全 文 ：书草坪害虫华北大黑鳃金龟幼虫围食膜蛋白
犎狅犘犲狉犻狋狉狅狆犺犻狀３基因克隆及序列分析
周洪旭，李长友，李国勋
（青岛农业大学无脊椎动物细胞培养和细胞工程中心，山东 青岛２６６１０９）
摘要：华北大黑鳃金龟是一种重要的草坪害虫，其幼虫中肠围食膜是害虫生物防治的潜在靶标。本研究利用棉铃
虫围食膜蛋白多克隆抗体，从已构建的华北大黑鳃金龟中肠ｃＤＮＡ表达文库中筛选得到一个编码围食膜蛋白的
ｃＤＮＡ克隆 ＨｏＰｅｒｉｔｒｏｐｈｉｎ３，其ｃＤＮＡ长度为１７３７ｂｐ，在ｐｏｌｙＡ末端上游含有１个多聚腺苷酸信号序列ＡＡＴＡ
ＡＡ，最长开放阅读框（ＯＲＦ）编码５２８个氨基酸，与华北大黑鳃金龟围食膜蛋白 ＨｏＰｅｒｉｔｒｏｐｈｉｎ２的相似性最高，为
６４．９％。结构域分析表明，ＨｏＰｅｒｉｔｒｏｐｈｉｎ３只含有较少的 Ｏ糖基化位点和 Ｎ糖基化位点，不含有类粘蛋白结构
域，具有５个几丁质结合功能域（ｃｈｉｔｉｎｂｉｎｄｉｎｇｄｏｍａｉｎ，ＣＢＤ），它们均由６个保守的半胱氨酸残基组成，与ＨｏＰｅｒ
ｉｔｒｏｐｈｉｎ１、ＨｏＰｅｒｉｔｒｏｐｈｉｎ２羧基端的ＣＢＤ只含有４个半胱氨酸残基明显不同。ＨｏＰｅｒｉｔｒｏｐｈｉｎ３的胰蛋白酶和胰凝
乳蛋白酶的作用位点主要位于５个ＣＢＤ内部，受到其保护，不会被降解；与 ＨｏＰｅｒｉｔｒｏｐｈｉｎ１、ＨｏＰｅｒｉｔｒｏｐｈｉｎ２不同
的是在第５个ＣＢＤ下游区域的１０７个氨基酸中，有３６．３％的氨基酸属于胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶的酶切位点。
关键词：草坪害虫；华北大黑鳃金龟；围食膜蛋白；免疫筛选；序列分析
中图分类号：Ｓ４３５．４；Ｓ４３６．６３４．２＋３　　文献标识码：Ａ　　文章编号：１００４５７５９（２０１０）０６０１４７０７
　 蛴螬是金龟总科（Ｓｃａｒａｂａｅｏｉｄｅａ）幼虫的总称，是鞘翅目昆虫中庞大的类群之一，也是农林业生产的大敌，其
危害已居各类地下害虫之首，占地下害虫总虫量的８０％以上［１，２］，严重危害草坪、林木、花生、甘薯等植物，造成大
面积减产。近年来，蛴螬对草坪的危害日趋严重，取食量大，暴发性强，使草坪失绿、萎蔫，大面积出现斑秃，较严
重的则成片死亡，由此造成超过６０％的草坪被毁，严重影响草坪的观赏价值和使用价值［３，４］。此外，全国各地迅
速发展的草坪、高尔夫球场等环境，蛴螬发生严重，也给农田、林业提供了大量虫源［５］。因此，草坪蛴螬成为危害
农林草业的重要害虫，防治草坪蛴螬是当前草坪业生产中的首要任务。华北大黑鳃金龟（犎狅犾狅狋狉犻犮犺犻犪狅犫犾犻狋犪）是
金龟子总科中的重要类群，是危害草坪的蛴螬优势种［６］，它们在土中取食草根的同时，也把周围的土壤颗粒、病原
微生物等一同带入消化道中，因此其围食膜（ｐｅｒｉｔｒｏｐｈｉｃｍｅｍｂｒａｎｅ，ＰＭ）韧性较差，易破碎，是一类独特的ＰＭ，
其对蛴螬的生长发育具有重要的作用［７］。
ＰＭ是位于昆虫中肠内壁包裹食物的一层厚薄均匀的长管状薄膜，它具有保护中肠上皮细胞、阻止有害物质
侵入和帮助消化等多种功能［８１０］，根据其成因分为Ⅰ型围食膜和Ⅱ型围食膜，前者为多层管状膜，由中肠细胞分
泌形成；后者呈连续的套筒管状，由中肠前端贲门中高度特化的细胞连续分泌产生，Ⅱ型围食膜较Ⅰ型结构更复
杂［１１，１２］。围食膜主要由蛋白质、糖和几丁质组成，ＰＭ 蛋白有众多几丁质结合功能域（ｃｈｉｔｉｎｂｉｎｄｉｎｇｄｏｍａｉｎ，
ＣＢＤ），与几丁质以共价或非共价键形式结合成致密的网状结构［１３］，迄今为止，已经有２０多种ＰＭ 蛋白被发
现［１４１８］，可以分为三大类，第１类既含有多几丁质结合功能域，也含有粘蛋白结构域（ｍｕｃｉｎｄｏｍａｉｎ）；第２类只含
有多几丁质结合功能域；第３类具有与几丁质脱乙酰酶相似的功能域（ｃｈｉｔｉｎｄｅａｃｅｔｙｌａｓｅｌｉｋｅｄｏｍａｉｎ）［１９］。它们
具有不同的几丁质结合活性，对于保护ＰＭ、防止病原物侵入中肠、促进昆虫消化食物并维持ＰＭ 结构具有重要
作用，因此ＰＭ成为害虫生物防治的潜在新靶标［１３，２０］。
以往研究主要集中在对鳞翅目、双翅目、直翅目、蜚蠊目等昆虫的ＰＭ 蛋白进行分离鉴定，周洪旭等［１９］以鞘
第１９卷　第６期
Ｖｏｌ．１９，Ｎｏ．６
草　业　学　报
ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ 　　
１４７－１５３
２０１０年１２月
 收稿日期：２０１００１０６；改回日期：２０１００３０９
基金项目：国家９７３项目（２００９ＣＢ１１８９０２），山东省自然科学基金项目（Ｙ２００７Ｄ６９）和青岛农业大学高层次人才基金资助。
作者简介：周洪旭（１９６８），男，山东莱阳人，副教授，博士。Ｅｍａｉｌ：ｈｘｚｈｏｕ＠ｑａｕ．ｅｄｕ．ｃｎ
通讯作者。Ｅｍａｉｌ：ｇｘｌｉ＠ｑａｕ．ｅｄｕ．ｃｎ
翅目昆虫－华北大黑鳃金龟为对象，首次克隆了 ＨｏＰｅｒｉｔｒｏｐｈｉｎ１与 ＨｏＰｅｒｉｔｒｏｐｈｉｎ２两种围食膜蛋白基因。本
研究以已构建的华北大黑鳃金龟中肠ｃＤＮＡ表达文库为基础，通过免疫筛选又分离得到了 ＨｏＰｅｒｉｔｒｏｐｈｉｎ３围
食膜蛋白基因，其具有一些新的特点，对完善昆虫ＰＭ 理论和研制以蛴螬ＰＭ蛋白为靶标的新型生物杀虫剂具有
重要意义。
１　材料与方法
１．１　试剂及培养基
棉铃虫ＰＭ蛋白多克隆抗体，由本实验室自行制备；ａｎｔｉｒａｂｂｉｔＩｇＧ（偶联碱性磷酸酶的羊抗兔抗体，Ｓｉｇｍａ）
购自博士德生物工程有限公司。
华北大黑鳃金龟中肠ｃＤＮＡ表达文库由本实验室制备［１９］。
培养基：ＬＢ液体培养基，ＬＢ固体培养基，ＮＺＹ液体培养基，ＮＺＹ固体培养基，ＮＺＹ上层固体培养基，ＬＢ添
加因子培养基，参见ＺＡＰｃＤＮＡ? Ｇｉｇａｐａｃｋ?ＩＩＩＧｏｌｄ克隆试剂盒说明书。
１．２　ｃＤＮＡ文库的筛选
参照狆犻犮狅ＢｌｕｅＴＭ免疫筛选试剂盒（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，ＬａＪｏｌａ，ＣＡ）操作手册，２００８年４月用棉铃虫ＰＭ蛋白多克
隆抗体从ｃＤＮＡ表达文库中筛选ＰＭ 蛋白基因ｃＤＮＡ克隆。第１轮和第２轮筛选后得到阳性噬菌斑，依据
ＺＡＰｃＤＮＡＧｉｇａｐａｃｋ克隆试剂盒操作步骤，应用帮助噬菌体（ＥｘＡｓｓｉｓｔ?ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅｒｅｓｉｓｔａｎｔｈｅｌｐｅｒｐｈａｇｅ）将
噬粒载体［ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ?ＳＫ（－）ｐｈａｇｅｍｉｄ］切除。
１．３　ＤＮＡ的测序及序列分析
将筛选得到的ｃＤＮＡ阳性克隆按碱解法提取质粒，用限制性内切酶犡犺狅Ｉ／犈犮狅ＲＩ进行切割，鉴定插入片段的
大小，并进行限制性酶切分析，选取酶切产物不同的克隆由上海生工进行Ｔ３和Ｔ７引物双向测序［２１］，重复３次。
使用ＤＮＡＭＡＮ软件包和ＢＬＡＳＴ数据库搜索程序进行ＤＮＡ和氨基酸序列分析，进化树构建和数据库搜索。
结构域分析使用ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ／ｐｒｏｓｉｔｅ／［２２］，糖基化位点预测使用ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／ｓｅｒｖ
ｉｃｅｓ／ＮｅｔＮＧｌｙｃ１．０／；ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ＮｅｔＯＧｌｙｃ３．１／。
２　结果与分析
２．１　编码华北大黑鳃金龟ＰＭ蛋白ＨｏＰｅｒｉｔｒｏｐｈｉｎ３的ｃＤＮＡ序列分析
利用棉铃虫ＰＭ蛋白多克隆抗体，筛选华北大黑鳃金龟中肠ｃＤＮＡ表达文库，将测序后的序列通过ＢＬＡＳＴ
（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｂａｌｓｔ）进行相似性分析。筛选得到 ＨｏＩ６９克隆，命名为 ＨｏＰｅｒｉｔｒｏｐｈｉｎ３，插
入片断为１７３７个碱基，含终止密码子ＴＡＧ，在ｐｏｌｙＡ末端上游１８ｂｐ处有一个多聚腺苷酸信号序列ＡＡＴＡ
ＡＡ，这与粉纹夜蛾（犜狉犻犮犺狅狆犾狌狊犻犪狀犻）围食膜蛋白ＴｎｉＩＩＭ２２的多聚腺苷酸信号序列相同［２３］。ＨｏＰｅｒｉｔｒｏｐｈｉｎ３最
长读码框（ＯＲＦ）编码５２８个氨基酸，在所有已发现的围食膜蛋白中与华北大黑鳃金龟围食膜蛋白 ＨｏＰｅｒｉｔｒｏ
ｐｈｉｎ２的相似性最高，为６４．９％，其次，与 ＨｏＰｅｒｉｔｒｏｐｈｉｎ１的相似性为５７．５％，命名为 ＨｏＰｅｒｉｔｒｏｐｈｉｎ３，其核酸
序列在ＧｅｎＢａｎｋ登录号为ＦＪ３９３５５０；结构域分析（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ／ｐｒｏｓｉｔｅ／）表明 ＨｏＰｅｒｉｔｒｏｐｈｉｎ３具
有５个几丁质结合功能域（ＣＢＤ），分别由２２或２４个氨基酸组成的间隔区（ｓｐａｃｅｒ）分开，５′端未发现信号肽
（图１）。
２．２　糖基化位点及其几丁质结合功能域分析
应用在线软件对糖基化位点分析表明，ＨｏＰｅｒｉｔｒｏｐｈｉｎ３在Ａｓｎ６、Ａｓｎ１６９、Ａｓｎ３３２和Ａｓｎ４７６各有１个Ｎ联糖基
化位点，其中前３个Ｎ联糖基化位点识别序列为ＮＧＳ，第４个Ｎ联糖基化位点识别序列为ＮＨＴ；ＨｏＰｅｒｉｔｒｏ
ｐｈｉｎ３在第１个ＣＢＤ与第２个ＣＢＤ之间的间隔区序列Ｔｈｒ８４处，第３个ＣＢＤ与第４个ＣＢＤ之间的间隔区序列
Ｔｈｒ２４７处，第５个ＣＢＤ下游Ｔｈｒ４４１处各有１个Ｏ联糖基化位点（图１）。
在ＨｏＰｅｒｉｔｒｏｐｈｉｎ３的１～５个ＣＢＤ中（图２），每个ＣＢＤ长５７～６０个氨基酸，且含有６个保守的半胱氨酸残
基，其序列可以用通式ＣＸ１３，１６ＣＸ５ＣＸ９ＣＸ１２ＣＸ７Ｃ表示，按照Ｓｈｅｎ和ＪａｃｏｂｓＬｏｒｅｎａ［２４］的预测模型，在１与３，２
与６，４与５之间的半胱氨酸残基分别形成３个二硫键，以维持围食膜蛋白的稳定性。
８４１ ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ（２０１０） Ｖｏｌ．１９，Ｎｏ．６
图１　编码犎狅犘犲狉犻狋狉狅狆犺犻狀３蛋白的犮犇犖犃核苷酸序列及其推导的氨基酸序列
犉犻犵．１　犖狌犮犾犲狅狋犻犱犲狊犲狇狌犲狀犮犲狅犳狋犺犲犮犇犖犃犳狅狉犎狅狆犲狉犻狋狉狅狆犺犻狀３犪狀犱犻狋狊犱犲犱狌犮犲犱犪犿犻狀狅犪犮犻犱狊犲狇狌犲狀犮犲
　ＧｅｎＢａｎｋＴＭ登录号为ＦＪ３９３５５０，多聚腺苷信号序列在内显示；终止密码子在□内显示；几丁质结合功能域为下划线所示；二硫键示灰色背景；
Ｎ糖基化位点用双方框表示；Ｏ糖基化位点用波浪线表示ＧｅｎＢａｎｋＴＭａｃｃｅｓｓｉｏｎｎｕｍｂｅｒＦＪ３９３５５０；Ｔｈｅｐｏｔｅｎｔｉａｌｐｏｌｙｄｅｎｙｌａｔｉｏｎｓｉｇｎａｌｓｅｑｕｅｎｃｅｉｓ
ｉｎｄｉｃａｔｅｄｉｎ；Ｔｈｅｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎｓｔｏｐｃｏｄｏｎｉｓｉｎｄｉｃａｔｅｄｉｎ□；Ｔｈｅｃｈｉｔｉｎｂｉｎｄｉｎｇｄｏｍａｉｎｓａｒｅｕｎｄｅｒｌｉｎｅｄ；Ｄｉｓｕｌｐｈｉｄｅｂｏｎｄｓｒｅｇｉｏｎｓｗｉｔｈｉｎｔｈｅｃｈｉ
ｔｉｎｂｉｎｄｉｎｇｄｏｍａｉｎｓａｒｅｐｒｅｓｅｎｔｅｄａｓｇｒａｙｂａｃｋｇｒｏｕｎｄ；ＡｐｕｔａｔｉｖｅＮｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎｓｉｔｅｉｓｉｎｄｉｃａｔｅｄｉｎｄｏｕｂｌｅｂｏｘｅｓａｎｄａｐｕｔａｔｉｖｅＯｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎｓｉｔｅ
ｉｓｉｎｄｉｃａｔｅｄｉｎｄｉｃａｔｅｄｂｙｗａｖｅｌｉｎｅ
２．３　酶切位点分析
应用ＤＮＡＳＴＡＲ软件对ＨｏＰｅｒｉｔｒｏｐｈｉｎ３的酶切位点分析发现，胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶的作用位点主要
位于ＣＢＤ内部和第５个ＣＢＤ的下游区域（图３），其ＣＢＤ的间隔区很少含有带电氨基酸（精氨酸和赖氨酸）和极
性氨基酸（组氨酸，亮氨酸，蛋氨酸，苯丙氨酸，色氨酸和酪氨酸），只是在 ＨｏＰｅｒｉｔｒｏｐｈｉｎ３的ｓｐａｃｅｒ２、ｓｐａｃｅｒ４、
ｓｐａｃｅｒ６的第１位氨基酸为酪氨酸，ｓｐａｃｅｒ６第２２位氨基酸为精氨酸，这些带电氨基酸和极性氨基酸都是胰蛋白
酶和胰凝乳蛋白酶的作用位点，因此，在ＣＢＤ内部虽然有胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶的作用位点，但这些酶切位点
被几丁质结合功能域包围，而免受中肠蛋白酶的降解，这对于ＰＭ蛋白在富含蛋白酶的中肠环境中发挥其功能是
非常重要的。而在第５个ＣＢＤ的下游１０７个氨基酸中，精氨酸１个、赖氨酸５个、组氨酸４个、亮氨酸９个、蛋氨
酸１个、苯丙氨酸８个、色氨酸２个、酪氨酸６个，因此，属于胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶作用位点的氨基酸共３６
个，占第５个ＣＢＤ下游区域的３６．３％，因此，在该段区域富含大量的胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶的酶切位点，而
ＨｏＰｅｒｉｔｒｏｐｈｉｎ３在富含蛋白酶的中肠环境中能够存在并发挥生理功能，推测在第５个ＣＢＤ的下游可能包含其
他的特殊结构起保护作用或者在空间折叠时这些胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶的作用位点被某种结构所保护，这有
待于进一步研究。
２．４　ＨｏＰｅｒｉｔｒｏｐｈｉｎ３与已知围食膜蛋白的聚类分析
ＨｏＰｅｒｉｔｒｏｐｈｉｎ３与几种ＰＭ蛋白的聚类分析结果表明（图４），１３种围食膜蛋白可以聚为３类：一类是粉纹
９４１第１９卷第６期 草业学报２０１０年
图２　华北大黑鳃金龟３种围食膜蛋白犆犅犇间的保守性分析
犉犻犵．２　犆狅狀狊犲狉狏犪狋犻狅狀犪狀犪犾狔狊犻狊狅犳犆犅犇狊犻狀犘犕狆狉狅狋犲犻狀狊狅犳犎．狅犫犾犻狋犪
图３　犎狅犘犲狉犻狋狉狅狆犺犻狀３的犆犅犇狊及胰凝乳蛋白酶和胰蛋白酶的作用位点
犉犻犵．３　犛犮犺犲犿犪狋犻犮狊狋狉狌犮狋狌狉犲狊狅犳狋犺犲犆犅犇狊犪狀犱犮犾犲犪狏犪犵犲狊犻狋犲狊狅犳狋狉狔狆狊犻狀犪狀犱犮犺狔犿狅狋狉狔狆狊犻狀犻狀狋犺犲犎狅犘犲狉犻狋狉狅狆犺犻狀３狆狉狅狋犲犻狀狊
　用ＤＮＡＳＴＡＲ分析胰凝乳蛋白酶和胰蛋白酶的作用位点，胰蛋白酶的作用位点主要是Ｒ∧Ｘ和Ｋ∧Ｘ，不包括Ｒ∧Ｐ和Ｋ∧Ｐ，∧指酶的作用位点，Ｘ
指氨基酸残基；胰凝乳蛋白酶的作用位点主要是 Ｗ∧Ｘ、Ｆ∧Ｘ、Ｙ∧Ｘ、Ｍ∧Ｘ、Ｌ∧Ｘ和 Ｈ∧Ｘ，不包括Ｙ∧ＰＴｈｅｔｒｙｐｓｉｎａｎｄｃｈｙｍｏｔｒｙｐｓｉｎｃｌｅａｖａｇｅｓｉｔｅｓ
ｗｅｒｅｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄｕｓｉｎｇｔｈｅｓｅｑｕｅｎｃｅａｎａｌｙｓｉｓｓｏｆｔｗａｒｅＤＮＡＳｔａｒ．ＴｈｅｔｒｙｐｓｉｎｃｌｅａｖａｇｅｓｉｔｅｓｗｅｒｅｄｅｆｉｎｅｄａｓＲ∧ＸａｎｄＫ∧Ｘ，ｅｘｃｌｕｄｉｎｇＲ∧ＰａｎｄＫ∧Ｐ
（∧ｉｎｄｉｃａｔｅｓｃｌｅａｖａｇｅｓｉｔｅｓ；Ｘｉｎｄｉｃａｔｅｓａｎｙａｍｉｎｏａｃｉｄｒｅｓｉｄｕｅｓ）．ＴｈｅｃｈｙｍｏｔｒｙｐｓｉｎｃｌｅａｖａｇｅｓｉｔｅｓｗｅｒｅｄｅｆｉｎｅｄａｓＷ∧Ｘ，Ｆ∧Ｘ，Ｙ∧Ｘ，Ｍ∧Ｘ，Ｌ∧Ｘ
ａｎｄＨ∧Ｘ，ｅｘｃｌｕｄｉｎｇＹ∧Ｐ
夜蛾（ＴｎＩＩＭ２２、ＴｎＩＩＭ１４）、蓓带夜蛾（犕犪犿犲狊狋狉犪犮狅狀犳犻犵狌狉犪狋犪）（ＭｃＭＵＣＩＮ）和甜菜夜蛾（犛狆狅犱狅狆狋犲狉犪犲狓犻犵狌犪）
（ＳｅＩＩＭ８、ＳｅＭＵＣＩＮ）３种鳞翅目的５种粘蛋白，相似性高，聚类在一起，它们既含有粘蛋白功能域，又含有几丁
质结合功能域；另一类是华北大黑鳃金龟围食膜蛋白（ＨｏＰｅｒｉｔｒｏｐｈｉｎ１、ＨｏＰｅｒｉｔｒｏｐｈｉｎ２和 ＨｏＰｅｒｉｔｒｏｐｈｉｎ３）以
及蓓带夜蛾围食膜蛋白（ＭｃＰ１）、粉纹夜蛾几丁质结合蛋白（ＴｎＣＢＰ１、ＴｎＣＢＰ２）和草地贪夜蛾（犛狆狅犱狅狆狋犲狉犪犳狉狌
犵犻狆犲狉犱犪）围食膜蛋白（ＳｆＰ１）７种ＰＭ 蛋白，它们只含有多几丁质结合功能域，没有粘蛋白结合功能域；粉纹夜蛾
Ｐ４２蛋白（ＴｎＰＭＰ４２）单独划为第３类，它含有与几丁质脱乙酰酶相似的功能域。图中也表明，ＨｏＰｅｒｉｔｒｏ
ｐｈｉｎ１、ＨｏＰｅｒｉｔｒｏｐｈｉｎ２、ＨｏＰｅｒｉｔｒｏｐｈｉｎ３均为华北大黑鳃金龟的围食膜蛋白，相似性最高，其中 ＨｏＰｅｒｉｔｒｏ
ｐｈｉｎ１、ＨｏＰｅｒｉｔｒｏｐｈｉｎ２聚类在一起后，再与 ＨｏＰｅｒｉｔｒｏｐｈｉｎ３聚类在一起，这是因为 ＨｏＰｅｒｉｔｒｏｐｈｉｎ１、ＨｏＰｅｒ
ｉｔｒｏｐｈｉｎ２的Ｃ端几丁质结合功能域均含有４个半胱氨酸残基，而 ＨｏＰｅｒｉｔｒｏｐｈｉｎ３的Ｃ端的几丁质结合功能域
０５１ ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ（２０１０） Ｖｏｌ．１９，Ｎｏ．６
含有６个半胱氨酸残基。
图４　犎狅犘犲狉犻狋狉狅狆犺犻狀３与几种主要犘犕蛋白的聚类分析
犉犻犵．４　犆犾狌狊狋犲狉犻狀犵犪狀犪犾狔狊犻狊狅犳犎狅犘犲狉犻狋狉狅狆犺犻狀３
犪狀犱狅狋犺犲狉犘犕狆狉狅狋犲犻狀狊
３　讨论
应用在线软件Ｂｌａｓｔ比对发现，ＨｏＰｅｒｉｔｒｏｐｈｉｎ３
与华北大黑鳃金龟围食膜蛋白 ＨｏＰｅｒｉｔｒｏｐｈｉｎ２的相
似性 为 ６４．９％，与 ＨｏＰｅｒｉｔｒｏｐｈｉｎ１ 的 相 似 性 为
５７．５％，期望值Ｅ值均为０；而与草地贪夜蛾Ｐｅｒｉｔｒｏ
ｐｈｉｎ１的相似性为１８．８％，期望值Ｅ值为３×１０－２３。
本研究中 ＨｏＰｅｒｉｔｒｏｐｈｉｎ３与 ＨｏＰｅｒｉｔｒｏｐｈｉｎ２、Ｈｏ
Ｐｅｒｉｔｒｏｐｈｉｎ１的Ｅ值均为０，说明 ＨｏＰｅｒｉｔｒｏｐｈｉｎ３与
ＨｏＰｅｒｉｔｒｏｐｈｉｎ１、ＨｏＰｅｒｉｔｒｏｐｈｉｎ２的相似性很高；与
草地贪夜蛾Ｐｅｒｉｔｒｏｐｈｉｎ１的Ｅ值接近于０，而相似性
相对较低，说明ＨｏＰｅｒｉｔｒｏｐｈｉｎ３是一种新型的ＰＭ蛋
白。
糖基化对于ＰＭ蛋白在富含蛋白酶的中肠环境中
发挥生理功能具有重要作用。已发现的多种昆虫围食
膜粘蛋白高度糖基化，多聚糖侧链通过糖基化位点与
ＰＭ蛋白结合形成高度伸展缠绕结构，以保护ＰＭ 蛋
白不被中肠蛋白酶降解［２０］。ＨｏＰｅｒｉｔｒｏｐｈｉｎ３含有４
个Ｎ联糖基化位点，不像粘蛋白那样含有丰富的 Ｏ
联糖基化位点，只含有３个Ｏ联糖基化位点。分析发
现，这种含有少量糖基化位点的ＰＭ蛋白，之所以能在富含蛋白酶的中肠环境中发挥生理功能，原因可能为：胰蛋
白酶和胰凝乳蛋白酶的作用位点主要位于ＣＢＤ内部，受到其保护，ＣＢＤ的间隔区不含有或只含有少量的作用位
点，ＣＢＤ内部的二硫键使蛋白与几丁质紧密结合，减少了酶作用位点暴露于中肠蛋白酶的机会，避免了蛋白酶对
ＰＭ蛋白的降解［１７］。与 ＨｏＰｅｒｉｔｒｏｐｈｉｎ１、ＨｏＰｅｒｉｔｒｏｐｈｉｎ２、ＴｎＣＢＰ１、ＴｎＣＢＰ２不同的是，ＨｏＰｅｒｉｔｒｏｐｈｉｎ３在第５
个ＣＢＤ的下游１０７个氨基酸中，有３６．３％的氨基酸属于胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶的酶切位点。就 ＨｏＰｅｒｉｔｒｏ
ｐｈｉｎ３在富含蛋白酶的中肠环境中能够存在并发挥生理功能，应用在线软件ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ／ｐｒｏｓｉｔｅ／
与ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｂｌａｓｔ／ｃｏｎｓｅｖｅｒｄｄｏｍａｉｎｓ未发现有其他的功能域。因此缺少粘蛋白功能域
的ＨｏＰｅｒｉｔｒｏｐｈｉｎ３能够在富含蛋白酶的环境中发挥作用的重要机制，除了与蛋白酶作用位点主要位于ＣＢＤ内
部以及具有多几丁质功能域外，可能还有其他方面的原因，这有待于进一步研究。
本研究新发现的ＨｏＰｅｒｉｔｒｏｐｈｉｎ３，只含有多几丁质结合功能域，不含有粘蛋白结构域，因此，属于第２类ＰＭ
蛋白，该类围食膜蛋白的几丁质结合功能域有４种类型，第１种是ｐｅｒｉｔｒｏｐｈｉｎＡ结构域，长６０～７０个氨基酸，含
有６个保守的Ｃｙｓ，形成３个二硫键，其结构通式是ＣＸ１３２０ＣＸ５６ＣＸ９１９ＣＸ１０１４ＣＸ４１４Ｃ，如绿蝇（犔狌犮犻犾犻犪犮狌狆狉犻狀犪）
的ｐｅｒｉｔｒｏｐｈｉｎ４４和ｐｅｒｉｔｒｏｐｈｉｎ４８，含有５个连续的ｐｅｒｉｔｒｏｐｈｉｎＡ区域和２个潜在的Ｎ糖基化位点［２５，２６］；第２
种是ｐｅｒｉｔｒｏｐｈｉｎＢ结构域，每个ＣＢＤ区域含有８个保守的Ｃｙｓ，其结构通式是ＣＸ１２１３ＣＸ２０２１ＣＸ１０ＣＸ１２ＣＸ２ＣＸ８
ＣＸ７１２Ｃ，如绿蝇的ｐｅｒｉｔｒｏｐｈｉｎ３０的信号序列后连接２个ｐｅｒｉｔｒｏｐｈｉｎＢ区域，并含１个潜在的Ｎ糖基化位点［１２］；
第３种是ｐｅｒｉｔｒｏｐｈｉｎＣ结构域，结构通式是ＣＸ８９ＣＸ１７２１ＣＸ１０１１ＣＸ１２１３ＣＸ１１Ｃ，如蛆症金蝇（犆犺狉狔狊狅犿狔犪犫犲狕狕犻
犪狀犪）幼虫的ｐｅｒｉｔｒｏｐｈｉｎ１５由信号序列和１个ｐｅｒｉｔｒｏｐｈｉｎＣ区域组成，无潜在的糖基化位点，Ｃ区含６个
Ｃｙｓ［２７，２８］；第４种是粉纹夜蛾的ＣＢＰ１和ＣＢＰ２以及蓓带夜蛾 ＭｃＰＭ１的几丁质结合功能域，结构通式是ＣＸ１４１５
ＣＸ５ＣＸ９ＣＸ１２ＣＸ７Ｃ［１７，２２］。本研究发现的 ＨｏＰｅｒｉｔｒｏｐｈｉｎ３序列可以用通式ＣＸ１３，１６ＣＸ５ＣＸ９ＣＸ１２ＣＸ７Ｃ表示
（图２），这与ＨｏＰｅｒｉｔｒｏｐｈｉｎ１、ＨｏＰｅｒｉｔｒｏｐｈｉｎ２的序列通式完全相同［１７］，与ｐｅｒｉｔｒｏｐｈｉｎＡ结构域类似，与粉纹夜
蛾的ＣＢＰ１和ＣＢＰ２以及蓓带夜蛾 ＭｃＰＭ１的几丁质结合功能域几乎等同，不同之处是 ＨｏＰｅｒｉｔｒｏｐｈｉｎ３的第１
１５１第１９卷第６期 草业学报２０１０年
个与第２个半胱氨酸之间有１３或１６个氨基酸残基，而ＣＢＰ１、ＣＢＰ２以及 ＭｃＰＭ１的第１个与第２个半胱氨酸之
间有１４或１５个氨基酸残基。ＨｏＰｅｒｉｔｒｏｐｈｉｎ１、ＨｏＰｅｒｉｔｒｏｐｈｉｎ２羧基端的ＣＢＤ只含有４个Ｃｙｓ，它们只在１与
３，４与５之间的半胱氨酸残基形成２对二硫键，正好缺少了第２与第６个半胱氨酸残基之间形成的二硫键，而
ＨｏＰｅｒｉｔｒｏｐｈｉｎ３羧基端及其之前的ＣＢＤ均含有６个Ｃｙｓ，因此，在华北大黑鳃金龟ＰＭ 中同时存在羧基端的
ＣＢＤ含有４和６个Ｃｙｓ的ＰＭ蛋白，尚未知这种由６个Ｃｙｓ和４个Ｃｙｓ组成的羧基端的ＣＢＤ功能作用是否有差
异，有待于进一步研究。
本研究筛选到的ＨｏＰｅｒｉｔｒｏｐｈｉｎ３基因是一种新型围食膜蛋白基因，但没有５′端，将利用Ｃｌｏｎｔｅｃｈ公司的
ｃＤＮＡ末端快速扩增技术（ｒａｐｉｄａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｃＤＮＡｅｎｄｓ，ＲＡＣＥ），设计特异性引物，扩增其５′端基因，以期
获得其全长ｃＤＮＡ；另一方面将继续制备华北大黑鳃金龟围食膜蛋白抗体，筛选其全长ｃＤＮＡ，进行功能研究。
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狀犪ｉｓｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｄｉｎｔｈｅｃａｒｄｉａａｎｄｒｅｇｕｒｇｉｔａｔｅｄｏｒｅｘｃｒｅｔｅｄａｓａｈｉｇｈｌｙｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｐｒｏｔｅｉｎ［Ｊ］．ＩｎｓｅｃｔＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙａｎｄＭｏ
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ｔｕｒａｌｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓａｎｄｔｈｅｉｒｆｕｎｃｔｉｏｎｓｉｎｔｈｅｐｒｏｔｅａｓｅｒｉｃｈｉｎｓｅｃｔｇｕｔ［Ｊ］．ＩｎｓｅｃｔＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙａｎｄＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，２００４，
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犕犪犿犲狊狋狉犪犮狅狀犳犻犵狌狉犪狋犪ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｍｕｃｉｎａｎｄａｎｏｖｅｌｐｅｒｉｔｒｏｐｈｉｎｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ１９ｃｈｉｔｉｎｂｉｎｄｉｎｇｄｏｍａｉｎｓ［Ｊ］．ＩｎｓｅｃｔＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ
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ｌａｒｖａｅｏｆ犔狌犮犻犾犻犪犮狌狆狉犻狀犪：ｃＤＮＡａｎｄｄｅｄｕｃｅｄａｍｉｎｏａｃｉｄｓｅｑｕｅｎｃｅｓ［Ｊ］．ＪｏｕｒｎａｌｏｆＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＣｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９９６，２７１：８９２５
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ｔｅｉｎ，‘ｐｅｒｉｔｒｏｐｈｉｎ４８’，ｆｒｏｍｔｈｅｌａｒｖａｅｏｆ犔狌犮犻犾犻犪犮狌狆狉犻狀犪［Ｊ］．ＩｎｓｅｃｔＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙａｎｄＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，１９９８，２８：９９
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狋犺犲狆犲狉犻狋狉狅狆犺犻犮犿犪狋狉犻狓狅犳犎狅犾狅狋狉犻犮犺犻犪狅犫犾犻狋犪，犪狋狌狉犳犵狉犪狊狊狆犲狊狋
ＺＨＯＵＨｏｎｇｘｕ，ＬＩＣｈａｎｇｙｏｕ，ＬＩＧｕｏｘｕｎ
（ＡＣｅｎｔｅｒｆｏｒＡｄｖａｎｃｅｄＩｎｖｅｒｔｅｂｒａｔｅＣｅｌＣｕｌｔｕｒｅａｎｄＣｅｌＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｑｉｎｇｄａｏ
ＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｑｉｎｇｄａｏ２６６１０９，Ｃｈｉｎａ）
犃犫狊狋狉犪犮狋：犎狅犾狅狋狉犻犮犺犻犪狅犫犾犻狋犪ｉｓａｎｉｍｐｏｒｔａｎｔｔｕｒｆｇｒａｓｓｐｅｓｔ，ｗｈｏｓｅｐｅｒｉｔｒｏｐｈｉｃｍａｔｒｉｘｉｓａｐｏｔｅｎｔｉａｌｔａｒｇｅｔｆｏｒ
ｂｉｏｃｏｎｔｒｏｌｏｆｐｅｓｔｉｎｓｅｃｔｓ．Ｔｈｅｐｅｒｉｔｒｏｐｈｉｃｍａｔｒｉｘｐｒｏｔｅｉｎｓｏｆ犎．狅犫犾犻狋犪ｗｅｒｅｓｔｕｄｉｅｄｂｙｓｃｒｅｅｎｉｎｇｗｉｔｈａＰＭ
ｐｒｏｔｅｉｎｐｏｌｙｃｌｏｎａｌａｎｔｉｓｅｒｕｍｆｒｏｍ犎犲犾犻犮狅狏犲狉狆犪犪狉犿犻犵犲狉犪．ＯｎｅｐｏｓｉｔｉｖｅｃＤＮＡｃｌｏｎｅｎａｍｅｄＨｏＰｅｒｉｔｒｏｐｈｉｎ３，
ｗｉｔｈａｓｉｚｅｏｆ１７３７ｂｐａｎｄａｐｏｌｙａｄｅｎｙｌａｔｉｏｎｓｉｇｎａｌｏｆＡＡＴＡＡＡｕｐｓｔｒｅａｍｏｆｔｈｅｐｏｌｙＡｔａｉｌ，ｗａｓｓｃｒｅｅｎｅｄａｎｄ
ｓｅｑｕｅｎｃｅｄｆｒｏｍｔｈｅｌｉｂｒａｒｙ．ＴｈｅｌｏｎｇｅｓｔｏｐｅｎｒｅａｄｉｎｇｆｒａｍｅｏｆＨｏＰｅｒｉｔｒｏｐｈｉｎ３ｃｏｄｅｄｆｏｒ５２８ａｍｉｎｏａｃｉｄｓ，
ｗｈｉｃｈｗｅｒｅｍｏｓｔｌｙｓｉｍｉｌａｒｔｏＨｏＰｅｒｉｔｒｏｐｈｉｎ２ｏｆ犎．狅犫犾犻狋犪，ｗｉｔｈａｓｉｍｉｌａｒｉｔｙｏｆ６４．９％．ＨｏＰｅｒｉｔｒｏｐｈｉｎ３，ｗｉｔｈ
ａｌｉｔｔｌｅＯｌｉｎｋｅｄｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎｓｉｔｅｓ，ｃｏｎｔａｉｎｅｄｆｉｖｅｃｈｉｔｉｎｂｉｎｄｉｎｇｄｏｍａｉｎｓ，ａｌｏｆｗｈｉｃｈｃｏｎｓｉｓｔｅｄｏｆｓｉｘｃｏｎ
ｓｅｒｖｅｄｃｙｓｔｅｉｎｅｒｅｓｉｄｕｅｓ，ｗｈｉｌｅＨｏＰｅｒｉｔｒｏｐｈｉｎ１ａｎｄＨｏＰｅｒｉｔｒｏｐｈｉｎ２ｆｏｕｎｄｉｎｔｈｅＰＭｏｆ犎．狅犫犾犻狋犪ｃｏｎｔａｉｎｅｄ
ｏｎｌｙｆｏｕｒｃｙｓｔｅｉｎｅｒｅｓｉｄｕｅｓａｔｔｈｅＣｔｅｒｍｉｎａｌ．Ｎｏ ｍｕｃｉｎｌｉｋｅｄｏｍａｉｎ ｗａｓｆｏｕｎｄｉｎｔｈｅ ＨｏＰｅｒｉｔｒｏｐｈｉｎ３
ｓｅｑｕｅｎｃｅ．ＴｈｅｃｌｅａｖａｇｅｓｉｔｅｓｏｆｔｒｙｐｓｉｎａｎｄｃｈｙｍｏｔｒｙｐｓｉｎｍａｉｎｌｙｌａｙｉｎｓｉｄｅｏｆＣＢＤｓｉｎｔｈｅＨｏＰｅｒｉｔｒｏｐｈｉｎ３，
ａｎｄｗｅｒｅｐｒｏｔｅｃｔｅｄｂｙｔｈｅｉｎｔｒａｄｏｍａｉｎｄｉｓｕｌｆｉｄｅｂｏｎｄｓ，ｓｏｔｈｅｙｃａｎｒｅｓｉｓｔｅｎｚｙｍｅｓａｎｄｅｘｅｒｔａｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ
ｆｕｎｃｔｉｏｎｉｎｔｈｅｍｉｄｇｕｔ．ＣｏｍｐａｒｅｄｗｉｔｈＨｏＰｅｒｉｔｒｏｐｈｉｎ１ａｎｄＨｏＰｅｒｉｔｒｏｐｈｉｎ２，３６．３％ ｏｆ１０７ａｍｉｎｏａｃｉｄｓ
ｄｏｗｎｓｔｒｅａｍｏｆｔｈｅｆｉｆｔｈＣＢＤｂｅｌｏｎｇｅｄｔｏｔｈｅｃｌｅａｖａｇｅｓｉｔｅｓｏｆｔｒｙｐｓｉｎａｎｄｃｈｙｍｏｔｒｙｐｓｉｎ．Ｆｕｒｔｈｅｒｓｔｕｄｙｉｓｎｅｃ
ｅｓｓａｒｙｔｏｅｘｐｌａｉｎｗｈｙＨｏＰｅｒｉｔｒｏｐｈｉｎ３ｃａｎｅｘｉｓｔｉｎｔｈｅｍｉｄｇｕｔｉｎｔｈｅｐｒｅｓｅｎｃｅｏｆａｂｕｎｄａｎｔｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ．
犓犲狔狑狅狉犱狊：ｔｕｒｆｇｒａｓｓｐｅｓｔ；犎狅犾狅狋狉犻犮犺犻犪狅犫犾犻狋犪；ＰＭ（ｐｅｒｉｔｒｏｐｈｉｃｍｅｍｂｒａｎｅ）ｐｅｒｉｔｒｏｐｈｉｎ；ｉｍｍｕｎｏｓｃｒｅｅｎｉｎｇ；ｓｅ
ｑｕｅｎｃｅａｎａｌｙｓｉｓ
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