全 文 ：书拟南芥高亲和性犓＋载体蛋白基因犮犇犖犃
克隆及其序列特征分析
王丽１，２，３，张俊莲１，３，４，张金文１，３，４，刘玉汇１，３，白江平１，３，４，
余斌１，３，杨宏羽１，３，４，王蒂１，３，４
（１．甘肃省作物遗传改良与种质创新重点实验室，甘肃 兰州７３００７０；２．甘肃农业大学生命科学技术学院，甘肃 兰州７３００７０；
３．甘肃省干旱生境作物学重点实验室，甘肃 兰州７３００７０；４．甘肃农业大学农学院，甘肃 兰州７３００７０）
摘要：以ＮａＣｌ胁迫处理的拟南芥幼苗叶片为材料，用ＲＮＡ提取试剂盒抽提总ＲＮＡ，通过ＲＴ－ＰＣＲ技术和ＤＮＡ
序列测定分析，证实获得了拟南芥高亲和性Ｋ＋载体蛋白基因（犃狋犎犓犜１）的ｃＤＮＡ序列。该ｃＤＮＡ全长１５２１ｂｐ，
包括５０６个氨基酸和１个终止密码子序列，且与原序列（ａｃｃｅｓｓｉｏｎｎｕｍｂｅｒＡＦ２３７６７２）同源性为９９．３４％，但与其他
科植物犎犓犜１基因同源性较低，注册该基因到ＧｅｎＢａｎｋ中，注册号为ＡＹ６８５１８２。利用生物信息学相关软件分析
预测犃狋犎犓犜１基因蛋白质功能和结构，结果发现，该蛋白分子量为５７．４５ｋＤ，理论等电点为９．３３；氨基酸序列中第
１～４０个氨基酸属信号肽序列；第１５２～５００个氨基酸属ＴｒｋＨ阳离子转运体蛋白保守结构域，并存在蛋白激酶Ｃ，
酪氨酸蛋白激酶，依赖ｃＡＭＰ／ｃＧＭＰ蛋白激酶磷酸化，糖基化和豆蔻酰化等功能位点；该基因编码的蛋白有１０个
跨膜结构，Ｎ末端、Ｃ末端及中部等多个跨膜区具疏水性，符合载体类运输蛋白特点。表明本研究获得了拟南芥
犃狋犎犓犜１基因。
关键词：拟南芥；高亲和性Ｋ＋载体蛋白；ＲＴ－ＰＣＲ技术；生物信息学分析
中图分类号：Ｑ９４３．２ 文献标识码：Ａ 文章编号：１００４５７５９（２０１３）０６０２３００９
犇犗犐：１０．１１６８６／ｃｙｘｂ２０１３０６２９
钾是植物生长发育必需的大量元素，参与植物许多生理生化过程，包括酶活性调节、蛋白质合成及渗透调节
等，保持胞质内较高Ｋ＋／Ｎａ＋对植物生长起着非常重要的作用［１］。盐胁迫时，大量Ｎａ＋从根部进入植物体内，抑
制Ｋ＋的吸收，Ｋ＋／Ｎａ＋降低，导致植物受害［２］。研究表明，植物的耐盐性与其维持体内Ｋ＋、Ｎａ＋平衡的能力密
切相关，具有高Ｋ＋／Ｎａ＋的植物有较强的耐盐性［３］。因此，限制Ｎａ＋吸收、增加Ｎａ＋外排，同时保证Ｋ＋吸收，维
持细胞质高Ｋ＋／Ｎａ＋可抵御过量的Ｎａ＋对植物造成的伤害［４］。ＨＫＴ（ｈｉｇｈａｆｆｉｎｉｔｙＫ＋ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ）类蛋白属于
一个广泛存在于植物、真菌、真细菌和古细菌中的Ｋ＋转运体超级家族，具有可以调节植物体内Ｋ＋／Ｎａ＋平衡的
能力［５］。
自１９９４年Ｓｃｈａｃｈｔｍａｎ和Ｓｃｈｒｏｅｄｅｒ［６］从小麦（犜狉犻狋犻犮狌犿犪犲狊狋犻狏狌犿）幼苗根ｃＤＮＡ表达文库中克隆到第１个
高亲和性Ｋ＋载体蛋白基因Ｔａ犎犓犜１以来，陆续在拟南芥（犃狉犪犫犻犱狅狆狊犻狊狋犺犪犾犻犪狀犪）［７］、碱蓬（犛狌犪犲犱犪狊犪犾狊犪）［５］、芦
苇（犘犺狉犪犵犿犻狋犲狊犪狌狊狋狉犪犾犻狊）［８］、水稻（犗狉狔狕犪狊犪狋犻狏犪）［９］、冰叶日中花（犕犲狊犲犿犫狉狔犪狀狋犺犲犿狌犿犮狉狔狊狋犪犾犾犻狀狌犿）［１０］、桉树
（犈狌犮犪犾狔狆狋狌狊犮犪犿犪犾犱狌犾犲狀狊犻狊）［１１］、大麦（犎狅狉犱犲狌犿狏狌犾犵犪狉犲）［１２］、商陆（犘犺狔狋狅犾犪犮犮犪犪犮犻狀狅狊犪）［１３］、海蓬子（犛犪犾犻犮狅狉狀犻犪
犫犻犵犲犾狅狏犻犻）［１４］等多种植物中克隆了其同源蛋白基因。早期研究认为，犎犓犜１蛋白是Ｎａ＋吸收和运输的载体，降低
犎犓犜１的表达，可能会提高植物抗盐性，如Ｌａｕｒｉｅ等［１５］研究发现，表达反义犎犓犜１基因的小麦植株较野生型耐
盐胁迫能力更强；Ｈｏｒｉｅ等［１６］比较耐盐水稻和盐敏感水稻时发现，抗盐性高的水稻犎犓犜１基因的表达量在盐胁
迫时降低，而盐敏感型水稻犎犓犜１的表达量一直维持在很高水平；Ｒｕｓ等［１７］研究发现拟南芥犃狋犎犓犜１基因在
２３０－２３８
２０１３年１２月
草 业 学 报
ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ
第２２卷 第６期
Ｖｏｌ．２２，Ｎｏ．６
收稿日期：２０１２１０２４；改回日期：２０１２１１１５
基金项目：高等学校博士学科点专项基金项目（２０１０６２０２１１０００７），国家科技支撑计划项目（２０１２ＢＡＤ０６Ｂ０３），甘肃省干旱生境作物学重点实验室
开放基金（ＧＳＣＳ２０１２１２）和甘肃农业大学科技创新基金项目（ＧＡＵＣＸ１０２４）资助。
作者简介：王丽（１９８１），女，甘肃兰州人，讲师，在读博士。Ｅｍａｉｌ：３９７２６８２１＠ｑｑ．ｃｏｍ
通讯作者。Ｅｍａｉｌ：ｚｈａｎｇｊｌ＠ｇｓａｕ．ｅｄｕ．ｃｎ，ｗａｎｇｄ＠ｇｓａｕ．ｅｄｕ．ｃｎ
ｓｏｓ３１突变体的过量表达增强了突变体植株在低Ｋ＋环境下对Ｎａ＋的敏感性及植株的缺Ｋ＋症状，犃狋犎犓犜１基
因可转运Ｎａ＋进入细胞、调控根部Ｎａ＋的吸收。然而近期更多的研究证明，犃狋犎犓犜１转运蛋白在提高植物耐盐
性中可能具有重要的积极作用，如Ｍｓｅｒ等［１８］认为拟南芥犃狋犎犓犜１基因参与调控Ｎａ＋在根和地上部分的分配；
Ｂｅｒｔｈｏｍｉｅｕ等［１９］认为犃狋犎犓犜１参与Ｎａ＋通过韧皮部汁液从地上部分至根部的再循环过程，降低叶中 Ｎａ＋积
累；Ｓｕｎａｒｐｉ等［２０］认为在高盐环境下，犃狋犎犓犜１基因调节 Ｎａ＋从根部木质部卸载。特别是最近的研究又发现，
犃狋犎犓犜１基因既不调控Ｎａ＋从地上部到根部的再循环，也不调节Ｎａ＋以内流的形式进入根部，而是将Ｎａ＋直接
滞留在根的木质部中，加载Ｎａ＋进入根部液泡，从而降低Ｎａ＋从根到茎的运输［２１２６］。由此可见，犃狋犎犓犜１基因
在植株中的耐盐表达调控机制仍有争议，目前尚未见利用该基因改良作物耐盐性的报道。
为了研究犃狋犎犓犜１基因参与植物耐盐调控机制，更好地发挥其作用，本研究以拟南芥为材料，利用ＲＴ－
ＰＣＲ技术，在盐胁迫条件下进行犃狋犎犓犜１基因的分离克隆。进一步通过该基因编码蛋白特性及结构分析，初步
确定该基因功能和特点，为进一步研究该基因功能及改良作物耐盐性奠定基础。
１ 材料与方法
１．１ 材料
１．１．１ 植物材料 拟南芥种子用７０％酒精浸泡３０ｓ，０．１％ ＨｇＣｌ２ 处理５ｍｉｎ，无菌水冲洗５次后接入ＭＳ基本
培养基上，在２５℃、１２ｈ／ｄ光照下培养。当幼苗生长至１４ｄ时，将１６０ｍｍｏｌ／Ｌ的ＮａＣｌ水溶液倒入培养基上，胁
迫幼苗１２ｈ待用。本试验在２００４年进行。
１．１．２ 菌株和载体 大肠杆菌（犈狊犮犺犲狉犻犮犺犻犪犮狅犾犻）菌株为ＤＨ５α的感受态细胞；Ｔ载体为ｐＧＥＭ?ＴＥａｓｙＶｅｃ
ｔｏｒ（购自Ｐｒｏｍｅｇａ公司），抗性标记为氨苄青霉素（Ａｍｐｒ）。
１．１．３ 酶和试剂 ＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔⅡ逆转录试剂盒购自Ｐｒｏｍｅｇａ公司；各种限制性内切酶、ＰｙｒｏｂｅｓｔＴＭＤＮＡ聚合酶
和Ｔ４ＤＮＡ连接酶购自ＴａＫａＲａ公司；ＴａｑＤＮＡ聚合酶和ＴＲＩｚｏｌ一步法ＲＮＡ提取试剂盒购自鼎国公司；ＤＮＡ
凝胶回收试剂盒购自上海开瑞公司；其他生化试剂为国产分析纯。
１．２ 犃狋犎犓犜１基因ｃＤＮＡ克隆
１．２．１ 逆转录合成ｃＤＮＡ第１链 １）总ＲＮＡ提取。用ＴＲＩｚｏｌ一步法ＲＮＡ提取试剂盒抽提盐胁迫下的拟南
芥叶片总ＲＮＡ，提取方法见试剂盒说明书。提取的总ＲＮＡ在经焦碳酸二乙酯（ＤＥＰＣ）处理的１％琼脂糖凝胶上
电泳，ＥＢ染色后检查ＲＮＡ完整性；２）ｃＤＮＡ第１链合成。在提取的７．５μＬＲＮＡ中加入１μＬＯｌｉｇｏ（ｄＴ），６５℃
加热８ｍｉｎ，室温自然冷却；向上述混合液中加入４μＬ２５ｍｍｏｌ／Ｌ的 ＭｇＣｌ２、４μＬ５×ｂｕｆｆｅｒ、２μＬ１０ｍｍｏｌ／Ｌ
ｄＮＴＰ和０．５μＬ的 ＲＮａｓｅ，混匀后加入 ＡＭＶ反转录酶，再次混匀后４２℃下保温３０ｍｉｎ，９９℃下煮５ｍｉｎ，
－２０℃保存。
１．２．２ ＰＣＲ扩增 根据已发表的拟南芥犃狋犎犓犜１基因序列（ａｃｃｅｓｓｉｏｎｎｕｍｂｅｒＡＦ２３７６７２），设计１对引物，即
上游引物ｐ１：５′ＣＧＧＧＡＴＣＣ（ＢａｍＨⅠ）ＡＴＧＧＡＣＡＧＡＧＴＧＧＴＧＧＣＡＡＡＡＡＴＡＧ３′和下游引物ｐ２：５′ＣＧ
ＧＡＧＣＴＣ（ＳａｃⅠ）ＴＴＡＧＧＡＡＧＡＣＧＡＧＧＧＧＴＡＡＡＧＴＡＴＣＣ３′，由北京赛百盛公司合成。扩增反应体系为２５
μＬ，由１μＬｃＤＮＡ模板、２．５μＬ１０×ｂｕｆｆｅｒ、１μＬｄＮＴＰ（１０ｍｍｏｌ／Ｌ）、１μＬ引物ｐ１（１０μｍｏｌ／Ｌ）、１μＬ引物ｐ２
（１０μｍｏｌ／Ｌ）、０．５μＬＰｙｒｏｂｅｓｔ
ＴＭＤＮＡ聚合酶、１８μＬｄｄＨ２Ｏ组成。扩增条件为：９４℃预变性１ｍｉｎ后，进行
９４℃５０ｓ、５３℃５０ｓ、７２℃１２０ｓ的３５个循环，再在７２℃下延伸１０ｍｉｎ。扩增产物ＥＢ染色后进行１％琼脂糖凝
胶电泳检测。
１．２．３ 犃狋犎犓犜１基因ｃＤＮＡ与Ｔ载体连接 扩增产物经１％琼脂糖凝胶电泳分离后回收，回收方法见上海开
瑞公司凝胶回收试剂盒说明书。扩增产物利用ＴａｑＤＮＡ聚合酶对其加Ａ，然后与Ｔ载体相连，连接产物转化感
受态细胞。
１．３ 重组质粒的鉴定
将转化细胞涂在含５０μｇ／ｍＬＡｍｐ
ｒ、２０ｍｇ／ｍＬ５溴４氯３吲哚βＤ半乳糖苷（Ｘｇａｌ）和１００ｍｇ／ｍＬ异丙
１３２第２２卷第６期 草业学报２０１３年
基βＤ硫代半乳糖苷（ＩＰＴＧ）的 ＬＢ平板上进行蓝白斑筛选。对所获得的白斑通过滞后质粒、ＰＣＲ 扩增、
犅犪犿犎Ⅰ和犛犪犮Ⅰ双酶切鉴定，－８０℃保存菌株。
１．４ 序列测定及分析
送鉴定后的白斑菌株到上海博亚公司测序，所测序列用ＤＮＡＭＡＮｖｉｒｓｉｏｎ６．０软件进行分析。然后通过
ＮＣＢＩ网站的ＢｌａｓｔＸ和ＢｌａｓｔＰ程序进行序列相似性分析；利用ＩｎｔｅｒＰｒｏＳｃａｎ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／Ｔｏｏｌｓ／
ＩｎｔｅｒＰｒｏＳｃａｎ／）进行信号肽分析和氨基酸保守性预测；用 ＭＥＧＡ４．０软件进行氨基酸序列比对和ＨＫＴ类蛋白质
序列系统进化树分析；链接至ｈｔｔｐ：／／ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ／ｔｏｏｌｓ／ｐｒｏｔｐａｒａｍ．ｈｔｍｌ网站进行蛋白质理化性质分析；利用
ＰｒｅｄｉｃｔＰｒｏｔｅｉｎＳｅｒｖｅｒ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｐｒｅｄｉｃｔｐｒｏｔｅｉｎ．ｏｒｇ／）进行蛋白质结构域分析；利用 ＴＭＨＭＭＳｅｒｖｅｒｖ２．０
（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ＴＭＨＭＭ２．０）程序分析蛋白质序列跨膜区；利用ＰｒｏｔＳｃａｌｅ（ｈｔｔｐ：／／ｅｘ
ｐａｓｙ．ｏｒｇ／ｔｏｏｌｓ／ｐｒｏｔｓｃａｌｅ．ｈｔｍｌ）分析氨基酸序列的疏水性。
２ 结果与分析
２．１ 拟南芥犃狋犎犓犜１基因的分离
图１ 拟南芥总犚犖犃
犉犻犵．１ 犜狅狋犪犾犚犖犃狅犳犃．狋犺犪犾犻犪狀犪
１，２：总ＲＮＡＴｏｔａｌＲＮＡ．
利用ＴＲＩｚｏｌ一步法ＲＮＡ提取试剂盒提取盐胁
迫下的拟南芥叶片总ＲＮＡ，琼脂糖凝胶电泳显示，总
ＲＮＡ５Ｓ、１８Ｓ和２８Ｓ三条带清晰、完整（图１），说明
ＲＮＡ完整性良好。利用 ＲＴ－ＰＣＲ试剂盒进行ｃＤ
ＮＡ第１链合成后，利用１对特异性引物及Ｐｙｒｏｂｅ
ｓｔＴＭＤＮＡ聚合酶，以ｃＤＮＡ为模板进行目的基因扩
增，期望获得约１５２１ｂｐ大小的ＤＮＡ片段。对扩增产
物电泳检查结果表明，扩增产物与预期片段的大小基
本一致（图２），说明可能获得了犃狋犎犓犜１基因的ｃＤ
ＮＡ克隆。
２．２ 重组菌株获得
因ｐＧＥＭ?ＴＥａｓｙＶｅｃｔｏｒ载体多克隆位点位于犔犪犮犣基因编码区，外源基因插入将改变犔犪犮犣基因编码序
列的完整性，影响β半乳糖苷酶活性，致使重组子在Ｘｇａｌ／ＩＰＴＧ平板上呈白色，而非重组子呈蓝色。选取白色
菌株进行滞后质粒筛选（图３），初步淘汰假阳性，然后对阳性菌株进行ＰＣＲ（图４）及双酶切（犅犪犿犎Ⅰ和犛犪犮Ⅰ）
鉴定（图５）。结果显示，扩增到或切下约１５２１ｂｐ大小的ＤＮＡ片段，说明可能获得了携带有犃狋犎犓犜１基因的重
组菌株。
图２ 拟南芥犃狋犎犓犜１基因的犘犆犚扩增
犉犻犵．２ 犘犆犚犪犿狆犾犻犳犻犮犪狋犻狅狀狅犳犃狋犎犓犜１犵犲狀犲
Ｍ：ＭａｋｅｒⅤ分子量标记ＤＮＡＭａｋｅｒⅤ；１，２：ＰＣＲ扩增
产物ＡｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｐｒｏｄｕｃｔｂｙＰＣＲ．
图３ 犜载体上滞后质粒筛选
犉犻犵．３ 犐犱犲狀狋犻犳犻犮犪狋犻狅狀狅犳犱犲犾犪狔犲犱狆犾犪狊犿犻犱狅犳犜狏犲犮狋狅狉
１～３：蓝斑Ｂｌｕｅｃｏｌｏｒｐｌａｓｍｉｄ；４：白斑 Ｗｈｉｔｅｃｏｌｏｒｐｌａｓｍｉｄ．
２３２ ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ（２０１３） Ｖｏｌ．２２，Ｎｏ．６
图４ 白斑滞后质粒犘犆犚鉴定
犉犻犵．４ 犐犱犲狀狋犻犳犻犮犪狋犻狅狀狅犳狑犺犻狋犲犮狅犾狅狉狆犾犪狊犿犻犱犫狔犘犆犚
Ｍ：ＭａｋｅｒⅤ分子量标记ＤＮＡｍａｒｋｅｒⅤ；１～５：白斑滞后
质粒 Ｗｈｉｔｅｃｏｌｏｒｐｌａｓｍｉｄ．
图５ 白斑滞后质粒犅犪犿犎 Ⅰ和犛犪犮Ⅰ酶切鉴定
犉犻犵．５ 犐犱犲狀狋犻犳犻犮犪狋犻狅狀狅犳狑犺犻狋犲犮狅犾狅狉狆犾犪狊犿犻犱犫狔犅犪犿犎 Ⅰ犪狀犱犛犪犮Ⅰ
Ｍ：ＭａｋｅｒⅤ分子量标记ＤＮＡＭａｋｅｒⅤ；１，２：白斑滞后质粒的犅犪犿犎Ⅰ和
犛犪犮Ⅰ酶切鉴定Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｗｈｉｔｅｃｏｌｏｒｐｌａｓｍｉｄｂｙ犅犪犿犎Ⅰａｎｄ犛犪犮Ⅰ．
２．３ 犃狋犎犓犜１基因ｃＤＮＡ序列及蛋白序列分析
２．３．１ ｃＤＮＡ序列特征分析 将经鉴定的重组菌株交上海博亚生物技术公司测序。将测序结果与原序列（ａｃ
ｃｅｓｓｉｏｎｎｕｍｂｅｒＡＦ２３７６７２）比较，发现二者同源性高达９９．３４％。对测序结果分析后发现，其开放阅读框架为
１５２１ｂｐ（图６），包括５０６个氨基酸编码区和１个终止密码子（ＴＡＡ）。该基因登记在ＧｅｎＢａｎｋ中（ａｃｃｅｓｓｉｏｎｎｕｍ
ｂｅｒＡＹ６８５１８２）。
用ＤＮＡＭＡＮ软件对该序列与ＧｅｎＢａｎｋ中登记的部分物种的犎犓犜１基因的ｃＤＮＡ序列进行同源性比较。
结果发现，该序列与其他学者登录的拟南芥犃狋犎犓犜１基因同源性都很高，达９９．３４％以上，与同科盐芥同源性较
高，为８４．００％，与其他科植物同源性低，为４８．４７％～５７．３４％（表１），说明同科植物特别是同种植物，该基因的
保守性强，而不同科植物的犃狋犎犓犜１基因间差异较大。
２．３．２ 蛋白质进化特征分析 系统进化树分析发现，１０个物种的２１个 ＨＫＴ蛋白被聚为９个类群，拟南芥
犃狋犎犓犜１和同科的盐芥犜犺犎犓犜１聚为一类，亲缘关系最近；禾本科水稻犗狊犎犓犜３、犗狊犎犓犜９、犗狊犎犓犜７、犗狊犎
犓犜４聚为一类；禾本科水稻犗狊犎犓犜１、犗狊犎犓犜２和芦苇犘犺犪犎犓犜１为一类；禾本科大麦 犎狏犎犓犜１和小麦
犜犪犎犓犜１为一类；番杏科冰花犕犮犎犓犜２、桃金娘科赤桉犈犮犎犓犜１、犈犮犎犓犜２和藜科碱蓬犛狊犎犓犜１为一类；禾本
科水稻犗狊犎犓犜８、犗狊犎犓犜６、番杏科冰花犕犮犎犓犜１、藜科海蓬子犛犫犎犓犜１单独聚为一类，基本表现为同科尤其
是同种同源性高、种间相对低的特点（图７）。
２．３．３ 蛋白理化性质及结构域分析 Ｐｒｏｔｐａｒａｍ软件预测犃狋犎犓犜１蛋白分子式为Ｃ２６５７Ｈ４１２６Ｎ６４８Ｏ７２５Ｓ２２，分子
量５７．４５ｋＤ，理论等电点为９．３３，带正电荷氨基酸残基数（Ａｒｇ＋Ｌｙｓ）为４７，带负电荷氨基酸残基数（Ａｓｐ＋Ｇｌｕ）
为４１，不稳定系数为３４．１９，为稳定碱性蛋白。该蛋白在第１～４０个氨基酸残基处有１个信号肽序列（图６，用
“·”表示）。在第１５２～５００个氨基酸处有１个ＴｒｋＨ阳离子转运体蛋白保守结构域（图６，用“［］”表示）。分别
在第７０～７３，１２８～１３１，１３８～１４１，１８５～１８８，１９１～１９４，２６０～２６３，３１８～３２１，３３９～３４２，４１１～４１４个氨基酸残基
处有９个酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点（图６，用“□”表示），表明该蛋白是一种真核细胞中普遍存在的信使非依赖性
丝／苏氨酸蛋白激酶，在细胞生存、生长、增殖及凋亡过程中具有重要功能。在第４８～５０，１８５～１８７，１９１～１９３，
２６０～２６２，２８２～２８４，４１３～４１５，４９２～４９４和４９５～４９７个氨基酸处具有８个蛋白激酶Ｃ磷酸化位点（图６，用“■”
表示），能将靶蛋白的Ｓｅｒ／ｔｈｒ磷酸化，从而激活细胞质中某些酶的活性，参与生化反应调控；还可与核中转录因
子相互作用，参与基因表达调控。该蛋白在第２２５～２２８个氨基酸处有１个依赖ｃＡＭＰ／ｃＧＭＰ蛋白激酶磷酸化
位点［图６，用“（）”表示］，能在ＡＴＰ存在的情况下使许多蛋白质特定的丝／苏氨酸残基磷酸化，调节细胞的物质
代谢和基因表达。此外，在第２６１～２６７个氨基酸处［图６，用“｛｝”表示］，该蛋白具有１个酪氨酸蛋白激酶磷酸化
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位点，可将自身的酪氨酸磷酸化或将各种不同靶蛋白的酪氨酸磷酸化来实现信号传递，其转导的信号通常与细胞
生长、繁殖、分化、生存有关。位于第４２９～４３２个氨基酸处该蛋白具有１个Ｎ端糖基化位点（图６，用“＝”表示），
使蛋白质能够抵抗消化酶的作用、赋予蛋白质传导信号的功能、或某些蛋白只有在糖基化之后才能正确折叠。此
外，３个Ｎ端豆蔻酰化位点分别在第１２２～１２７，３９４～３９９，４５９～４６４个氨基酸处（图６，用“－”表示）。
图６ 拟南芥犃狋犎犓犜１基因的犮犇犖犃序列及其推测的氨基酸序列
犉犻犵．６ 犖狌犮犾犲狅狋犻犱犲狊犲狇狌犲狀犮犲犪狀犱犱犲犱狌犮犲犱犪犿犻狀狅狊犲狇狌犲狀犮犲狅犳犃狋犎犓犜１犮犇犖犃狅犳犃．狋犺犪犾犻犪狀犪
·：信号肽Ｓｉｇｎａｌｐｅｐｔｉｄｅ；［］：蛋白保守区Ｐｒｏｔｅｉｎｃｏｎｓｅｒｖｅｄｒｅｇｉｏｎ；□：酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点ＣａｓｅｉｎｋｉｎａｓｅＩＩｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎｓｉｔｅ；■：蛋
白激酶Ｃ磷酸化位点ＰｒｏｔｅｉｎｋｉｎａｓｅＣｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎｓｉｔｅ；（）：依赖ｃＡＭＰ／ｃＧＭＰ蛋白激酶磷酸化位点ｃＡＭＰａｎｄｃＧＭＰｄｅｐｅｎｄｅｎｔｐｒｏｔｅｉｎｋｉｎａｓｅ
ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎｓｉｔｅ；｛｝：酪氨酸蛋白激酶磷酸化位点Ｔｙｒｏｓｉｎｅｋｉｎａｓｅｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎｓｉｔｅ；＝：Ｎ端糖基化位点Ｎｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎｓｉｔｅ；－：豆蔻酰化
位点Ｎｍｙｒｉｓｔｏｙｌａｔｉｏｎｓｉｔｅ．
２．３．４ 蛋白跨膜性及疏水性分析 经ＴＭＨＭＭＳｅｒｖｅｒｖ２．０软件分析推测，ＡｔＨＫＴ１蛋白有１０个跨膜区
（２１～４３，８２～１０４，１５８～１８０，１９５～２１７，２３０～２５２，２８５～３０７，３４３～３６５，３９５～４１２，４２５～４４７，４６７～４８６），其中
３９５～４１２区域的跨膜螺旋长度为１８个氨基酸残基，４６７～４８６区域的跨膜螺旋长度为２０个氨基酸残基，其余区
域均为２３个氨基酸残基（图８）。利用ＰｒｏｔＳｃａｌｅ软件的ＫｙｔｅａｎｄＤｏｏｌｉｔｔｌｅ算法对ＡｔＨＫＴ１蛋白进行亲水／疏水
性分析（图９）。在３４７～３５９区域的疏水性最强（最大值达３．４６７），疏水性较强的区域有１３个，分别位于第２２～３９，
５８～６８，８０～９３，１５７～１６４，１７０～１８１，１９９～２０６，２３１～２３８，２４５～２５６，２８３～３０６，３２６～３２８，３９７～４１１，４３０～４３４，
４３２ ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ（２０１３） Ｖｏｌ．２２，Ｎｏ．６
４７６～４８４个氨基酸处；在３７２～３９０区域的亲水性最强（分值为－２．９００），其次有５个区域（４５～５２，１２７～１３１，
１３９～１４１，２５９～２７６，４１５～４２２）具有较强的亲水性。就整体来看，该蛋白疏水性氨基酸均匀分布在整个肽链中，
占总氨基酸组成的４６．６４％，疏水区域大于亲水区域，Ｎ末端、Ｃ末端及中部等多个跨膜区均具有疏水性，整个多
肽链表现为疏水性，可认为拟南芥ＡｔＨＫＴ１蛋白是疏水性蛋白，符合载体类运输蛋白特点，表明获得了跨膜运输
蛋白基因———犃狋犎犓犜１基因。
表１ 拟南芥犃狋犎犓犜１基因犮犇犖犃与其他植物犎犓犜１基因犮犇犖犃序列同源性比较
犜犪犫犾犲１ 犃犾犻犵狀犿犲狀狋狅犳狀狌犮犾犲狅狋犻犱犲狊犲狇狌犲狀犮犲狅犳犃狋犎犓犜１犵犲狀犲狑犻狋犺狅狋犺犲狉犺狅犿狅犾狅犵狌犲狊
犎犓犜１基因的来源
ｃＤＮＡｓｏｕｒｃｅｓｏｆ犎犓犜１ｇｅｎｅ
所属科属
Ｆａｍｉｌｙｇｅｎｕｓ
ＧｅｎＢａｎｋ登记号
ＡｃｃｅｓｓｉｏｎｎｕｍｂｅｒｉｎＧｅｎＢａｎｋ
同源性
Ｉｄｅｎｔｉｔｉｅｓ（％）
拟南芥犃狉犪犫犻犱狅狆狊犻狊狋犺犪犾犻犪狀犪 十字花科鼠耳芥属Ｃｒｕｃｉｆｅｒａｅ，犃狉犪犫犻犱狅狆狊犻狊 ＡＦ２３７６７２ ９９．３４
拟南芥犃狉犪犫犻犱狅狆狊犻狊狋犺犪犾犻犪狀犪 十字花科鼠耳芥属Ｃｒｕｃｉｆｅｒａｅ，犃狉犪犫犻犱狅狆狊犻狊 ＮＭ＿１１７０９９ ９９．６７
盐芥犜犺犲犾犾狌狀犵犻犲犾犾犪犺犪犾狅狆犺犻犾犪 十字花科盐芥属Ｃｒｕｃｉｆｅｒａｅ，犜犺犲犾犾狌狀犵犻犲犾犾犪 ＥＦ０２５５００ ８４．００
桉树犈狌犮犪犾狔狆狋狌狊犮犪犿犪犾犱狌犾犲狀狊犻狊 桃金娘科桉属 Ｍｙｒｔａｃｅａｅ，犈狌犮犪犾狔狆狋狌狊 ＡＦ１７６０３５ ５７．３４
碱蓬犛狌犪犲犱犪狊犪犾狊犪 藜科碱蓬属Ｃｈｅｎｏｐｏｄｉａｃｅａｅ，犛狌犪犲犱犪ｓｐｐ． ＡＹ５３０７５４ ５６．３６
海蓬子犛犪犾犻犮狅狉狀犻犪犫犻犵犲犾狅狏犻犻 藜科盐角草属Ｃｈｅｎｏｐｏｄｉａｃｅａｅ，犛犪犾犻犮狅狉狀犻犪 ＨＭ０９９６６１ ５４．３８
芦苇犘犺狉犪犵犿犻狋犲狊犪狌狊狋狉犪犾犻狊 禾本科芦苇属Ｇｒａｍｉｎｅａｅ，犘犺狉犪犵犿犻狋犲狊 ＡＢ２３４３０５ ５２．６２
冰叶日中花犕犲狊犲犿犫狉狔犪狀狋犺犲犿犮狉狔狊狋犪犾犾犻狀狌犿 番杏科日中花属Ａｉｚｏａｃｅａｅ，犕犲狊犲犿犫狉狔犪狀狋犺犲犿狌犿 ＡＦ３６７３６６ ５２．３０
大麦犎狅狉犱犲狌犿狏狌犾犵犪狉犲 禾本科大麦属Ｇｒａｍｉｎｅａｅ，犎狅狉犱犲狌犿 ＡＭ００００５６ ５２．３０
小麦犜狉犻狋犻犮狌犿犪犲狊狋犻狏狌犿 禾本科小麦属Ｇｒａｍｉｎｅａｅ，犜狉犻狋犻犮狌犿 Ｕ１６７０９Ｓ７１７７６ ５１．６７
水稻犗狉狔狕犪狊犪狋犻狏犪 禾本科稻属Ｇｒａｍｉｎｅａｅ，犗狉狔狕犪 ＡＢ０６１３１１ ５１．６４
玉米犣犲犪犿犪狔狊 禾本科玉米属Ｇｒａｍｉｎｅａｅ，犣犲犪 ＨＱ８４５２８６ ４８．４７
图７ 犃狋犎犓犜１蛋白与其他物种 犎犓犜类蛋白构建的系统进化树分析
犉犻犵．７ 犘犺狔犾狅犵犲狀犲狋犻犮狋狉犲犲犪狀犪犾狔狊犻狊狅犳犃狋犎犓犜１犳狅狉犿犃．狋犺犪犾犻犪狀犪狑犻狋犺狅狋犺犲狉狉犲狆狅狉狋犲犱犎犓犜狆狉狅狋犲犻狀狊
Ｏｓ：水稻犗狉狔狕犪狊犪狋犻狏犪；Ｐｈａ：芦苇犘犺狉犪犵犿犻狋犲狊犪狌狊狋狉犪犾犻；Ｈｖ：大麦 犎狅狉犱犲狌犿狏狌犾犵犪狉犲；Ｔａ：小麦犜狉犻狋犻犮狌犿犪犲狊狋犻狏狌犿；Ｔｈ：盐芥犜犺犲犾犾狌狀犵犻犲犾犾犪犺犪犾狅
狆犺犻犾；Ａｔ：拟南芥犃狉犪犫犻犱狅狆狊犻狊狋犺犪犾犻犪狀犪；Ｍｃ：冰叶日中花犕犲狊犲犿犫狉狔犪狀狋犺犲犿狌犿犮狉狔狊狋犪犾犾犻狀狌犿；Ｅｃ：赤桉犈狌犮犪犾狔狆狋狌狊犮犪犿犪犾犱狌犾犲狀狊犻狊；Ｓｓ：盐地碱蓬犛狌犪犲
犱犪狊犪犾狊犪；Ｓｂ：海蓬子犛犪犾犻犮狅狉狀犻犪犫犻犵犲犾狅狏犻犻．
５３２第２２卷第６期 草业学报２０１３年
图８ 犃狋犎犓犜１蛋白跨膜区分析
犉犻犵．８ 犜犺犲犪狀犪犾狔狊犻狊狅犳狋狉犪狀狊犿犲犿犫狉犪狀犲狅犳犃狋犎犓犜１狆狅犾狔狆犲狆狋犻犱犲
图９ 犃狋犎犓犜１氨基酸序列疏水性分析
犉犻犵．９ 犜犺犲犪狀犪犾狔狊犻狊狅犳犺狔犱狉狅狆犺狅犫犻犮犻狋狔狅犳犃狋犎犓犜１狆狅犾狔狆犲狆狋犻犱犲
３ 讨论
已有研究表明犃狋犎犓犜１基因参与Ｎａ＋的转运，与植物耐盐性有关，但关于其具体功能，不同研究者存在着
不同观点。早期研究认为，犃狋犎犓犜１基因的过量表达可增加植株的盐敏感性［１７］，近期部分学者对该基因的作用
有新解，认为犃狋犎犓犜１基因可调节Ｎａ＋在根和茎中的分配以及从茎到根部的再循环［１８２０］，ＡｔＨＫＴ１蛋白如果在
拟南芥根部的中柱鞘及维管束过量表达，会增加Ｎａ＋在根部木质部薄壁组织及皮层中滞留，减少Ｎａ＋由根部转
运至叶，从而降低叶片中Ｎａ＋浓度，表明该基因在根部的过量表达可提高拟南芥植株的耐盐性，但如果由组成型
３５Ｓ启动子驱动犃狋犎犓犜１基因在整个植株中的过量表达却导致了转基因植株的盐敏感性，说明犃狋犎犓犜１基因
的组织特异性表达与植株耐盐性关系密切［２４２６］。本研究根据ＧｅｎＢａｎｋ中拟南芥高亲和性Ｋ＋载体蛋白基因序列
（ＡＦ２３７６７２）设计引物，利用ＲＴ－ＰＣＲ方法，从拟南芥总ＲＮＡ中扩增出目的ｃＤＮＡ片段。序列分析发现，该
ｃＤＮＡ片段的开放阅读框架为１５２１ｂｐ，包括５０６个氨基酸编码区和１个终止密码子（ＴＡＡ）。该片段与Ｇｅｎ
Ｂａｎｋ中其他学者发表的拟南芥该基因ｃＤＮＡ序列（ＮＭ＿１１７０９９）同源性为９９．６７％，与同科盐芥（ＥＦ０２５５００）ｃＤ
ＮＡ同源性为８４．００％，蛋白质同源性为７８％，与其他科植物ｃＤＮＡ序列同源性较低，为４８．４７％～５７．３４％，蛋白
质序列同源性为４２．００％～５１．００％。说明同一物种中该基因保守，但不同物种间差异明显，这与其他研究者对
不同基因或不同物种同源性分析时的结论是一致的，即属内同源性高，属间相对低［２７２９］，可见高亲和性Ｋ＋载体
蛋白在进化上也存在多样性。
本研究对克隆到的犃狋犎犓犜１基因的ｃＤＮＡ片段利用相关软件进行了分析，发现其具有１个ＴｒｋＨ阳离子
６３２ ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ（２０１３） Ｖｏｌ．２２，Ｎｏ．６
转运体蛋白保守结构域和１个信号肽序列，存在蛋白激酶Ｃ、酪氨酸蛋白激酶、酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化、依赖
ｃＡＭＰ／ｃＧＭＰ蛋白激酶磷酸化、糖基化、豆蔻酰化等功能位点，表明该基因具有阳离子转运功能。王景艳等［３０］认
为植物通过离子外排和区域化降低Ｎａ＋的毒害与植物跨膜运输蛋白有密切关系，ＡｔＨＫＴ１蛋白疏水性及跨膜性
分析表明，该蛋白有１０个跨膜区，是疏水性蛋白，符合载体类跨膜运输蛋白特点，推测其与钾和钠离子的转运相
关。本研究为该基因进一步功能研究奠定了基础。
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ＯｏｃｙｔｅｓａｎｄＮａ＋ ｕｐｔａｋｅｉｎ犛犪犮犮犺犪狉狅犿狔犮犲狊犮犲狉犲狏犻狊犻犪犲［Ｊ］．ＰｌａｎｔＰｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，２０００，１２２：１２４９１２５９．
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７３２第２２卷第６期 草业学报２０１３年
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犆犾狅狀犻狀犵犪狀犱犪狀犪犾狔狊犻狊狅犳狊犲狇狌犲狀犮犲犮犺犪狉犪犮狋犲狉犻狊狋犻犮狊狅犳犮犇犖犃犲狀犮狅犱犻狀犵狋犺犲
犃狋犎犓犜１犵犲狀犲犳狉狅犿犃狉犪犫犻犱狅狆狊犻狊狋犺犪犾犻犪狀犪犾犲犪狏犲狊
ＷＡＮＧＬｉ１，２，３，ＺＨＡＮＧＪｕｎｌｉａｎ１，３，４，ＺＨＡＮＧＪｉｎｗｅｎ１，３，４，ＬＩＵＹｕｈｕｉ１，３，ＢａｉＪｉａｎｇｐｉｎｇ１，３，４，
ＹＵＢｉｎ１，３，ＹＡＮＧＨｏｎｇｙｕ１，３，４，ＷＡＮＧＤｉ１，３，４
（１．ＧａｎｓｕＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＣｒｏｐＧｅｎｅｔｉｃ＆ＧｅｒｍｐｌａｓｍＥｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ，Ｌａｎｚｈｏｕ７３００７０，Ｃｈｉｎａ；２．Ｃｏｌｅｇｅ
ｏｆＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓａｎｄＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＧａｎｓｕＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｌａｎｚｈｏｕ７３００７０，Ｃｈｉｎａ；
３．ＧａｎｓｕＰｒｏｖｉｎｃｉａｌＫｅｙＬａｂｏｆＡｒｉｄｌａｎｄＣｒｏｐＳｃｉｅｎｃｅ，Ｌａｎｚｈｏｕ７３００７０，Ｃｈｉｎａ；
４．ＣｏｌｅｇｅｏｆＡｇｒｏｎｏｍｉｃ，ＧａｎｓｕＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，
Ｌａｎｚｈｏｕ７３００７０，Ｃｈｉｎａ）
犃犫狊狋狉犪犮狋：Ｔｈｅｆｕｌｌｅｎｇｔｈｃｏｄｉｎｇｓｅｑｕｅｎｃｅｏｆ犃狋犎犓犜１ｗａｓｃｌｏｎｅｄｖｉａＲＴＰＣＲ（ｒｅｖｅｒｓｅｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｐｏｌｙｍｅｒ
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ｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ，Ｎｍｙｒｉｓｔｏｙｌａｔｉｏｎｓｉｔｅｓａｎｄｏｔｈｅｒｆｕｎｃｔｉｏｎｓｉｔｅｓ．Ｔｈｅｄｅｄｕｃｅｄｐｅｐｔｉｄｅｃｏｎｔａｉｎｅｄ１０ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ
ｄｏｍａｉｎｓ．ＴｈｅｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅｄｏｍａｉｎｓｎｅａｒｔｈｅＮｔｅｒｍｉｎｕｓ，ｔｈｅＣｔｅｒｍｉｎｕｓａｎｄｔｈｅｍｉｄｄｌｅｐａｒｔｏｆｔｈｅｐｅｐｔｉｄｅ
ｄｉｓｐｌａｙｅｄｈｉｇｈｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃｉｔｙ．Ｔｈｅｒｅｆｏｒｅ，ｉｔｉｓｓｕｇｇｅｓｔｅｄｔｈａｔｔｈｅｇｅｎｅｐｒｏｄｕｃｔｏｆ犃狋犎犓犜１ｍｉｇｈｔｐｌａｙｒｏｌｅｓｉｎ
ｆａｃｉｌｉｔａｔｉｎｇｃａｔｉｏｎｔｒａｎｓｐｏｒｔａｔｉｏｎ．
犓犲狔狑狅狉犱狊：犃狉犪犫犻犱狅狆狊犻狊狋犺犪犾犻犪狀犪；ｈｉｇｈａｆｆｉｎｉｔｙｐｏｔａｓｓｉｕｍｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ；ＲＴＰＣＲ；ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃａｎａｌｙｓｉｓ
８３２ ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ（２０１３） Ｖｏｌ．２２，Ｎｏ．６