全 文 ：书甘肃河西马铃薯根际生防木霉菌对
接骨木镰刀菌的拮抗筛选及鉴定
张茹１，２，李金花１，３，柴兆祥３，王蒂１，２
（１．甘肃省作物遗传与种质创新重点实验室，甘肃 兰州７３００７０；２．甘肃农业大学农学院，
甘肃 兰州７３００７０；３．甘肃农业大学草业学院，甘肃 兰州７３００７０）
摘要：从甘肃省西部地区农牧交错区的马铃薯根际土壤中共分离到１０８株木霉菌株，通过平板对峙法筛选出１０株
对马铃薯干腐病主要病菌接骨木镰刀菌拮抗效果较好的木霉菌株，抗性系数均在０．８２６以上，其中天祝３株、永登
４株、山丹３株。根据形态学特征、培养性状和ＩＴＳ序列分析，将这１０株生防木霉菌鉴定为哈茨木霉、长枝木霉、深
绿木霉和粘绿木霉４个种。研究结果还表明，马铃薯根际土壤中的优势生防木霉菌种为哈茨木霉和长枝木霉，长
枝木霉与深绿木霉对病原菌接骨木镰刀菌的拮抗作用最强。长枝木霉菌对接骨木镰刀菌有较好的拮抗效果，在国
内系首次报道。
关键词：马铃薯；根围土壤；木霉菌；干腐病；拮抗作用
中图分类号：Ｓ４３５．１２１；Ｓ５３２．０８　　文献标识码：Ａ　　文章编号：１００４５７５９（２００９）０２０１３８０８
　 农业生产中，各种植物病害产生的适应性、抗药性与病原菌生理小种的快速变异的现象，以及出现的对环境
和人类健康危害的事实，农药、化学试剂的过度使用已引起人类的重视，因此使用合理、有效的方法控制植物病害
的发生势在必行，生物防治便成为了国内外研究的热点。从植物病害防治的角度来讲，生物防治就是利用生物及
其代谢产物防治植物病害，控制病原物的方法。它的实质就是利用生物种间关系、种内关系，调节有害生物种群
密度，即利用生物群防治生物群［１～４］。植物病害的生物防治是在农业生态系统中调节寄主植物的微生物环境，使
其利于寄主而不利于病原或者使其对寄主与病原物的相互作用发生有利于寄主而不利于病原物的影响，从而达
到防治病害的目的。生物防治可以通过生物及其代谢产物防治作物病害，控制病原，达到抑制病害、保护环境、保
护人畜健康的目的。
根际微生物是土壤和植物生命系统的重要组成成分，是根际微环境与土壤有机物质循环和转换的枢纽，对植
物的生长发育起着重要作用［１］。根标微生物主要包括根际细菌、根际放线菌、根际真菌和根际原生动物等，而木
霉菌正是一种重要的具有生防作用的根际真菌。
木霉（犜狉犻犮犺狅犱犲狉犿犪）广泛存在于土壤、空气和植物体表面等生态环境中，有些菌株对植物病原真菌具有寄生
或拮抗作用［２］，可用于防治由立枯丝核菌（犚犺犻狕狅犮狋狅狀犻犪狊狅犾犪狀犻）、镰刀菌（犉狌狊犪狉犻狌犿ｓｐｐ．）、齐整小核菌（犛犮犾犲狉狅狋犻
狌犿狉狅犾犳狊犻犻）等引起的植物病害，是一种重要的生防菌［３～５］。
２０世纪７０年代以来，对木霉菌的拮抗作用及其机制作了深入研究，国外已有商品化的木霉制剂问世［６，７］。
目前，具有生防潜力的木霉菌种主要是哈茨木霉（犜狉犻犮犺狅犱犲狉犿犪犺犪狉狕犻犪狀狌犿）、绿色木霉（犜．狏犻狉犻犱）、康氏木霉（犜．
犽狅狀犻狀犵犻犻）、钩状木霉（犜．犺犪犿犪狋狌犿）和长枝木霉（犜．犾狅狀犵犻犫狉犪犮犺犻犪狋狌犿）［８］。
马铃薯（犛狅犾犪狀狌犿狋狌犫犲狉狅狊狌犿）是世界第４大重要的粮食作物，中国是世界上最大的马铃薯生产国。虽然马铃
薯是重要的粮菜兼用型作物，但也是优良的饲料作物。据报道，全世界种植的马铃薯大约有１／３左右作为饲
料［９，１０］，在马铃薯加工过程中的薯皮、薯渣也大量用作饲料［１０～１２］。可见马铃薯在饲料作物中占有相当重要的地
１３８－１４５
２００９年４月
　　　草　业　学　报　　　
　　　ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ　　　
第１８卷　第２期
Ｖｏｌ．１８，Ｎｏ．２
 收稿日期：２００８１００６；改回日期：２００８１１１８
基金项目：转基因抗逆耐盐及抗病马铃薯新品系培育研究（ＧＮＳＷ２００６０１），马铃薯优质高效配套生产技术研究与示范（２００６ＢＡＤ２１Ｂ０５３）和
马铃薯镰刀菌干腐病病原学及抗病种质资源筛选研究（ＧＫＬＡＵ０６０３）资助。
作者简介：张茹（１９７８），女，甘肃兰州人，在读博士。Ｅｍａｉｌ：ｃｈｏｕｒｕｅｒ＠１６３．ｃｏｍ
通讯作者。Ｅｍａｉｌ：ｊｉａｎｇｚｅ＠ｐｕｂｌｉｃ．ｌｚ．ｇｓ．ｃｎ
位。甘肃西部农牧交错区是种植马铃薯的主要区域之一，据报道，在甘肃由接骨木镰刀菌（犉狌狊犪狉犻狌犿狊犪犿犫狌犮犻
狀狌犿）等病原引起的干腐病是马铃薯种植和贮藏过程中发生的重要病害之一［１３］。为掌握甘肃省西部地区的生防
木霉菌资源，发现生防能力强、抑菌范围广谱的优质木霉菌，寻找对环境和人类健康友好的植物病害防治方法，安
全、有效控制该病，从甘肃省西部地区马铃薯根围土壤中分离木霉菌，通过拮抗试验筛选生防潜力大的木霉菌株，
为深入开发和利用木霉菌提供理论和实践依据。
１　材料与方法
１．１　土样采集
２００７年４－１０月从甘肃省西部农牧交错的张掖、山丹、天祝和永登等地的马铃薯种植田块按照常规土壤取
样方法（５点法）采集马铃薯根围土壤。每个采样区选有代表性的地块作为取样单位，每个取样单位用土壤取样
器按照５点取样法取０～２０ｃｍ耕作层的土样，每点取１次，５点的土样充分混匀后装入牛皮纸袋供分离用，每取
样单位取样１份，共采集３８份土壤样品。
１．２　土壤溶液的制备
将采集到的土样敲碎、风干后过筛。取充分混匀的土样０．５ｇ于１５０ｍＬ三角瓶中，加１００ｍＬ灭菌蒸馏水，
振动１ｍｉｎ后静置１ｍｉｎ，分别吸取１ｍＬ悬浮液，用浓度梯度法稀释成１０－２，１０－３，１０－４三个浓度梯度的土壤溶
液，充分摇匀后用于分离。
１．３　木霉菌的分离、纯化与保存
以下操作均在无菌条件下进行。木霉菌的分离采用平板稀释法进行。移取上述配置好的不同浓度梯度的土
壤溶液１ｍＬ注入马铃薯葡萄糖培养基（ｐｏｔａｔｏｄｅｘｔｒｏｓｅａｇａｒ，ＰＤＡ）平板（含马铃薯２００ｇ，葡萄糖１５ｇ，琼脂１５
ｇ，氯霉素０．０１％，丙酸钠１０ｍｍｏｌ／Ｌ，蒸馏水１０００ｍＬ）上，迅速用无菌推铲推开，置于２８℃恒温培养，每个浓度
重复５次。待ＰＤＡ平板上长出菌落后，挑取菌落边缘幼嫩菌丝到ＰＤＡ平板上反复纯化。将纯化后的菌种，根据
培养特性挑取菌体显微镜检，选出木霉菌单孢分离，１５％甘油中－７０℃下保存待用。
１．４　拮抗木霉菌的筛选
用于筛选拮抗木霉菌的竞争病原菌为接骨木镰刀菌，从马铃薯干腐病病薯上分离到［１３］，由甘肃农业大学植
物病理学实验室提供。
将ＰＤＡ上平板上培养５ｄ左右的木霉菌与接骨木镰刀菌分别用打孔器打成大小为６ｍｍ的菌饼，分别接种
于ＰＤＡ平板上，２个菌饼相距４ｃｍ，于２８℃培养，逐日观察记录木霉和镰刀菌的菌落相向半径。以只接接骨木
镰刀菌不接木霉菌为对照。每处理重复３次。待对照菌落长满平板时（１０ｄ），计算拮抗系数。
拮抗系数的计算公式：犖＝（犔犆－犔犘）／犔犆
式中，犖：拮抗系数；犔犆：对照菌落半径；犔犘：被抑制病原菌半径［１４，１５］。
１．５　拮抗木霉菌的鉴定方法
按拮抗系数从大到小选取１０株对接骨木镰刀菌拮抗效果较好的木霉菌菌株，根据形态学分类方法及ｒＤＮＡ
－ＩＴＳ序列同源性分析进行木霉菌株的鉴定。
１．５．１　形态学鉴定　将筛选出的木霉菌在ＰＤＡ和水琼脂（ｗａｔｅｒａｇａｒ，ＷＡ）（琼脂２０ｇ，蒸馏水１０００ｍＬ）上培
养［１６］，依据菌落形态、分生孢子的大小、形状、颜色，分生孢子梗的形态和产孢细胞的形态特征等进行鉴定。
１．５．２　ＩＴＳ－ＰＣＲ扩增和测序分析　基因组ＤＮＡ的提取：分别将１０株木霉菌待测菌株接种在马铃薯葡萄糖培
养液中（ｐｏｔａｔｏｄｅｘｔｒｏｓｅｂｒｏｔｈ，ＰＤＢ）（马铃薯２００ｇ，葡萄糖１５ｇ，１０００ｍＬ蒸馏水），２８℃、１４０ｒ／ｍｉｎ，振荡培
养４８～７２ｈ，收集菌丝，提取ＤＮＡ［１７］。通过电泳方法检查ＤＮＡ纯度和定量（与ＤＮＡｍａｋｅｒＩ比较）。根据木霉
菌ｒＤＮＡ中的转录间隔区（ｉｎｔｅｒｎａｌｔｒａｎｓｃｒｉｂｅｄｓｐａｃｅｒ，ＩＴＳ）区间特有的保守序列［１８］，进行引物合成（由上海生
工合成）。引物对为：ＥＦ１７２８Ｆ（５′ＣＡＴＣＧＡＧＡＡＧＴＴＣＧＡＧＡＡＧＧ３′）和 ＥＦ１９８６Ｒ（５′ＴＡＣＴＴＧＡＡＧ
ＧＡＡＣＣＣＴＴＡＣＣ３′）。
ＰＣＲ反应包括１０×Ｔａｑｂｕｆｆｅｒ２．５μＬ，２．５ｍｍｏｌ／ＬｄＮＴＰ２μＬ，１０μｍｏｌ／Ｌ的引物１μＬ，模板ＤＮＡ１μＬ，
５Ｕ／μＬＴａｑ酶０．２５μＬ，超纯水将反应体系补至２５μＬ。
９３１第１８卷第２期 草业学报２００９年
ＰＣＲ反应热循环参数设置为：预变性９４℃４ｍｉｎ；９４℃变性３０ｓ，５５℃退火３０ｓ，７２℃延伸２ｍｉｎ，进行３５个
循环；７２℃延伸１０ｍｉｎ。
ＰＣＲ产物采用北京天为时代科技有限公司的离心柱型ＰＣＲ产物纯化试剂盒（普通型）进行纯化，取６～８μＬ
扩增产物于１％的琼脂糖凝胶上电泳，利用成像系统成像，并将ＰＣＲ产物送上海生工公司测序。
序列同源性比较和聚类分析：将待测菌株的ｒＤＮＡ－ＩＴＳ序列与Ｇｅｎｂａｎｋ核苷酸数据库中的ＩＴＳ序列进行
同源性比较，采用ＤＮＡｓｔａｒ软件对所测１０个菌株的ＩＴＳ序列与Ｇｅｎｂａｎｋ中的同源性最高的部分木霉种的ＩＴＳ
序列进行聚类分析，构建同源性树。
２　结果与分析
２．１　木霉菌的分离结果
经统计，从甘肃省西部地区马铃薯根围土壤中共分离到１０８株木霉菌株，其中从天祝分离到４０株，山丹３０
株，永登３２株，张掖６株（表１）。
２．２　拮抗木霉菌的筛选结果
通过木霉菌对接骨木镰刀菌拮抗作用的研究，筛选出１０株对接骨木镰刀菌拮抗效果较好的菌株，抗性系数
均在０．８２６以上（表１）。其中天祝３株（菌株号为ＴＢ２，ＴＢ３，ＴＢ４）、永登４株（菌株号为ＹＢ２，ＹＢ４，ＹＢ
１０，ＹＣ８）、山丹３株（菌株号为ＳＥ１，ＳＤ３，ＳＤ１）（表１，图１）。
２．３　拮抗木霉菌的鉴定结果
通过形态学特征和分子生物学鉴定，将１０个对接骨木镰刀菌拮抗效果较好的木霉菌菌株鉴定为４个种，分
别为哈茨木霉４株，长枝木霉３株，深绿木霉（犜．犪狋狉狅狏犻狉犻犱犲）１株，粘绿木霉（犜．狏犻狉犲狀狊）１株。
２．３．１　拮抗木霉菌种的形态学特征描述　哈茨木霉：在ＰＤＡ平板上，菌落生长迅速，棉絮状，老熟时为暗绿色，
孢子梗丛束疏松，环状排列，主分枝呈树状，其上众多次级分枝，整个分枝系统像金字塔状，瓶梗初短，终级瓶梗变
细而长，中间膨大，以大角度伸出，分生孢子球形或近球形，短倒卵形，壁光滑，孢子小（图２Ａ）。菌株：ＴＢ２，Ｙ
Ｂ４，ＹＢ１０，ＳＤ１。分布：天祝、永登、山丹。
深绿木霉：在ＰＤＡ平板上，菌落生长迅速，老熟时呈暗黄色，常有芳香气味。分生孢子梗主轴上初级分枝常
位于基部，且多不规则，瓶梗细长，窄安瓿形，常向分枝顶端呈弧形弯曲，分生孢子成熟时表面光滑（图２Ｂ）。菌
株：ＴＢ４。分布：天祝。
长枝木霉：在ＰＤＡ平板上，菌落生长迅速，棉絮状，浅绿色至深绿色，分生孢子梗主轴上初级分枝常位于基
部，且多不规则，孢子梗主轴次级分枝分布结构复杂，通常具有２～３回分枝，瓶梗基部收缩不明显，分生孢子椭圆
形或卵圆形，表面光滑（图２Ｃ）。菌株：ＴＢ３，ＹＢ２，ＳＤ３。分布：天祝、永登、山丹。
粘绿木霉：在ＰＤＡ平板上，菌落生长迅速，背面无色，老时逐渐变成暗黄色。分生孢子梗主轴上分枝分布较
均匀，单生、对生或３～４个轮生，分生孢子梗主轴无延长结构，瓶梗巾茎轴着生，分生孢子多而密，孢子表面粗糙
（图２Ｄ）。菌株：ＹＣ８。分布：永登。
２．３．２　ｒＤＮＡＩＴＳ序列分析　经测序分析，ＰＣＲ扩增后有９个木霉菌菌株得到了大小为３００ｂｐ的条带（图３），
将大小一致的条带回收测序后在Ｇｅｎｂａｎｋ上比对，与形态学鉴定结果一致，分别为哈茨木霉，长枝木霉，深绿木
霉和粘绿木霉。利用ＤＮＡＳｔａｒ软件绘制测序菌株的系统发育树状图。菌株ＹＢ４号与Ｇｅｎｂａｎｋ上登记的菌株
ＡＹ６０５７７９哈茨木霉的亲缘关系最近（图４），同源性达９８％；菌株ＴＢ４号与Ｇｅｎｂａｎｋ上登记的菌株ＡＦ４５６８８２
的亲缘关系最近，同源性达９６％（图５）。而其他的菌株同源性都在９６％以上。
３　讨论
木霉属真菌广泛存在于土壤等多种基质中，因其许多种类对植物病原真菌具有拮抗和重寄生作用及能够产
生纤维素酶等多种酶类而倍受关注。甘肃西部地区的张掖、山丹、天祝和永登等地地理、气候类型多样，资源丰
富。但对在国民经济和自然生态系统中有重要价值的木霉菌的分类鉴定少见报道。
甘肃是马铃薯生产大省，由接骨木镰刀菌等病原引起的干腐病（ｐｏｔａｔｏｄｒｙｒｏｔ）是马铃薯种植和贮藏过程中
发生广泛的重要病害之一［１３］，有效防治该病对马铃薯种植与产业发展具有重要意义。本研究广泛调查和筛选甘
０４１ ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ（２００９） Ｖｏｌ．１８，Ｎｏ．２
表１　拮抗木霉菌株的分离来源和拮抗系数比较
犜犪犫犾犲１　犛狅狌狉犮犲狊犪狀犱犪狀狋犪犵狅狀犻狊狋犻犮犻狀犱犲狓狅犳犜狉犻犮犺狅犱犲狉犿犪犻狊狅犾犪狋犲犱犳狉狅犿犱犻犳犳犲狉犲狀狋狆狅狋犪狋狅狋犲狉狉犪
菌号
Ｉｓｏｌａｔｅｃｏｄｅ
采集地
Ｓｏｕｒｃｅｓ
拮抗系数
Ａｎｔａｇｏｎｉｓｔｉｃｉｎｄｅｘ
菌号
Ｉｓｏｌａｔｅｃｏｄｅ
采集地
Ｓｏｕｒｃｅｓ
拮抗系数
Ａｎｔａｇｏｎｉｓｔｉｃｉｎｄｅｘ
菌号
Ｉｓｏｌａｔｅｃｏｄｅ
采集地
Ｓｏｕｒｃｅｓ
拮抗系数
Ａｎｔａｇｏｎｉｓｔｉｃｉｎｄｅｘ
ＺＡ１ 张掖 ０．７６８ ＴＡ１ 天祝 ０．８０５ ＴＥ７ 天祝 ０．７９８
ＺＡ２ 张掖 ０．７６３ ＴＡ２ 天祝 ０．８２２ ＴＥ８ 天祝 ０．７７８
ＺＡ３ 张掖 ０．７８０ ＴＢ１ 天祝 ０．７５４ ＴＥ９ 天祝 ０．７２８
ＺＡ４ 张掖 ０．７２９ ＴＢ２ 天祝 ０．８５６ ＴＥ１０ 天祝 ０．７５４
ＺＡ５ 张掖 ０．７１２ ＴＢ３ 天祝 ０．８２６ ＹＡ１ 永登 ０．８１８
ＺＡ６ 张掖 ０．７０７ ＴＢ４ 天祝 ０．８４７ ＹＡ２ 永登 ０．８０８
ＳＡ１ 山丹 ０．８０９ ＴＢ５ 天祝 ０．７３８ ＹＡ３ 永登 ０．８１８
ＳＡ２ 山丹 ０．８０５ ＴＢ６ 天祝 ０．８１８ ＹＢ１ 永登 ０．７６３
ＳＡ３ 山丹 ０．７３２ ＴＢ７ 天祝 ０．７８４ ＹＢ２ 永登 ０．８３０
ＳＡ４ 山丹 ０．８０５ ＴＢ８ 天祝 ０．８０２ ＹＢ３ 永登 ０．８１８
ＳＡ５ 山丹 ０．８１４ ＴＣ１ 天祝 ０．７４６ ＹＢ４ 永登 ０．８４３
ＳＡ６ 山丹 ０．８１４ ＴＣ２ 天祝 ０．５９１ ＹＢ５ 永登 ０．７３２
ＳＡ７ 山丹 ０．７３２ ＴＣ３ 天祝 ０．７５８ ＹＢ６ 永登 ０．８０９
ＳＡ８ 山丹 ０．８１８ ＴＣ４ 天祝 ０．８０２ ＹＢ７ 永登 ０．８２１
ＳＡ９ 山丹 ０．８１８ ＴＣ５ 天祝 ０．８１８ ＹＢ８ 永登 ０．８０５
ＳＡ１０ 山丹 ０．７７４ ＴＣ６ 天祝 ０．８０７ ＹＢ９ 永登 ０．７３２
ＳＢ１ 山丹 ０．７５３ ＴＣ７ 天祝 ０．７４６ ＹＢ１０ 永登 ０．８３８
ＳＢ２ 山丹 ０．８１６ ＴＣ８ 天祝 ０．７８９ ＹＢ１１ 永登 ０．７３３
ＳＢ３ 山丹 ０．７３７ ＴＤ１ 天祝 ０．８０２ ＹＢ１２ 永登 ０．７３３
ＳＣ１ 山丹 ０．８２２ ＴＤ２ 天祝 ０．８１８ ＹＢ１３ 永登 ０．８０１
ＳＣ２ 山丹 ０．８２２ ＴＤ３ 天祝 ０．８０７ ＹＣ１ 永登 ０．８１８
ＳＣ３ 山丹 ０．８１４ ＴＤ４ 天祝 ０．７９４ ＹＣ２ 永登 ０．８１８
ＳＤ１ 山丹 ０．８２６ ＴＤ５ 天祝 ０．８０７ ＹＣ３ 永登 ０．８１８
ＳＤ２ 山丹 ０．７６９ ＴＤ６ 天祝 ０．７８４ ＹＣ４ 永登 ０．８０１
ＳＤ３ 山丹 ０．８３４ ＴＤ７ 天祝 ０．８１８ ＹＣ５ 永登 ０．７３８
ＳＤ４ 山丹 ０．８０９ ＴＤ８ 天祝 ０．８１１ ＹＣ６ 永登 ０．８３０
ＳＤ５ 山丹 ０．７７７ ＴＤ９ 天祝 ０．７５６ ＹＣ７ 永登 ０．８１２
ＳＤ６ 山丹 ０．７３８ ＴＤ１０ 天祝 ０．７６４ ＹＣ８ 永登 ０．８４２
ＳＤ７ 山丹 ０．８２０ ＴＤ１１ 天祝 ０．８１８ ＹＤ１ 永登 ０．７５８
ＳＥ１ 山丹 ０．８３０ ＴＤ１２ 天祝 ０．８０４ ＹＤ２ 永登 ０．７６３
ＳＥ２ 山丹 ０．７７１ ＴＥ１ 天祝 ０．７６４ ＹＤ３ 永登 ０．７７１
ＳＥ３ 山丹 ０．７６３ ＴＥ２ 天祝 ０．７８９ ＹＤ４ 永登 ０．７５８
ＳＥ４ 山丹 ０．８２１ ＴＥ３ 天祝 ０．８１１ ＹＤ５ 永登 ０．７４１
ＳＦ１ 山丹 ０．７８７ ＴＥ４ 天祝 ０．８２１ ＹＤ６ 永登 ０．７５４
ＳＦ２ 山丹 ０．７３８ ＴＥ５ 天祝 ０．８１４ ＹＤ７ 永登 ０．７３４
ＳＦ３ 山丹 ０．７３７ ＴＥ６ 天祝 ０．８２１ ＹＤ８ 永登 ０．７７１
　为筛选到的抗性较好的木霉菌株 Ｔｈｅ犜狉犻犮犺狅犱犲狉犿犪ｉｓｏｌａｔｅｓｗｉｔｈｂｅｔｔｅｒａｎｔａｇｏｎｉｓｔｉｃｅｆｆｅｃｔ．张掖 Ｚｈａｎｇｙｅ；山丹 Ｓｈａｎｄａｎ；天祝 Ｔｉａｎｚｈｕ；永登
Ｙｏｎｇｄｅｎｇ．
１４１第１８卷第２期 草业学报２００９年
图１　木霉菌株对接骨木镰刀菌的拮抗效果
犉犻犵．１　犐狀犺犻犫犻狋犻狅狀犲犳犳犲犮狋狅犳犜狉犻犮犺狅犱犲狉犿犪狋狅犉．狊犪犿犫狌犮犻狀狌犿
Ａ：深绿木霉对接骨木镰刀犜．犪狋狉狅狏犻狉犻犱犲ｔｏ犉．狊犪犿犫狌犮犻狀狌犿；Ｂ：哈茨木霉对接骨木镰刀菌犜．犺犪狉狕犻犪狀狌犿ｔｏ犉．狊犪犿犫狌犮犻狀狌犿；Ｃ：粘绿木霉对
接骨木镰刀菌犜．狏犻狉犲狀狊ｔｏ犉．狊犪犿犫狌犮犻狀狌犿；Ｄ：长枝木霉对接骨木镰刀菌犜．犾狅狀犵犻犫狉犪犮犺犻狋犪犿ｔｏ犉．狊犪犿犫狌犮犻狀狌犿；Ｅ：对照ＣＫ
图２　木霉菌产孢梗和分生孢子
犉犻犵．２　犆狅狀犻犱犻狅狆犺狅狉犲狊犪狀犱犮狅狀犻犱犻狅狊狆狅狉犲狅犳犜狉犻犮犺狅犱犲狉犿犪
Ａ：哈茨木霉犜．犺犪狕犻犪狀狌犿；Ｂ：深绿木霉犜．犪狋狉狅狏犻狉犻犱犲；Ｃ：长枝木霉犜．犾狅狀犵犻犫狉犪犮犺犻犪狋狌犿；Ｄ：粘绿木霉犜．狏犻狉犲狀狊
２４１ ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ（２００９） Ｖｏｌ．１８，Ｎｏ．２
图３　１０株木霉菌株的引物犈犉１的犘犆犚产物电泳图
犉犻犵．３　犜犺犲犫犪狀犱狊狅犳犘犆犚狆狉狅犱狌犮狋狊狅犳１０犻狊狅犾犪狋犲狊狅犳犜狉犻犮犺狅犱犲狉犿犪犪狋狆狉犻犿犲狉犈犉１
泳道１～１１依次为ＴＢ２，ＴＢ３，ＴＢ４，ＹＢ２，ＹＢ４，ＹＢ１０，ＹＣ８，ＳＤ１，ＳＤ３，ＳＥ１，阴性对照
Ｂａｎｄ１－１１：ＴＢ２，ＴＢ３，ＴＢ４，ＹＢ２，ＹＢ４，ＹＢ１０，ＹＣ８，ＳＤ１，ＳＤ３，ＳＥ１，ｎｅｇａｔｉｖｅｃｏｎｔｒｏｌ
图４　菌株犢犅４（哈茨木霉犜．犺犪狕犻犪狀狌犿）的遗传聚类分析图谱
犉犻犵．４　犘犺狔犾狅犵犲狀犲狋犻犮狋狉犲犲狅犳狋犺犲犻狊狅犾犪狋犲犢犅４
肃省西部地区马铃薯根际土壤中对马铃薯干腐病主要病菌接骨木镰刀菌具有生防作用的木霉真菌，明确其种类
和分布特性。根据Ｒｉｆｉａ的分类系统［１９，２０］与分子生物学试验相结合，将１０株拮抗效果较好的木霉菌菌株鉴定为
哈茨木霉，长枝木霉，深绿木霉和粘绿木霉，其中哈茨木霉和长枝木霉是甘肃省西部农牧交错区马铃薯根际土
壤中分布较为广泛的２种木霉，并且对接骨木镰刀菌的抑制效果最好。国内外研究拮抗作用较好的木霉菌通常
为哈茨木霉和绿色木霉［２１］，本研究表明，长枝木霉对接骨木镰刀菌具有较好的拮抗性状，这在中国属于首次报
道。
木霉菌的鉴定一般通过形态学来进行［２２］，但有些木霉菌株是介于已确定的种与种之间的中间类型，部分种
之间在形态上又存在相似性，这给木霉的鉴定和分类带来困难和争议［２３］。而核糖体ＤＮＡ（ｒＤＮＡ）内转录间隔区
（ＩＴＳ）的序列分析是鉴定种，尤其是形态相似种的有力工具。本研究中，用木霉菌中的ＩＴＳ序列作为种间比对，
虽然ＩＴＳ１和ＩＴＳ２序列差异较种内大，而５．８ＳｒＤＮＡ无论在种内还是在种间变异均较小，可见ＩＴＳ序列不仅适
用于较高分类等级的系统学研究，也能反映种内变异及多态性［２４］。通过分子生物学技术与形态学鉴定相结合，
使木霉菌的分类鉴定更准确，对开发和利用甘肃省木霉菌的资源具有重要的理论研究和实际应用意义。
木霉作为有效的生防菌之一，具有多种多样的应用形式。利用木霉菌可以直接对土壤和种子进行处理，达到
防治效果，亦可直接喷施作物的表面而产生抑菌作用，木霉菌和杀菌剂的组合应用可以明显增强生防效果，同时
３４１第１８卷第２期 草业学报２００９年
图５　菌株犜犅４号（深绿木霉犜．犪狋狉狅狏犻狉犻犱犲）的遗传聚类分析图谱
犉犻犵．５　犘犺狔犾狅犵犲狀犲狋犻犮狋狉犲犲狅犳犻狊狅犾犪狋犲犜犅４
减少杀菌剂的用量，减少环境污染，降低农药残留量，减轻对环境中有益微生物的破坏。随着基因工程的发展，克
隆转化拮抗微生物的有益基因，优化拮抗微生物，构建高抗高控工程菌株，研制高效的生防制剂，已是生防工作的
重点。木霉菌中产生的许多重要拮抗物质，如胞壁降解酶可以直接对病原菌产生抑制防治的作用，而利用这些胞
壁降解酶的基因更是生防应用的重点。木霉菌中含有大量的几丁质酶与葡聚糖酶，利用它们的基因改造有益菌
株或植株，可以对病原菌达到更强的抑制作用而对植物起到促生的作用。总之，对木霉菌株的研究，可以为生物
防治提供更多的契机，为生防因子木霉菌展示更加广阔的应用前景。
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ｂａｓｅｄｏｎａｎａｌｙｓｉｓｏｆｒｉｂｏｓｏｍａｌＤＮＡｉｎｔｅｒｎａｌｔｒａｎｓｃｒｉｂｅｄｓｐａｃｅｒｓｅｑｕｅｎｃｅｓ［Ｊ］．Ｍｙｃｏｌｏｇｉａ，１９９７，８９（３）：４４２４６０．
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犛犮狉犲犲狀犻狀犵狅犳犫犻狅犮狅狀狋狉狅犾犜狉犻犮犺狅犱犲狉犿犪犳狉狅犿狆狅狋犪狋狅狉犺犻狕狅狊狆犺犲狉犲狅犳犠犲狊狋犲狉狀犌犪狀狊狌犪犵犪犻狀狊狋
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（１．ＧａｎｓｕＫｅｙＬａｂｏｆＣｒｏｐｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔａｎｄＧｅｒｍｐｌａｓｍＥｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ，ＧａｎｓｕＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，
Ｌａｎｚｈｏｕ７３００７０，Ｃｈｉｎａ；２．ＣｏｌｅｇｅｏｆＡｇｒｏｎｏｍｙ，ＧａｎｓｕＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｌａｎｚｈｏｕ
７３００７０，Ｃｈｉｎａ；３．ＣｏｌｅｇｅｏｆＧｒａｓｓｌａｎｄＳｃｉｅｎｃｅ，ＧａｎｓｕＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ
Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｌａｎｚｈｏｕ７３００７０，Ｃｈｉｎａ）
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５４１第１８卷第２期 草业学报２００９年