全 文 ：书马铃薯和拟南芥犌犃犘犆酶基因的克隆及分析
邹雪，张烨，吴明阳，王西瑶
（四川农业大学农学院，四川 成都６１１１３０）
摘要：胞质三磷酸甘油醛脱氢酶（ＧＡＰＣ）是糖酵解中的关键酶，近年的研究表明其对盐、低温、高温、氧化、高渗、低
磷等多种逆境胁迫均有响应。本实验采用ＲＴ－ＰＣＲ，分别从马铃薯和拟南芥中克隆ＧＡＰＣ的编码区序列（ＣＤＳ），
并作生物信息学比较，同时构建２个基因的植物表达载体。结果表明，犛狋犌犃犘犆和犃狋犌犃犘犆２的ＣＤＳ长度均为
１０１７ｂｐ，相似性８４％，编码３３８个氨基酸，相似性为９２％。蛋白分子量分别为３６．６５和３６．９１ｋＤａ，理论等电点为
６．３４和６．６７，均属稳定蛋白；三级结构预测表明两者和水稻（２ｅ５ｒＣ）ＧＡＰＣ蛋白结构相似，具有 ＧＡＰＣ保守功能
域。多种植物犌犃犘犆基因的序列进化分析表明同科属植物的同源性较高可归于同一分支，与现有的分类系统相对
应。以ｐＢＩ１２１为基础载体，构建了由ＣａＭＶ３５Ｓ启动犌犃犘犆基因的植物表达载体，导入农杆菌ＥＨＡ１０５，经ＰＣＲ
检测确定获得阳性克隆。本研究为获得转犌犃犘犆基因的材料并进一步研究ＧＡＰＣ在逆境中的功能奠定基础。
关键词：马铃薯；拟南芥；胞质３磷酸甘油醛脱氢酶；基因克隆；生物信息学分析
中图分类号：Ｓ５３２．０３；Ｑ９４３．２ 文献标识码：Ａ 文章编号：１００４５７５９（２０１４）０１０２３９０９
犇犗犐：１０．１１６８６／ｃｙｘｂ２０１４０１２９
３磷酸甘油醛脱氢酶（ｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ３ｐｈｏｓｐｈａｔｅｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ，ＧＡＰＤＨ）是生物中普遍存在的酶。在高
等植物中，根据其存在位置、催化的反应可分为３类：１）磷酸化ＮＡＤ依赖型和非磷酸化ＮＡＤＰ依赖型，由４个相
同ＧａｐＣ亚基组成，存在于胞质中参与糖酵解，前者催化的反应产生含高能磷酸键的产物并在下一步反应中生成
３磷酸甘油酸和ＡＴＰ，后者催化反应直接形成３磷酸甘油酸，没有ＡＴＰ的产生；２）磷酸化ＮＡＤ依赖型，存在于
质体中；３）磷酸化ＮＡＤＰＨ依赖型，由ＧａｐＡ和ＧａｐＢ两种亚基组成，存在于叶绿体中，参与卡尔文循环［１２］。由
于糖酵解和卡尔文循环都是植物细胞能量代谢的主要途径，因此ＧＡＰＤＨ在植物碳代谢和能量代谢中起关键作
用。Ｂｒｉｎｋｍａｎｎ等［３］、Ｒｕｓｓｅｌ 和Ｓａｃｈｓ［４］最初从玉米（犣犲犪犿犪狔狊）中克隆到３个胞质三磷酸甘油醛脱氢酶基因
（犌犃犘犆）［３４］，迄今已从多种植物中克隆到该基因，如拟南芥（犃狉犪犫犻犱狅狆狊犻狊狋犺犪犾犻犪狀犪）、水稻（犗狉狔狕犪狊犪狋犻狏犪）、西伯利
亚蓼（犘狅犾狔犵狅狀狌犿狊犻犫犻狉犻犮狌犿）［５７］。最初人们认为ＧＡＰＣ蛋白仅参与糖酵解其ｍＲＮＡ在细胞内表达稳定，因此将
犌犃犘犆作为ＲＴＰＣＲ（ｒｅｖｅｒｓｅｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎ，反转录聚合酶链式反应）等检测中的内参
基因，但近年来越来越多的研究表明植物ＧＡＰＣ对盐、干旱、高渗、低温、高温、活性氧、低磷、病菌侵染等多种逆
境胁迫均有响应，并通过过量表达犌犃犘犆基因获得了抗盐胁迫的水稻和马铃薯（犛狅犾犪狀狌犿狋狌犫犲狉狅狊狌犿）［８１４］。
磷对重要粮食作物马铃薯的块茎形成以及淀粉积累都有良好的促进作用，并交叉影响抗逆表现，而我国农田
有２／３缺磷，因此研究马铃薯的磷吸收利用机制并通过生物技术增强马铃薯对磷的吸收和利用效率具有重要意
义［１５１８］。王西瑶等［１０，１９］从拟南芥耐低磷突变体中首先鉴定到犃狋ＧＡＰＣ２蛋白与耐低磷性状相关，进一步分析表
明低磷诱导该基因（犃狋犌犃犘犆２）转录增强，ＴＤＮＡ插入突变体表现出对低磷胁迫的敏感性。Ｐｅｎａｌｏｚａ等［９］研究
发现白羽扇豆（犔狌狆犻狀狌狊犪犾犫狌狊）在低磷胁迫的早期及晚期与ＮＡＤ依赖型ＧＡＰＤＨ同源的基因表达增强，推测糖
酵解在白羽扇豆响应低磷胁迫的特殊机制中起作用。但 Ｈａｊｉｒｅｚａｅｉ等［２０］通过反义技术沉默马铃薯犌犃犘犆基因
（犛狋犌犃犘犆），表明该基因在马铃薯块茎形成的代谢调节上仅发挥次要作用。
犛狋犌犃犘犆和犃狋犌犃犘犆２所编码的蛋白在功能多样性上是否具有差异，犌犃犘犆的过量表达能否提高马铃薯对
第２３卷 第１期
Ｖｏｌ．２３，Ｎｏ．１
草 业 学 报
ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ
２３９－２４７
２０１４年２月
收稿日期：２０１３０２２６；改回日期：２０１３０４０２
作者简介：邹雪（１９８４），女，四川彭山人，在读博士。Ｅｍａｉｌ：ｚｏｕ＿ｘｕｅ＿２００８＠ａｌｉｙｕｎ．ｃｏｍ
通讯作者。Ｅｍａｉｌ：ｗｘｙｒｔｌ＠１６３．ｃｏｍ
低磷、盐等多种逆境胁迫的抗性，为此本实验分别克隆了这２个基因并对两者的序列和蛋白结构作对比分析；同
时利用多种植物的犌犃犘犆序列建立进化树，分析环境胁迫对ＧＡＰＣ进化及功能多样性产生的影响；最后分别构
建了这２个基因的植物表达载体，为进一步验证ＧＡＰＣ的功能多样性并获得耐逆境胁迫的马铃薯材料奠定基
础。
１ 材料与方法
１．１ 试验材料
野生型拟南芥种子（Ｃｏｌｕｍｂｉａ生态型），由四川农业大学玉米研究所张素芝教授提供。马铃薯栽培型品种米
拉，由四川农业大学农学院马铃薯研究开发中心提供。植物表达载体ｐＢＩ１２１由四川农业大学李立芹副教授惠
赠，克隆载体ｐＭＤＴＭ１９ＴＳｉｍｐｌｅＶｅｃｔｏｒ（ＴａＫａＲａ）购自宝生物公司。
１．２ 方法
１．２．１ 犃狋犌犃犘犆２和犛狋犌犃犘犆基因的克隆 实验于２０１０年１０－１２月在四川农业大学农学院马铃薯研究开发
中心完成，分别取拟南芥和马铃薯幼苗叶片１００ｍｇ，采用Ｔｒｉｚｏｌ法提取总ＲＮＡ，以４０μＬＤＥＰＣ（ｄｉｅｔｈｙｌｐｙｒｏ
ｃａｒｂｏｎａｔｅ，焦碳酸二乙酯）处理水溶解。反转录合成ｃＤＮＡ第一链，体系为２０μＬ，在用ＤＥＰＣ处理过的无菌０．２
ｍＬＰＣＲ管中依次加入：ｏｌｉｇｏｄＴ１μＬ，ＲＮＡ３μＬ，ＤＥＰＣ处理水８μＬ，轻微混匀并离心３０ｓ，６５℃变性５ｍｉｎ，冰
上急冷２ｍｉｎ，按序加入５×ＲｅａｃｔｉｏｎＢｕｆｆｅｒ４μＬ，ＲＮａｓｅ抑制剂 （２０Ｕ／μＬ）１μＬ，１０ｍｍｏｌ／ＬｄＮＴＰＭｉｘ２μＬ，
反转录酶 （２００Ｕ／μＬ）１μＬ。轻微混匀稍离心，４２℃，６０ｍｉｎ，７２℃１０ｍｉｎ终止反应。以第一链为模板，ＰＣＲ扩
增目的片段，根据ＮＣＢＩ上公布的犃狋犌犃犘犆２（拟南芥）和犛狋犌犃犘犆（马铃薯）的ＣＤＳ全长序列（ＡｃｃｅｓｓｉｏｎＮｏ．
ＡＹ０９０２７５，ＡＦ５２７７７９），用Ｏｌｉｇｏ６软件分别设计引物并引入犡犫犪Ⅰ、犛犿犪Ⅰ酶切位点。
犃狋犌犃犘犆２Ｐ１：５′ＴＣＴＡＧＡＡＴＧＧＣＴＧＡＣＡＡＧＡＡＧＡＴＣＡＧＡＡＴ３′，Ｐ２：５′ＣＣＣＧＧＧＴＴＡＧＧＣＣＴＴＴＧＡ
ＣＡＴＧＴＧＡＡＣＧ３′。
犛狋犌犃犘犆Ｐ１：５′ＴＣＴＡＧＡＡＴＧＧＣＣＡＡＴＧＧＣＡＡＧＡＴＣＡＡＡＡＴ３′，Ｐ２：５′ＣＣＣＧＧＧＴＣＡＡＧＣＣＴＴＧＧＣ
ＣＡＴＡＴ３′。
ＰＣＲ扩增体系为２５μＬ，反应体系中加入：ｄｄＨ２Ｏ１６μＬ，１０×ＰＣＲｂｕｆｆｅｒ２．５μＬ，Ｐ１（１０μｍｏｌ／Ｌ）０．５μＬ，
Ｐ２（１０μｍｏｌ／Ｌ）０．５μＬ，ｄＮＴＰＭｉｘｔｕｒｅ（２．５ｍｍｏｌ／Ｌ）２．０μＬ，ｃＤＮＡ，１．０μＬ（拟南芥或马铃薯），犜犪犓犪犚犪犈狓
犜犪狇０．５μＬ，ＭｇＣｌ２２．０μＬ。ＰＣＲ扩增反应条件，拟南芥：９４℃预变性５ｍｉｎ；９４℃变性３０ｓ，５８℃退火３０ｓ，７２℃
延长６０ｓ，３０个循环；７２℃ 延长１０ｍｉｎ。马铃薯：９５℃预变性３ｍｉｎ；９５℃变性３０ｓ，６８℃退火延长９０ｓ，３０个循
环；６８℃ 延长１０ｍｉｎ。产物于１％琼脂糖凝胶电泳检测。
１．２．２ 基因克隆及测序 电泳检测后回收纯化目的片段，与克隆载体ｐＭＤＴＭ１９ＴＳｉｍｐｌｅＶｅｃｔｏｒ在４℃连接２４
ｈ，１０μＬ连接体系如下：ｐＭＤ１９ＴＶｅｃｔｏｒ０．５μＬ，ＩｎｓｅｒｔＤＮＡ３．５μＬ，ＳｏｌｕｔｉｏｎＩ５μＬ，ｄｄＨ２Ｏ１μＬ。将连接产
物转化大肠杆菌ＤＨ５α感受态，在涂有Ｘｇａｌ（２０ｍｇ／ｍＬ）４０μＬ 和ＩＰＴＧ（２００ｍｇ／ｍＬ）４μＬ的含 Ａｍｐ（１００
μｇ／ｍＬ）的ＬＢ平板上作蓝白斑筛选。将筛选的白色单克隆提质粒作ＰＣＲ检测和质粒酶切鉴定，酶切反应体系
２０μＬ：犡犫犪Ⅰ和犛犿犪Ⅰ０．５／０．５μＬ，０．１％ＢＳＡ０．２μＬ，１０×ＴＢｕｆｆｅｒ２．０μＬ，ｄｄＨ２Ｏ１．８μＬ，质粒１５．０μＬ。
３０℃水浴６ｈ，１％琼脂糖凝胶电泳检测。最后各随机选取３个克隆，３次重复测序（上海生工生物工程股份有限
公司）。
１．２．３ 序列分析与比较 将测得的序列拼接后通过ＮＣＢＩ的ＢＬＡＳＴ寻找核苷酸同源序列（ｈｔｔｐ：／／ｂｌａｓｔ．ｎｃ
ｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）。利用 ＰｒｏｔＰａｒａｍ 程序预测氨基酸序列分子量和理论等电点（ｐＩ）、不稳定系数等，用
ＰｒｏＳｃａｌｅ程序预测蛋白疏水性，通过ＣｏｎｓｅｒｖｅｄＤｏｍａｉｎｓ程序进行保守功能区分析（ｈｔｔｐ：／／ａｕ．ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ／）。
将氨基酸序列提交ＳｗｉｓｓＭｏｄｅｌ预测三级结构，用Ｒａｓｍｏｌ２．６查看图像。用ＣｌｕｓｔａｌＸ和ＤＮＡＭＡＮ对克隆的
两种基因作核苷酸和氨基酸序列比对，并将ＮＣＢＩ中不同植物的犌犃犘犆序列数据作进化树分析。
１．２．４ 植物表达载体的构建 用内切酶犡犫犪Ｉ和犛犿犪Ｉ对表达载体ｐＢＩ１２１和克隆载体ｐＭＤＡｔＧＡＰＣ２、ｐＭＤ
０４２ ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ（２０１４） Ｖｏｌ．２３，Ｎｏ．１
ＳｔＧＡＰＣ进行酶切，酶切体系５０μＬ：１０×ＴＢｕｆｆｅｒ５．０μＬ，０．１％ＢＳＡ５．０μＬ，犡犫犪Ｉ和犛犿犪Ｉ１．０μＬ，质粒３０．０
μＬ，ｄｄＨ２Ｏ８．０μＬ，３０℃进行４～６ｈ。电泳后切胶回收相应片段连接，连接体系２０．０μＬ：Ｔ４ＤＮＡ连接酶（３
Ｕ／μＬ）２．０μＬ，１０×Ｂｕｆｆｅｒ２．０μＬ，ｐＢＩ１２１Ｖｅｃｔｏｒ４．０μＬ，目的片段１２．０μＬ，４℃２４ｈ。连接产物转化大肠杆菌
ＤＨ５α感受态，在含卡那霉素（Ｋａｎ，５０μｇ／ｍＬ）的平板上筛选阳性克隆，经质粒ＰＣＲ、酶切鉴定后将正确的重组
质粒用冻融法转化到根癌农杆菌ＥＨＡ１０５的感受态中，在含Ｋａｎ＋（５０μｇ／ｍＬ）和利福平（２５μｇ／ｍＬ）ＹＥＢ平板
上挑选单菌落扩增培养后提质粒作ＰＣＲ鉴定。
２ 结果与分析
２．１ 犃狋犌犃犘犆２和犛狋犌犃犘犆基因的克隆
从野生型拟南芥Ｃｏｌ和栽培型马铃薯品种米拉中分别提取ＲＮＡ，经凝胶电泳检测，如图１Ａ所示，有２８Ｓ，
１８Ｓ以及５Ｓ三个条带，说明ＲＮＡ的完整性较好。由Ｏｌｉｇｏｄ（Ｔ）作引物转录合成ｃＤＮＡ第一链，以此为模板，根
据Ｇｅｎｂａｎｋ公布的序列设计引物，用高保真ＤＮＡ聚合酶犜犪犓犪犚犪犈狓犜犪狇扩增目的条带，取２μＬ扩增产物进
行电泳检测，表明得到了预期大小的片段（约１０００ｂｐ，图１Ｂ）。回收目的片段，与克隆载体ｐＭＤＴＭ１９ＴＳｉｍｐｌｅ
Ｖｅｃｔｏｒ连接后转化大肠杆菌ＤＨ５α，挑选白斑进行滞后质粒筛选（图２Ａ），进行ＰＣＲ及犡犫犪Ⅰ、犛犿犪Ⅰ双酶切检
测（图２Ｂ、图２Ｃ）。检测结果表明无论是扩增还是酶切均能获得１０００ｂｐ左右片段。
图１ 总犚犖犃提取及犚犜－犘犆犚扩增犌犃犘犆基因
犉犻犵．１ 犜狅狋犪犾犚犖犃犲狓狋狉犪犮狋犻狅狀犪狀犱犌犃犘犆犵犲狀犲犪犿狆犾犻犳犻犮犪狋犻狅狀
Ａ：总ＲＮＡ提取 ＲＮＡｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ；１～２：拟南芥犃狉犪犫犻犱狅狆狊犻狊；３～６：马铃薯Ｐｏｔａｔｏ．Ｂ：犌犃犘犆基因的ＲＴ－ＰＣＲ扩增产物 Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｐｒｏｄ
ｕｃｔｓｏｆ犌犃犘犆ｇｅｎｅｂｙＲＴ－ＰＣＲ；Ｍ：ＭａｒｋｅｒⅢ；１～２：拟南芥犃狉犪犫犻犱狅狆狊犻狊；３～４：马铃薯Ｐｏｔａｔｏ．
图２ 含目的基因的克隆检测
犉犻犵．２ 犐犱犲狀狋犻犳犻犮犪狋犻狅狀狅犳犮犾狅狀犲狊
Ａ：滞后质粒筛选Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｄｅｌａｙｅｄｐｌａｓｍｉｄ；Ｂ：目的片段ＰＣＲ扩增
犌犃犘犆ｇｅｎｅＰＣＲａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ；Ｍ：ＤＮＡ ＭａｒｋｅｒⅢ；１：蓝斑质粒 Ｂｌｕｅｃｏｌｏｒ
ｐｌａｓｍｉｄ；２～４：ｐＭＤＳｔＧＡＰＣ；５～７：ｐＭＤＡｔＧＡＰＣ２．Ｃ：犡犫犪Ｉ和犛犿犪Ｉ酶
切质粒Ｐｌａｓｍｉｄｄｉｇｅｓｔｉｏｎｂｙ犡犫犪Ｉａｎｄ犛犿犪Ｉ；Ｍ：ＤＮＡ ＭａｒｋｅｒⅢ；１～２：
ｐＭＤＳｔＧＡＰＣ；３～４：ｐＭＤＡｔＧＡＰＣ２．
１４２第２３卷第１期 草业学报２０１４年
挑选重组子ｐＭＤＡｔＧＡＰＣ２和ｐＭＤＳｔＧＡＰＣ各３个，每个３次重复作测序，其中ｐＭＤＡｔＧＡＰＣ２有２个
重组子的序列与公布序列完全一致，另有１个发生Ａ到Ｇ的变异。而ｐＭＤＳｔＧＡＰＣ的３个重组子与公布序列
均有差异：其中１个在４０４ｂｐ处由Ｔ变为Ｃ；１个在１４３ｂｐ处由Ｔ变为Ｃ，且８７１ｂｐ处由Ｇ变为Ａ；第３个在
９７６ｂｐ处由Ｔ变为 Ａ，由于３个重组子与公布序列的差异在不同位置，所以很可能是ＰＣＲ扩增时碱基错配造
成，另选３个ｐＭＤＳｔＧＡＰＣ重组子测序，其中２个与公布序列完全一致，另１个在１５８ｂｐ处Ｃ变为Ｔ，６０１处Ａ
变为Ｇ。将所获得的测序正确克隆扩繁后再作测序，仍与公布的序列完全相同，至此获得了与公布序列完全一致
的犃狋犌犃犘犆２和犛狋犌犃犘犆基因的克隆。
２．２ 犛狋犌犃犘犆和犃狋犌犃犘犆２序列分析
２．２．１ 犛狋犌犃犘犆和犃狋犌犃犘犆２氨基酸序列分析和结构域预测 测序结果表明，两者的开放阅读框均为１０１７ｂｐ，
编码３３８个氨基酸和１个终止密码子。两者的比对表明核苷酸序列相似性为８４％，氨基酸序列相似性达到
９２％。犛狋ＧＡＰＣ氨基酸序列分子量为３６．６４６ｋＤａ，理论ｐＩ值６．３４，整个氨基酸组成中缬氨酸（Ｖａｌ）含量最高达
１０．４％，其次是丙氨酸（Ａｌａ）占９．８％，蛋白不稳定系数为２０．２１，属稳定蛋白；犃狋ＧＡＰＣ２氨基酸序列分子量为
３６．９１３ｋＤａ，理论ｐＩ值６．６７，整个氨基酸组成中缬氨酸（Ｖａｌ）含量最高达１１．５％，其次是赖氨酸（Ｌｙｓ）占９．２％，
蛋白不稳定系数为２２．６，属稳定蛋白。以上可以看出两者的基本性质相似。从图３Ａ可以看出两者在氨基酸序
列上共有２６处存在差异，有些是同类氨基酸间的转变如：ＫＲ、ＡＶ、ＳＴ、ＤＥ，有些则是非极性与极性间的转变
如：ＧＫ、ＡＰ、ＭＴ、ＡＥ。
图３ 犛狋犌犃犘犆和犃狋犌犃犘犆２氨基酸序列与单体三维结构比较
犉犻犵．３ 犃犾犻犵犿犲狀狋狅犳犪犿犻狀狅犪犮犻犱狊犲狇狌犲狀犮犲犪狀犱犿狅狀狅犿犲狉３犇狊狋狉狌犮狋狌狉犲狅犳犛狋犌犃犘犆犪狀犱犃狋犌犃犘犆２
Ａ：氨基酸序列比对，相同区域以阴影表示，下划线标记的８个氨基酸为ＧＡＰＤＨ活性位点的特征序列Ａｌｉｇｍｅｎｔｏｆａｍｉｎｏａｃｉｄｓｅｑｕｅｎｃｅ，ｔｈｅｓｈａ
ｄｅｄｐａｒｔｓｈｏｗｅｄｉｄｅｎｔｉｃａｌｓｅｑｕｅｎｃｅｓ，ｔｈｅｕｎｄｅｒｌｉｎｅｓｈｏｗｅｄｔｏｔａｌｙｃｏｎｓｅｒｖｅｄｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓｅｑｕｅｎｃｅｉｎａｃｔｉｖｅｓｉｔｅｏｆＧＡＰＤＨ；Ｂ：单体三维结构 Ｍｏｎｏ
ｍｅｒ３Ｄｓｔｒｕｃｔｕｒｅ；１，折叠差异Ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｏｆｓｔｒａｎｄｓ；２～３，α螺旋差异 Ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｏｆαｈｅｌｉｃｅｓ．
２４２ ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ（２０１４） Ｖｏｌ．２３，Ｎｏ．１
利用ＮＣＢＩ网站的ＣｏｎｓｅｒｖｅｄＤｏｍａｉｎｓ程序作保守功能区分析表明犛狋ＧＡＰＣ和犃狋ＧＡＰＣ２具有ＧＡＰＤＨ典
型的２个保守区域：ＮＡＤＢ＿Ｒｏｓｓｍａｎｎ（登录号ｃｌ０９９３１），即 Ｎ 端 ＮＡＤ（Ｐ）结合域；Ｇｐ＿ｄｈ＿Ｃ （登录号
ｐｆａｍ０２８００），即Ｃ端行使糖结合功能和催化功能的区域。两者均含所有ＧＡＰＤＨ催化活性位点固有的特征序列
ＡＳＣＴＴＮＣＬ（两多肽链上的１５４～１６１位）（图３Ａ中下划线所示）。
２．２．２ 犛狋ＧＡＰＣ和犃狋ＧＡＰＣ２蛋白结构预测 利用ＳｗｉｓｓＭｏｄｅｌ在线分析功能预测犛狋ＧＡＰＣ和犃狋ＧＡＰＣ２蛋
白的三级结构，两者均与模板３ｅ５ｒＣ（犗狉狔狕犪狊犪狋犻狏犪 ＧＡＰＤＨ Ｃｃｈａｉｎ）的相似度最高，分别为８５．６２９％和
８５．５８６％，并得到了犛狋ＧＡＰＣ和犃狋ＧＡＰＣ２蛋白单体的３Ｄ预测结构（如图３Ｂ所示），三者的３Ｄ结构非常相似，
其中左边区域有一个由７个β折叠构成的马鞍型超二级结构位于催化结构域中，起着固定活性中心的作用，而右
边区域的βαβαβ结构形成Ｒｏｓｓｍａｎｎ卷曲为结合ＮＡＤ的区域。犛狋ＧＡＰＣ蛋白单体包含１６个α螺旋，２２个β折
叠，３６个转角；犃狋ＧＡＰＣ２蛋白单体包含１６个螺旋，２２个β折叠，３７个转角；而３ｅ５ｒＣ有１５个α螺旋，２０个β折
叠，４０个转角。图３Ｂ中１号和２号箭头分别表示这两种蛋白都有而３ｅ５ｒＣ没有的２个β折叠和１个α螺旋，３
号箭头显示出两者在参与形成该螺旋的氨基酸数目上有差异，而三者在Ｎ末端和Ｃ末端均有差异。
２．２．３ 犌犃犘犆基因序列的同源性比较 将不同科、属植物犌犃犘犆的核苷酸序列（ＣＤＳ）以及氨基酸序列用ＤＮＡ
ＭＡＮ作同源比对。结果显示与马铃薯同科的植物中，普通蕃茄（犔狔犮狅狆犲狉狊犻犮狅狀犲狊犮狌犾犲狀狋狌犿）核苷酸序列同源性与
其最高为９６．３％，其次是大叶烟草×花烟草（犖．犾犪狀犵狊犱狅狉犳犳犻犻×犖．狊犪狀犱犲狉犪犲）９０．８％，野生型马铃薯（犛狅犾犪狀狌犿
犮犺犪犮狅犲狀狊犲）和普通烟草（犖犻犮狅狋犻犪狀犪狋犪犫犪犮狌犿）与之同源性较低为８０％左右；而氨基酸序列间的同源性高于核苷酸
依次为９８．６％，９４．４％，８９．３％，９１．５％。犃狋犌犃犘犆２与犃狋犌犃犘犆１以及同科的芥菜（犅狉犪狊狊犻犮犪犼狌狀犮犲犪）、油菜（犅．
狀犪狆狌狊ＧＡＰＣ１和ＧＡＰＣ２）、白菜（犅．狉犪狆犪）等核苷酸序列同源性均为９０％左右，而氨基酸同源性则高达９８％～
９６％。犛狋犌犃犘犆和犃狋犌犃犘犆２都与禾本科植物，如玉米、水稻、小麦（犜狉犻狋犻犮狌犿犪犲狊狋犻狏狌犿）等的同源性较低，核苷酸
为７６％～７８％，氨基酸为８５％～８７％。
根据多种植物犌犃犘犆基因的ＣＤＳ序列建立如图４所示进化树，蕨类植物复活卷柏与其他被子植物处于两
大分支中，被子植物中的单子叶植物水稻、玉米、小麦、毛竹与其他双子叶植物处于不同分支，而双子叶植物中拟
南芥、油菜、白菜等十字花科在一个分支中，同属藜科的大洋洲滨藜和甜菜在同一分支，同属豆科的大豆和豌豆在
同一分支，其他科、属的植物也按此聚类，基本与现有的分类系统相符。但同为茄科的马铃薯栽培型、番茄、大叶
烟草×花烟草为一个分支，而马铃薯野生型、矮牵牛、普通烟草则出现在较远的另一分支。
２．３ 犛狋犌犃犘犆和犃狋犌犃犘犆２基因植物表达载体构建
将植物表达载体ｐＢＩ１２１和克隆载体分别酶切，并回收相应片段，纯化连接，构建了ＣａＭＶ３５Ｓ驱动犌犃犘犆基
因表达的载体。以重组子为模板ＰＣＲ扩增犌犃犘犆基因，可扩增出约１０００ｂｐ左右的片段（图５Ａ），用犡犫犪Ⅰ和
犛犿犪Ⅰ双酶切重组质粒，也可获得１０００ｂｐ左右的片段（图５Ｂ）。检测结果说明犌犃犘犆基因片段已插入表达载体
ｐＢＩ１２１上，将获得的重组质粒分别命名为ｐＢＩ１２１ＳｔＧＡＰＣ和ｐＢＩ１２１ＡｔＧＡＰＣ２。
采用冻融法将两种表达载体分别转入感受态农杆菌ＥＨＡ１０５中，在含Ｋａｎ的平板上获得单菌落，各选２个
单菌落提质粒，ＰＣＲ扩增Ｋａｎ抗性基因狀狆狋Ⅱ和目的基因犌犃犘犆，如图５所示，能扩增出预期的６５０和１０００ｂｐ
左右的片段，说明获得了分别含ｐＢＩ１２１ＳｔＧＡＰＣ和ｐＢＩ１２１ＡｔＧＡＰＣ２质粒的两种菌株。
３ 讨论
胞质３磷酸甘油醛脱氢酶是由４个同型亚基组成的四聚体蛋白，Ｍａｒｒｉ等［２１］将拟南芥磷酸化ＧＡＰＤＨ 基因
作了分类和表达研究，其中ＧａｐＣ为胞质内ＮＡＤ依赖型的ＧＡＰＤＨ，在糖酵解、糖质新生代谢中行使功能，由２
个基因犌犪狆犆１和犌犪狆犆２编码，两者ｃＤＮＡ相似性为８９％，氨基酸序列相似性达９７．９％，本实验克隆了其中的
犃狋犌犃犘犆２基因。目前认为造成克隆序列间差异的原因主要有品种差异、ＰＣＲ扩增时的碱基错配、测序错误或者
发生中性突变［２２］。本实验根据测序，筛选到了与ＧｅｎＢａｎｋ公布的序列完全一致的克隆。而同时测序的几个克
隆中，与公布序列在不同位置有１个或２个碱基的变异，这可能是ＰＣＲ扩增过程中的碱基错配造成。所克隆的
３４２第２３卷第１期 草业学报２０１４年
图４ 犌犃犘犆基因的进化树分析
犉犻犵．４ 犘犺狔犾狅犵犲狀犲狋犻犮狋狉犲犲犪狀犪犾狔狊犻狊犫犪狊犲犱狅狀狀狌犮犾犲狅狋犻犱犲狅犳犌犃犘犆
图５ 表达载体犘犆犚与酶切检测
犉犻犵．５ 犐犱犲狀狋犻犳犻犮犪狋犻狅狀狅犳犲狓狆狉犲狊狊犻狅狀狏犲犮狋狅狉犫狔犲狀狕狔犿犲犱犻犵犲狊狋犻狅狀
Ａ：质粒ＰＣＲ扩增目的片段ＧＡＰＣｇｅｎｅＰＣＲａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ；Ｍ：ＤＮＡＭａｒｋｅｒⅢ；１：ｐＢＩ１２１ＳｔＧＡＰＣ；２：ｐＢＩ１２１ＡｔＧＡＰＣ２；Ｂ：质粒酶切Ｅｎｚｙｍｅ
ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ；Ｍ：ＤＮＡＭａｒｋｅｒＤＬ１５０００ＴＭ；１，３：ｐＢＩ１２１ＳｔＧＡＰＣ和ｐＢＩ１２１ＡｔＧＡＰＣ２质粒犡犫犪Ⅰ和犛犿犪Ⅰ双酶切 ＥｎｚｙｍｅｄｉｇｅｓｔｉｏｎｏｆｐＢＩ１２１
ＳｔＧＡＰＣａｎｄｐＢＩ１２１ＡｔＧＡＰＣ２ｂｙ犡犫犪Ⅰａｎｄ犛犿犪Ⅰ；２，４：ｐＢＩ１２１ＳｔＧＡＰＣ和ｐＢＩ１２１ＡｔＧＡＰＣ２质粒犛犿犪Ⅰ单酶切ＥｎｚｙｍｅｄｉｇｅｓｔｉｏｎｏｆｐＢＩ１２１
ＳｔＧＡＰＣａｎｄｐＢＩ１２１ＡｔＧＡＰＣ２ｂｙ犛犿犪Ⅰ．
犛狋犌犃犘犆和犃狋犌犃犘犆２核苷酸序列的相似性为８４％，氨基酸序列相似性达９２％，氨基酸转变会有疏水性变化，最
终会使３Ｄ结构产生差异，这些差异是否会造成犛狋犌犃犘犆和犃狋犌犃犘犆２功能间的差异还需进一步研究。
由于植物ＧＡＰＣ氨基酸序列间的同源性很高，遗传密码的兼并性可能会掩盖进化差别，降低进化树的可信
度，因此本实验利用犌犃犘犆的核苷酸序列构建进化树，发现与现有的分类系统基本相符，这与肖川等［６］对多个物
种犌犃犘犇犎 基因的分子进化研究结果相同，其研究表明叶绿体的犌犃犘犇犎 基因更接近原核生物，低等植物苔藓
４４２ ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ（２０１４） Ｖｏｌ．２３，Ｎｏ．１
较早分支，裸子植物和被子植物处于两大分支，被子植
图６ 质粒转化农杆菌的犘犆犚验证
犉犻犵．６ 犐犱犲狀狋犻犳犻犮犪狋犻狅狀狅犳犈犎犃１０５狋狉犪狀狊犳狅狉犿犲犱
犻狀狋狅狆犾犪狊犿犻犱犫狔犘犆犚
Ｍ：ＤＮＡＭａｒｋｅｒⅢ；１～２：ｐＢＩ１２１ＳｔＧＡＰＣ扩增犌犃犘犆基因 Ａｍｐｌｉ
ｆｉｃａｔｉｏｎ犌犃犘犆ｇｅｎｅｏｆｐＢＩ１２１ＳｔＧＡＰＣ；３～４：ｐＢＩ１２１ＡｔＧＡＰＣ扩增
犌犃犘犆 基因 Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ犌犃犘犆ｇｅｎｅｏｆｐＢＩ１２１ＡｔＧＡＰＣ２；５～６：
ｐＢＩ１２１ＳｔＧＡＰＣ扩增狀狆狋Ⅱ基因 Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ狀狆狋Ⅱ ｇｅｎｅｏｆｐＢＩ１２１
ＳｔＧＡＰＣ；７～８：ｐＢＩ１２１ＡｔＧＡＰＣ２扩增狀狆狋Ⅱ基因 Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ狀狆狋Ⅱ
ｇｅｎｅｏｆｐＢＩ１２１ＡｔＧＡＰＣ２．
物中单子叶植物和众多双子叶植物也处于不同分支，
认为犌犃犘犇犎 作为分子进化研究材料有较高可信度。
犌犃犘犆在同科、属间的同源性较高，说明在进化上较
为保守，这与其参与糖酵解这一基本生理活动有关。
对其他不同基因的研究所构建的进化树分析也表明各
基因的属内同源性较高可归于同一分支［２２２５］。研究表
明西伯利亚蓼的ＧＡＰＤＨ 可提高酵母的抗盐碱胁迫
能力，并且该基因与盐生植物冰叶日中花的遗传距离
最近，推测逆境胁迫的作用使植物ＧＡＰＤＨ基因的进
化方向和功能趋于相同［７］。本实验所构建的进化树
中，茄科植物出现了同属但不在一个分支，不同属反在
同一分支的现象，如马铃薯栽培型（茄属）、番茄栽培型
（番茄属）、大叶烟草×花烟草（烟草属）为一个分支，而
马铃薯野生型（茄属）、矮牵牛（矮牵牛属）、普通烟草
（烟草属）出现在另一分支。马铃薯栽培型在遗传上是四倍体而野生型是二倍体，可能对不同生长环境的适应及
染色体倍性的变化影响着犌犃犘犆基因的进化。进化树的构建是一个统计学问题，所构建出来的进化树只是对真
实进化关系的模拟，所以单凭犌犃犘犆序列建立的进化树还不能充分反映出马铃薯栽培型和野生型间的进化关
系。
ＧＡＰＣ是糖酵解中的关键酶之一，催化３磷酸甘油醛形成含高能磷酸键的１，３二磷酸甘油酸和ＮＡＤＨ，前
者在下一步反应中生成３磷酸甘油酸和ＡＴＰ，过去认为ＧＡＰＣ在细胞内表达稳定但近年来的研究表明ＧＡＰＣ
具有功能多样性。动物中的研究表明ＧＡＰＣ除参与糖酵解外，还参与细胞凋亡、调节 ｍＲＮＡ稳定性、氧化胁迫
应答、细胞自我吞噬、介导细胞信号转导、组蛋白基因调节等，并对ＧＡＰＣ在这些过程中的作用机理都有深入研
究和解释［２６］。植物中发现ＧＡＰＣ能够响应多种逆境胁迫，但研究的深度滞后于动物。关于ＧＡＰＣ响应高温、低
温、活性氧、低磷、盐等多种逆境胁迫已被不同研究者所证实［８１２］，而通过转基因技术也表明犌犃犘犆基因的过量表
达能提高植物对盐胁迫的抗性［１３１４］，抑制表达则影响代谢和生长［２７］。但目前关于ＧＡＰＣ在植物抗逆胁迫中如何
起作用的研究还不够深入，Ｚｈａｎｇ等［１４］对水稻的研究表明犗狊犌犃犘犆３过量表达的转基因材料中，与水稻抗逆相关
的基因犆犪狋犃、犇犚犈犅２犃、犔犻狆９表达量高于对照，并且Ｈ２Ｏ２ 含量低，植株的耐盐胁迫能力提高。这从一定程度上
解释了过量表达犌犃犘犆提高耐盐胁迫的原因。Ｇｏｕ等［２８］利用双分子荧光互补充技术，发现Ｈ２Ｏ２ 能促进拟南芥
ＧＡＰＣｓ和磷脂酶Ｄ的相互作用从而增强磷脂酶Ｄ的活性，证明ＧＡＰＣ参与ＡＢＡ诱导的逆境胁迫信号转导过
程，这一研究揭示了 ＧＡＰＣ的调节功能和作为逆境信号转导中的节点作用。本研究克隆了马铃薯和拟南芥
犌犃犘犆，并构建植物表达载体，这将为进一步通过转基因和酵母双杂等途径研究两者在马铃薯抗逆中的功能机制
奠定基础。
４ 结论
本实验通过ＲＴＰＣＲ技术，克隆了马铃薯和拟南芥的胞质３磷酸甘油醛脱氢酶基因的开放阅读框序列
（ＣＤＳ），对其核苷酸和氨基酸序列以及蛋白结构作对比分析，并构建了植物表达载体，为下一步基因功能的研究
以及获得耐逆境胁迫的材料奠定基础。
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ｄδｔｏｔｒａｎｓｄｕｃｅｈｙｄｒｏｇｅｎｐｅｒｏｘｉｄｅｓｉｇｎａｌｓｉｎｔｈｅ犃狉犪犫犻犱狅狆狊犻狊ｒｅｓｐｏｎｓｅｔｏｓｔｒｅｓｓ［Ｊ］．ＴｈｅＰｌａｎｔＣｅｌ，２０１２，２４：２２００２２１２．
犆犾狅狀犻狀犵犪狀犱犪狀犪犾狔狊犻狊狅犳狋犺犲犮狔狋狅狊狅犾犻犮犵犾狔犮犲狉犪犾犱犲犺狔犱犲３狆犺狅狊狆犺犪狋犲犱犲犺狔犱狉狅犵犲狀犪狊犲
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ＺＯＵＸｕｅ，ＺＨＡＮＧＹｅ，ＷＵＭｉｎｇｙａｎｇ，ＷＡＮＧＸｉｙａｏ
（ＣｏｌｅｇｅｏｆＡｇｒｏｎｏｍｙ，ＳｉｃｈｕａｎＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｃｈｅｎｇｄｕ６１１１３０，Ｃｈｉｎａ）
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７４２第２３卷第１期 草业学报２０１４年