全 文 ：书叶绿素荧光技术在筛选光合突变体中的应用
郭玉朋１，郑霞２，王新宇１，曹孜义１，３
（１．兰州大学生命科学院，甘肃 兰州７３００００；２．中国农业科学院麻类研究所，湖南 长沙４１０２０５；
３．甘肃农业大学生命科学技术学院，甘肃 兰州７３００７０）
摘要：叶绿素荧光技术作为光合作用研究的手段，在光合突变体筛选中起到了重要作用。使用该技术，大量光合突
变体得以分离，并且随着分子生物学的进展，突变基因也被陆续克隆，同时利用这一技术的筛选方法也随着人们对
光合作用机制认识的深入，不断得到了改进，本研究就这方面进展做以综述。
关键词：叶绿素荧光技术；光合突变体；筛选
中图分类号：Ｑ９４５．１１ 文献标识码：Ａ 文章编号：１００４５７５９（２００９）０６０２２６０９
早在１９３１年，Ｋａｕｔｓｋｙ首先用肉眼观察到叶绿素荧光，红色而且漂亮［１］。自从叶绿素荧光现象发现后，人们
了解到叶绿素荧光的变化实际上反映了研究对象的光合功能状态，之后基于光合研究的需要，叶绿素荧光理论和
技术很快发展起来。在应用上，由于利用叶绿素荧光探测光合功能不但快速灵敏，而且无损伤［２］，因此给研究带
来很大方便。随着研究的深入，叶绿素荧光所包含的丰富信息逐渐得到了正确理解和应用［３，４］，现在叶绿素荧光
技术不但在光合作用基础研究中发挥了重要作用，而且在作物抗逆、产量预测、遗传育种、病虫害监测等应用学科
领域也得到了广泛应用［５～１０］，并且近年来正在发展利用卫星平台，通过探测叶绿素荧光而预测一个地区植物生
长状况的技术［１１～１３］。
在生物学研究中，突变体分析是剖析复杂生物学过程的强有力工具，并且现在已经成为研究基因功能的重要
手段［１４］。尤其在模式生物，例如拟南芥（犃狉犪犫犻犱狅狆狊犻狊狋犺犪犾犻犪狀犪）和水稻（犗狉狔狕犪狊犪狋犻狏犪）全基因组序列测序工作完
成后，利用突变体研究基因功能及表达调控的工作得到了极大地促进［１５，１６］。在光合作用功能基因研究中，利用
叶绿素荧光作为筛选光合突变体的手段，在光合突变体分离中发挥了重要作用。
１ 叶绿素荧光理论基础
１．１ 叶绿素荧光的产生
叶绿素作为重要的光敏色素，在光合作用中捕获、传递光能，并通过光化学作用，将光能转变为化学能。在能
量转化过程中，由叶绿素所吸收的光能除主要部分被转变为化学能外，有少部分能量以荧光的形式释放，这就是
叶绿素荧光。叶绿素荧光主要由叶绿素ａ产生，在光系统中，大约有一半以上的叶绿素ａ分布于光系统Ｉ（ｐｈｏｔｏ
ｓｙｓｔｅｍＩ，ＰＳＩ），其余的存在于光系统ＩＩ（ｐｈｏｔｏｓｙｓｔｅｍＩＩ，ＰＳＩＩ）。
在光合能量的转化过程中，光子首先被叶绿素ａ以及其他光合色素分子吸收，叶绿素ａ分子以外其他光合色
素分子吸收的光能以激子的形式快速（皮秒ｐｓ，１０－１２ｓ）传递给叶绿素ａ。这些光合色素分子由于吸收光子，而从
基态（ｇｒｏｕｎｄｓｔａｔｅ）跃迁至激发态（ｅｘｃｉｔｅｄｓｔａｔｅ），分子势能改变，不同波长光子引起色素分子势能改变不同，其
中，色素分子吸收一个红光子，分子势能大约增加１．８ｅＶ，而蓝光子则引起大约３．１ｅＶ的改变。处于激发态的
叶绿素是不稳定的，经过去激发途径释放能量而回到基态，在此过程中，激发态主要通过放热、发射荧光或磷光、
以及分子间能量传递回到基态［１７］。
在ＰＳＩＩ，反应中心叶绿素分子ａ（Ｐ６８０）接受激子后，发生电荷分离形成Ｐ６８０＋，接着电子传递给初级醌电子
受体ＱＡ，ＱＡ 形成质半醌ＱＡ－；在ＰＳＩ，反应中心叶绿素分子ａ（Ｐ７００）则将电荷传递至电子受体叶绿醌Ａ１，这样
２２６－２３４
２００９年１２月
草 业 学 报
ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ
第１８卷 第６期
Ｖｏｌ．１８，Ｎｏ．６
收稿日期：２００８１１０３；改回日期：２００９０３１６
作者简介：郭玉朋（１９７５），男，甘肃敦煌人，博士。Ｅｍａｉｌ：ｍｌｐｌｍｌ＠ｓｉｎａ．ｃｏｍ
通讯作者。Ｅｍａｉｌ：ｃａｏｚｙ＠ｇｓａｕ．ｅｄｕ．ｃｎ
在２个反应中心分别形成２个自由基对Ｐ６８０＋ＱＡ－和Ｐ７００＋Ａ１－。电子在被传递至下一级电子受体前，２个反应
中心都处于关闭状态，不能再发生电荷分离，直至２个自由基对重新回到电中性状态，之前能够发生光化学反应
的电中性状态称为开放态。在ＰＳＩＩ，初级电子供体向Ｐ６８０＋传递电子的速度很快（大约要５０ｎｓ），而ＱＡ－向外传
导电子的速度很慢（＞１００μｓ），自由基对长时间以Ｐ６８０ＱＡ
－状态存在，而ＰＳＩ刚好相反，自由基对长时间以
Ｐ７００＋Ａ１ 存在。Ｐ６８０＋和Ｐ７００＋都是非常有效的激子淬灭剂，将吸收的激子能量以热的形式耗散（ｎｏｎｒａｄｉａｔｉｖｅ
ｄｅｃａｙ）而不是用于光化学反应和发射荧光，因此当２个光系统都处于关闭状态时，ＰＳＩＩ将吸收的激子能量主要以
荧光形式耗散，而ＰＳＩ所吸收的激子能量则主要通过Ｐ７００＋以热的形式耗散，因此整个光系统叶绿素荧光产量变
化主要由ＰＳＩＩ荧光变化引起［４，１７］。
１．２ 叶绿素荧光诱导现象
在光下，光合作用的光反应由２个光系统相互协调完成，但经过暗适应的叶片２个光系统间协调消失，这时
的光系统处于非功能化状态，在照光后需要重新建立协调。同样，参与暗反应的酶系统，黑暗条件下也处于非活
性状态，照光后同样需要一个活化过程［１７，１８］。因此，经过暗适应的叶片，在照光后叶绿素荧光会有一个迅速的变
化过程，并逐渐过渡到稳态水平，这被称为叶绿素荧光诱导现象。在这一过程中，首先是ＰＳＩＩ电子传递初级受体
ＱＡ 被来自ＰＳＩＩ反应中心的电子还原，ＰＳＩＩ反应中心由开放状态变为关闭状态，当所有初级受体ＱＡ 及次级受体
ＱＢ 都被还原时，荧光由最低值犉０ 上升至最大值犉犿，这一阶段为叶绿素荧光诱导的快相（ＯＰ），主要反映了ＰＳＩＩ
的原初光化学反应状态；之后随着ＰＳＩ开始工作，电子由ＰＳＩＩ排出，经其他传递体最终传递至 ＮＡＤＰ＋形成
ＮＡＤＰＨ，暗反应也被激活，荧光逐渐从犉犿降低至犉狋，该阶段为叶绿素荧光诱导的慢相（ＰＴ），主要反映了光合碳
代谢的变化［１９，２０］。叶绿素荧光诱导具体过程见图１。
图１ 叶绿素荧光诱导过程［２１］
犉犻犵．１ 犓犻狀犲狋犻犮犻狀犱狌犮狋犻狅狀犮狌狉狏犲狅犳犮犺犾狅狉狅狆犺狔犾
犪犳犾狌狅狉犲狊犮犲狀犮犲犻狀犾犻犵犺狋
Ａ：ＯＰ荧光诱导快相Ｔｈｅｆａｓｔｐｈａｓｅｏｆｉｎｄｕｃｔｉｏｎｃｕｒｖｅ；Ｂ：ＰＴ
荧光诱导慢相Ｔｈｅｓｌｏｗｐｈａｓｅｏｆｃｈｌｏｒｏｐｈｙｌａｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ
１．３ 叶绿素荧光淬灭
叶绿素荧光诱导过程中，荧光由最高值降至稳态，
在此过程中荧光产量的下降称为叶绿素荧光淬灭。由
光化学过程引起的淬灭称为光化学淬灭（ｐｈｏｔｏｃｈｅｍｉ
ｃａｌｑｕｅｎｃｈｉｎｇ，ｑＰ），而热耗散造成的荧光产量降低称
为非光化学淬灭（ｎｏｎｐｈｏｔｏｃｈｅｍｉｃａｌｑｕｅｎｃｈｉｎｇ，ｑＮ
或ＮＰＱ）。光化学淬灭由光合作用引起，而非光化学
淬灭根据形成条件的不同，以及照光后黑暗状态下叶
绿素荧光恢复动态的变化，主要被区分为３个组分：
ｑＥ能态淬灭、ｑＴ状态转化和ｑＩ光抑制淬灭，大量研
究表明，叶黄素循环与非光化学淬灭形成密切相
关［２２］。在非光化学淬灭中，ｑＥ由类囊体内外质子浓
度差引起，是非光化学淬灭最重要的部分，也是反应最
快的组分，它是一种迅速可逆的光能调节方式，有助于
植物适应短时间光强剧烈变化［２３～２６］；ｑＴ是由状态转
化形成的非光化学淬灭；ｑＩ是与光合作用的光抑制联
系在一起的荧光淬灭机制。在这三者之中，ｑＴ、ｑＩ与ｑＥ相比要小的多，并不是主要的荧光淬灭途径［２４］。通常，
对非光化学淬灭的３个组分可以根据暗弛豫时间长短加以区分，具体见图２。
光系统吸收的能量通过光化学和热及荧光三者之一得以耗散，这三者之间存在此消彼长的关系，叶绿素荧光
因受其他两方面的影响而变化，因此可以通过测量叶绿素荧光的变化，来了解其他２个方面的状况。
１．４ 叶绿素荧光动力学参数
叶绿素荧光动力学参数是使用叶绿素荧光技术，定量描述研究对象光合功能的工具，这些参数是根据具体研
７２２第１８卷第６期 草业学报２００９年
究目的，而采用相应测量方法获得的，但通常基本数据
图２ 根据暗弛豫时间长短测定叶绿素荧光非光化
学淬灭的３个组分狇犈、狇犜、狇犐［２６］
犉犻犵．２ 犜犺狉犲犲犮狅犿狆狅狊犻狋犻狅狀狅犳狀狅狀狆犺狅狋狅犮犺犲犿犻犮犪犾
犱犲狋犲狉犿犻狀犲犱犳狉狅犿狉犲犾犪狓犪狋犻狅狀狋犻犿犲犻狀犱犪狉犽
的测量方法和步骤是基本相同的。一般情况是，在测
量前先将待测样品经过充分暗适应，测量时，先向样品
照一微弱测量光，得到基础荧光犉０，接着打开饱和光
使ＰＳＩＩ饱和，得到犉犿（暗适应条件下最大荧光），之后
打开光化光，等叶绿素荧光产量稳定后，记录稳态荧光
产量犉狋，然后再照一次饱和光，获得犉犿′（光适应条件
下的最大荧光），关闭光化光，打开远红光测量光适应
状态下的基础荧光犉０′。在使用荧光仪测得基本数据
后，其他参数可以通过相应公式计算得到［２０］。
叶绿素荧光动力学参数，在应用上可以分为用来
描述光化学淬灭和非光化学淬灭的２类，在描述光化
学淬灭时，ＰＳＩＩ实际光化学量子效率ФＰＳＩＩ、ＰＳＩＩ最大
光化学量子效率犉狏／犉犿 和光化学淬灭系数狇犘 较为常
用；而在定量非光化学淬灭时，犖犘犙、狇犖 被广泛应用。
这些参数的计算公式如下［２，８，２０］：
ФＰＳＩＩ＝（犉犿′－犉狋）／犉犿′ （１）
犉狏／犉犿＝（犉犿－犉０）／犉犿 （２）
犑＝ФＰＳＩＩ×犘犉犇犪×０．５ （３）
狇犘＝（犉犿′－Ｆ）／（犉犿′－犉０′） （４）
犖犘犙＝（犉犿－犉犿′）／犉犿′ （５）
狇犖＝１－（犉犿′－犉０′）／（犉犿－犉０） （６）
式中，ФＰＳＩＩ表示在作用光下，部分ＰＳＩＩ反应中心关闭时，ＰＳＩＩ的原初光能捕获效率，这一指标可以用来估计电子
传递速率（公式３，犘犉犇犪光合有效辐射强度），从而了解光合作用效率。一般情况下，电子传递速率与光合作用
效率有很强的线性关系，但在胁迫条件下，由于围绕ＰＳＩ环式电子传递速率的提高和光呼吸作用的增强，这种线
性关系会被改变；犉狏／犉犿 是指经过暗适应后，所有反应中心都处于开放状态时，ＰＳＩＩ的最大光能转化效率，是表
征ＰＳＩＩ功能的重要指标，常用来衡量光抑制程度［２７，２８］；狇犘是用来表示ＰＳＩＩ反应中心开放程度的指标，其大小由
ＱＡ 的氧化还原状态决定，有时也用１狇犘表示ＰＳＩＩ关闭的反应中心比例或者称为激发压。犖犘犙和狇犖 两个参
数中，狇犖 称为非光化学淬灭系数，是过去常用的１个参数，现在多用犖犘犙［２０］。
２ 利用叶绿素荧光筛选光合突变体
光合功能突变体可以有多种表型，在筛选中主要依据叶绿素变化和叶绿素荧光变化为标准。在应用中，根据
叶绿素荧光特性筛选获得的突变体，往往叶绿素会有不同程度缺失，而根据叶绿素变化得到的突变体，叶绿素荧
光特性也会发生变化，因而这２种方法在筛选光合突变体时可以相互补充。相对叶绿素表型变化，用叶绿素荧光
特征来筛选突变体具有更精确的特点，并且突变体荧光变化特征能够为后续研究提供线索［２９～３６］。利用叶绿素荧
光筛选突变体的方法主要被区分为２类：高叶绿素荧光筛选法和叶绿素荧光参数筛选法。
２．１ 高叶绿素荧光突变体筛选
正常情况下，光合作用过程中，叶绿素荧光产量只占吸收光能的１％～２％［２０］，而当涉及光合过程的关键基因
产生突变时，叶绿素吸收的光能无法有效用于光合作用，将导致荧光产量上升，表现为高叶绿素荧光表型 ＨＣＦ
（ｈｉｇｈｃｈｌｏｒｏｐｈｙｌｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ）［３７］。造成高叶绿素荧光表型的突变，主要是由于光合电子传递组分或者光合中
心组分突变导致的电子传递阻断而引起［３０］。
高叶绿素荧光表型突变体的筛选需要在暗室中，采用长波紫外灯照射的方法，通过观察或拍照筛选出发射亮
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红色荧光的突变株，在最初是Ｂｅｎｎｏｕｎ和Ｌｅｖｉｎｅ［３８］对
图３ 莱茵哈德衣藻高叶绿素荧光突变体筛选［３８］
犉犻犵．３ 犎犻犵犺犮犺犾狅狉狅狆犺狔犾犳犾狌狅狉犲狊犮犲狀犮犲犿狌狋犪狀狋
狊犮狉犲犲狀犻狀犵狅犳犆．狉犲犻狀犺犪狉犱犻
箭头所指为高叶绿素荧光突变克隆Ａｒｒｏｗｉｎｄｉｃａｔｅｔｈｅｍｕｔａｎｔｃｌｏｎｅ
经过 ＥＭＳ诱变的莱茵哈德衣藻（犆犺犾犪犿狔犱狅犿狅狀犪狊
狉犲犻狀犺犪狉犱犻）进行了高叶绿素荧光突变体筛选。他们使
用高压水银灯作光源，加长波截止滤光片将波长大于
６４０ｎｍ的光波滤去，当采用４０００ｌｘ的光强时，肉眼
即可分辨出高叶绿素荧光突变体。作为更灵敏的检测
方法，拍照被用来记录筛选结果，使用对红色光敏感的
胶卷，并加短波截止滤光片，将波长小于６４０ｎｍ的短
波光滤去，只允许长波光通过在胶片上成像，使用这种
方法大约从每２００个克隆就可以很容易筛选到一个高
叶绿素荧光突变克隆（图３）。经验证，得到的高叶绿
素荧光突变克隆，只有在基本培养基添加乙酸酯后才
能正常生长，这说明突变克隆的光合作用被破坏，不能
光合自养，而只能在外界提供有机碳源的情况下才可
以生长。经ＣＯ２ 固定试验检测，这些突变克隆的确无
法正常固定ＣＯ２［３８］。
高叶绿素荧光方法在其他植物光合突变体筛选上也得到了广泛应用，例如在玉米（犣犲犪犿犪狔狊）、拟南芥等植
物中也筛选到大量此类突变体［３９］。Ｍｅｕｒｅｒ等［３７］及其同事就对拟南芥高叶绿素荧光突变体做了筛选，Ｍｅｕｒｅｒ使
用波长３６５ｎｍ的紫外灯作光源，通过对经由ＥＭＳ诱变的７７００个 Ｍ２ 代株系的筛选，共得到２３８个高叶绿素荧
光突变株系，经过对自交 Ｍ３ 代的复选，最终确认３４个株系。其中，大多数突变体表现苗期致死，能够存活的突
变株生长发育也受到极大影响而不能开花结实，这些突变株系只能通过杂合体保存。多数突变体同时表现为叶
绿素不同程度缺失，在添加蔗糖培养基上，其叶绿素缺失表型可以恢复，除了高叶绿素表型外，与同条件下生长的
野生植株没有明显区别［３７］。在获得突变体的基础上，Ｍｅｕｒｅｒ等［３７］还利用饱和脉冲技术测定了突变体叶绿素荧
光诱导过程各荧光参数的变化，并结合对ＰＳＩ氧化还原状态光吸收变化的检测，对突变体突变位点做了初步预测
和分类，最终突变体被区分为６类，前４类是由于电子传递链组分缺陷引起，第５类无法辨别突变位点，第６类是
叶绿素ｂ缺失突变体。为证明预测和分类的准确性，使用Ｎｏｒｔｈｅｒｎ和 Ｗｅｓｔｅｒｎ技术做了验证，结果表明通过荧
光技术所做的预测是准确的。
然而，Ｍｅｕｒｅｒ等［３７］所使用的方法只能得到光化学淬灭过程突变体，所使用的光强并不足以引起非光化学淬
灭大的变化。利用高叶绿素荧光表型筛选突变体，也可以基于叶绿素荧光淬灭不同组分产生的条件，变化筛选条
件，得到关于不同淬灭组分的突变体，这其中包括对非光化学淬灭突变体的鉴定。Ｓｈｉｋａｎａｉ等［４０］对高叶绿素荧
光筛选方法做了改进，对经由ＥＭＳ诱变的拟南芥突变体库做了筛选。在Ｓｈｉｋａｎａｉ等［４０］的方法中，材料先经过暗
适应，照以２００μｍｏｌ／（ｍ
２·ｓ）的光化光后，立刻记录叶绿素荧光成像，在照射时，光源装有长波光截止滤光片，将
波长大于５９０ｎｍ长波光滤除，以免干扰叶绿素荧光成像，之后再照以３００μｍｏｌ／（ｍ
２·ｓ）的光化光，这一光强足
以引起非光化学淬灭，２ｍｉｎ后，记录荧光成像，比较２次成像结果即可得到非光化学淬灭突变体（图４）。通过对
２１０００个 Ｍ２ 代植株的筛选，共获得３７个突变株，结合叶绿色荧光动力学测定和ＰＳＩ氧化还原状态光吸收检测，
对突变体做了详细研究，突变体被分为３类。其中，第１类由于犉０ 升高，而造成犉狏／犉犿 大幅降低，高光强下荧光
水平会降到犉０ 以下，此类突变一般由ＰＳＩＩ缺陷造成；第２类则犉狏／犉犿 与野生型相比变化不大，ФＰＳＩＩ、ФＰＳＩ（通过
测量ＰＳＩ氧化还原状态光吸收变化计算得到）也没有受到太大影响，而作用光增强时，荧光淬灭大幅降低，而第３
类ФＰＳＩＩ或ФＰＳＩ受到严重影响，在低光强下即表现出荧光淬灭能力降低，第２和第３类的区别主要在于第２类只在
高光强下荧光淬灭能力下降，而低光强下与野生型没有太大区别。Ｓｈｉｋａｎａｉ等［４０］所得到的突变体与 Ｍｅｕｒｅｒ
等［３７］的有所不同，他在筛选前剔除了苗期致死突变，而且在得到光化学淬灭突变体的同时，通过改变作用光强，
也得到了非光化学淬灭突变体。
９２２第１８卷第６期 草业学报２００９年
图４ ２００μ犿狅犾／（犿２·狊）光化光照射（犃）和３００μ犿狅犾／（犿２·狊）光化光照射２犿犻狀（犅）
［４０］
犉犻犵．４ 犘犺狅狋狅犵狉犪狆犺犻狀２００μ犿狅犾／（犿２·狊）犪犮狋犻狏犲犾犻犵犺狋（犃）犪狀犱犅狆犺狅狋狅犵狉犪狆犺犻狀３００μ犿狅犾／（犿２·狊）犪犳狋犲狉２犿犻狀（犅）
箭头所指为非光化学淬灭突变体Ａｒｒｏｗｉｎｄｉｃａｔｅｔｈｅｍｕｔａｎｔ
从对已获得高叶绿素荧光突变体研究发现，突变几乎涉及光合作用的各个方面。例如，玉米 犎犆犉６０突变
体，由Ａｃ转座子插入突变引起，被破坏基因编码叶绿体核糖体小亚基蛋白１７，突变体由于叶绿体核糖体缺陷，使
叶绿体ＤＮＡ编码基因翻译受阻，叶绿体发育障碍，正常情况下突变体不能光合自养，苗期致死。同样是玉米高
叶绿素荧光突变体，而犎犆犉１０６突变影响叶绿体膜系统发育，突变体呈浅绿色，不能光合自养，萌发后３周死
亡［４１］。作为模式植物的拟南芥，在光合功能的研究中得到了更广泛的应用，通过系统筛选已获得了大量突变体，
并且到目前为止，已经对约１５个高叶绿素荧光突变体进行了刻画，鉴定的基因参与了叶绿体生物发生各个水平
的调节［１４］。例如，突变体犎犆犉１０７，被破坏的基因参与叶绿体ＲＮＡ加工过程，结果狆狊犫犅、狆狊犫犎 基因表达受到影
响，造成ＰＳＩＩ发育缺陷［４２］。在犎犆犉１７３中 ＰＳＩＩ核心蛋白Ｄ１相对野生型显著减少，核糖体对编码Ｄ１蛋白的
狆狊犫犃ｍＲＮＡ的起始翻译减少，突变基因编码蛋白是一个与叶绿体膜系统相关的高分子复合体组分，这一高分子
复合体与狆狊犫犃ｍＲＮＡ加工成熟有关［４３］。在拟南芥另外一个突变体犎犆犉１４５中，由于ｐｓａＡｐｓａＢｒｐｓ１４翻译受
到影响，因此光系统ＰＳＩ缺陷［４４］。在突变体犎犆犉１５３中，细胞色素ｂ６ｆ复合体含量相比野生型减少，光合电子传
递受阻造成高叶绿素荧光表型，该突变体由ＴＤＮＡ插入引起，突变基因编码一个分子量为１５ｋＤａ的叶绿体蛋
白，该蛋白可能参与细胞色素ｂ６ｆ复合体发生过程的翻译后修饰［４５］。
在国内，Ｐｅｎｇ等［４６］对拟南芥ＴＤＮＡ插入突变体库高叶绿素荧光突变体进行筛选，共获得大约９０个性状
不同的隐性突变体，其中有３个得到了详细研究并克隆了相应突变基因。其中犾狆犪１编码蛋白与Ｄ１作用，定位
于类囊体膜，以分子伴侣的形式参与ＰＳＩＩ有效组装［４６］。犾狆犪２突变基因编码一个类囊体膜内在蛋白，与ＰＳＩＩ核
心蛋白ＣＰ４３作用，协助ＣＰ４３对ＰＳＩＩ的组装［４７］。
２．２ 根据叶绿素荧光参数筛选突变体
以高叶绿素荧光作为筛选标准，所得到的突变体大都光合过程受到严重影响，不能光合自养，而在光合突变
中也有许多突变只是轻微改变光合过程的某些方面，正常环境下不至于引起明显的叶绿素荧光变化，突变只是造
成某些荧光参数的轻微改变，对此类突变体，可以用特定荧光参数为标准加以筛选［３０］。在筛选中，用以描述非光
化学淬灭的参数犖犘犙和光化学淬灭参数ФＰＳＩＩ较为常用。
２．２．１ 以非光化学淬灭参数犖犘犙为筛选标准 Ｎｉｙｏｇｉ等［４８］以犖犘犙为参数，做了莱茵哈德衣藻光合突变体筛
选工作。在筛选前，材料的培养环境光强为５０μｍｏｌ／（ｍ
２·ｓ），筛选光强采用１００μｍｏｌ／（ｍ
２·ｓ），这一高光强几
乎使光化学淬灭饱和，因此大部分叶绿素荧光淬灭，由非光化学淬灭引起。以一定的时间间隔拍照，由计算机处
理形成犖犘犙参数的伪彩色图像，对比随光照进程变化的伪彩色图像，筛选出非光化学淬灭突变体。在获得非光
化学淬灭突变体后，使用ＰＡＭ荧光仪做具体的非光化学淬灭诱导分析，突变体被分辨成４类：非光化学淬灭诱
０３２ ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ（２００９） Ｖｏｌ．１８，Ｎｏ．６
导第１段降低（狀狆狇４）、第２段降低（狀狆狇１）、２个阶段同时降低（狀狆狇２、狀狆狇１１）和与野生型相比非光化学淬灭升高４
类，各种类型由不同突变造成［２４］。Ｎｉｙｏｇｉ等［４８］用同样的方法，也以拟南芥为材料作了筛选工作，共鉴定出１３个
犖犘犙发生变化的突变体。
在非光化学淬灭的形成机制上，叶黄素循环被认为与光合机构对过剩光能的调节密切相关，莱茵哈德衣藻和
拟南芥犖犘犙突变体的获得证实了这一理论。在莱茵哈德衣藻突变体狀狆狇１中，紫黄质脱环氧化酶被破坏，紫黄
质无法转变成单环氧玉米黄质和玉米黄质，而狀狆狇２中，则缺乏玉米黄质环氧化酶，玉米黄质向紫黄质的转化被
阻断，这２个突变都造成了叶黄素循环的破坏，最终影响到了非光化学淬灭犖犘犙的形成。拟南芥狀狆狇１、狀狆狇２
突变体与莱茵哈德衣藻突变体成因一致，同样由缺失紫黄质脱环氧化酶和玉米黄质环氧化酶造成。
２．２．２ 以ＰＳＩＩ实际光化学量子效率ФＰＳＩＩ参数为筛选标准 除犖犘犙外，其他叶绿素荧光参数也被用来作为筛
选标准。Ｖａｒｏｔｔｏ等［３０］以ＰＳⅡ实际光化学量子效率ФＰＳＩＩ为参数，对拟南芥ＴＤＮＡ和Ｅｎ插入突变体库做了筛
选。他的检测没有采用叶绿素荧光成像技术，而是使用一个带有自动控制装置的系统，检测每株植物的叶绿素荧
光。植株在经过２００μｍｏｌ／（ｍ
２·ｓ）光化光适应后，稳态荧光Ｆｓ被记录，然后照以饱和脉冲光，得到光适应状态
下的最大荧光犉犿′，计算出ФＰＳＩＩ。在对Ｅｎ插入突变体库２７００个株系中的筛选中，得到１３个ФＰＳＩＩ减小的株系，
在４７０００个ＴＤＮＡ插入株系中，筛到３５个ФＰＳＩＩ减小的株系。在这些突变体中，有３个基因被鉴定为编码蛋白
定位于叶绿体，其中，犮犺犪狅狊突变体的犆犃犗 基因是被Ｅｎ转座子插入破坏，在另外一个突变体中，编码ＰＳＩ的Ｅ亚
基蛋白犘犛犃犈１基因也是被Ｅｎ破坏，第３基因由ＴＤＮＡ插入引起，该基因编码血红素氧化酶蛋白ＨＯ１。
在植物的生境中，对高光强的适应能力，是影响光合功能的重要方面，过高的光强会引起光抑制，植物长时间
处在高光强下甚至发生光氧化、光漂白，而且往往伴随其他生境因子（例如中午的高温）共同作用更加重了光抑
制。完善的光能调节机制使植物能够及时改变光合机构状态，避免或减轻高光强所带来的伤害，然而相关基因突
变会改变植物的光能调节利用途径，造成植物对高光强适应能力下降，最终导致光合效率降低，甚至光合机构被
破坏。在有关这类突变体的筛选中，Ｗａｌｔｅｒｓ［４９］以ФＰＳＩＩ为参数，以拟南芥ＴＤＮＡ插入突变体库为材料，利用叶绿
素荧光成像技术，做了光强适应能力发生变化突变体筛选的工作。在筛选过程中，植株先被培养在低光强（１００
μｍｏｌ／ｍ
２·ｓ）下１４ｄ，移至高光强（４００μｍｏｌ／ｍ
２·ｓ）下３ｄ，培养前后，分别检测光适应（２５０μｍｏｌ／ｍ
２·ｓ，１５
ｍｉｎ）状态下的ФＰＳＩＩ，比较高光强处理前后ФＰＳＩＩ的荧光成像，筛选出光适应能力变化的突变株，最终从３００００个植
株中共得到５１个突变体。通过分离插入位点侧翼序列发现，其中被命名为犪狆犲１的突变体，被破坏的基因编码一
个未知功能蛋白，据预测这一蛋白与光合机构有关，另外一个突变体犪狆犲２，ＴＰＴ基因被破坏，该基因编码位于叶
绿体内膜的磷酸丙糖易位子蛋白。
２．３ 根据具体光合过程改变筛选符合预期叶绿素荧光变化的突变体
用叶绿素荧光技术筛选光合突变体时，关键在于突变体和野生型叶绿素荧光的差异。突变体可以直接表现
为高叶绿素表型，也可以通过构造的具体荧光参数来区分突变体和野生型。另外也可以根据具体光合过程特性，
以及可能对叶绿素荧光产生的影响，筛选出叶绿素荧光变化符合预期的突变体。在这方面，Ｋｒｕｓｅ等［５０］所做的
莱茵哈德衣藻ｓｔａｔｅ２向ｓｔａｔｅ１转变受阻突变体筛选就是范例［５０］。在光系统中，ＰＳＩＩ、ＰＳＩ可以根据光质及光强
变化调节光能在２个光系统的分配。在远红光照射下，ＰＳＩ叶绿素ａ对光能吸收占优势，ＰＳＩ将吸收的过剩光能
向ＰＳＩＩ分配，此时的状态称为状态１（ｓｔａｔｅ１），与状态１相反，当光源以短波光为主的情况下，ＰＳＩＩ对光能吸收占
优势，光能向ＰＳＩ分配，称为状态２（ｓｔａｔｅ２）。在ｓｔａｔｅ２下，光合电子传递链的质醌库被还原，ＰＳＩＩ吸收光能过剩，
造成ＰＳＩＩ集光复合体（ＬＨＣＩＩ）蛋白激酶激活，磷酸化ＬＨＣＩＩ复合体，ＬＨＣＩＩ与ＰＳＩＩ中心复合体解离，使ＰＳＩＩ吸
收的光能减少［５１］，而且解离的ＬＨＣＩＩ进一步从分布集中的基粒类囊体向间质类囊体迁移，使ＰＳＩＩ叶绿素ａ减
少，最后造成ＰＳＩＩ叶绿素荧光产量减少，而ｓｔａｔｅ１则刚好相反。因此根据状态转换中叶绿素荧光变化的特点，筛
选叶绿素荧光增加的克隆即为ｓｔａｔｅ２向ｓｔａｔｅ１转变受阻突变体［５２］。Ｋｒｕｓｅ等［５０］通过对２×１０４ 个莱茵哈德衣藻
克隆的筛选，确定了５个状态转换突变克隆，对其中一个命名为狊狋犿１的突变克隆研究发现，与野生型相比该克隆
的集光复合体ＬＨＣＩＩ磷酸化水平显著降低，而ＬＨＣＩＩ磷酸化是保证ｓｔａｔｅ２向ｓｔａｔｅ１转化的重要反应。
１３２第１８卷第６期 草业学报２００９年
３ 结语
光合突变体筛选中，以前的方法多采用探测样品的ＣＯ２ 固定能力变化来确定突变体［５３］，这对于象莱茵哈德
衣藻这样的小个体生物，可以利用放射性标记，通过放射显影的办法，尽可能减少工作量，然而对于植物，工作量
巨大，筛选的可操作性差。叶绿素荧光筛选技术的发明，使这一工作变得高效而且简便［３８］，并且经过许多研究者
的努力，筛选的理论和技术日趋成熟，并且用于测定的荧光仪也不断得以改进，不断向小型化和智能化发展，使测
定更加容易和便捷，尤其叶绿素荧光成像技术的发明，使得应用叶绿素荧光参数精确、大规模筛选突变体成为可
能。然而，叶绿素荧光技术虽然获得了很好的发展，但在应用时，除高叶绿素荧光突变体的筛选相对简单外，通过
叶绿素荧光参数筛选突变体则相对困难，因为叶绿素荧光成像仪造价昂贵，并不普及，而且对使用者有很高要求，
否则，所测数据将很难得到合理解释。除此以外，现有的叶绿素荧光技术筛选方法是建立在当前对光合作用理解
的程度上的，因此，所采用的荧光参数只反映当前进展，而影响光合作用的因素是复杂多样的，因此光合突变的获
得并不可能由一种方法完成，需要其他方法补充，也可以通过鉴别叶绿素或生活力变化来辅助筛选。将来随着光
合作用研究的不断进展，利用叶绿素荧光技术筛选突变体的理论和方法会得到不断的完善，并且在光合作用研究
中发挥更重要的作用。
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ＧＵＯＹｕｐｅｎｇ１，ＺＨＥＮＧＸｉａ２，ＷＡＮＧＸｉｎｙｕ１，ＣＡＯＺｉｙｉ１，３
（１．ＳｃｈｏｏｌｏｆＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓ，ＬａｎｚｈｏｕＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｌａｎｚｈｏｕ７３００００，Ｃｈｉｎａ；２．ＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＢａｓｔＦｉｂｅｒ
Ｃｒｏｐｓ，ＣｈｉｎｅｓｅＡｃａｄｅｍｙｏｆＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ，Ｃｈａｎｇｓｈａ４１０２０５，Ｃｈｉｎａ；３．ＳｃｈｏｏｌｏｆＬｉｆｅ
ＳｃｉｅｎｃｅａｎｄＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＧａｎｓｕＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｌａｎｚｈｏｕ７３００７０，Ｃｈｉｎａ）
犃犫狊狋狉犪犮狋：Ａｓａｂａｓｉｃｔｅｃｈｎｉｑｕｅｉｎｐｈｏｔｏｓｙｎｔｈｅｔｉｃｒｅｓｅａｒｃｈ，ｃｈｌｏｒｏｐｈｙｌｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｉｓａｎｉｍｐｏｒｔａｎｔｗａｙｔｏ
ｓｃｒｅｅｎｐｈｏｔｏｓｙｎｔｈｅｔｉｃｍｕｔａｎｔｓ．Ｍａｎｙｍｕｔａｎｔｓｈａｖｅｂｅｅｎｉｓｏｌａｔｅｄｕｓｉｎｇｔｈｉｓｔｅｃｈｎｉｑｕｅ，ａｎｄｓｏｍｅｇｅｎｅｓｈａｖｅ
ｂｅｅｎｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄｉｎｒｅｃｅｎｔｙｅａｒｓ．Ａｔｔｈｅｓａｍｅｔｉｍｅ，ｓｃｒｅｅｎｉｎｇｍｅｔｈｏｄｔｈｅｏｒｉｅｓｈａｖｅａｌｓｏｂｅｅｎｄｅｖｅｌｏｐｅｄｗｉｔｈｔｈｅ
ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎｏｆｋｎｏｗｌｅｄｇｅｏｎｐｈｏｔｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ．Ｔｈｅｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｏｆｓｃｒｅｅｎｉｎｇｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙｉｓｄｉｓｃｕｓｓｅｄｉｎｔｈｉｓ
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４３２ ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ（２００９） Ｖｏｌ．１８，Ｎｏ．６