全 文 ：书豌豆清蛋白１（犘犃１）基因的克隆及对苜蓿的转化
张改娜１，２，贾敬芬２
（１．河南科技大学农学院，河南 洛阳４７１０００；２．西北大学生命科学学院，陕西 西安７１００６９）
摘要：本研究用ＰＣＲ方法从豌豆（食荚大菜豌）克隆出富含硫氨基酸、同时具有抗虫作用的双功能的蛋白质基因－
豌豆清蛋白１（ＰＡ１）基因，并构建了植物表达载体ｐＣＡＭＢＩＡｌ３０１－ＰＡ１。采用农杆菌介导法转化了紫花苜蓿，并
对其转化体系进行了优化，得到了多个转基因胚性愈伤组织及其再生植株。ＰＣＲ和Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交检测表明，ＰＡ１
基因和潮霉素抗性基因已被整合到了宿主细胞。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析表明该基因在再生植株中有一定表达。游离氨
基酸分析表明，ＰＡ１基因的表达转基因苜蓿中蛋氨酸和半胱氨酸的含量从０．１％提高到０．４％。
关键词：豌豆清蛋白（ＰＡ１）基因；富硫氨基酸；苜蓿；遗传转化
中图分类号：Ｓ５５１．＋７０３；Ｑ９４３．２　　文献标识码：Ａ　　文章编号：１００４５７５９（２００９）０３０１１７０９
　 苜蓿（犕犲犱犻犮犪犵狅狊犪狋犻狏犪）是一种世界上最重要的豆科牧草和饲料作物［１］。其蛋白含量占总干物质量的１７％
～２０％，相比其他豆科牧草，其营养丰富。但苜蓿含硫氨基酸，如蛋氨酸和半胱氨酸的含量较低。而含硫氨基酸
的水平限制着豆科牧草的营养品质。高水平的含硫氨基酸可显著增加羊的生长量及羊毛产量［２］。因此，人们希
望培育出富含含硫氨基酸的豆科牧草，以提高其营养价值［３］，其主要途径有突变体筛选法［４］和基因工程技术［５］。
而培育抗虫品种是苜蓿育种的另一目标，利用生物工程技术有可能实现这一目标［６］。后者的优点在于简单方便，
育种周期短。２０世纪９０年代，曾有人用富含硫氨基酸的鸡卵清蛋白基因［７］、菜豆（犘犺犪狊犲狅犾狌狊狏狌犾犵犪狉犻狊）蛋白基
因［８］、向日葵（犎犲犾犻犪狀狋犺狌狊犪狀狀狌狌狊）种子清蛋白基因［９］分别转化苜蓿。这些转基因操作都获得了一定的成功。但
是此类蛋白的表达量仍有待提高。２００４年Ａｖｒａｈａｍ等［１０］用拟南芥（犃狉犪犫犻犱狅狆狊犻狊狋犺犪犾犻犪狀犪）的胱硫醚－γ合成酶
（ＡｔＣＧＳ）基因转化苜蓿获得了蛋氨酸和半胱氨酸含量大幅度提高的转基因苜蓿。显示了转基因技术在提高苜
蓿含硫氨基酸方面的可行性。
本研究根据ＮＣＢＩ（美国国立生物技术信息中心）发表的豌豆ＰＡ１基因已知序列设计的一对引物，用ＰＣＲ
（聚合酶链式反应）方法从豌豆（食荚大菜豌）克隆出富含硫氨基酸，同时具有抗虫作用的双功能的清蛋白１基因
（ＰＡ１基因）。ＰＡ１基因产物本身是一个富硫氨基酸蛋白质，未成熟的肽链含硫氨基酸高达１１％，剪切成ａ、ｂ两
条成熟的肽链，其中ＰＡ１ｂ链含６个半胱氨酸和１个蛋氨酸，含硫氨基酸高达１８．７％，ＰＡ１ａ链含硫氨基酸达
７．５％。同时其成熟肽链ＰＡ１ｂ又是１个结构稳定的，对多种昆虫具有毒害作用的昆虫毒素［１１］。本研究通过农
杆菌介导法将克隆的该基因的完整阅读框导入紫花苜蓿中，以探讨其能否在转基因苜蓿中得到表达。希望能提
高紫花苜蓿蛋白质中含硫氨基酸含量。
１　材料与方法
１．１　载体和菌株
ｐＭＤ１８Ｔ载体购自大连宝生物公司；二元载体ｐＣＡＭＢＩＡ１３０１、大肠杆菌（犈狊犮犺犲狉犻犮犺犻犪犮狅犾犻）ＤＨ５α菌株
（Ａｍｐｓ）、章鱼碱型根癌农杆菌（犃犵狉狅犫犪犮狋犲狉犻狌犿狋狌犿犲犳犪犮犻犲狀狊）ＬＢＡ４４０４（ｐＡＬ４４０４，Ｓｔｒｒ）由本实验室保存。
１．２　ＰＡ１基因克隆与表达载体构建
１．２．１　ＰＡ１基因克隆　豌豆（犘犻狊狌犿狊犪狋犻狏狌犿，品种为食荚大菜豌）种子购自成都市种子总公司。种子萌发后，
取幼苗，用ＣＴＡＢ法［１３］分离总基因组ＤＮＡ。
第１８卷　第３期
Ｖｏｌ．１８，Ｎｏ．３
草　业　学　报
ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ 　　
１１７－１２５
２００９年６月
 收稿日期：２００９０１１４；改回日期：２００９０３０２
基金项目：国家自然科学基金项目（３０６７１０８２）资助。
作者简介：张改娜（１９７７），女，河南许昌人，讲师，博士。Ｅｍａｉｌ：ｚｇｎｌｕｃｋ１＠１６３．ｃｏｍ
通讯作者。Ｅｍａｉｌ：ｊｉａｊｆ３８＠ｎｗｕ．ｅｄｕ．ｃｎ
以ＮＣＢＩ发表的豌豆ＰＡ１基因（登录号为ＡＪ５７４７９４）序列和植物表达载体ｐＣＡＭＢＩＡ１３０１的酶切位点为基
础，设计一对引物：５′ＣＧＣＣＡＴＧＧＣＴＴＣＣＧＴＴＡＡ ＡＣＴＣＧＣＴＴＣ３′；５′ＣＣＧＧＧＴＧＡＣＣＴＴＡＡＧ
ＣＡＧＴＧＧＡＡＡＣＡＣ３′。其中上游引物含有犖犮狅Ⅰ位点，下游引物含有犅狊狋狆Ⅰ酶切位点。
以该引物为ＰＣＲ扩增引物，食荚大菜豌总ＤＮＡ为模板，２５．０μＬ反应体系，１０×ＰＣＲｂｕｆｆｅｒ２．５μＬ，ＭｇＣｌ２
１．５μＬ，上下游引物各１．０μＬ，模板ＤＮＡ０．３μｇ，４ｄＮＴＰ２．０μＬ，Ｔａｑ酶０．５μＬ；扩增条件为９４℃预变性５
ｍｉｎ，９４℃变性４５ｓ，５４℃退火４５ｓ，７２℃延伸５０ｓ，３５个循环，最后７２℃延伸１０ｍｉｎ。ＰＣＲ扩增体系如表１，产物
经１％琼脂糖凝胶电泳，ＴａＫａＲａ公司琼脂糖凝胶ＤＮＡ纯化试剂盒（ＡｇａｒｏｓｅＧｅｌＤＮＡｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎＫｉｔＶｅｒ．
２．０）回收和纯化。
ＰＣＲ产物连接到ｐＭＤ１８－ＴＶｅｃｔｏｒ（大连宝生物公司）上，热激法转化新鲜的大肠杆菌ＤＨ５α感受态细胞，
上海基康生物公司测序。ＤＮＡ序列分析用ＤＮＡｓｔａｒ软件完成。
１．２．２　ＰＡ１基因表达载体的构建　２００６年，用犖犮狅Ⅰ和犅狊狋狆Ⅰ两种限制性内切酶分别双酶切１．２．１获得的质
粒ＤＮＡ和植物表达载体ｐＣＡＭＢＩＡ１３０１后，从凝胶中回收和纯化来自质粒ＤＮＡ的４８０ｂｐ基因片段和植物载
体质粒的大片段，用Ｔ４ 连接酶将二者在１６℃连接过夜。其中ＰＡ１基因取代了植物表达载体ｐＣＡＭＢＩＡ１３０１的
原ＧＵＳ基因。所得重组质粒命名为ｐＣＡＭＢＩＡ－ＰＡ１。用上述的转化方法转化感受态细胞ＤＨ５α，涂布于５０
ｍｇ／Ｌ的Ｋａｎ平板上。挑取阳性克隆，并提取阳性克隆的质粒，进行ＰＣＲ测定及犖犮狅Ⅰ和犅狊狋狆Ⅰ双酶切检测。
将检测正确的克隆，用碱裂解法从大肠杆菌提取质粒，用液氮处理的冻融直接转移法将ｐＣＡＭＢＩＡ－ＰＡ１质
粒转入根癌农杆菌ＬＢＡ４４０４。微量提取质粒进行ＰＣＲ和酶切分析，结果表明，ｐＣＡＭＢＩＡ－ＰＡ１质粒已经导入
根癌农杆菌ＬＢＡ４４０４。
１．３　紫花苜蓿的转化和转基因植株再生
１．３．１　菌液的制备　将根癌农杆菌ＬＢＡ４４０４／ｐＣＡＭＢＩＡ－ＰＡ１划线培养在含１００ｍｇ／Ｌ卡那霉素（Ｋａｎ）的
ＹＥＢ固体培养基上，挑取单菌落接种于５ｍＬ各含５０μｇ／ｍＬ卡那霉素、利福平和链霉素的液体ＹＥＢ培养基中，
２８℃培养过夜，对数生长期的菌液用于感染外植体。
１．３．２　苜蓿外植体的转化、培养和植株再生　紫花苜蓿种子购自杨凌种子公司。转化方法同吕德阳等［５］，浸染
后的外植体接种于含有（或者不含）１０μｇ／ｍＬ乙酰丁香酮的１／２ＭＳ固体培养基上，２５～２８℃共培养２～６ｄ。
然后，将子叶转入筛选培养基Ｐ１／Ｐ２＋头孢霉素（Ｃｅｆ，５００ｍｇ／Ｌ）＋潮霉素（ｈｙｐ，２５ｍｇ／Ｌ），在继代培养过程中逐
步降低Ｃｅｆ浓度直至零，但潮霉素的浓度直到分化培养基Ｐ３时，降低到５ｍｇ／Ｌ。培养条件为光照１６ｈ，黑暗８
ｈ，（２５±２）℃。在Ｐ１筛选培养基上培养２５ｄ，经Ｐ２培养基上继代筛选后，得到的抗性愈伤组织在Ｐ３和Ｐ４培养
基上诱导分化。
将经Ｐ１、Ｐ２和Ｐ３培养基培养，得到抗性小植株转移至１／２ＭＳ＋ｈｙｐ（５ｍｇ／Ｌ）培养基中培养，炼苗并移栽至
花盆土中。
Ｐ１＝ＭＳ＋２，４Ｄ（２，４二氯苯氧乙酸，４ｍｇ／Ｌ）＋６ＢＡ（６苄氨基嘌呤，０．５ｍｇ／Ｌ）；Ｐ２＝ＳＨ＋ＮＡＡ（α萘乙
酸，３．０ｍｇ／Ｌ）＋ＫＴ（激动素，１．５ｍｇ／Ｌ）；Ｐ３＝ＳＨ＋ＮＡＡ（０．１ｍｇ／Ｌ）＋ＫＴ（０．１ｍｇ／Ｌ）＋脯氨酸（５００ｍｇ／Ｌ）；
Ｐ４＝ＳＨ＋ＫＴ（０．２ｍｇ／Ｌ）＋ＮＡＡ（０．２ｍｇ／Ｌ）＋脯氨酸（１ｍｇ／Ｌ）＋谷氨酰胺（５００ｍｇ／Ｌ）＋Ｃｅｆ（５ｍｇ／Ｌ）。
１．４　基因组ＤＮＡ的提取和转化体的分子及生化分析
１．４．１　植物ＤＮＡ的提取　２００７年，取未转基因苜蓿和随机挑选的转基因苜蓿Ｔ１ 代新鲜叶片各５００ｍｇ，按
ＣＴＡＢ微量提取法［１２］分别提取总ＤＮＡ。
１．４．２　ＰＣＲ检测　以含潮霉素磷酸转移酶基因（ＨＰＴ）的ｐＣＡＭＢＩＡ１３０１质粒ＤＮＡ（稀释５００倍）为模板的阳
性对照，未转基因的愈伤组织再生植株ＤＮＡ为阴性对照，对转基因苜蓿再生植株基因组ＤＮＡ，进行 ＨＰＴ的
ＰＣＲ扩增检测。ＨＰＴ：扩增片段长度为５０９ｂｐ，上游引物：５′ＡＧＣＴＧＣＧＣＣＧＡＴＧＧＴＴＴＣＴＡＣＡＡ３′；下游引
物：５′ＡＴＣＧＣＣＴＣＧＣＴＣＣＡＧＴＣＡＡＴＧ３′。ＰＣＲ程序设定为：９４℃，预变性５ｍｉｎ；９４℃，变性１ｍｉｎ；６０．５℃，退
火１ｍｉｎ；７２℃，延伸３０ｓ；循环３０次；７２℃，延伸１０ｍｉｎ。采用ＰＡ１基因引物对再生转基因植株进行ＰＣＲ分析
（同１．２．１）。
８１１ ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ（２００９） Ｖｏｌ．１８，Ｎｏ．３
１．４．３　Ｓｏｕｔｈｅｒｎｂｌｏｔ分析　提取经上述ＰＣＲ检测的转基因苜蓿植株的基因组ＤＮＡ，经内切酶犈犮狅犚Ⅰ酶切，以
ＰＡ１基因保守序列作为探针，参照ＤＩＧｈｉｇｈｐｒｉｍｅＤＮＡｌａｂｅｌｉｎｇａｎｄｄｅｔｅｃｔｉｏｎｓｔａｒｔｅｒｋｉｔⅡ（高效ＤＮＡ地高辛
标记和检测试剂盒ＩＩ，购自Ｒｏｃｈｅ公司）标准程序进行。
１．４．４　ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析　采用ｐＨ值为８．９的小孔凝胶系统，分析低分子量蛋白质，参考何忠效和张树政［１３］
的《电泳》，略有改动。
１．４．５　氨基酸分析　采用柱前衍生化高效液相色谱法分析游离氨基酸，取苜蓿对照和２个转基因系幼苗，在
１０５℃的烘箱中杀青３０ｍｉｎ，然后在７５℃的烘箱中烘干，样品经６ｍｏｌ／ＬＨＣｌ在１１０℃恒温箱中水解２２ｈ后，抽
酸，定容。样品经离心分离后用ＡｃｃＱＦｌｕｏｒ试剂衍生，用高压液相色谱（ＨＰＬＣ）进行检测；色谱条件为 ＡｃｃＱ
ＴａｇＡａ分析柱，流动相Ａ：１４０ｍｍｏｌ／ＬＮａＡｃ溶液，Ｂ：６０％乙晴水溶液（６０：４０），流速１ｍＬ／ｍｉｎ。荧光检测，检
测波长为２５０ｎｍ。
２　结果与分析
２．１　ＰＡ１基因的克隆序列分析
将经ＰＣＲ和酶切鉴定后均呈阳性的菌落送至上海基康生物公司进行测序。测序结果如下，下划线的碱基表
示酶切位点，小写字母表示内含子边界：
ＣＧＣＣ ＡＴＧ ＧＣＴＴＣＣＧＴＴＡＡＡＣＴＣＧＣＴＴＣＴＴＴＧＡＴＣＧＴＣＴＴＧＴＴＴＧＣＣＡＣＡＴＴＡＧＧＴＡＣｇｔＡＡＴＴＴＡＴ
ＣＣＡＴＣＴＴＴＣＴＴＡＣＣＡＡＴＡＴＡＡＴＡＣＡＴＧＣＡＴＣＴＴＴＧＧＴＴＧＴＴＣＣＡＡＴＴＴＴａｇＴＴＧＡＣＴＴＴＧＣＣＡＡＴＴＧ
ＣＡＧＧＴＡＴＧＴＴＣＣＴＧＡＣＡＡＡＡＡＡＣＧＴＡＧＧＡＧＣＡＧＣＡＡＧＣＴＧＣＡＡＴＧＧＧＧＴＴＴＧＴＴＣＴＣＣＡＴＴＴＧＡＧＡ
ＴＧＣＣＡＣＣＡＴＧＴＧＧＣＡＣＴＴＣＡＧＣＴＴＧＴＣＧＡＴＧＴＡＴＣＣＣＴＧＴＴＧＧＴＣＴＡＴＴＴＡＴＡＧＧＴＴＡＣＴＧＣＡＧＡＡ
ＡＴＣＣＡＴＣＴＧＧＡＧＴＴＴＴＣＴＴＧＡＡＧＧＣＧＡＡＴＧＡＴＧＡＡＣＡＣＣＣＴＡＡＣＴＴＡＴＧＴＧＡＧＴＣＴＧＡＴＧＣＣＧＡＴＴ
ＧＴＡＧＧＡＡＧＡＡＡＧＧＡＡＧＴＧＧＴＡＡＣＴＴＴＴＧＣＧＧＴＣＡＴＴＡＴＣＣＴＡＡＴＣＣＴＧＡＴＡＴＴＧＡＡＴＡＴＧＧＡＴＧＧ
ＴＧＴＴＴＴＧＣＣＴＣＴＡＡＡＴＣＴＧＡＡＧＣＡＧＡＡＧＡＣＴＴＴＴＴＣＴＣＴＡＡＧＡＴＴＡＣＣＣＣＡＡＡＡＧＡＣＴＴＧＴＴＧＡＡＧ
ＡＧＴＧＴＴＴＣＣＡＣＴＧＣＴ ＴＡＡＧＧＴＣＡＣＣＣＧＧ
测序结果表明，以豌豆的基因组为模板可以克隆得到ＰＡ１基因片段，并且与ＮＣＢＩ发表的序列相比，只有８
个碱基（下双划线）发生改变。不影响其蛋白质结构。这说明得到的ＰＡ１的序列是正确的。
推测的蛋白质序列如下：
ＭＡＳＶＫＬＡＳＬＩＶＬＦＡＴＬＧＭＦＬＴＫＮ
獉獉獉獉獉獉獉獉獉獉獉獉獉獉獉獉獉獉獉獉獉獉獉
ＶＧＡＡＳＣＮＧＶＣＳＰＦＥＭＰＰＣＧＴＳＡＣＲＣＩＰＶＧＬ犉犐ＧＹＣＲＮＰＳＧＶＦ犔犓
ＡＮ ＤＥＨＰＮＬＣＥＳＤＡＤＣＲＫＫＧＳＧＮＦＣＧＨＹＰＮＰＤＩＥＹＧＷＣＦＡＳＫＳＥＡＥＤＦＦＳＫＩＴＰＫＤＬＬＫＳＶＳＴＡ
共１３０个氨基酸，其中有３个蛋氨酸，１０个半胱氨酸；着重号标记部分为信号肽；下划线部分为ＰＡ１ｂ；方框
部分为ＰＡ１ａ。斜体部分是与ＳＷＩＳＳＰＲＯＴ（国际蛋白质数据库）登录不同的２个氨基酸。
推测的蛋白质ＰＡ１ｂ亚基二硫键位置如图１。
图１　犘犃１犫多肽序列和二硫键位置
犉犻犵．１　犘犃１犫狆狅犾狔狋犻犱犲狊犲狇狌犲狀犮犲犪狀犱犱犻狊狌犾犳犻犱犲犫狅狀犱犾狅犮犪狋犻狅狀
２．２　ＰＡ１基因植物表达载体的构建及其检测
为了将富硫氨基酸和抗虫双功能基因ＰＡ１转入豆科牧草———苜蓿中，利用载体ｐＣＡＭＢＩＡ１３０１构建了植物
表达载体ｐＣＡＭＢＩＡ－ＰＡ１。载体的构建过程见图２：将目的片段插入到载体ｐＣＡＭＢＩＡ１３０１上原来ＧＵＳ基因
的位点上，即目的基因ＰＡ１取代了ＧＵＳ基因。
为了检测插入与否，我们分别进行的ＰＣＲ和犖犮狅Ｉ及犅狊狋狆Ｉ双酶切鉴定，无论ＰＣＲ（ｌｉｎｅ３）还是双酶切（ｌｉｎｅ
２）均获得了１条约４９０ｂｐ的片段，证明载体ｐＣＡＭＢＩＡ１３０１中插入了一段４９０ｂｐ的目的片段（图３）。
９１１第１８卷第３期 草业学报２００９年
图２　重组质粒狆犆犃犕犅犐犃－犘犃１
犉犻犵．２　犚犲犮狅犿犫犻狀犪狋犻狅狀狆犾犪狊犿犱狆犆犃犕犅犐犃－犘犃１
２．３　苜蓿的转化体的筛选与植株再生
图３　重组质粒的酶切与犘犆犚检测
犉犻犵．３　犈狀狕狔犿犲犱犻犵犲狊狋犻狅狀犪狀犱犘犆犚犲狓犪犿犻狀犪狋犻狅狀狅犳
狉犲犮狅犿犫犻狀犪狀狋狆犾犪狊犿犻犱狆犆犃犕犅犐犃－犘犃１犇犖犃
　　　Ｍ：λＤＮＡ／ＥｃｏＲⅠ＋ＨｉｎｄⅢ 分子标记１：阴性对照；２：重组质粒的
犖犮狅Ⅰ＆犅狊狋狆Ⅰ双酶切；３：重组质粒的ＰＣＲ扩增产物 Ｍ：λＤＮＡ／ＥｃｏＲ
Ⅰ＋ＨｉｎｄⅢ Ｍａｒｋｅｒ；１：Ｎｅｇａｔｉｖｅｃｏｎｔｒｏｌ；２：Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｐｌａｓｍｉｄｓｄｉｇｅｓ
ｔｅｄｂｙ犖犮狅Ⅰ＆犅狊狋狆Ⅰ；３：ＰＣＲｐｒｏｄｕｃｔｓｆｒｏｍｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｐｌａｓｍｉｄｓ
子叶外植体经处理之后，在筛选培养基Ｐ１／Ｐ２
上诱导愈伤组织。共处理培养基中含乙酰丁香酮
时，抗性出愈率最高为５９．４％，而无乙酰丁香酮时，
最高出愈率为４１％。转基因苜蓿产生的胚性愈伤
组织（图４１，２）在形成子叶胚后，绝大部分在含有
２５ｍｇ／Ｌ潮霉素的Ｐ３培养基上未能继续发育，逐
渐白化死亡，只有少数子叶胚可长成小植株，但生长
异常缓慢。若将３ｍｍ大小的子叶胚放到潮霉素为
１０ｍｇ／Ｌ的Ｐ３培养基上培养时，子叶胚的胚根开
始发育，胚根生长特别强壮，而苗端发育很慢。转基
因胚性愈伤组织形成的子叶胚常常聚集在愈伤组织
的某一个部位，在形态上与未转化的对照愈伤组织
有明显差别，后者形成的胚比较分散。若将胚性愈
伤组织放在Ｐ４培养基＝ＳＨ培养基＋ＫＴ（０．２）＋
ＮＡＡ（０．２）＋脯氨酸（１ｍｇ／Ｌ）＋谷氨酰胺（５００
ｍｇ／Ｌ）＋Ｃｅｆ（５ｍｇ／Ｌ）上培养时，曾得到大量发育
良好的子叶胚（图４６），并再生了植株（图４８，９）。
０２１ ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ（２００９） Ｖｏｌ．１８，Ｎｏ．３
Ｐ４培养基上培养的转基因胚性愈伤组织子叶胚部分出现畸形（图４３）、或３个（图４４）或４个（图４５，８）甚至更
多的子叶（图４７），有些再生植株的子叶肥厚（图４５）。
２．４　转基因苜蓿再生植株的ＰＣＲ检测
对苜蓿转化系潮霉素抗性再生植株Ⅰ～Ⅵ株系Ｔ１ 代进行了潮霉素磷酸转移酶基因（５０９ｂｐ）的ＰＣＲ扩增。
扩增后的电泳结果显示（图５），潮霉素磷酸转移酶基因已经整合到转化系再生植株染色体ＤＮＡ上。
对上述再生植株Ⅰ～Ⅵ Ｔ１代进行了目的基因ＰＡ１（４９０ｂｐ）的ＰＣＲ扩增。扩增后的电泳结果显示（图６），
ＰＡ１基因已经整合到抗性转化系Ⅰ～Ⅳ和Ⅵ的基因组中。
图４　转基因苜蓿的再生
犉犻犵．４　犚犲犵犲狀犲狉犪狋犻狅狀狅犳狋狉犪狀狊犵犲狀犻犮犕．狊犪狋犻狏犪
　１．筛选培养基上子叶愈伤组织；２．含２５ｍｇ／ｍＬ潮霉素的筛选培养基上的一个胚状体；３．一个非正常胚；４．一个含有３个子叶的胚；５．含有４个子
叶的芽；６．分化的芽；７．多子叶转基因苜蓿芽；８．多子叶转基因植株；９．移栽在土壤中的转基因植株１．Ｃａｌｉｆｒｏｍｃｏｔｙｌｅｄｏｎｓｅｇｍｅｎｔｓｏｎｓｅｌｅｃｔｉｏｎｍｅ
ｄｉｕｍ；２．Ａｎｅｍｂｒｙｏｇｒｏｗｉｎｇｏｎｓｅｌｅｃｔｅｄｍｅｄｉｕｍｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ２５ｍｇ／ｍＬＨｙｇｒｏｍｙｃｉｎ；３．Ａｎａｂｎｏｒｍａｌｅｍｂｒｙｏ；４．Ａｎｅｍｂｒｙｏｗｉｔｈ３ｃｏｔｙｌｅｄｏｎｓ；５．Ｅｍ
ｂｒｙｏｓｓｈｏｗｉｎｇｏｎｅｓｈｏｏｔｗｉｔｈ４ｃｏｔｙｌｅｄｏｎｓ；６．Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｎｇｓｈｏｏｔｓ；７．Ｍｕｌｔｉｃｏｔｙｌｅｄｏｎｓｈｏｏｔｓｏｆｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ犕．狊犪狋犻狏犪；８．Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｐｌａｎｔｓｗｉｔｈｍｕｌｔｉ
ｃｏｔｙｌｅｄｏｎ；９．Ａｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｐｌａｎｔｔｒａｎｓｐｌａｎｔｅｄｉｎｔｈｅｐｏｔｓｏｉｌ
图５　苜蓿转化系Ⅰ～Ⅵ的潮霉素基因的犘犆犚扩增
犉犻犵．５　犘犆犚犲狓犪犿犻狀犪狋犻狅狀犪犫狅狌狋犺狆狋狅犳狋狉犪狀狊犵犲狀犻犮犕．狊犪狋犻狏犪Ⅰ－Ⅵ
Ｍ：２００ｂｐＤＮＡ分子标记；１：非转基因苜蓿；２：ｐＣＡＭＢＩＡ１３０１质粒；３～８：转基因苜蓿Ⅰ～Ⅵ
Ｍ：２００ｂｐＤＮＡｍａｒｋｅｒ；１：Ｎｏｎｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ犕．狊犪狋犻狏犪；２：ＰｌａｓｍｉｄｐＣＡＭＢＩＡ１３０１；３－８：Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ犕．狊犪狋犻狏犪Ⅰ－Ⅵ
１２１第１８卷第３期 草业学报２００９年
２．５　转基因紫花苜蓿再生植株的Ｓｏｒｔｈｏｒｎｂｌｏｔ检测
转基因植株Ⅰ～Ⅳ和ⅥＳｏｕｔｈｅｎｂｌｏｔ杂交结果显示（图７），未转化的对照植株基因组（ｌｉｎｅ０）没有阳性信号；
５个转基因植株ＤＮＡ中，均出现阳性杂交信号，说明Ⅰ～Ⅳ和Ⅵ确为转基因植株，目的基因已经整合到苜蓿基因
组中，且拷贝数不同。这与ＰＣＲ检测结果相一致，说明采用本研究的筛选方法，获得的转基因植株的假阳性很
低。
２．６　转基因苜蓿再生植株ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析
转基因苜蓿再生植株ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳图谱显示（图８），在约２６０００Ｄａ处，转基因植株电泳谱带略有不同，
其中转化系Ⅲ、Ⅳ产生了分子量略小于对照的电泳谱带，而４个转化系均在约６０００和４０００Ｄａ处比对照多出１
条谱带。初步推测这条特异性条带有可能是ＰＡ１ａ和ＰＡ１ｂ基因表达产物。但仍需就电泳条件及蛋白提取方法
进行优化，以求进一步的研究证实。
２．７　转基因紫花苜蓿的游离氨基酸含量
在对照系紫花苜蓿中，蛋氨酸和半胱氨酸含量分别是０．１５％和０．１１％（表１），而２个转基因植株中蛋氨酸
和半胱氨酸含量分别提高到０．３８％，０．４３％和０．４１％，０．４７％，相当于对照系的３～４倍。虽然在转基因Ⅰ和Ⅳ
中天冬氨酸和丝氨酸含量有较大幅度降低，但各种必须氨基酸的含量较均衡。这样水平的含硫氨基酸含量在转
基因系中不再成为苜蓿氨基酸营养的限制因素，说明豌豆清蛋白在紫花苜蓿中成功表达。
图６　苜蓿转化系植株犘犃１基因的犘犆犚检测
犉犻犵．６　犘犆犚犲狓犪犿犻狀犪狋犻狅狀犪犫狅狌狋犘犃１狅犳狋狉犪狀狊犵犲狀犻犮犕．狊犪狋犻狏犪Ⅰ－Ⅵ
Ｍ：２００ｂｐＤＮＡ分子标记；１：ｐＣＡＭＢＩＡ－ＰＡ１质粒；２～７：转基因苜蓿Ⅰ～Ⅵ；８：非转基因苜蓿
Ｍ：２００ｂｐＤＮＡｍａｒｋｅｒ；１：ＰｌａｓｍｉｄｐＣＡＭＢＩＡ－ＰＡ１；２－７：Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ犕．狊犪狋犻狏犪Ⅰ－Ⅵ；８：Ｎｏｎｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ犕．狊犪狋犻狏犪
图７　犛狅狌狋犺犲狀犫犾狅狋检测苜蓿转基因苜蓿
犉犻犵．７　犛狅狌狋犺犲狉狀犲狓犪犿犻狀犪狋犻狅狀狅犳狋狉犪狀狊犵犲狀犻犮犕．狊犪狋犻狏犪
　０：非转基因苜蓿；Ｍ：质粒ｐＣＡＭＢＩＡ－ＰＡ１；１～５：转基因苜蓿Ⅰ～
Ⅳ 和Ⅵ０：Ｎｏｎｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ犕．狊犪狋犻狏犪；Ｍ：ｐＣＡＭＢＩＡ－ＰＡ１；１－５：Ｔｒａｎ
ｓｇｅｎｉｃ犕．狊犪狋犻狏犪Ⅰ－ⅣａｎｄⅥ
图８　转基因苜蓿再生植株犛犇犛－犘犃犌犈图谱
犉犻犵．８　犛犇犛－犘犃犌犈犲狓犪犿犻狀犪狋犻狅狀狅犳狋狉犪狀狊犵犲狀犻犮犕．狊犪狋犻狏犪
　Ｍ：蛋白质超低分子量标记；１；非转基因苜蓿２～５：转基因苜蓿Ⅰ～
Ⅳ 和Ⅵ Ｍ：Ｕｌｔｒａｌｏｗｍｏｌｅｃｕｌａｒｗｅｉｇｈｔｍａｒｋｅｒ；１：Ｎｏｎｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ犕．
狊犪狋犻狏犪；２－５：ＴｒａｎｓｇｅｎｉｃｐｌａｎｔｓⅠ－Ⅳ
２２１ ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ（２００９） Ｖｏｌ．１８，Ｎｏ．３
３　讨论
含硫氨基酸－蛋氨酸和半胱氨酸，在豆科牧草蛋
白质营养中占重要地位，但一般含量较低。苜蓿作为
一种最重要的牧草饲料，若能提高这２种氨基酸的含
量，将会大大改良其营养品质。通过常规育种手段提
高作物含硫氨基酸含量的潜力有限，而转基因技术则
可能实现这一目标［１４］。Ａｖｒａｈａｍ等［１０］报道，拟南芥
胱硫醚－γ合酶（ＡｔＣＧＳ）基因在转基因苜蓿中的过量
表达有效提高了苜蓿的蛋氨酸和半胱氨酸含量。最
近，Ｈａｃｈａｍ等［１５］的研究报道表明，突变型的天冬氨
酸激酶和拟南芥胱硫醚－γ合酶（ＡｔＣＧＳ）基因的表达
使得转基因烟草蛋氨酸含量和苏氨酸含量都得到很大
提高，显示了基因工程方法的可行性，具备可用来提高
含硫氨基酸含量的基因是首先必要的前提。ＰＡ１基
因曾作为富硫蛋白基因转化白三叶草（犜狉犻犳狅犾犻狌犿狉犲
狆犲狀狊），发现在转基因植物叶中有一定表达［１６］。１９９８
年，Ｍｏｒｔｏｎ等［１７］发现，豌豆清蛋白ＰＡ１基因对硫含
量敏感的位点存在于ＰＡ１基因的３′端非编码区。为
此，本试验用ＰＣＲ方法从豌豆（食荚大菜豌）中克隆了
豌豆清蛋白ＰＡ１基因约５００ｂｐ片段，去除硫敏感区。
测序结果与ＮＣＢＩ发表的序列相比，只有８个碱基发
生改变，ＤＮＡｓｔａｒ序列软件分析氨基酸同源序列比
对，发现该序列与豌豆中克隆的不同登记号的ＰＡ１基
因序列同源性达８９％～１００％，说明所克隆的基因确
表１　转基因苜蓿与对照系游离氨基酸的含量
犜犪犫犾犲１　犆狅狀狋犲狀狋狅犳犪犿犻狀犪犪犮犻犱狊 ％
氨基酸
Ａｍｉｎｏａｃｉｄ
对照
Ｃｏｎｔｒｏｌ
转基因Ⅰ
Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ
ｐｌａｎｔⅠ
转基因 Ⅳ
Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ
ｐｌａｎｔⅣ
天冬氨酸Ａｓｐ ２．６３ ２．０１ １．８９
苏氨酸Ｔｈｒ ０．５３ ０．５５ ０．５４
丝氨酸Ｓｅｒ ０．６１ ０．３３ ０．３８
谷氨酸Ｇｌｕ １．１１ １．５６ １．６４
脯氨酸Ｐｒｏ ０．８４ １．０１ ０．９８
甘氨酸Ｇｌｙ ０．５２ ０．８８ ０．７３
丙氨酸Ａｌａ ０．５７ ０．５５ ０．５５
半胱氨酸Ｃｙｒ ０．１１ ０．４３ ０．４７
缬氨酸Ｖａｌ ０．８２ ０．７１ ０．６９
甲硫氨酸 Ｍｅｔ ０．１５ ０．３８ ０．４１
异亮氨酸Ｉｌｅ ０．５４ ０．６２ ０．５９
亮氨酸Ｌｅｕ ０．７６ ０．５３ ０．４９
酪氨酸Ｔｙｒ ０．２８ ０．７１ ０．６６
苯丙氨酸Ｐｈｅ ０．６５ ０．３５ ０．４１
赖氨酸Ｌｙｓ ０．９７ １．０７ １．１１
组氨酸 Ｈｉｓ ０．２９ ０．３３ ０．３０
精氨酸Ａｒｇ ０．４８ ０．５１ ０．５９
总氨基酸含量
Ｔｏｔａｌａｍｉｎａａｃｉｄｓｃｏｎｔｅｎｔ
１１．８６ １２．５３ １２．４３
系ＰＡ１基因。进而用所克隆的ＰＡ１基因构建了植物表达载体（ｐＣＡＭＢＩＡ－ＰＡ１１３０１），通过农杆菌转化苜蓿，
经潮霉素筛选培养，成功得到了多个潮霉素抗性再生植株。ＰＣＲ检测和Ｓｏｕｔｈｅｒｎｂｌｏｔｔｉｎｇ分析证明，潮霉素抗
性基因和ＰＡ１基因都整合到了转基因苜蓿再生植株叶子中。游离氨基酸分析表明ＰＡ１基因得到了表达。在所
测的２个转化系Ⅰ和Ⅳ中，蛋氨酸含量相当于对照（野生型）的２．５３和２．７５倍；半胱氨酸含量分别相当于对照的
３．９１和４．２７倍。这就表明，ＰＡ１基因的表达提高了这２种含硫氨基酸的积累水平。值得注意的是，在２种含硫
氨基酸含量提高的同时，转基因苜蓿的游离氨基酸总量并没有降低，反而比对照有所提高。转基因苜蓿的ＳＤＳ－
ＰＡＧＥ电泳图谱显示，所测的４个转化系均在６０００和４０００Ｄａ处比未转化系多出１条带。这些特异条带很可
能是ＰＡ１基因表达的２条多肽链，但仍然需要进一步证明。应该提及的是ｐＣＡＭＢＩＡ－ＰＡ１１３０１质粒所带基因
的导入引起转基因苜蓿再生过程中的形态变异，包括转化系与对照在相同培养条件下，气孔的开闭时间不一致，
且开合度也不相同，对照在晚上少数能够完全开开，但转化系始终处于半开状态，夜里有部分关闭，而且对照与转
化系气孔的形状也不很相同。在其他转抗病、抗虫基因的植物，如枸杞（犔狔犮犻狌犿犮犺犻狀犲狀狊犲）［１８］、拟南芥［１９］等中，也
曾发现气孔的变化，如气孔指数和气孔导度均有下降。这就间接表明在这些转基因植株中气孔开度有所下降。
尤其值得注意的变异是在胚状体中出现多子叶现象（图４７）。曾对其进行染色体检查，并未发现染色体数目变
异，可能是染色体结构或基因插入引起的，其原因有待研究。
本研究结果表明，从食荚大菜豌豌豆克隆的ＰＡ１基因转化苜蓿的初步结果显示，ＰＡ１基因的过量表达是提
３２１第１８卷第３期 草业学报２００９年
高苜蓿含硫氨基酸合成水平的可行手段。关于它在增强抗虫性方面的作用及其转基因植物的遗传稳定性都值得
进一步研究。
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ｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｃｒｉｔｉｃａｌｐａｒａｍｅｔｅｒｓｉｎｆｌｕｅｎｃｉｎｇｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ［Ｊ］．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ＆ＧｅｎｅｒａｌＧｅｎｅｔｉｃｓ，１９９１，２３０：４７５４８５．
４２１ ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ（２００９） Ｖｏｌ．１８，Ｎｏ．３
犆犾狅狀犻狀犵狅犳犘犃１犵犲狀犲犳狉狅犿犘犻狊狌犿狊犪狋犻狏狌犿犪狀犱犵犲狀犲狋犻犮狋狉犪狀狊犳狅狉犿犪狋犻狅狀狅狀犕犲犱犻犮犪犵狅狊犪狋犻狏犪
ＺＨＡＮＧＧａｉｎａ１，２，ＪＩＡＪｉｎｇｆｅｎ２
（１．ＣｏｌｅｇｅｏｆＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅｏｆＨｅｎａｎＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＳｃｉｅｎｃｅａｎｄＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｌｕｏｙａｎｇ４７１０００，Ｃｈｉｎａ；
２．ＳｃｈｏｏｌｏｆＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅ，ＮｏｒｔｈｗｅｓｔＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｘｉ’ａｎ７１００６９，Ｃｈｉｎａ）
犃犫狊狋狉犪犮狋：Ａｇｅｎｅ，ａｓｕｌｐｈｕｒｒｉｃｈａｎｄｉｎｓｅｃｔｔｏｘｉｃｓｅｅｄａｌｂｕｍｉｎＰＡ１ｇｅｎｅ，ｗａｓｃｌｏｎｅｄｂｙＰＣＲｍｅｔｈｏｄｆｒｏｍＰｉ
ｓｕｍｓａｔｉｖｕｍ （ｃｕｌｔｉｖａｒｓｈｉｊｉａｄａｃａｉｗａｎ）．Ｉｎｏｒｄｅｒｔｏｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｅｔｈｅｆｕｎｃｔｉｏｎｏｆｔｈｉｓｇｅｎｅ，ａｐｌａｎｔｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ
ｖｅｃｔｏｒ，ｐＣＡＭＢＩＡ１３０１－ＰＡ１，ｗａｓｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ．Ｔｈｉｓｖｅｃｔｏｒｗａｓｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄｉｎｔｏ犕．狊犪狋犻狏犪ｖｉａ犃犵狉狅犫犪犮狋犲狉犻
狌犿ｍｅｄｉａｔｅｄｍｅｔｈｏｄ．Ｔｈｅｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓｆｏｒｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｗｅｒｅｏｐｔｉｍｉｚｅｄ．Ｔｈｅｓｅｖｅｒａｌｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｅｍｂｒｙｏｇｅｎｉｃ
ｃａｌｉａｎｄｒｅｇｅｎｅｒａｔｅｄｐｌａｎｔｌｅｔｓｗｅｒｅｏｂｔａｉｎｅｄ．ＰＣＲａｎｄＳｏｕｔｈｅｒｎｂｌｏｔｔｉｎｇｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｃｏｎｆｉｒｍｅｄｔｈａｔＰＡ１
ｇｅｎｅａｎｄｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎＢｐｈｏｓｐｈｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅｒｅｓｉｓｔａｎｔｇｅｎｅｈａｓｂｅｅｎｉｎｔｅｇｒａｔｅｄｉｎｔｏｔｈｅｇｅｎｏｍｅｏｆ犕．狊犪狋犻狏犪，
ＳＤＳ－ＰＡＧＥａｎａｌｙｓｉｓｉｎｄｉｃａｔｅｄｔｈａｔＰＡ１ｇｅｎｅｅｘｐｒｅｓｓｅｄｉｎｔｈｅｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｌｉｎｅｓ．Ｆｒｅｅａｍｉｎｏａｃｉｄａｎａｌｙｓｉｓ
ｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｔｈｅｌｅｖｅｌｓｏｆｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅａｎｄｃｙｓｔｅｉｎｅｉｎｔａｎｓｇｅｎｉｃ犕．狊犪狋犻狏犪．Ｐｌａｎｔｌｅｔｓｉｍｐｒｏｖｅｄｆｒｏｍ０．１％ｔｏ
０．４％．
犓犲狔狑狅狉犱狊：ＰＡ１ｇｅｎｅ；ｓｕｌｐｈｕｒｒｉｃｈａｍｉｎｏａｃｉｄ；犕犲犱犻犮犪犵狅狊犪狋犻狏犪；ｇｅｎｅｔｉｃｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ
５２１第１８卷第３期 草业学报２００９年