全 文 ：书犆狉狔Ⅲ犃基因植物表达载体构建及马铃薯遗传转化
尤佳１，２，张宁２，文义凯２，吴家和３，司怀军１，２，王蒂１
（１．甘肃省干旱生境作物学省部共建国家重点实验室培育基地 甘肃省作物遗传改良与种质创新重点实验室，甘肃 兰州７３００７０；
２．甘肃农业大学生命科学技术学院，甘肃 兰州７３００７０；３．中国科学院微生物研究所植物
基因组学国家重点实验室，北京１００１０１）
摘要：利用ＩｎＦｕｓｉｏｎ技术将酶切位点不匹配、目的基因内部含载体酶切位点的犆狉狔Ⅲ犃 基因和植物表达载体
ｐＢＩ１２１相连接，分别成功构建了组成型启动子ＣａＭＶ３５Ｓ和马铃薯茎叶特异表达启动子ＳＴＬＳ１驱动的犆狉狔Ⅲ犃
基因植物表达载体。利用冻融法将２个重组质粒转入根癌农杆菌ＬＢＡ４４０４，转化马铃薯栽培品种陇薯３号和甘农
薯２号获得了转化植株，经卡那霉素筛选和ＰＣＲ检测，共有１０株阳性植株犆狉狔Ⅲ犃基因成功整合到马铃薯基因组
中。经实时荧光定量ＰＣＲ检测表明，犆狉狔Ⅲ犃基因在ＣａＭＶ３５Ｓ驱动的犆狉狔Ⅲ犃转基因植株的根、茎、叶中均有表
达，且在叶中表达量较高，茎和根次之；在马铃薯茎叶特异表达启动子ＳＴＬＳ１驱动的犆狉狔Ⅲ犃转基因植株中，在根
中未见表达，仅在茎、叶中表达，且在叶中表达量较高。
关键词：ＩｎＦｕｓｉｏｎ；犆狉狔Ⅲ犃基因；表达载体；马铃薯；遗传转化
中图分类号：Ｓ４３５．３２；Ｑ９４３．２ 文献标识码：Ａ 文章编号：１００４５７５９（２０１４）０１０２４８０９
犇犗犐：１０．１１６８６／ｃｙｘｂ２０１４０１３０
马铃薯甲虫（犔犲狆狋犻狀狅狋犪狉狊犪犱犲犮犲犿犾犻狀犲犪狋犪）属鞘翅目叶甲科，又称马铃薯叶甲或科罗拉多马铃薯甲虫（Ｃｏｌｏ
ｒａｄｏｐｏｔａｔｏｂｅｅｔｌｅ，ＣＰＢ），是国际公认的毁灭性检疫害虫，也是我国重要外来入侵物种之一。因其具有高繁殖
率、滞育和迁飞等习性，生态可塑性强，且世代重叠，防治难度大，其主要以成虫和幼虫取食叶片，通常将植株叶片
吃光，仅剩茎秆，其危害造成马铃薯产量一般损失为３０％～５０％，严重者可达９０％以上，甚至绝产。而且还可传
播病害，如褐斑病、环腐病等［１２］。近年来我国检疫部门通过口岸检疫截获马铃薯甲虫的频率在逐步增加［３］。由
此可见，我国马铃薯甲虫的防控形势十分严峻。利用植物基因工程的方法选育优良的抗虫植物品种已被证实为
一种控制虫害的有效途径［４］。目前全世界总共已获得了５０多种转犅狋基因植物［５］，在已获得的转犅狋基因植物
中，绝大多数植物对靶标昆虫产生了强烈的毒杀作用，有效地减轻了由害虫所造成损失。尽管转犅狋基因抗虫植
物在生产上已经展现出了良好的应用前景，但依旧存在一些问题需要妥善地加以解决，否则就有可能影响其持续
利用，甚至产生一些不良后果，其中昆虫对转犅狋杀虫晶体蛋白产生抗性的问题尤为严峻［６］。犅狋犆狉狔Ⅲ犃基因是
一种能抗鞘翅目（犆狅犾犲狅狆狋犲狉犪）昆虫的基因，Ｓｕｔｔｏｎ等［７］对特异毒杀鞘翅目昆虫的犆狉狔Ⅲ犃基因进行了重新合成。
试验显示，表达该基因的烟草（犖犻犮狅狋犻犪狀犪狋犪犫犪犮狌犿）蛋白质提取物对ＣＰＢ有明显的抑制作用，表明改造后的
犆狉狔Ⅲ犃基因在抗甲虫转基因植物研究上具有应用价值，对抑制检疫性害虫ＣＰＢ具有一定作用。Ｐｅｒｌａｋ等［８］用
合成的犆狉狔Ⅲ犃基因，也获得了可有效抵抗ＣＰＢ的转基因马铃薯（犛狅犾犪狀狌犿狋狌犫犲狉狅狊狌犿）植株。１９９５年，孟山都公
司转犆狉狔Ⅲ犃基因的抗甲虫马铃薯新品种（Ｎｅｗｌｅａｆ）获准商业化生产。
本研究选用的犆狉狔Ⅲ犃基因内部含有植物表达载体ｐＢＩ１２１的酶切位点，选用传统的酶切连接方法需要采用
平端连接的方法，为此首先需要Ｋｌｅｎｏｗ酶将酶切后突出的５′末端填平，再用Ｔ４ＤＮＡ聚合酶将突出的３′末端删
去。为了减少载体的自身环化，还经常采用牛小肠碱性磷酸酶将载体５′末端的磷酸基团去除［９］。但平端连接的
效率非常低，而且较难确定插入片段的正反方向。为了实现定向克隆，人们常采用ＴＡ克隆载体进行重组，但要
将目的基因插入片段克隆到所需要的载体上尚需一轮亚克隆，因此操作比较繁琐，实验难度大，工作周期长［１０］。
２４８－２５６
２０１４年２月
草 业 学 报
ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ
第２３卷 第１期
Ｖｏｌ．２３，Ｎｏ．１
收稿日期：２０１３０１０７；改回日期：２０１３０３０５
基金项目：甘肃省农业科技创新项目（ＧＮＣＸ２０１１４９）和国家公益性行业（农业）科研专项（２０１１０３０２６２）资助。
作者简介：尤佳（１９８８），女，甘肃兰州人，硕士。Ｅｍａｉｌ：ａｂｂｙｙｊ＠１２６．ｃｏｍ
通讯作者。Ｅｍａｉｌ：ｈｊｓｉ＠ｇｓａｕ．ｅｄｕ．ｃｎ，ｗａｎｇｄ＠ｇｓａｕ．ｅｄｕ．ｃｎ
ＩｎＦｕｓｉｏｎ克隆技术是新兴发展起来的克隆技术，该技术的原理是目的基因的ＰＣＲ引物的５′端加上与线性
化载体同源的碱基序列，以使ＰＣＲ的扩增产物两端分别带上１５个和线性化载体两端同源的碱基序列。ＩｎＦｕ
ｓｉｏｎ酶可以识别ＰＣＲ产物和线性化载体两端的同源序列，将ＰＣＲ产物置换到目标载体上从而发生同源重组，这
种技术不受载体和酶切位点限制，不附加冗余序列，适用于各种载体模型构建，也可以完成多片段连接实验和定
点突变实验，是一种快捷高效的克隆技术。本研究采用ＩｎＦｕｓｉｏｎ克隆技术成功构建了组成型启动子ＣａＭＶ３５Ｓ
和马铃薯茎叶特异表达启动子ＳＴＬＳ１驱动的犆狉狔Ⅲ犃基因植物表达载体，并转化马铃薯获得了转基因植株，对
犆狉狔Ⅲ犃基因在转基因植株中的表达特性进行了分析，为选育抗甲虫转基因马铃薯新品系奠定了一定的基础。
１ 材料与方法
１．１ 材料
１．１．１ 菌株和载体 大肠杆菌（犈狊犮犺犲狉犻犮犺犻犪犮狅犾犻）ＤＨ５α、根癌农杆菌（犃犵狉狅犫犪犮狋犲狉犻狌犿狋狌犿犲犳犪犮犻犲狀狊）ＬＢＡ４４０４及
植物表达载体ｐＢＩ１２１由甘肃农业大学作物遗传改良与种质创新重点实验室提供。含合成的苏云金芽孢杆菌杀
虫晶体蛋白犆狉狔Ⅲ犃 基因的质粒ｐＢｉｎ４３８犆狉狔Ⅲ犃［１１］，由中国科学院微生物研究所吴家和副研究员提供。将
ｐＢＩ１２１中的组成型启动子ＣａＭＶ３５Ｓ置换为马铃薯茎叶特异表达启动子ＳＴＬＳ１的质粒的ｐＢＩ１２１ＳＴＬＳ１由
本实验室构建并保存。
１．１．２ 酶及生化试剂 ＬＡ犜犪狇ＤＮＡ聚合酶，限制性核酸内切酶犎犻狀ｄⅢ、犅犪犿ＨⅠ、犛犪犮Ⅰ，ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔＲＴｒｅ
ａｇｅｎｔＫｉｔｗｉｔｈｇＤＮＡＥｒａｓｅｒ，ＳＹＢＲ?ＰｒｅｍｉｘＥｘＴａｑＴＭ ＧＣ购自ＴａＫａＲａ公司；ＩｎＦｕｓｉｏｎ? ＨＤＣｌｏｎｉｎｇＫｉｔ购
自Ｃｌｏｎｔｅｃｈ公司；ＤＮＡ胶回收试剂盒购自上海生物工程技术服务有限公司。常用的化学试剂为国产分析纯。
引物由上海生物工程技术服务有限公司合成。溶液配方及常用抗生素与激素的配置详见文献［１２］。
１．１．３ 引物设计 根据已知的犆狉狔Ⅲ犃ｃＤＮＡ的序列设计合成扩增引物，为了使扩增的目的片段与经犅犪犿ＨⅠ
和犛犪犮Ⅰ酶切后的线性化ｐＢＩ１２１载体发生同源重组反应，在扩增目的片段的上、下游引物的５′端分别加入与载
体线性化位点两侧序列同源的１５～２０ｂｐ。下划线处为鉴定酶切位点，虚线为根据犆狉狔Ⅲ犃的ＣＤＳ区序列设计
的引物。正向引物ｉｎｆｕｓｉｏｎＦ１：５′ＧＧＡＣＴＣＴＡＧＡＧＧＡＴＣＣＡＴＧＡＣＴＧＣＴＧＡＴＡＡＣＡＡＣＡＣ
Ｇ３′（下划线为
犅犪犿ＨⅠ 位点）和反向引物ｉｎｆｕｓｉｏｎＲ１：５′ＧＡＴＣＧＧＧＧＡＡＡＴＴＣＧＡＧＣＴＣＴＴＡＡＴＴＣＡＣＴＧＧＡＡＴＧ
ＡＡ
ＣＴＣ３′（下划线为犛犪犮Ⅰ位点）。同理，准确找出茎叶特异表达启动子ＳＴＬＳ１启动ＧＵＳ的表达载体ｐＢＩ１２１ＳＴ
ＬＳ１被限制性内切酶犅犪犿ＨⅠ、犛犪犮Ⅰ酶切成为线性载体后两端１５～２０ｂｐ的准确序列，与根据犆狉狔Ⅲ犃的ＣＤＳ
区序列设计的引物按照要连接的方向拼成完整的定制引物。正向引物ｉｎｆｕｓｉｏｎＦ２：５′ＧＴＧＡＧＡＧＣＡＡ
ＧＧＡＴＣＣＡＴＧＡＣＴＧＣＴＧＡＴＡＡＣＡＡＣＡＣＧ３′（下 划 线 为 犅犪犿ＨⅠ 位 点）和 反 向 引 物ｉｎｆｕｓｉｏｎＲ２：５′
ＧＡＴＣＧＧＧＧＡＡＡＴＴＣＧＡＧＣＴＣＴＴＡＡＴＴＣＡＣＴＧＧＡＡＴＧＡＡＣ
ＴＣ３′（下划线为犛犪犮Ⅰ位点）。另外在犆狉狔Ⅲ犃
的ＣＤＳ区序列中间设计一对普通引物作为检测引物，序列为ＪＣＰＦ：５′ＣＡＧＡＡＧＡＴＴＧＣＣＧＡＴＴＡＣＧ３′和
ＪＣＰＲ：５′ＧＡＧＴＣＧＴＴＡＣＣＧＴＡＧＴＡＴＣＣＴＧ３′，扩增片段大小为７０９ｂｐ。引物由上海生物工程技术服务有限
公司合成，用无菌去离子水溶解至终浓度为１０μｍｏｌ／Ｌ，－２０℃保存备用。
１．２ 植物表达载体的构建
１．２．１ 目的片段的ＰＣＲ 提取ｐＢｉｎ４３８ＣｒｙⅢＡ的质粒为模板，分别用正向引物ｉｎｆｕｓｈｉｏｎＦ１、反向引物ｉｎｆｕ
ｓｉｏｎＲ１ 和正向引物ｉｎｆｕｓｉｏｎＦ２、反向引物ｉｎｆｕｓｉｏｎＲ２ 进行ＰＣＲ扩增，反应程序：９４℃４ｍｉｎ，９４℃１ｍｉｎ，５５℃
１ｍｉｎ３０ｓ，７２℃１ｍｉｎ，３５个循环，７２℃１０ｍｉｎ，４℃保存。用１．５％琼脂糖进行ＰＣＲ产物凝胶电泳，用ＤＮＡ快
速纯化回收试剂盒回收目的片段，具体操作按产品说明书进行。
１．２．２ 植物表达载体ｐＢＩ１２１线性化处理 犅犪犿ＨⅠ和犛犪犮Ⅰ限制性酶双酶切植物表达载体ｐＢＩ１２１和ｐＢＩ１２１
ＳＴＬＳ１。酶切反应体系为：质粒ＤＮＡ８μＬ＋ｄｄＨ２Ｏ８μＬ＋１０×ＫＢｕｆｆｅｒ２μＬ＋犅犪犿ＨⅠ１μＬ＋犛犪犮Ⅰ１μＬ，反
应体系共２０μＬ。３７℃恒温酶切１６ｈ，１．５％的琼脂糖凝胶电泳检测酶切结果，从胶上切下目的条带，用ＤＮＡ快
速纯化回收试剂盒回收目的片段，具体操作按产品说明书进行。
９４２第２３卷第１期 草业学报２０１４年
１．２．３ 建立ＩｎＦｕｓｉｏｎ连接体系 回收后的线性化载体和目的基因用Ｉｍｐｌｅｎ超微量分光光度计测浓度，根据
目的基因与载体摩尔比１０∶１来计算出各所需的体积，连接体系如下：５×ＩｎＦｕｓｉｏｎＨＤＥｎｚｙｍｅＰｒｅｍｉｘ２μＬ＋
ＬｉｎｅａｒｉｚｅｄＶｅｃｔｏｒ６μＬ＋ＰｕｒｉｆｉｅｄＰＣＲＦｒａｇｍｅｎｔ２μＬ，反应体系共１０μＬ。５０℃水浴反应１５ｍｉｎ，－２０℃贮存。
组成型启动子ＣａＭＶ３５Ｓ和马铃薯茎叶特异表达启动子ＳＴＬＳ１驱动的犆狉狔Ⅲ犃 基因植物表达载体ｐＢＩ１２１
ＣａＭＶ３５ＳＣｒｙＩＩＩＡ和ｐＢＩ１２１ＳＴＬＳ１ＣｒｙＩＩＩＡ构建示意图分别见图１和图２。
图１ 植物表达载体狆犅犐１２１犆犪犕犞３５犛犆狉狔犐犐犐犃构建示意图
犉犻犵．１ 犆狅狀狊狋狉狌犮狋犻狅狀犱犻犪犵狉犪犿狅犳狆犾犪狀狋犲狓狆狉犲狊狊犻狅狀狏犲犮狋狅狉狆犅犐１２１犆犪犕犞３５犛犆狉狔犐犐犐犃
图２ 植物表达载体狆犅犐１２１犛犜犔犛１犆狉狔犐犐犐犃构建示意图
犉犻犵．２ 犆狅狀狊狋狉狌犮狋犻狅狀犱犻犪犵狉犪犿狅犳狆犾犪狀狋犲狓狆狉犲狊狊犻狅狀狏犲犮狋狅狉狆犅犐１２１犛犜犔犛１犆狉狔犐犐犐犃
将上述连接产物转化大肠杆菌 ＤＨ５α感受态细胞，用质粒ＰＣＲ和酶切鉴定的方法证明构建是否成功。
ＣａＭＶ３５Ｓ驱动的犆狉狔Ⅲ犃基因重组载体质粒用犅犪犿ＨⅠ和犛犪犮Ⅰ进行双酶切鉴定；ＳＴＬＳ１驱动犆狉狔Ⅲ犃基因
重组载体除了用犅犪犿ＨⅠ和犛犪犮Ⅰ进行双酶切鉴定外，用犅犪犿ＨⅠ和犎犻狀ｄⅢ也进行一次双酶切。双酶切反应体
系：质粒ＤＮＡ８μＬ＋ｄｄＨ２Ｏ８μＬ＋１０×ＫＢｕｆｆｅｒ２μＬ＋犅犪犿ＨⅠ１μＬ＋犛犪犮Ⅰ（犎犻狀ｄⅢ）１μＬ，３７℃，６ｈ。１％
的琼脂糖凝胶电泳检测酶切结果。目的基因序列的测定由上海生工有限公司完成。正确后即可用于农杆菌的转
化。农杆菌的转化方法见文献［１３］，转化及鉴定方法参照文献［１４１７］。
１．３ 农杆菌介导的马铃薯试管薯遗传转化与植株再生
１．３．１ 马铃薯试管薯的诱导 以马铃薯栽培品种陇薯３号和甘农薯２号为实验材料。试管苗在无菌条件下剪
０５２ ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ（２０１４） Ｖｏｌ．２３，Ｎｏ．１
成带有２个腋芽的茎段，转接到 ＭＳ＋３％蔗糖＋０．４５％琼脂的固体培养基上。用１５０ｍＬ三角瓶培养，每瓶装
５０ｍＬ固体培养基，接种５个茎段，２０００ｌｘ光照下培养３周，形成壮苗。将试管苗在ＭＳ＋３％蔗糖的液体培养基
上生长３周后，倒出三角瓶中的液体培养基，加入５０ｍＬ的诱导培养基［ＭＳ＋５ｍｇ／Ｌ６ＢＡ（６苄氨基嘌呤，６
ｂｅｎｚｙｌａｍｉｎｏｐｕｒｉｎｅ）＋８％蔗糖］，置于暗处条件下诱导结薯。
１．３．２ 诱导芽与生根选择压的确定 将直径为５ｍｍ左右的马铃薯试管薯从三角瓶里取出后切成厚度为１
ｍｍ左右的薄片，分别接种于附加０，２５，５０，７５ｍｇ／ＬＫａｎ（卡那霉素，ｋａｎａｍｙｃｉｎ）的芽诱导培养基上，培养基为
ＭＳ＋１ｍｇ／ＬＩＡＡ（吲哚３乙酸，ｉｎｄｏｌｅ３ａｃｅｔｉｃａｃｉｄ）＋０．２ｍｇ／ＬＧＡ３（赤霉素，ｇｉｂｂｅｒｅｌｉｃａｃｉｄ）＋０．５ｍｇ／Ｌ６
ＢＡ＋２ｍｇ／ＬＺＴ（玉米素核苷，ｚｅａｔｉｎｒｉｂｏｓｉｄｅ）。培养４周后，确定抑制芽分化的最低 Ｋａｎ浓度。将无菌试管苗
剪成带有２个腋芽的茎段接种于分别附加５０，７５，１００ｍｇ／ＬＫａｎ的 ＭＳ培养基上，３周后观察无菌苗的生根状
况，并确定抑制生根的最低Ｋａｎ浓度。
１．３．３ 农杆菌工程菌液的制备 吸取１ｍＬ含目的基因的农杆菌菌液接种于５０ｍＬ含Ｋａｎ（５０ｍｇ／Ｌ）和Ｒｉｆ
（利福平，ｒｉｆａｍｐｉｃｉｎ，５０ｍｇ／Ｌ）的ＬＢ液体培养基中，于２８℃、２６０ｒ／ｍｉｎ避光振荡培养过夜。吸取１ｍＬ接种于
５０ｍＬ含 Ｋａｎ（５０ｍｇ／Ｌ）和Ｒｉｆ（５０ｍｇ／Ｌ）的ＬＢ液体培养基中２８℃、２６０ｒ／ｍｉｎ避光振荡培养３～４ｈ至对数生
长期，然后转入无菌离心管中，于５０００ｒ／ｍｉｎ离心６ｍｉｎ，收集菌体用等量液体 ＭＳ培养基重新悬浮后用于转化，
其处理所用菌液浓度ＯＤ６００为０．５。
１．３．４ 外植体侵染与植株再生 将直径为０．５ｃｍ左右的试管薯切成２ｍｍ的薄片，置于农杆菌工程菌液中浸
泡７ｍｉｎ，期间不断摇动，使菌液与薯片充分接触。然后用无菌滤纸吸去多余菌液，转入固体 ＭＳ培养基于２８℃、
黑暗条件下共培养２ｄ，然后转移到分化培养基［ＭＳ＋１ｍｇ／ＬＩＡＡ＋０．２ｍｇ／ＬＧＡ３＋０．５ｍｇ／Ｌ６ＢＡ＋２ｍｇ／Ｌ
ＺＴ＋５０ｍｇ／ＬＫａｎ＋２００ｍｇ／ＬＣａｒｂ（羧苄青霉素，ｃａｒｂｅｎｉｃｉｌｉｎ）］，置于光照度２０００ｌｘ，光周期１６ｈ／ｄ，温度２４℃
的条件下，１０ｄ换一次培养基，培养３～４周即可分化出芽。待芽长０．５～１．０ｃｍ时切下转入生根培养基（ＭＳ＋
１００ｍｇ／ＬＫａｎ＋２００ｍｇ／ＬＣａｒｂ），进行生根筛选和扩繁。
１．４ 转基因植株鉴定
１．４．１ 转化再生植株的ＰＣＲ检测 将待检测植株和对照植株的叶片用ＣＴＡＢ（十六烷基三甲基溴化胺，ｃｅｔｙｌｔ
ｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍｂｒｏｍｉｄｅ）法提取总ＤＮＡ。参照Ｓａｍｂｒｏｏｋ等［１４］的方法对抗性植株进行ＰＣＲ检测。以检
测引物ＪＣＰＦ和ＪＣＰＲ进行ＰＣＲ扩增，预期片段大小为７０９ｂｐ。用１％琼脂糖凝胶电泳检测ＰＣＲ结果。
１．４．２ 转基因植株的实时荧光定量（ｑＲＴＰＣＲ）检测与分析 分别提取ＤＮＡ检测呈阳性植株的茎、叶和根总
ＲＮＡ，用ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔＲＴｒｅａｇｅｎｔＫｉｔｗｉｔｈｇＤＮＡＥｒａｓｅｒ反转录试剂进行反转录，具体操作按产品说明书进行。
以马铃薯犲犳１犪 基因为内参（扩增引物为ｅｆ１ａＦ：５′ＣＡＡＧＧＡＴＧＡＣＣＣＡＧＣＣＡＡＧ３′和ｅｆ１ａＲ：５′ＴＴＣＣＴ
ＴＡＣＣＴＧＡＡＣＧＣＣＴＧＴ３′），以犆狉狔Ⅲ犃基因序列设计一对特异性较高的引物ＢｔＦ：５′ＴＣＴＡＣＡＧＡＧＣＣＧＴＧ
ＧＣＡＡＡＣ３′和ＢｔＲ：５′ＣＴＧＧＧＡＴＧＧＴＴＣＣＴＣＴＧＣＴＡＣ３′。利用ＳＹＢＲ荧光染料法进行转基因植株实时荧
光定量（ｑＲＴＰＣＲ）检测与分析［１４］，根据公式２－△△Ｃｔ计算出犆狉狔Ⅲ犃基因在根、茎、叶中的相对表达量。
２ 结果与分析
２．１ 植物表达载体构建
２．１．１ 组成型表达启动子ＣａＭＶ３５Ｓ驱动的犆狉狔Ⅲ犃基因表达载体构建 对重组载体进行质粒ＰＣＲ鉴定，检
测引物ＪＣＰＦ和ＪＣＰＲ扩出约７００ｂｐ大小的条带（图３泳道１），引物ｉｎｆｕｓｉｏｎＦ１ 和ｉｎｆｕｓｉｏｎＲ１ 扩出约１８００ｂｐ
大小的条带（犆狉狔Ⅲ犃基因大小为１７９４ｂｐ，引物还含有线性化载体两端共３６ｂｐ大小的碱基），扩增得到的目的片
段与预期大小一致（图３泳道２）。用犅犪犿ＨⅠ和犛犪犮Ⅰ进行重组质粒双酶切鉴定，获得大小约１３０００，１５００，３００
ｂｐ三条带（犆狉狔Ⅲ犃基因第３２８个碱基位置含有犛犪犮Ⅰ的酶切位点，用犛犪犮Ⅰ进行酶切不仅可以将其从重组载体
上切下，而且会从中间切断，基因整体大小为１７９４ｂｐ，酶切后会成为１４６６和３２８ｂｐ两个片段），得到目的片段大
小均与预期大小一致（图４）。重组质粒经上海生工有限公司测序表明得到的序列正确。
１５２第２３卷第１期 草业学报２０１４年
２．１．２ 马铃薯茎叶特异表达启动子ＳＴＬＳ１驱动的犆狉狔Ⅲ犃基因表达载体构建 对重组载体进行质粒ＰＣＲ鉴
定，检测引物ＪＣＰＦ和ＪＣＰＲ扩出约７００ｂｐ大小的条带（图５泳道２），引物ｉｎｆｕｓｉｏｎＦ２ 和ｉｎｆｕｓｉｏｎＲ２ 扩出约
１８００ｂｐ大小的条带，与预期大小一致（图５泳道１）。分别用犅犪犿ＨⅠ和犛犪犮Ⅰ、犅犪犿ＨⅠ和犎犻狀ｄⅢ进行重组质
粒双酶切鉴定，犅犪犿ＨⅠ和犛犪犮Ⅰ切出大小应为１３０００，１５００和３００ｂｐ三条带（犆狉狔Ⅲ犃基因第３２８个碱基位置含
有犛犪犮Ⅰ的酶切位点，用犛犪犮Ⅰ进行酶切后会成为１４６６和３２８ｂｐ两个片段）。犅犪犿ＨⅠ和犎犻狀ｄⅢ双酶切得到大
小约１４０００和１６００ｂｐ两条带（茎叶特异启动子ＳＴＬＳ１启动ＧＵＳ的表达载体ｐＢＩ１２１大小为１５４５９ｂｐ，切掉
ＧＵＳ连上犆狉狔Ⅲ犃基因大小为１５３５９ｂｐ，启动子大小为１５７２ｂｐ），得到目的片段大小均与预期大小一致（图６）。
重组质粒经上海生工有限公司测序表明得到的序列正确。
图３ 重组质粒狆犅犐１２１犆犪犕犞３５犛犆狉狔犐犐犐犃的犘犆犚扩增鉴定
犉犻犵．３ 犐犱犲狀狋犻犳犻犮犪狋犻狅狀狅犳狉犲犮狅犿犫犻狀犪狀狋狆犾犪狊犿犻犱狆犅犐１２１
犆犪犕犞３５犛犆狉狔犐犐犐犃犫狔犘犆犚犪犿狆犾犻犳犻犮犪狋犻狅狀
Ｍ：ＤＬ２０００标记ＤＬ２０００ｍａｒｋｅｒ；１：检测引物ＪＣＰＦ和ＪＣＰＲ的ＰＣＲ
扩增重组质粒产物 ＰＣＲｐｒｏｄｕｃｔｏｆｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｐｌａｓｍｉｄｕｓｉｎｇｔｅｓｔｉｎｇ
ｐｒｉｍｅｒｓＪＣＰＦａｎｄＪＣＰＲ；２：引物ｉｎｆｕｓｉｏｎＦ１和ｉｎｆｕｓｉｏｎＲ１的ＰＣＲ扩增
重组质粒产物ＰＣＲｐｒｏｄｕｃｔｏｆｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｐｌａｓｍｉｄｕｓｉｎｇｐｒｉｍｅｒｓｉｎｆｕｓｉｏｎ
Ｆ１ａｎｄｉｎｆｕｓｉｏｎＲ１．
图４ 重组质粒狆犅犐１２１犆犪犕犞３５犛犆狉狔犐犐犐犃的酶切鉴定
犉犻犵．４ 犐犱犲狀狋犻犳犻犮犪狋犻狅狀狅犳狉犲犮狅犿犫犻狀犪狀狋狆犾犪狊犿犻犱狆犅犐１２１
犆犪犕犞３５犛犆狉狔犐犐犐犃犫狔犲狀狕狔犿犲犱犻犵犲狊狋犻狅狀
Ｍ：ＤＬ２０００标记ＤＬ２０００ｍａｒｋｅｒ；１：重组质粒犅犪犿ＨⅠ／犛犪犮Ⅰ
双酶切产物犅犪犿ＨⅠ／犛犪犮Ⅰｄｏｕｂｌｅｅｎｚｙｍｅｄｉｇｅｓｔｉｏｎｐｒｏｄｕｃｔｓｏｆ
ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｐｌａｓｍｉｄ．
图５ 重组质粒狆犅犐１２１犛犜犔犛１犆狉狔犐犐犐犃的犘犆犚扩增鉴定
犉犻犵．５ 犐犱犲狀狋犻犳犻犮犪狋犻狅狀狅犳狉犲犮狅犿犫犻狀犪狀狋狆犾犪狊犿犻犱狆犅犐１２１犛犜
犔犛１犆狉狔犐犐犐犃犫狔犘犆犚犪犿狆犾犻犳犻犮犪狋犻狅狀
Ｍ：ＤＬ２０００标记ＤＬ２０００ｍａｒｋｅｒ；１：引物ｉｎｆｕｓｉｏｎＦ２和ｉｎｆｕｓｉｏｎＲ２
的ＰＣＲ扩增重组质粒产物ＰＣＲｐｒｏｄｕｃｔｏｆｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｐｌａｓｍｉｄｕｓｉｎｇ
ｐｒｉｍｅｒｓｉｎｆｕｓｉｏｎＦ２ａｎｄｉｎｆｕｓｉｏｎＲ２；２：检测引物ＪＣＰＦ和ＪＣＰＲ的
ＰＣＲ扩增重组质粒产物ＰＣＲｐｒｏｄｕｃｔｏｆｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｐｌａｓｍｉｄｕｓｉｎｇ
ｔｅｓｔｉｎｇｐｒｉｍｅｒｓＪＣＰＦａｎｄＪＣＰＲ．
图６ 重组质粒狆犅犐１２１犛犜犔犛１犆狉狔犐犐犐犃的酶切鉴定
犉犻犵．６ 犐犱犲狀狋犻犳犻犮犪狋犻狅狀狅犳狉犲犮狅犿犫犻狀犪狀狋狆犾犪狊犿犻犱狆犅犐１２１犛犜
犔犛１犆狉狔犐犐犐犃犫狔犲狀狕狔犿犲犱犻犵犲狊狋犻狅狀
Ｍ１：ＤＬ２０００标记 ＤＬ２０００ ｍａｒｋｅｒ；Ｍ２：ＤＬ１５０００标记 ＤＬ１５０００
ｍａｒｋｅｒ；１：重组质粒 犅犪犿ＨⅠ／犛犪犮Ⅰ双酶切产物 犅犪犿ＨⅠ／犛犪犮Ⅰ
ｄｏｕｂｌｅｅｎｚｙｍｅｄｉｇｅｓｔｉｏｎｐｒｏｄｕｃｔｓｏｆｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｐｌａｓｍｉｄ；２：重组质粒
犅犪犿ＨⅠ／犎犻狀ｄⅢ双酶切产物犅犪犿ＨⅠ／犎犻狀ｄⅢｄｏｕｂｌｅｅｎｚｙｍｅｄｉｇｅｓ
ｔｉｏｎｐｒｏｄｕｃｔｓｏｆｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｐｌａｓｍｉｄ．
２５２ ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ（２０１４） Ｖｏｌ．２３，Ｎｏ．１
利用冻融法将２个重组质粒转入根癌农杆菌ＬＢＡ４４０４，挑取单克隆的转化菌接种培养，提取质粒ＤＮＡ进行
ＰＣＲ鉴定，能特异地扩增出大小约１８００ｂｐ（引物ｉｎｆｕｓｉｏｎＦ２ 和ｉｎｆｕｓｉｏｎＲ２）和７００ｂｐ（引物ＪＣＰＦ和ＪＣＰＲ）左
右的片段，表明２个重组质粒均成功转入农杆菌中。
２．２ 马铃薯遗传转化与生根选择压的确定
马铃薯试管薯薄片在芽分化培养基上经过２～３周的培养，未转化对照组的外植体能直接分化长出绿色健壮
小芽；在２５ｍｇ／ＬＫａｎ选择浓度下，农杆菌转化外植体分化芽的情况与对照无明显差异；在５０ｍｇ／ＬＫａｎ选择浓
度下，对照组外植体已经基本不能分化出芽。因而确定芽诱导时Ｋａｎ的选择压为５０ｍｇ／Ｌ。４周后，转化试管薯
薄片分化出绿色小芽（图７）。马铃薯植株经过３周的生根选择培养，未转化对照组的植株未能生根（图８），而转
化植株能够正常生根（图８，９）。
图７ 试管薯薄片在含有卡那霉素的分化培养基上再生出绿色小芽
犉犻犵．７ 犌狉犲犲狀狊犺狅狅狋狊狉犲犵犲狀犲狉犪狋犲犱犱犻狉犲犮狋犾狔犳狉狅犿犿犻犮狉狅狋狌犫犲狉犱犻狊犮狊狅狀狋犺犲犱犻犳犳犲狉犲狀狋犻犪狋犻狅狀犿犲犱犻狌犿犮狅狀狋犪犻狀犻狀犵犽犪狀犪犿狔犮犻狀
Ａ：表达载体ｐＢＩ１２１ＣａＭＶ３５ＳＣｒｙＩＩＩＡ转化薯片 ＭｉｃｒｏｔｕｂｅｒｄｉｓｃｓｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄｂｙｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｖｅｃｔｏｒｐＢＩ１２１ＣａＭＶ３５ＳＣｒｙＩＩＩＡ；Ｂ：表达载体
ｐＢＩ１２１ＳＴＬＳ１ＣｒｙＩＩＩＡ转化薯片 ＭｉｃｒｏｔｕｂｅｒｄｉｓｃｓｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄｂｙｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｖｅｃｔｏｒｐＢＩ１２１ＳＴＬＳ１ＣｒｙＩＩＩＡ．
图８ 转化植株在附加１００犿犵／犔犓犪狀
培养基上进行生根选择
犉犻犵．８ 犚狅狅狋犻狀犵狊犲犾犲犮狋犻狅狀狅犳狋狉犪狀狊犳狅狉犿犲犱狆犾犪狀狋狊狅狀
狋犺犲犿犲犱犻狌犿犮狅狀狋犪犻狀犻狀犵１００犿犵／犔犓犪狀
Ａ，Ｃ：未转基因的对照植株 Ｎｏｎｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｃｏｎｔｒｏｌ
ｐｌａｎｔｓ；Ｂ，Ｄ：转化植株Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄｐｌａｎｔｓ．
图９ 转化植株在附加１００犿犵／犔犓犪狀培养基上生根
犉犻犵．９ 犚狅狅狋犻狀犵狅犳狋狉犪狀狊犳狅狉犿犲犱狆犾犪狀狋狊狅狀狋犺犲犿犲犱犻狌犿
犮狅狀狋犪犻狀犻狀犵１００犿犵／犔犓犪狀
Ａ：ｐＢＩ１２１ＣａＭＶ３５ＳＣｒｙＩＩＩＡ 转 化 植 株 Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄｐｌａｎｔｓ ｗｉｔｈｐｌａｓｍｉｄ
ｐＢＩ１２１ＣａＭＶ３５ＳＣｒｙＩＩＩＡ；Ｂ：ｐＢＩ１２１ＳＴＬＳ１ＣｒｙＩＩＩＡ 转化植株 Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ
ｐｌａｎｔｓｗｉｔｈｐｌａｓｍｉｄｐＢＩ１２１ＳＴＬＳ１ＣｒｙＩＩＩＡ．
２．３ 转基因植株检测与分析
ＰＣＲ扩增产物的电泳分析结果表明，转化植株可扩增到７０９ｂｐ的特异性条带，而未转化的植株中无该片段
的产生（图１０），从而初步证明再生植株为转基因植株。经Ｋａｎ抗性生根筛选和ＰＣＲ扩增鉴定共获得１０株抗性
植株，对其进行ｑＲＴＰＣＲ检测，结果表明，转基因马铃薯植株有典型的荧光扩增曲线；且其Ｃｔ值都小于４０，而非
３５２第２３卷第１期 草业学报２０１４年
转基因植株和空白对照其荧光扩增曲线都呈现平直，且都位于阈值线之下。ＣａＭＶ３５Ｓ为组成型强启动子，其驱
动的犆狉狔Ⅲ犃转基因马铃薯在不同组织中基因均有表达，从相对表达量来看，犆狉狔Ⅲ犃基因在马铃薯根、茎、叶中
的表达有显著差异，其中叶的平均表达量是茎和根的４～５倍（图１１）；茎叶特异表达启动子ＳＴＬＳ１驱动的犆狉狔
Ⅲ犃转基因马铃薯茎、叶中有表达，根的荧光扩增曲线呈现平直，未见表达，从相对表达量来看，叶的表达量也高
出茎４倍左右（图１２）。
图１０ 部分转基因植株的犘犆犚检测
犉犻犵．１０ 犇犲狋犲犮狋犻狅狀狅犳狊狅犿犲狋狉犪狀狊犵犲狀犻犮狆犾犪狀狋狊犫狔犘犆犚
Ｍ：ＤＬ２０００标记ＤＬ２０００ｍａｒｋｅｒ；１：质粒阳性对照Ｐｏｓｉｔｉｖｅｃｏｎｔｒｏｌｏｆｐｌａｓｍｉｄ；２：空白对照Ｂｌａｎｋｃｏｎｔｒｏｌ；３～７：ｐＢＩ１２１ＣａＭＶ３５ＳＣｒｙＩＩＩＡ转化植
株ＴｒａｎｓｆｏｒｍｅｄｐｌａｎｔｓｗｉｔｈｐｌａｓｍｉｄｐＢＩ１２１ＣａＭＶ３５ＳＣｒｙＩＩＩＡ；８～１３：ｐＢＩ１２１ＳＴＬＳ１ＣｒｙＩＩＩＡ转化植株ＴｒａｎｓｆｏｒｍｅｄｐｌａｎｔｓｗｉｔｈｐｌａｓｍｉｄｐＢＩ１２１
ＳＴＬＳ１ＣｒｙＩＩＩＡ；１４～１５：非转基因马铃薯Ｎｏｎｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｐｌａｎｔｓ．
图１１ 狆犅犐１２１犆犪犕犞３５犛犆狉狔犐犐犐犃转基因植株的
狇犚犜犘犆犚组织特异性表达检测
犉犻犵．１１ 犜犻狊狊狌犲狊狆犲犮犻犳犻犮犲狓狆狉犲狊狊犻狅狀犪狊狊犪狔狅犳狋犺犲狋狉犪狀狊犵犲狀犻犮
狆犾犪狀狋狊狑犻狋犺狆犅犐１２１犆犪犕犞３５犛犆狉狔犐犐犐犃犫狔狇犚犜犘犆犚
Ｔ１～Ｔ５为５个不同的转基因株系。Ｔ１－Ｔ５ａｒｅ５ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ
ｐｌａｎｔｌｉｎｅｓ．
图１２ 狆犅犐１２１犛犜犔犛１犆狉狔犐犐犐犃转基因植株的
狇犚犜犘犆犚组织特异性表达检测
犉犻犵．１２ 犜犻狊狊狌犲狊狆犲犮犻犳犻犮犲狓狆狉犲狊狊犻狅狀犪狊狊犪狔狅犳狋犺犲狋狉犪狀狊犵犲狀犻犮
狆犾犪狀狋狊狑犻狋犺狆犅犐１２１犛犜犔犛１犆狉狔犐犐犐犃犫狔狇犚犜犘犆犚
Ｔ６～Ｔ１０为５个不同的转基因株系。Ｔ６－Ｔ１０ａｒｅ５ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｔｒａｎｓｇｅｎ
ｉｃｐｌａｎｔｌｉｎｅｓ．
３ 讨论
基因重组技术是分子生物学中常用的方法，是研究基因功能的基本手段。但在基因重组中经常会出现插入
的目的基因片段与载体的酶切位点不匹配，致使基因重组出现困难。为解决酶切位点不匹配的情况，人们常采用
平端连接，但是平端连接的操作步骤多，连接效率极低以及需要鉴定正反向插入等缺点。为克服上述困难，本实
验采用ＩｎＦｕｓｉｏｎ技术成功构建了组成型启动子ＣａＭＶ３５Ｓ和马铃薯茎叶特异表达启动子ＳＴＬＳ１驱动的
犆狉狔Ⅲ犃基因植物表达载体。ＩｎＦｕｓｉｏｎ技术构建重组质粒具有以下优点：适用范围极广，平、粘末端连接都适用，
只要线性化载体就行；不用连接酶、不用载体的去磷酸化、反应混合物５０℃水浴１５ｍｉｎ即可，节省了时间；可以
实现靶向克隆，避免了鉴定正反向插入的麻烦；插入的目的基因从起始密码子序列开始，没有两端多余的序列，不
４５２ ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ（２０１４） Ｖｏｌ．２３，Ｎｏ．１
影响后续基因的表达；重组效率高；无需末端抹平。该方法避免了传统克隆方法难以克服的困难，是一种简便高
效、省时省力的基因克隆手段。实验能否成功的关键在于引物的设计。这种方法引物设计的原则是引物的５′末
端必须包含与载体末端相同的１５个碱基序列，引物的３′末端必须包含与目的基因片段相互补的特异碱基序列，
补齐酶切位点缺失碱基。该实验采用的ｉｎｆｕｓｉｏｎ酶，可以识别ＰＣＲ产物和线性化载体的两端同源序列，并将
ＰＣＲ产物置换到目标载体上从而发生同源重组。在这一过程中，为了提高同源重组率，目的基因片段和目标载
体的比例要合适，二者的摩尔数之比一般（８～１０）∶１较好。ＰＣＲ产物浓度会比酶切回收的载体浓度高很多，所
以合理控制二者比例才能有效连接。
犆狉狔Ⅲ犃 基因编码的Ｂｔ毒素蛋白具有对人、畜及害虫天敌极少或完全没有毒害作用的特点，已成为目前世
界上应用最广泛地微生物杀虫剂。自从１９８７年比利时的Ｖａｅｃｋ等［１８］报道了首例转犅狋基因烟草的研究结果以
来，Ｂｔ毒素蛋白基因已在烟草、棉花（犌狅狊狊狔狆犻狌犿ｓｐｐ．）、水稻（犗狉狔狕犪狊犪狋犻狏犪）、玉米（犣犲犪犿犪狔狊）、番茄（犛狅犾犪狀狌犿
犾狔犮狅狆犲狉狊犻犮狌犿）、甘蓝（犅狉犪狊狊犻犮犪狅犾犲狉犪犮犲犪）等５０余种植物上获得成功［１９２０］。Ｃｏｏｐｅｒ等［２１］已经成功获得抗马铃薯
甲虫的转犅狋基因马铃薯，国内也有少数相关的研究报道［２２］。尽管运用现代基因工程技术得到了大量的转犅狋基
因植物，然而随着转犅狋毒蛋白基因植物的大面积种植，给昆虫造成很高的选择压力，可能会使昆虫对此毒蛋白产
生抗性，这些不容忽视的问题限制了这些转基因植物向商品化、实用化方向发展。为此，本研究运用ＣａＭＶ３５Ｓ
强组成型启动子驱动犆狉狔Ⅲ犃基因来提高Ｂｔ毒蛋白基因的表达量来提高转基因植株的抗虫性；同时，本研究充
分考虑到基因表达的时空特异性，选用马铃薯茎叶特异表达启动子ＳＴＬＳ１，使目的基因犆狉狔Ⅲ犃基因只限定在
容易被马铃薯甲虫危害的叶片和茎秆中特异表达，从而实现对目的基因的表达调控，而目的基因在块茎中不表
达，从而使人们食用转基因马铃薯更加安全。本研究通过ｑＲＴＰＣＲ检测分析表明在ＣａＭＶ３５Ｓ和ＳＴＬＳ１启动
子驱动的犆狉狔Ⅲ犃转基因马铃薯植株中，犆狉狔Ⅲ犃基因在叶中的表达量最高，且在ＳＴＬＳ１启动子驱动的犆狉狔Ⅲ犃
转基因植株的根中未见表达。对于转基因植株抗虫效果的鉴定正在进行中。
４ 结论
采用ＩｎＦｕｓｉｏｎ技术成功构建了组成型启动子ＣａＭＶ３５Ｓ和马铃薯茎叶特异表达启动子ＳＴＬＳ１驱动的
犆狉狔Ⅲ犃基因植物表达载体，转化马铃薯栽培品种获得了转基因植株，应用组织特异性表达启动子ＳＴＬＳ１实现
了目的基因的定向表达，为丰富转基因理论和培育抗甲虫转基因马铃薯新品系奠定了基础。
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犆狅狀狊狋狉狌犮狋犻狅狀狅犳犪狆犾犪狀狋犲狓狆狉犲狊狊犻狅狀狏犲犮狋狅狉狅犳狋犺犲犆狉狔Ⅲ犃犵犲狀犲犪狀犱犻狋狊犵犲狀犲狋犻犮狋狉犪狀狊犳狅狉犿犪狋犻狅狀犻狀狆狅狋犪狋狅
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（１．ＧａｎｓｕＰｒｏｖｉｎｃｉａｌＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＡｒｉｄｌａｎｄＣｒｏｐＳｃｉｅｎｃｅ，ＧａｎｓｕＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＣｒｏｐＧｅｎｅｔｉｃ＆
ＧｅｒｍｐｌａｓｍＥｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ，Ｌａｎｚｈｏｕ７３００７０，Ｃｈｉｎａ；２．ＣｏｌｅｇｅｏｆＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅａｎｄＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，
ＧａｎｓｕＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｌａｎｚｈｏｕ７３００７０，Ｃｈｉｎａ；３．ＳｔａｔｅＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙ
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６５２ ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ（２０１４） Ｖｏｌ．２３，Ｎｏ．１