
编辑，并证实株系１和株系２是相同的。
总之，本研究以国产优良假俭草Ｅ１２６种子为外植体，将获得黄色颗粒状愈伤组织在０℃低温条件下处理，
筛选出２块耐寒愈伤组织，此愈伤组织经分化、生根再生出２个株系。２个株系其苗期外部形态相同且与对照没
有显著性差异。通过ＬＴ５０抗寒性鉴定显示，对照和筛选株系ＬＴ５０存在显著性差异，但是，株系１和株系２无差
异。筛选株系和对照ＳＲＡＰ的带型亦明显不同，但是，株系１和株系２的条带完全相同。由此可见，通过低温体
细胞筛选获得的植株苗期外部性状与对照没有显著差异，但其抗寒性高于对照，且在分子水平上也表达出稳定
的差异性，但２个株系无论在外部性状、抗寒性以及ＳＲＡＰ指纹图谱均无差异，因此，株系１和株系２可合并成一
个株系。
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ｉｔｓａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｔｏｍａｐｐｉｎｇａｎｄｇｅｎｅｔａｇｇｉｎｇｉｎ犅狉犪狊狊犻犮犪［Ｊ］．ＴｈｅｏｒｅｔｉｃａｌａｎｄＡｐｐｌｉｅｄＧｅｎｅｔｉｃｓ，２００１，１０３：４５５４６１．
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犃犮狇狌犻狊犻狋犻狅狀犪狀犱犻犱犲狀狋犻犳犻犮犪狋犻狅狀狅犳犮狅犾犱狉犲狊犻狊狋犪狀狋狊狅犿犪狋犻犮犿狌狋犪狀狋狊狅犳犮犲狀狋犻狆犲犱犲犵狉犪狊狊
ＹＵＡＮＸｕｅｊｕｎ１，２，ＷＡＮＧＺｈｉｙｏｎｇ１，３，ＺＨＥＮＧＹｉｑｉ１，ＬＩＵＪｉａｎｘｉｕ１，ＳＨＥＪｉａｎｍｉｎｇ１
（１．ＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＢｏｔａｎｙ，ＪｉａｎｇｓｕＰｒｏｖｉｎｃｅ＆ＣｈｉｎｅｓｅＡｃａｄｅｍｙｏｆＳｃｉｅｎｃｅｓ，Ｎａｎｊｉｎｇ２１００１４，Ｃｈｉｎａ；
２．ＣｏｌｅｇｅｏｆＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅ，ＱｉｏｎｇｚｈｏｕＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｓａｎｙａ５７２０００，Ｃｈｉｎａ；３．Ｃｏｌｅｇｅｏｆ
Ａｇｒｏｎｏｍｙ，ＨａｉｎａｎＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｄａｎｚｈｏｕ５７１７３７，Ｃｈｉｎａ）
犃犫狊狋狉犪犮狋：Ｗｅａｋｃｏｌｄｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｏｆｃｅｎｔｉｐｅｄｅｇｒａｓｓｉｓｏｎｅｏｆｔｈｅｍａｊｏｒｆａｃｔｏｒｓｌｉｍｉｔｉｎｇｉｔｓｗｉｄｅａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ．Ｔｈｉｓ
ｓｔｕｄｙａｉｍｅｄｔｏｏｂｔａｉｎｃｏｌｄｒｅｓｉｓｔａｎｔｓｏｍａｔｉｃｍｕｔａｎｔｓｆｒｏｍｔｈｅｓｅｅｄｏｆｅｍｉｎｅｎｔＣｈｉｎｅｓｅｎａｔｉｖｅｃｅｎｔｉｐｅｄｅｇｒａｓｓｓｅ
ｌｅｃｔｉｏｎＥ１２６ｂｙｉｎｄｕｃｔｉｏｎａｎｄｓｃｒｅｅｎｉｎｇａｔｌｏｗｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ．Ｔｈｅｃａｌｕｓｉｎｄｕｃｅｄｂｙｓｅｅｄｓｏｆｃｅｎｔｉｐｅｄｅｇｒａｓｓｗａｓ
ｃｕｌｔｉｖａｔｅｄａｔ０℃ｆｏｒ２６ｄｄｕｒｉｎｇｔｈｅｐｒｏｃｅｓｓｏｆｓｕｂｃｕｌｔｕｒｅａｎｄｔｗｏｐｉｅｃｅｓｏｆｓｕｒｖｉｖａｌｃａｌｕｓｔｉｓｓｕｅｓｗｅｒｅｏｂ
ｔａｉｎｅｄ．Ｓｔｒａｉｎ１ａｎｄｓｔｒａｉｎ２ｗｅｒｅｏｂｔａｉｎｅｄａｆｔｅｒｓｕｒｖｉｖａｌｃａｌｕｓｓｕｂｃｕｌｔｕｒｅｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ，ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ，ｒｈｉｚｏ
ｇｅｎｅｓｉｓａｎｄｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ．Ｎｏｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓｗｅｒｅｆｏｕｎｄｉｎｌｅａｆｃｏｌｏｒ，ｌａｍｅｌａｒｈａｉｒ，ｌｅａｆｌｅｎｇｔｈａｎｄ
ｌｅａｆｗｉｄｔｈｂｅｔｗｅｅｎｓｔｒａｉｎｓ１ａｎｄ２ａｎｄｔｈｅｃｏｎｔｒｏｌ．ＬＴ５０ｏｆｓｔｒａｉｎｓ１ａｎｄ２ｗｅｒｅ－６．６４６ａｎｄ－６．５４６℃，ｒｅ
ｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ，ｗｈｉｃｈｗａｓｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｌｏｗｅｒｔｈａｎｔｈａｔｏｆｃｏｎｔｒｏｌｐｌａｎｔｓ（－５．３５１℃）ａｎｄｔｈｅｒｅｗａｓｎｏｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ
ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｂｅｔｗｅｅｎｔｈｅＬＴ５０ｏｆｓｔｒａｉｎｓ１ａｎｄ２．Ｔｈｅｒｅｓｕｌｔｓｏｆｓｅｑｕｅｎｃｅｒｅｌａｔｅｄａｍｐｌｉｆｉｅｄｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ（ＳＲＡＰ）
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ｉｃａｌｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃ；ＬＴ５０；ＳＲＡＰ
４４２ ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ（２０１１） Ｖｏｌ．２０，Ｎｏ．６