全 文 ：书林业科学研究!"#$%!"&"$#$$
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!!文章编号!$##$($)*&""#$%##$(###$(#
拟南芥 !"#$%&+ 在植物顶端生长调节中的作用
李建波$!"! 张!进$! 刘伯斌$! 徐有明"! 卢孟柱$! 陈!军$!
"$+中国林业科学研究院林业研究所!林木遗传育种国家重点实验室!北京!$###*$%
"+华中农业大学园艺林学学院!湖北 武汉!),#####
收稿日期$ "#$,(#)(#*
基金项目$ &&-,计划课题""#$,..$#"#"#
作者简介$ 李建波"$*&(#!男!硕士研究生+主要研究方向$林木遗传育种+电话$#$#(-"&")#"#+/(0123$345617$#$8$-,+9:0
!
通讯作者$博士!副研究员+主要研究方向$树木极性生长和细胞内蛋白质极性运输+电话$#$#(-"&")#,,+/(0123$9;<7=67891>+19+97
摘要!拟南芥,&!-./+ 基因是!-.0123$基因家族的一员!其编码蛋白含有类似于?(@:A的结构域) 表达模式网络预
测结果显示该基因在茎顶端分生组织中高丰度表达!但对于 !-.0123$基因家族的研究还很少!其功能目前尚不明
确) 为此!本研究通过组织半定量表达分析和BCD染色显示,&!-./+ 基因在拟南芥中具有时空表达特异性) 结果
表明$在真叶形成前和形成初期!该基因主要在茎顶端分生组织和下胚轴区域表达%真叶形成后!该基因在下胚轴的
表达明显减少!而主要集中在茎顶端分生组织表达) 遗传转化显示$与野生型植株相比!过表达,&!-./+ 基因的植
株生长发育缓慢!抽薹时间推迟 , ) E!莲座叶叶片面积减小!叶片数目平均增多 $# 片!并且伴随有变态叶出现%
过表达植株株高比野生型矮!株高最大差值达到 $" 90) 共表达网络预测 ,&!-./+ 与多个与生长素和花发育相关
的基因具有共表达关系) 以上研究结果表明$,&!-./+ 基因在拟南芥的生长发育过程中!特别是在顶端分生组织分
化过程中起重要作用)
关键词!拟南芥%?(@:A结构域%基因功能% 茎顶端分生组织
中图分类号!D$&+- 文献标识码!.
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! D9E:5?6
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"$+DF1F
<6W;531<0
0
分生组织"或侧生分生组织#!其中!初生分生组织
包括茎顶端分生组织 " D.Z#和根顶端分生组织
"N.Z#
*$++
) 茎端分生组织的分化产生植物地上部
分的主要器官!是植物生长发育最基本的活动之
一*" [)+ !也是树木纵向生长及侧生分生组织形成的
必要前提) 优良林木新品种的培育首先需要寻找和
验证控制 D.Z维持和分化的基因) 现阶段对林木
的顶端分生组织研究较少!主要以拟南芥",#(72F"G0
%2%&*(12(6( "H+# Q<57;#为材料!并集中于干细胞的
维持和分化的分子机制等方面) 在维持干细胞稳定
的分子机制中!PH\(UCD"PH.\.J.(UCDPQ/H#的
负反馈调控作用是最典型的调节途径) UCD 抑制
干细胞分化和维持干细胞数目!而 PH\则促进干细
胞分化和器官的形成*% [-+ ) 另一条途径即 G]YJ(
J/^ (324<"G]Y_#同源蛋白 DQYYJZ/NODJ/ZH/DD
"DJZ#!能促进干细胞的分裂!抑制分化*+ ) 类
L/HH$ 蛋白 /`]]aUOD/" ]`a#和 Y`C]^ (?YYH(
ODQ" ]`?#在干细胞的分化和维持中同样发挥重要
作用*&+ ) 通过对 D.Z中作用干细胞维持的相关基
因和调控叶发育的 D
"D
因等的功能分析发现!它们除在 D.Z形态的建成,
叶片和花发育中起作用外!对植株的生长速度并无
影响** [$#+ ) 因此!现阶段需要更进一步的寻找和挖
掘参与 D.Z调控的基因及作用机制!以期达到加速
培育速生植物新品种的目的) "##* 年!a1E1T等*$$+
用D/LM,N
基因表达图谱!将 D.Z中基因的表达区域划分为上
述 , 个标记基因表达区域!即单个,两两交叉和三者
交叉等的 个区域) 在基因表达图谱中发现!,&!-0
./+ 基因主要在 D/LM 与 N功能未知) 区域特异表达的,&!-./+ 基因在顶端分
生组织的维持和分化中是否也起着重要作用是本研
究旨在解决的主要问题)
拟南芥信息资源网 "J.ON!;FW$bbVVV+1I1@2(
E:WK2K+:IMb#中数据显示!,&!-./+ 基因位于拟南芥
第 , 号染色体上!基因号为 ,&MAOPQRS!属于 !-.0
123$基因家族) 美国国家生物技术信息中心"]PLO!
;FW$bbVVV+79@2+730+72;+M:Tb#数据库显示!在所
有已检测的生物中共有 ,,$ 个类似结构的蛋白) 此
基因家族为植物界所特有!在细菌,古细菌,真菌和
其它的真核生物中均未见到) 目前!网络预测和一
些文献都提到了该基因在顶端分生组织中表
达*&! $$+ !但并无证据显示其具有组织特异性!其具体
功能也尚不明确) 本研究以拟南芥为材料!通过不
同组织的半定量表达和 BCD 染色对 ,&!-./+ 的组
织定位进行了分析) 通过构建,&!-./+ 过表达载体
并转化拟南芥!对该基因在调节植物顶端生长发育
过程中的作用进行了初步研究)
$!材料与方法
9+9:实验材料
实验所用拟南芥为P:360@21(# 生态型!由中国林
业科学研究院林木遗传育种国家重点实验室保存)
大肠杆菌"E%)*$#2)*2( )"12#菌株 K#(6%+(J$ 购自天根
生化科技有限公司"北京#!根癌农杆菌",A#"7()&$#20
?@&?@$T()2$6%#菌株;LM+S+由本实验室保存)
9+;:实验试剂
P`N所用试剂和Z1I4
]1`Y
)
WQc+""-&+)d]1
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Q` Y
)
和 ,$+-d]1Q
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!#+"d JI2F:7 _($##%BCD 染色液为 %# 00:3-
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B369!药品均购自 D2M01"上海#公司)
9+<:拟南芥种植方法与培养条件
"#$$ 年 月将拟南芥种子先后分别用 %d和
$##d的酒精灭菌和脱水!播种于 $b" ZD 培养基中)
) f条件下黑暗冷藏 , E 再移至拟南芥培养室中发
芽和培养!$) E之后将拟南芥幼苗转移至混合土"营
养土g蛭石c$#g$#中继续培养) 培养室的培养条件
为""" h"#f!$- ; 光照b& ; 黑暗!光照强度 $$#
"
第 $ 期 李建波等$拟南芥,&!-./+ 在植物顶端生长调节中的作用
!
0:3-0
["
-K
[$
)
9+=:基因的组织器官表达分析
分别提取拟南芥的根,茎,叶,茎顶端分生组织,
花和果荚共 - 个组织与器官的总 N].!并用紫外分
光光度计测定样品 N].的浓度和纯度) 利用 O7(
T2FI:M<7 9^].合成试剂盒将提取的总 N].反转录
成 9^].之后!取等量的 9^].为模板进行半定量
NJ(`PN反应) P`N反应体系为$酶 $#
!
H!正反向
引物"$#
!
0:3-H
[$
#各 #+%
!
H!模板 $
!
H!EEQ
"
Y&
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H!共 "#
!
H) 反应条件$*) f预变性 % 027%*) f
$ 027!%- f ,# K!" f $ 027!,# 个循环%" f延伸
027%) f保存) ,&!-./+ 基因半定量引物 ,&!-0
./+(?$ 和 ,&!-./+(N$!内参基因 ,DK4:Q 引物 ,D0
K4:Q(?$ 和,DK4:Q(N"!引物序列见表 $)
9>?:!"#$%& 基因的克隆和表达载体构建
根据J.ON网站提供的序列设计 ,&!-./+ 编码
区正反向引物 ,&!-./+(?",,&!-./+(N" 和启动子
正反向引物序列 W,&!-./+(?$,W,&!-./+(N$!引物
序列见表 $) 引物序列中的下划线部分为 1FL接头
序列!用于之后的 M1F
编码序列和启动子序列) P`N反应体系$酶 "%
!
H!
正反向引物"$#
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#各 $
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H) 反应条件$*& f预变性 ,#
K%*& f $# K!%% f $% K!-& f $ 027!% 个循环%*& f
$# K!-& f $ 027!,# 个循环%" f延伸 027%) f
保存) 利用胶回收纯化的 P`N产物与 W Y^]N"""e$
质粒进行 L` 反应!获得入门载体) 通过测序确定序
列正确后利用 HN反应将它们分别亚克隆到 WZ(
P^," 和 WZ^ P$-) 载体中获得过表达载体 GMOI$$
,&!-./+ 和BCD表达载体 W,&!-./+$$;
引物 引物序列"%i(,i#
,&!-./+(?$ ...P..B...BBBJJ..B.JBPJP
,&!-./+(N$ PJ.B.J.P.B..P..B.PJPPP....
,DK4:Q(?$ BPPPJPBJJJBJBBB..JBB
,DK4:Q(N" ..BPPJJJB.JPJJB.B.BP
,&!-./+(?" BBBB.P..PJJJBJ.P......BJJBB..JB..JPJPB.JJJJB.JB.PJPJ..B
,&!-./+(N" BPBBPPBP.P..PJJJBJ.P..B...BJJBBBJ.JJ...J.B.BB.P..B.P..B.JJBJP.B
W,&!-./+(?$ BBBB.P..PJJJBJ.P......BJJBB.JBPJBJPJJJP..BPPJ.JPBJ
W,&!-./+(N$ BBPBBPPBP.P..PJJJBJ.P..B...BJJBBBJ.PJJJJJP...JBP...JP.PP.P
9+@:转化与检测
参考徐芳等*$"+和 P3:6M; 等*$,+的方法!用电击
法将含有目的基因的植物表达载体质粒转入农杆菌
;LM+S+!并利用花粉管导入法转化野生型拟南芥)
将J
$
代种子在含有潮霉素""% 0M-0H[$ #的 $b"
ZD培养基上进行抗性筛选!" 周后挑选阳性植株种
植!并提取植株基因组 ]^.进行 P`N验证) 以筛
选的阳性转基因植株的 9^].为模板!通过半定量
NJ(`PN检测阳性植株中 ,&!-./+ 的表达量!反应
体系和反应条件同 $+))
9>A:3BC组织化学染色
参考 P<99;
冲液浸洗 , 次) 倒去洗涤缓冲液后加入适量的BCD
染色液!真空抽气 , 次!在 , f条件下染色过夜!第
" 天用酒精梯度去除叶绿素!最后在体视镜下观察
染色情况)
"!结果与分析
;>9:拟南芥!"#$%& 基因表达的组织特异性
利用半定量 NJ(`PN对拟南芥根,茎,嫩叶,茎
顶端分生组织,花和果荚中的 ,&!-./+ 进行组织表
达定量分析) 分析结果表明$,&!-./+ 主要在茎顶
端分生组织表达!在其它器官组织中检测不到"图
$.#) 这与网络预测的该基因表达模式相同 "图
$L#!进一步验证了 ,&!-./+ 基因的表达具有组织
特异性)
;>;:拟南芥!"#$%& 基因的表达量在不同生长时
间的动态变化
!!选取,&!-./+ 基因上游 "+$4@ ]^.序列作为
启动子区域!构建 W,&!-./+$$BCD 的表达载体!获
,
林!业!科!学!研!究 第 "& 卷
得转基因植株) 分别取 $ 周!" 周和 , 周的转基因植
株进行 BCD 染色!检测 BCD 活性) 结果显示$在 $
周时!基因在茎顶端和下胚轴区域高丰度表达"图
".#%在 " , 周时!在下胚轴区域表达量明显减少!
基因的表达主要集中在茎顶端区域"图 "L P#!说
明,&!-./+ 的表达具有一定的时空性)
.+半定量NJ(`PN分析显示 ,&!-./+ 基因在不同组织中的表达
情况% L+基于基因芯片数据库的网络预测显示 ,&!-./+ 基因在
不同组织中的相对表达情况%$+根% "+茎% ,+嫩叶% )+茎顶端分
生组织% %+花% -+果荚
图 $!拟南芥,&!-./+ 基因的组织表达分析
.+$ 周时的BCD染色% L+" 周时的BCD染色%
P+, 周时的BCD染色
图 "!BCD染色组织定位
;><:拟南芥过表达!"#$%& 转基因植株的生长
选取拟南芥过表达 ,&!-./+ 植株的 , 个 J, 代
纯合株系和野生型植株进行表型观察) " 周时!野
生型植株出现 " ) 片真叶!过表达植株幼苗真叶
尚未发育!且过表达植株的根系较野生型发育缓慢
"图 ,.#%) 周时!观察到转基因植株出现 " 个明显
的顶芽"图 ,L#%- 周时!抽薹后转基因植株的 " 个
顶芽分别形成 " 个花茎!转基因拟南芥幼苗高较野
生型明显矮"图 ,P#%株系 $ 和株系 " 的抽薹时间都
比野生型的晚 , ) E!株系 , 与野生型相差较小
"图 ,/#%株系 $,株系 " 和株系 , 中 ,&!-./+ 的表
达量均高于野生型!株系 $ 和株系 " 中 ,&!-./+ 的
表达量高于株系 ,!可见过表达株系中 ,&!-./+ 的
表达量越高!植株表型越明显"图 , ,^/#)
. P为分别为 ",),- 周过表达拟南芥与野生型幼苗的对比%
^为过表达植株中 ,&!-./+ 基因的表达量分析% /为抽薹时间
比较
图 ,!拟南芥,&!-./+ 过表达植株与野生型植株"UJ#
生长的比较
;>=:拟南芥过表达!"#$%&+ 转基因植株的莲座叶
拟南芥过表达植株在生长过程中出现 " 个顶
芽!在 " 个顶芽周围形成了各自的莲座叶!并最终发
育成 " 个不同的花茎) 为了分析叶片的形态和数量
变化!实验选取J, 代纯合株系 $!在 ) 周时进行叶片
分析) 过表达植株莲座叶的面积明显比野生型小
"图 ).#!但是莲座叶的数量比野生型多 $# 片左右
"图 )P#%过表达植株中出现变态叶!部分叶片下部
出现融合现象"图 )L#!这种叶片主要发生在 " 个顶
芽之间的部位)
;+?:拟南芥过表达转基因植株的矮化
对J, 代纯合株系在不同时期的株高进行统计)
对于多顶端的植株!以最高茎的高度为准) 统计发
现$过表达植株株高生长趋势与野生型相同!但是比
野生型发育晚%在植株的整个生命周期中!转基因植
株的高度均比野生型矮"图 %#)
)
第 $ 期 李建波等$拟南芥,&!-./+ 在植物顶端生长调节中的作用
.+过表达,&!-./+ 植株莲座叶片与野生型莲座叶片的对比% L+过表达,&!-./+ 植株变态叶% P+莲座叶数目统计
图 )!拟南芥,&!-./+ 过表达植株与野生型植株"UJ#莲座叶的比较
;>@:拟南芥!"#$%& 共表达基因
通过拟南芥基因共表达数据库分析,&!-./+ 的
共表达基因"1F
"图 -,表 "#!其中!直接共表达基因有 , 个!分别为
,&UAMOPSS"相关性 #+%&#,,&UAM+V+O"相关性 #+-$#
和,&MAOWRRS"相关性 #+-"#) ,&UAMOPSS 编码.FLj(
O`$)b?^ 蛋白!主要参与开花调控) ?^ 通过与 ?J
相互作用!正向调节植物的开花) ,&UAM+V+O 是一个
功能未知的转录激活因子!属于 L, 蛋白家族) 与
,&!-./+ 基因相似!,&UAM+V+O 也是主要在顶端分生
图 %!拟南芥,&!-./+ 过表达植株与野生型植株"UJ#
株高随生长时间的变化
图 -!拟南芥,&!-./+ 基因共表达网络
%
林!业!科!学!研!究 第 "& 卷
组织表达%而 ,&MAOWRRS 则编码一个功能完全未知
蛋白!也主要在顶端分生组织表达) 间接共表达基
因共 $ 个!其中!包括H4:V 等生长素转运蛋白编码
基因!以及 D
等相关的基因)
表 ;:拟南芥!"#$%& 共表达基因相关信息
基因号 共表达关系相关系数 相关信息
,&MAOWRRS 直接 #+-" 未知蛋白
,&UAM+V+O 直接 #+-$ L, 家族转录因子
,&UAMOPSS 直接 #+%& @jO`家族转录因子"开花调控#
,&OAV+WOS 间接 #+-$
YIW;17家族转录因子"花分生组
织特征基因#
,&+ARVUQS 间接 #+-# PCP,"调控顶端分生组织的形成#
,&UAMQOUS 间接 #+%& aCP$"参与生长素的合成#
,&OAVVPUS 间接 #+%& P"P"(^:>家族转录因子
,&+AVUQVS 间接 #+%) Z6 N^家族转座酶
,&MA+O+RS 间接 #+%) PCP$"调控顶端分生组织形成和
植物激素介导的侧根的形成#
,&+AM+M+S 间接 #+%) 富含羟脯氨酸的糖蛋白家族蛋白
,&+A+UVWR 间接 #+%, .FQL,""同源框蛋白 ,"#
,&OAS+VVS 间接 #+%, O7F
,&QA+RRRS 间接 #+%# @jO`家族转录因子
,&+ARR++S 间接 #+%# O`]-"生长素外向转运蛋白#
,&+AMSPOS 间接 #+)* C?Y"识别花分生组织#
,&QA+WOSS 间接 #+)" Y?` "卵形家族蛋白#
,&OAOWQWS 间接 #+)$ L, 家族转录因子
,&OAO+WRS 间接 #+)# Z.^ D家族转录因子
,&OASM+OS 间接 #+" P"Q" 家族转录因子
,!结论与讨论
实验表明$,&!-./+ 过表达植株呈现多顶芽表
型!说明顶端 D.Z的正常形成和分化出现问题)
,&!-./+ 编码蛋白含有类似于 ?(@:A的结构域*$%+ !
拟南芥中已经确定编码 ?(@:A结构域的基因有 -*)
个*$-+ ) 其中!最典型的是生长素运输抑制剂响应蛋
白JON$ 及相关 ?(@:A蛋白*$+ ) JON$ 蛋白通过 ?(
@:A结构域与 DP?"D4W$(N@A$(P63$(?(@:AWI:F<27#泛
素连接酶的其它组分结合) 在生长素的信号转导途
径中!DP?JON$复合物被生长素调控与其底物生长素
效应蛋白.6AbO..的结合!加速 .6AbO..泛素化使
其降解!从而启动下游基因的转录*$&+ ) 对于编码有
类似于?(@:A的结构域的.F?L^ H$ 蛋白可能通过类
似于 DP?JON$的信号转导过程!对生长素起调控作用!
在.F?L^ H$ 蛋白过表达时!造成顶端生长素信号的
紊乱!影响植物顶端的生长) 同时!在生长素运输过
程中!外向转运蛋白 O`]K通过极性运输生长素!使
生长素在不同组织和细胞中形成浓度梯度!进而在
器官的发生和建成中发挥重要作用) 共表达结果显
示$,&!-./+ 与H4:V 存在共表达关系) 现阶段对于
H4:V 的具体功能还不清楚!但组织表达分析结果表
明!H4:V 主要在顶端分生组织,原分生组织及茎中
表达*$*+ ) 可以推测含有类似于?(@:A结构域的,&!0
-./+ 编码蛋白可能参与到了生长素转运蛋白 O`]-
对生长素在顶端分生组织中的运输!当 ,&!-./+ 过
表达时会造成生长素浓度的不正常极性分布!形成
了多个顶芽的现象)
在网络预测的共表达基因中!主要发现两类具
有典型顶端分生组织调节功能的基因) 一类是在茎
顶端分生组织中调节叶片发育的 D
,I>BBEK4D/E,LEIQ",IQ#!在 D.Z的形成过程
中发挥作用**+ ) 其中!IKB能够抑制干细胞的分化!
过表达时植株出现不正常发育的变态叶*"#+ ) ,I+
和 ,IQ 基因在叶片形态的极性调控中起着重要作
用!影响叶片近轴和远轴面极性的形成!而且 IKB,
,I+ 和,IQ 基因的非正常表达都会引起顶端的异常
变化*"$+ ) 另一类是顶端分生组织中调节花器官发
育的基因!如 /!>和!/JNE.ELE/JHBE:K"!.#
等基因) /!>属于花分生组织特征基因!在较早的
花分生组织原基,营养生长阶段和抽薹前叶原基中
都有表达!能促进植物从营养生长向生殖生长的转
变*$#+ ) !.基因编码一种 @jO`转录因子!在调节开
花过程中起重要作用!TF 突变体能推迟开花*""+ )
/!>和!.都能延长营养生长,推迟植物开花并使植
物生长变缓慢*",+ ) 这两类基因分别通过调控不同
的顶端器官原基"包括叶原基和花原基#的分化和
发育来调节植物顶端的生长!然而 ,&!-./+ 则与这
两类基因都共表达!说明 ,&!-./+ 可能同时参与了
这 Q 个过程!处于一个更为关键或者更为上游的位
置) 这两类基因在异常表达时产生的表型与本实验
中,&!-./+ 过表达所产生的表型具有相似之处!进
一步说明可能存在这种关系%但是!它们之间具体的
相互作用关系和调控机制还有待进一步研究)
从上述分析中可以推测,&!-./+ 参与了生长素
信号的转导!并可能与一些具有典型顶端分生组织
调节功能的基因共同作用!最终影响植物顶端的形
成与分化!对植株的生长发育起着重要作用) 因此!
对该基因在顶端分生组织发育调控中的功能和作用
机理的进一步研究!将为寻找调节茎顶端分生组织
-
第 $ 期 李建波等$拟南芥,&!-./+ 在植物顶端生长调节中的作用
分化的基因和培育优良速生树种打下坚实的基础)
参考文献!
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国蔬菜! "##%!$",#$"* [,$+
*$,+ P3:6M; D k!L<7F.?+?3:I13E2W$1K20W32>2
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