全 文 ：书羊草Δ１吡咯琳５羧酸合成酶（犔犮犘５犆犛１）
基因的克隆与分析
张乐新１，２，苏蔓１，马甜１，３，马兴勇１，闫学青１，２，
彭献军１，陈双燕１，程丽琴１，刘公社１
（１．中国科学院植物研究所资源植物研发重点实验室，北京１０００９３；２．中国科学院研究生院，
北京１０００４９；３．宁夏大学农学院，宁夏 银川７５００２１）
摘要：羊草具有耐寒、耐盐和耐旱等特点，是一种兼具经济价值和生态价值的多年生重要牧草。脯氨酸是植物在渗
透胁迫下积累的主要渗透调节物质之一。Δ１吡咯啉５羧酸合成酶（Ｐ５ＣＳ）是脯氨酸的谷氨酸合成途径中的关键
酶。根据前期Ｓｏｌｅｘａ测序结果的数据，设计同源引物，从羊草中克隆了一个犘５犆犛基因，该基因ｃＤＮＡ序列全长
２１９７ｂｐ，推断其编码７３０个氨基酸，根据序列比对将其蛋白命名为ＬｃＰ５ＣＳ１。同源性分析表明：犔犮犘５犆犛１与单子
叶植物短柄草犘５犆犛的同源性为９５％，而与双子叶植物的犘５犆犛同源性较低。表达模式分析表明，在叶鞘、叶和茎
中，犔犮犘５犆犛１均有较高表达；在冷、ＡＢＡ、盐和干旱胁迫下，该基因明显受胁迫诱导，并随胁迫时间的延长，其表达量
总体呈上调趋势。对羊草人工创伤处理后的Ｓｏｌｅｘａ测序差异表达数据分析表明：犔犮犘５犆犛１在处理２和６ｈ后表达
量明显提高，推测羊草创伤处理后体内脯氨酸含量升高可能是其耐牧的一种适应性机制。
关键词：羊草；胁迫；Ｐ５ＣＳ；表达模式
中图分类号：Ｓ５４３＋．９０３；Ｑ９４３．２　　文献标识码：Ａ　　文章编号：１００４５７５９（２０１３）０４０１９７０８
犇犗犐：１０．１１６８６／ｃｙｘｂ２０１３０４２４　　
　　低温、盐和干旱等是严重影响植物生长的逆境胁迫因子，是我国农作物产量和播种面积的主要限制因素。脯
氨酸（ｐｒｏｌｉｎｅ）是植物在逆境胁迫下积累的主要渗透胁迫物质之一，其在植物体内起调节细胞渗透压、保护蛋白质
分子、清除活性氧等作用，从而维持植物逆境条件下正常生长［１，２］。植物积累脯氨酸能力的高低，与植物抗逆性
的强弱有直接关系。
在植物体内，脯氨酸的合成主要有鸟氨酸／精氨酸和谷氨酸２个途径。逆境胁迫下谷氨酸途径是合成脯氨酸
的主要途径［３，４］。Δ１吡咯琳５羧酸合成酶（Ｐ５ＣＳ）是谷氨酸合成途径中的限速酶，它是一个双功能酶，具有谷氨
酸激酶和谷氨酶－γ－半醛脱氨酶活性，催化脯氨酸合成的前２步反应，同时它又可以被其产物脯氨酸反馈抑
制［４，５］。因此，犘５犆犛被认为是一个重要的抗逆相关基因。
羊草（犔犲狔犿狌狊犮犺犻狀犲狀狊犻狊）隶属于禾本科赖草属，是欧亚大陆草原区东部和蒙古草原的建群种。作为我国北
方干旱、半干旱草原的乡土草种，在环境的选择压力下，形成了广泛的逆境适应能力。其抗寒冷、耐盐碱［６，７］，但
不耐涝或严重干旱，培育高抗逆性羊草，无疑会带来巨大的经济效益和生态效益［８］。由于植物的抗旱、耐盐碱性
状是多基因控制的数量性状，给通过杂交育种提高作物的抗逆性带来很大困难，而通过基因工程来改良作物的抗
逆性却为全面提高作物抗性提供了可能。通过转基因增加植物犘５犆犛基因的表达量，从而提高植物积累脯氨酸
的能力，是培育综合抗逆境植物的一条有效途径［９］。目前，羊草犘５犆犛基因的克隆与功能研究还未见报道。本研
究利用二代４５４测序技术结果结合ＲＴ－ＰＣＲ扩增法克隆了羊草犘５犆犛基因，并初步验证了其在植物体内和逆
境条件下的表达模式，以期探索其功能。
第２２卷　第４期
Ｖｏｌ．２２，Ｎｏ．４
草　业　学　报
ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ 　　
１９７－２０４
２０１３年８月
收稿日期：２０１２０９０５；改回日期：２０１２１０１９
基金项目：国家自然科学基金项目（３１１７０３１６和３０９７０２９１）资助。
作者简介：张乐新（１９８６），男，山东高密人，硕士。Ｅｍａｉｌ：ｚｈａｎｇｌｅｘｉｎ１２３＠１６３．ｃｏｍ
通讯作者。Ｅｍａｉｌ：ｌｉｕｇｓ＠ｉｂｃａｓ．ａｃ．ｃｎ；ｌｑｃｈｅｎｇ＠ｉｂｃａｓ．ａｃ．ｃｎ
１　材料与方法
１．１　材料
羊草种子来源于本实验室保存，表达分析所用幼苗为所保存种子萌发。用于组织特异性分析的羊草种植于
中国科学院植物研究所羊草种质圃。
１．２　试剂
ｃＤＮＡＳｙｎｔｈｅｓｉｓＫｉｔ，ｐＭＤ１８Ｔｖｅｃｔｏｒ，Ｔ４ｌｉｇａｔｉｏｎｋｉｔ购自Ｔａｋａｒａ公司；Ｔｒｉｚｏｌ总ＲＮＡ提取试剂盒，质粒
ＤＮＡ提取试剂盒购自百泰克公司。
１．３　方法
１．３．１　羊草ＬｃＰ５ＣＳ１的ｃＤＮＡ片段克隆和分析　２０１０－２０１２年，本实验室为研究羊草耐牧机理，对羊草人工
创伤处理后的Ｓｏｌｅｘａ测序的差异表达数据结果进行分析发现：ｃｏｎｔｉｇ０５９４６在处理２和６ｈ后表达量分别上升了
１．６４和２．０２倍，对ｃｏｎｔｉｇ０５９４６在ＮＣＢＩ中Ｂｌａｓｔ比对结果显示：其与二穗短柄草（犅狉犪犮犺狔狆狅犱犻狌犿犱犻狊狋犪犮犺狔狅狀）
预测的犘５犆犛有９０％的同源性，与本实验室所登录的甜高粱（犛狅狉犵犺狌犿犫犻犮狅犾狅狉）的犛犫犘５犆犛１有８７％的同源性，推
测其为羊草的犘５犆犛１。根据已有的甜高粱犛犫犘５犆犛１的结果和前人的研究结果，犘５犆犛１基因是一个胁迫诱导基
因，故采用冷处理后的羊草幼苗，提取ＲＮＡ进行下一步基因克隆试验。羊草植株以及羊草种子来源于本实验
室。用于组织特异性分析的羊草种植于中国科学院植物研究所羊草种质圃。
以冷处理１２ｈ的羊草幼苗为材料，提取总ＲＮＡ，进行１．２％的琼脂糖凝胶电泳检测。
据本实验室测序结果，结合已公开的玉米（犣犲犪犿犪狔狊）、水稻（犗狉狔狕犪狊犪狋犻狏犪）、甜高粱的犘５犆犛１的ｃＤＮＡ序列
寻找保守区域，根据保守区域序列设计引物，具体的引物序列如下：
Ｓ１５′ＧＡＡＴＧＧＧＣＡＧＧＧＧＴＧＧＣＡＴ３′；Ｓ２５′ＣＣＴＣＡＴＴＧＣＡＡＡＧＧＡＡＧＡＴＣＣ３′。
以提取羊草幼苗的总ＲＮＡ为模板，用ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ１ｓｔＳｔｒａｎｄｃＤＮＡＳｙｎｔｈｅｓｉｚｅｄＫｉｔ试剂盒（Ｔａｋａｒａ公司）
并参照试剂盒说明书，反转合成第一链ｃＤＮＡ。以上述获得的第一链ｃＤＮＡ为模板，用Ｓ１和Ｓ２组成的引物对进
行ＰＣＲ扩增，ＰＣＲ反应体系为２５μＬ，其中各组分如下：ｃＤＮＡ模板、Ｓ１与Ｓ２各１μＬ，１０×Ｂｕｆｆｅｒ２．５μＬ，ｄＮＴＰ
混合物（１０ｍｍｏｌ／Ｌ）２μＬ，Ｔａｑ酶０．２５μＬ，ｄｄＨ２Ｏ１２．２５μＬ；反应条件为：９４℃ 预变性５ｍｉｎ；９４℃３０ｓ，５５℃３０
ｓ，７２℃２．５ｍｉｎ，共３５个循环；最后７２℃ 延伸１０ｍｉｎ。
反应结束后，对ＰＣＲ扩增产物进行１．２％琼脂糖凝胶电泳检测，检测是否扩增到目的片段。回收并纯化
ＰＣＲ产物按照说明书进行。连接反应按照ＰＭＤ１８Ｔ载体（Ｔａｋａｒａ公司）试剂盒说明书进行。连接产物转化大
肠杆菌ＤＨ５α感受态细胞（北京全式金生物技术有限公司），筛选阳性克隆进行菌液ＰＣＲ鉴定，提取阳性克隆的
质粒进行测序，对测序结果进行ＢＬＡＳＴ分析。
１．３．２　ＬｃＰ５ＣＳ１生物信息学分析　用ＤＮＡＭＡＮ和 ＯＭＩＧＡ软件对犔犮犘５犆犛１基因及其编码的蛋白进行序列
生物信息学分析，预测其氨基酸序列、分子量和等电点。用在线ＢＬＡＳＴ工具（ｈｔｔｐ：／／ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／
Ｂｌａｓｔ．ｃｇｉ）分析犔犮犘５犆犛１基因的结构域、同源性和系统进化树。
１．３．３　ＬｃＰ５ＣＳ１组织特异性表达模式分析　在羊草的开花期进行取样，从同一株上分别提取叶、叶鞘、茎、穗、
根、根茎和根茎芽７个不同部位的材料提取总ＲＮＡ之后，利用ｃＤＮＡＳｙｎｔｈｅｓｉｓＫｉｔ（Ｔａｋａｒａ）试剂盒反转录合成
ｃＤＮＡ。根据羊草Ａｃｔｉｎ基因序列设计内参引物；以Ａｃｔｉｎ基因作为内标对不同组织的ｃＤＮＡ 模板进行半定量，
０．８％琼脂糖凝胶电泳并拍照。利用凝胶成像系统自带软件分析扩增产物的浓度，以调整模板量。多次重复，以
减小操作所引起的误差。
内参Ａｃｔｉｎ引物：１：５′ＴＧＧＡＣＴＣＴＧＧＴＧＡＴＧＧＴＧＴＧＡＧ３′；２：５′ＧＴＧＣＴＡＡＧＧＧＡＧＧＣＡＡＧＧＡＴＧ３′。
犔犮犘５犆犛１引物：１：５′ＧＴＣＧＧＣＡＣＣＧＣＴＡＴＴＧＴＣ３′；２：５′ＧＣＣＡＡＡＣＴＧＴＣＧＴＴＡＴＣＣＣ３′。
内参反应条件：９４℃５ｍｉｎ；９４℃３０ｓ，５５℃３０ｓ，７２℃３０ｓ，２６个循环。
犔犮犘５犆犛１反应条件：９４℃１０ｍｉｎ；９４℃３０ｓ，５５℃３０ｓ，７２℃９０ｓ，３５个循环，每种材料重复３次。
１．３．４　ＬｃＰ５ＣＳ１在不同胁迫条件下的表达模式分析　将羊草种子置４℃春化２ｄ，将种子播种于装有蛭石的培
养皿中，置光照培养箱中。正常萌发之后，将幼苗转移到装有白蛭石的塑料盆内（１０ｃｍ×１０ｃｍ），于２５℃／１８℃
８９１ ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ（２０１３） Ｖｏｌ．２２，Ｎｏ．４
（昼／夜）温室下正常生长，光照１６ｈ，每盆９株。
将上述正常生长８周的羊草幼苗分别进行不同的胁迫处理：冷（４℃）、脱落酸ＡＢＡ（１００μｍｏｌ／Ｌ）于处理的
０，１，３，８，１２，２４ｈ取材；盐（２５０ｍｍｏｌ／ＬＮａＣｌ）处理，于处理的０，１，２，４，８，１２，２４，４８ｈ取材；干旱（断水）处理，于
断水０，１，２，３，４，５，６ｄ取材，分别提取以上处理材料的总ＲＮＡ，利用ｃＤＮＡＳｙｎｔｈｅｓｉｓＫｉｔ（Ｔａｋａｒａ）反转录合成
ｃＤＮＡ第一链，用于ＲＴ－ＰＣＲ分析不同胁迫、不同时间的表达量。引物及反应条件同１．３．３。
１．３．５　ＬｃＰ５ＣＳ１及谷氨酸合成途径酶（Ｐ５ＣＤＨ、ＰＤＨ）在创伤处理后的表达分析　正常生长８周的羊草幼苗，
将其叶片进行针刺创伤处理，处理后２，６，２４ｈ分别取材，迅速冻于液氮中，保存于－７０℃，备用。提取以上处理
材料的总ＲＮＡ，送去生物芯片上海国家工程研究中心进行Ｓｏｌｅｘａ测序。对创伤处理后不同材料脯氨酸代谢相
关基因：Δ１吡咯啉５羧酸合成酶（Δ１ｐｒｏｌｉｎｅ５ｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅｓｙｎｔｈａｓｅ，Ｐ５ＣＳ）、脯氨酸脱氢酶（ｐｒｏｌｉｎｅｄｅｈｙｄｒｏ
ｇｅｎａｓｅ，ＰＤＨ）和二氢吡咯啉５羧酸脱氢酶（Ｐ５Ｃｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ，Ｐ５ＣＤＨ）表达进行分析。
２　结果与分析
２．１　羊草犔犮犘５犆犛１的ｃＤＮＡ片段克隆
所提取的ＲＮＡ有２条明显的电泳条带（图１），从上到下依次为２８ＳＲＮＡ和１８ＳＲＮＡ，表明获得了纯度较
高、较完整的总ＲＮＡ。
根据实验室高通量测序结果和已公开的Ｐ５ＣＳ残基序列的保守区域，设计引物扩增获得了长度约为２２００
ｂｐ的目的片段，结果如图２所示。测序后进行 ＢＬＡＳＴ 分析，该片段长２１９７ｂｐ。将其编码基因命名为
犔犮犘５犆犛１。
图１　犚犖犃提取电泳
犉犻犵．１　犚犖犃犲犾犲犮狋狉狅狆犺狅狉犲狊犻狊
图２　犘犆犚产物检测
犉犻犵．２　犃犵狉狅狊犲犵犲犾犲犾犲犮狋狉狅狆犺狅狉犲狊犻狊狅犳犘犆犚狆狉狅犱狌犮狋
２．２　ＬｃＰ５ＣＳ１的生物信息学分析
２．２．１　犔犮犘５犆犛１基因的序列分析及其编码蛋白的结构功能预测　利用 ＤＮＡＭＡＮ 和 ＯＭＩＧＡ 软件对
犔犮犘５犆犛１的全长ｃＤＮＡ序列进行生物信息学分析：该序列全长２１９７ｂｐ，自５′端第３位～第２１９５位为ＯＲＦ，推
断其编码７３０个氨基酸，推测其分子量为７８．８８７ｋＤａ，等电点为６．６９。犔犮犘５犆犛１的结构示意图如图３所示。氨
基末端第２１位～第２９５位氨基酸残基为ＡＡＫ超家族的保守结构域，自氨基末端３１０位～７１０位为ＡＬＤＨＳＦ
超家族的保守结构域，自氨基末端第２２位～第７３０位氨基酸残基为Ｐ５ＣＳ多重结构域序列。用在线ＢＬＡＳＴ工
具（ｈｔｔｐ：／／ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｂｌａｓｔ．ｃｇｉ）分析ＬｃＰ５ＣＳ１的结构域。结果表明：该蛋白属于Ｐ５ＣＳ多重结构
域，表明该蛋白是Ｐ５ＣＳ家族中的一员。
２．２．２　ＬｃＰ５ＣＳ１同源基因的序列分析　将犔犮犘５犆犛１的氨基酸序列与水稻和拟南芥（犃狉犪犫犻犱狅狆狊犻狊狋犺犪犾犻犪狀犪）的
Ｐ５ＣＳ比对。结果显示犔犮犘５犆犛１包含高等植物Ｐ５ＣＳ蛋白质具有６个主要功能域：ＡＴＰ结合位点、２个亮氨酸结
构域、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ结合域、谷氨酰基酶（ＧＫ）结构域和谷氨酸半醛（ＧＳＡ）结构域（图４）。表明ＬｃＰ５ＣＳ１可能在羊
草脯氨酸合成中起作用，除其中一个亮氨酸结构域，其他功能区均较为保守。
９９１第２２卷第４期 草业学报２０１３年
图３　犔犮犘５犆犛１的保守结构域
犉犻犵．３　犘狌狋犪狋犻狏犲犮狅狀狊犲狉狏犲犱犱狅犿犪犻狀狊狅犳犔犮犘５犆犛１
图４　羊草犔犮犘５犆犛１的氨基酸序列与拟南芥和水稻犘５犆犛氨基酸序列比对
犉犻犵．４　犆狅犿狆犪狉犻狊狅狀狅犳狋犺犲犱犲犱狌犮犲犱犪犿犻狀狅犪犮犻犱狊犲狇狌犲狀犮犲狊狅犳犔犮犘５犆犛１狑犻狋犺犃．狉犪犫犻犱狅狆狊犻狊狋犺犪犾犻犪狀犪犪狀犱犗．狊犪狋犻狏犪
ＬｃＰ５ＣＳ１：羊草犔．犮犺犻狀犲狀狊犻狊；ＡｔＰ５ＣＳ１：拟南芥犃．狋犺犪犾犻犪狀犪；ＯｓＰ５ＣＳ：水稻犗．狊犪狋犻狏犪．
００２ ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ（２０１３） Ｖｏｌ．２２，Ｎｏ．４
２．２．３　ＬｃＰ５ＣＳ１与Ｐ５ＣＳ类蛋白序列的同源性及系统进化树分析　利用在线ＢＬＡＳＴ工具对犔犮犘５犆犛１与植物
中其他已克隆的Ｐ５ＣＳ氨基酸序列进行同源性分析比对：表明犔犮犘５犆犛１与单子叶植物二穗短柄草Ｐ５ＣＳ的同源
性分别为９５％；而与双子叶植物，例如拟南芥、甜瓜（犆狌犮狌犿犻狊犿犲犾狅）等的Ｐ５ＣＳ同源性相对较低。进化树分析
（图５）表明：Ｐ５ＣＳ类蛋白在进化过程中出现了较大差异，单子叶植物的Ｐ５ＣＳ聚为一类，双子叶植物的Ｐ５ＣＳ也
聚为一类。
图５　进化树分析
犉犻犵．５　犃狀犪犾狔狊犻狊狅犳犲狏狅犾狌狋犻狅狀犪狉狔狋狉犲犲
横线边数据表示可信度 Ｔｈｅｖａｌｕｅｓｍｅａｎｃｒｅｄｉｂｉｌｉｔｙ．
２．３　犔犮犘５犆犛１的组织特异表达模式分析
分别提取羊草叶、叶鞘、茎、穗、根、根茎芽和根茎７个不同部位的 ＲＮＡ 进行半定量 ＲＴ－ＰＣＲ，分析
犔犮犘５犆犛１在羊草不同器官中的表达模式。结果（图６）表明，犔犮犘５犆犛１在羊草的各组织中均有表达，其中在叶、叶
鞘、茎３个部位表达较高，根茎、根芽茎中表达量次之，穗中表达较弱，在根中表达最弱。表明羊草正常生长情况
下，犔犮犘５犆犛１在羊草的各组织中组成型表达，在地上部器官中表达量较高，但在地下部特别是根中表达量较低。
２．４　犔犮犘５犆犛１在逆境胁迫下的表达模式分析
分别提取冷、ＡＢＡ、盐和干旱胁迫处理羊草材料的ＲＮＡ进行ＲＴ－ＰＣＲ。分析了不同处理时间下犔犮犘５犆犛１
的表达情况。结果（图７）显示，犔犮犘５犆犛１的表达量随处理时间的延长呈现逐渐增加的趋势，未经处理的幼苗，
犔犮犘５犆犛１表达量均较弱。以上结果表明，犔犮犘５犆犛１的表达受冷、ＡＢＡ、盐和干旱胁迫的诱导。
１０２第２２卷第４期 草业学报２０１３年
图６　犔犮犘５犆犛１的组织特异性表达分析
犉犻犵．６　犜犺犲狅狉犵犪狀狊狆犲犮犻犳犻犮犲狓狆狉犲狊狊犻狅狀狆犪狋狋犲狉狀狅犳犔犮犘５犆犛１
图７　不同非生物胁迫处理下羊草犔犮犘５犆犛１的表达
犉犻犵．７　犈狓狆狉犲狊狊犻狅狀犾犲狏犲犾狊狅犳犔犮犘５犆犛１犻狀犔．犮犺犻狀犲狀狊犻狊犪狋犱犻犳犳犲狉犲狀狋狋犻犿犲犪犳狋犲狉犪犫犻狅狋犻犮狊狋狉犲狊狊
（ａ）：４℃；（ｂ）：ＡＢＡ；（ｃ）：ＮａＣｌ；（ｄ）：干旱Ｄｒｏｕｇｈｔ．
２．５　犔犮犘５犆犛１及谷氨酸合成途径酶（Ｐ５ＣＤＨ、ＰＤＨ）
在创伤处理后的表达分析
对创伤处理后羊草不同时间点材料进行Ｓｏｌｅｘａ
测序分析基因差异表达情况，根据差异表达数据结果，
分析了与脯氨酸代谢相关基因在创伤处理后的表达量
变化情况。Ｐ５ＣＳ催化谷氨酸磷酸化及合成谷氨酸γ
半醛还原，Ｐ５ＣＳ催化的头两步反应是谷氨酸合成途
径的限速步骤。脯氨酸的降解发生在线粒体中，是脯
氨酸合成的相反步骤，由脯氨酸脱氢酶（ｐｒｏｌｉｎｅｄｅｈｙ
ｄｒｏｇｅｎａｓｅ，ＰＤＨ）和 二 氢 吡 咯 啉５羧 酸 脱 氢 酶
（Ｐ５Ｃｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ，Ｐ５ＣＤＨ）催化。
本实验结果显示，Ｐ５ＣＳ和Ｐ５ＣＤＨ在创伤处理后
２和６ｈ都有不同倍数的上调，而降解途径的ＰＤＨ则
表现出下调的表达（表１）。
表１　创伤后谷氨酸合成途径中酶的表达变化
犜犪犫犾犲１　犈狓狆狉犲狊狊犻狅狀犮犺犪狀犵犲狊狅犳犲狀狕狔犿犲狊犻狀
犵犾狌狋犪犿犪狋犲狆犪狋犺狑犪狔犪犳狋犲狉狑狅狌狀犱犻狀犵
Ｕｎｉｇｅｎｅｓ及注释
Ｕｎｉｇｅｎｅｓａｎｄ
ａｎｎｏｔａｔｉｏｎ
变化倍数（ｌｏｇ２ｒａｔｉｏ）
Ｆｏｌｄｃｈａｎｇｅ（ｌｏｇ２ｒａｔｉｏ）
２ｈ ６ｈ ２４ｈ
ｃｏｎｔｉｇ０５９４６Ｐ５ＣＳ １．６４３１１７　　 ２．０１６５１７５　 －１．１８２３４４
ｃｏｎｔｉｇ０６４８１Ｐ５ＣＤＨ ２．０８５５０５　　 ２．３３３３７４６　 －　　　
ｃｏｎｔｉｇ０６４８２Ｐ５ＣＤＨ －　　　　 １．２４０２６５２　 －０．９２２４１４
ｃｏｎｔｉｇ０６４８４Ｐ５ＣＤＨ －　　　　 １．６１８７７６８　 －　　　
ｃｏｎｔｉｇ２３４７２ＰＤＨ －０．６５４７３６　　－０．６９６３７３　 －１．０２１３７２
３　讨论
犘５犆犛已被证实在许多植物中均存在２个同源基因，分别为犘５犆犛１和犘５犆犛２［１０１５］。在拟南芥敲除犘５犆犛１
突变体中，胁迫诱导的脯氨酸合成减少，对盐胁迫更敏感，且积累了活性氧物质。而犘５犆犛２突变体则在种子发育
后期引起败育。拟南芥Ｐ５ＣＳ酶表现出非冗余的功能，犘５犆犛１不足以补偿犘５犆犛２失活引起的缺陷［１２］。水稻胁
迫诱导基因犗狊犘５犆犛２在水稻抗盐和抗低温耐受中是必需的［１３］。Ｍａｔｔｉｏｌｉ等［１５］的研究还表明犘５犆犛１与犘５犆犛２
在拟南芥花器官转换过程中功能重合。但在胚胎发育过程中功能不同，犃狋犘５犆犛２在胚胎形成和细胞分裂的脯氨
酸中有特殊作用。在羊草中可能也存在２个不同的犘５犆犛基因，在本试验中已经证明犔犮犘５犆犛１是一个胁迫诱导
基因，在羊草对低温、ＡＢＡ、盐和干旱胁迫的响应中有明显的诱导表达，而犔犮犘５犆犛２的功能还有待于进一步研究
２０２ ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ（２０１３） Ｖｏｌ．２２，Ｎｏ．４
验证。
过表达犘５犆犛１基因能提高作物的抗逆能力。陈吉宝等［１６］证明在拟南芥中的超表达普通菜豆（犘犺犪狊犲狅犾狌狊
狏狌犾犵犪狉犻狊）犘狏犘５犆犛１基因改善了转基因植株的抗旱性和耐盐性。已有研究证明在土豆（犛狅犾犪狀狌犿狋狌犫犲狉狅狊狌犿）［１７］、
水稻［１８，１９］和小麦［２０］中过表达犘５犆犛基因，提高了转基因植株的脯氨酸含量和植株抗逆性。转豇豆（犞犻犵狀犪狌狀
犵狌犻犮狌犾犪狋犪）犘５犆犛基因的萝卜（犇犪狌犮狌狊犮犪狉狅狋犪）也表现出对盐害抗性的提高［２１］。羊草抗寒、耐盐碱，抗逆性能优
良，其犔犮犘５犆犛１的克隆与功能分析为利用基因工程改良农作物奠定了基础。
在羊草创伤处理后，Ｐ５ＣＳ和Ｐ５ＣＤＨ都呈现出上调表达的趋势，ＰＤＨ则表现出下调的表达趋势。说明创伤
胁迫下，在胞质中Ｐ５Ｃ的积累增加，脯氨酸的降解减慢，而线粒体内的Ｐ５Ｃ降解速度加快，位于线粒体内的谷氨
酸增加。说明在创伤处理后，植物体增加脯氨酸的含量是植物对抗外界伤害的一种形式。羊草创伤处理后体内
脯氨酸含量升高可能是其耐牧的一种适应性机制。
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ｓａｌｔｓｔｒｅｓｓｒｅｑｕｉｒｅｓＡＢＡａｎｄｉｓｒｅｇｕｌａｔｅｄｂｙ犃犅犃１，犃犅犐１ａｎｄ犃犡犚２ｉｎ犃狉犪犫犻犱狅狆狊犻狊［Ｊ］．ＴｈｅＰｌａｎｔＪｏｕｒｎａｌ，１９９７，１２（３）：
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ｔｉｏｎａｒｉｌｙｄｉｖｅｒｇｅｎｔｇｅｎｅｓｆｏｒΔ１ｐｙｒｒｏｌｉｎｅ５ｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅｓｙｎｔｈｅｔａｓｅｆｒｏｍｔｏｍａｔｏ［Ｊ］．ＰｌａｎｔＰｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，１９９８，１１８（２）：６６１
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ＺＨＡＮＧＬｅｘｉｎ１，２，ＳＵＭａｎ１，ＭＡＴｉａｎ１，３，ＭＡＸｉｎｇｙｏｎｇ１，ＹＡＮＸｕｅｑｉｎｇ１，２，
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犃犫狊狋狉犪犮狋：犔犲狔犿狌狊犮犺犻狀犲狀狊犻狊ｉｓｔｏｌｅｒａｎｔｔｏｈｉｇｈｓａｌｉｎｉｔｙ，ｄｒｏｕｇｈｔａｎｄｃｏｌｄｓｔｒｅｓｓｅｓ．Ｉｔｉｓａｎｉｍｐｏｒｔａｎｔｐｅｒｅｎｎｉａｌ
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ｓｔｒｅｓｓｅｓ．Δ１ｐｙｒｒｏｌｉｎｅ５ｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ（Ｐ５ＣＳ）ｉｓａｋｅｙｒｅｇｕｌａｔｏｒｙｅｎｚｙｍｅｔｈａｔｐｌａｙｓａｃｒｕｃｉａｌｒｏｌｅｉｎ
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犔．犮犺犻狀犲狀狊犻狊ｗａｓｃｌｏｎｅｄｂｙＲＴ－ＰＣＲｕｓｉｎｇｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓｐｒｉｍｅｒｓ．ＴｈｅｃＤＮＡｓｅｑｕｅｎｃｅｗａｓ２１９７ｂｐｉｎｌｅｎｇｔｈ
ａｎｄｐｕｔａｔｉｖｅｌｙｔｒａｎｓｌａｔｅｄｔｏ７３０ａｍｉｎｏａｃｉｄｓ．Ｂａｓｅｄｏｎｔｈｅｓｅｑｕｅｎｃｅａｌｉｇｎｍｅｎｔｒｅｓｕｌｔｓ，ｔｈｅｐｒｏｔｅｉｎｗａｓｎａｍｅｄ
ＬｃＰ５ＣＳ１．Ｔｈｅｈｏｍｏｌｏｇｙｂｅｔｗｅｅｎ犔犮犘５犆犛１ａｎｄＢｄ犘５犆犛１ｗａｓ９５％，ｂｕｔ犔犮犘５犆犛１ｈａｄｌｏｗｈｏｍｏｌｏｇｙｗｉｔｈ
Ｐ５ＣＳｆｒｏｍｄｉｃｏｔｙｌｅｄｏｎｓ．Ａｎａｌｙｓｉｓｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｐｒｏｆｉｌｅｓｏｆ犔犮犘５犆犛１ｒｅｖｅａｌｅｄｔｈａｔ犔犮犘５犆犛１ｗａｓｈｉｇｈｌｙｅｘｐｒｅｓｓｅｄ
ｉｎｌｅａｆｓｈｅａｔｈｓ，ｓｔｅｍｓａｎｄｌｅａｖｅｓ．Ｉｎｃｏｌｄｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ，ＡＢＡ，ｓａｌｔａｎｄｄｒｏｕｇｈｔｓｔｒｅｓｓ，ｉｔｗａｓｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｉｎ
ｄｕｃｅｄｗｉｔｈｔｉｍｅ，ａｎｄｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｌｅｖｅｌｓｏｆ犔犮犘５犆犛１ｗｅｒｅｕｐｒｅｇｕｌａｔｅｄ．ＴｈｅｒｅｓｕｌｔｓｏｆＳｏｌｅｘａｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇｆｏｒ
ｗｏｕｎｄｅｄ犔．犮犺犻狀犲狀狊犻狊ｓｈｏｗｅｄｔｈａｔ犔犮犘５犆犛１ｗａｓｕｐｒｅｇｕｌａｔｅｄ，ａｎｄｔｈｅｉｎｃｒｅａｓｅｄｐｒｏｌｉｎｅｉｎ犔．犮犺犻狀犲狀狊犻狊ｍａｙ
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犓犲狔狑狅狉犱狊：犔犲狔犿狌狊犮犺犻狀犲狀狊犻狊；ｓｔｒｅｓｓ；Ｐ５ＣＳ；ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｐｒｏｆｉｌｅｓ
４０２ ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ（２０１３） Ｖｏｌ．２２，Ｎｏ．４