全 文 ：林业科学研究　2006, 19 (4) : 446～451
Forest Research
　　文章编号 : 100121498 (2006) 0420446206
新疆杨胰蛋白酶抑制剂基因的克隆与表达 3
梁文星 1 , 范在丰 1 , 李 永 2 , 宋丽敏 1 , 李怀方 1 , 田国忠 23 3
(11中国农业大学植物病理系 ,北京　100094;
21中国林业科学研究院森林生态环境和保护研究所 ,国家林业局森林保护学重点实验室 ,北京　100091)
摘要 :杨树受损伤后能诱导一些基因的表达 ,其编码的蛋白质可能在杨树的防卫反应中起一定作用。用 PCR方法
从新疆杨叶片中克隆出一个损伤诱导型 Kunitz胰蛋白酶抑制剂基因 PaTI1。序列分析表明 :此基因不含内含子 ,其
翻译起点上游具有‘TATA’和‘CCAAT’等转录控制元件 ,包含的阅读框架能编码一个长为 213个氨基酸的多肽。
此多肽与克隆自美洲山杨的 PtTI2和 PtTI1氨基酸序列同源性最高 ,分别为 95%和 80% ,其 N端存在一长度为 27
个氨基酸的信号肽。将此基因以融合蛋白的形式在大肠杆菌中进行表达 ,纯化后的融合蛋白对胰蛋白酶的活性有
抑制作用 ,每 815μg融合蛋白可完全抑制 1μg牛胰蛋白酶的活性。W estern blot分析表明融合蛋白与 PtTI2特异的
抗体之间有明显的血清学反应。
关键词 :蛋白酶抑制剂基因 ;新疆杨 ;损伤诱导
中图分类号 : S792111　　　　　文献标识码 : A
收稿日期 : 2005206207
基金项目 : 国家重点基础研究发展规划项目“树木育种的分子基础研究”(973项目 ) ( G1999016003)
作者简介 : 梁文星 (1979—) ,男 ,山东泰安人 ,在读博士研究生 ,研究方向为植物病毒分子生物学.3 致谢 : 感谢宁夏回族自治区固原市林业局提供新疆杨树苗 ;感谢加拿大 Peter Constabel教授惠赠 PtTI2抗血清.3 3 通讯作者 : 田国忠 (1963—) ,男 ,研究员 ,主要从事森林病理学和分子生物学研究.
The C lon ing and Functiona l Expression of a Kun itz Trypsin Inh ib itor Gene
from Popu lus a lba var. pyram ida lis
L IANG W en2xing1 , FAN Zai2feng1 , L I Yong, SONG L i2m in, L I Huai2fang1 , TIAN Guo2zhong2
(1. Plant Pathology Department, China Agricultural University, Beijing　100094, China;
2. Research Institute of Forest Ecology, Environment and Protection, CAF, Key Laboratory of Forestry Protection,
State Forestry Adm inistration, Beijing　100091, China)
Abstract:Wounding of pop lar trees leads to the accumulation of several mRNA species that encode p roteins with putative
defensive function. A Kuntiz tryp sin inhibitor gene was isolated from Populus alba var. pyram idalis by RT2PCR. The gene
was exp ressed in E. coli as recombinant p rotein and its p roduct was shown to have inhibitor activity to tryp sin in vitro. No
evident affinity was found between the recombinant p rotein and bovine tryp sin. W estern blotting analysis showed that the
recombinant p rotein could strongly recognize the antibody specifically for PtTI2 from trembling aspen.
Key words: tryp sin inhibitor( TI) gene; Populus alba var. pyram idalis; wound inducement
为了抵抗病原物的侵染及食草动物的危害 ,植物在
生长发育过程中产生大量的蛋白水解酶类如几丁质
酶、β21, 32葡聚糖酶以及蛋白酶抑制剂 ( Proteinase
Inhibitor, P I)等 [ 1 ]。P I是一类能够抑制蛋白酶活性
的小分子蛋白或多肽 ,存在于所有的生物体内 ,是自
然界数量最多的一类蛋白质 [ 2 ]。昆虫危害或病原物
侵染能诱导植物的防卫反应 ,而 P I则是众多防卫反
应化学物质中的一类 [ 3 ]。在自然界中 P I的作用主
要有 : (1)防止细胞、组织及器官中蛋白质的过度水
解 ,因为蛋白质的过度水解对于其生化及生理过程
第 4期 梁文星等 :新疆杨胰蛋白酶抑制剂基因的克隆与表达
非常不利 ; (2)保护细胞、组织及器官中的蛋白质免
遭外源蛋白水解酶的水解 [ 2 ]。早在 1954年 , L ipke
等就发现含有大豆胰蛋白酶抑制剂的大豆 ( Glycine
m ax (L inn. ) Merr. )浸提物可抑制拟谷盗 ( Tribolium
confusum Jac. du Val. )的生长 [ 4 ]。1976年 , Peng和
B lack发现 , 受到致病疫霉 ( Phytoph thora infestans
(Mont. ) de Bary)侵染的番茄 (L ycopersicon escu len2
tum M ill. )叶片表现出胰蛋白酶与胰凝乳蛋白酶抑
制剂活性的增强 [ 5 ] , 此后对侵染烟草 ( N icotiana
tabacum L)、马铃薯 ( Sa lanum tuberosum L. )和西瓜
(C itru llus lana tus ( Thunb. ) Mansfeld)等植物的病原
真菌、细菌和病毒的研究中也都观察到类似的现
象 [ 6～8 ]。1987, H ilder等将豇豆 (V igna ungu icu la ta
(L inn. ) W alp. )胰蛋白酶抑制剂 ( Cowpea Tryp sin
Inhibitor, CpTI)基因转化烟草并表达成功 ,首次获
得了蛋白酶抑制剂抗虫性的直接证据 [ 9 ]。根据所抑
制的蛋白水解酶的种类 ,可将 P I分为丝氨酸蛋白酶
抑制剂 ( Serine Proteinase Inhibitor)、半胱氨酸蛋白
酶抑制剂 (Cysteine Proteinase Inhibitor)、天冬氨酸蛋
白酶抑制剂 (A spartic Proteinase Iinhibitor)及金属蛋
白酶抑制剂 (Mentallo2Proteinase Inhibitor)等 [ 3 ]。其
中丝氨酸蛋白酶抑制剂引起了人们更多的关注 [ 2 ]。
到目前为止 ,至少已经从杨树 ( Popu lus spp. )中分离
了 15个丝氨酸蛋白酶抑制剂基因 [ 10～14 ]。
据报道 ,新疆杨 ( Populus a lba L. var. pyram ida2
lis Bge. )等白杨派 ( Sect. L euce Duby)杨树对杨树溃
疡病 (D oth iorella gregaria Sacc. )和天牛 (A noplophora
g labripenn is (Motsh. ) )的抗性比小叶杨 ( P. sim onii
Carr. )和大关杨 ( P. × dakuanensis H su) 要高得
多 [ 15 ]。为了更好地了解新疆杨对昆虫、病原物及损
伤的防卫反应机制 ,作者从新疆杨中克隆了一个胰
蛋白酶抑制剂基因 PaTI 1,并将该基因在大肠杆菌
( Escherich ia coli (M igula) Castellani and Chelmers)
中进行了表达 ,从而为将其进一步应用于抗虫和抗
病的杨树转基因育种创造了条件。
1 材料与方法
1. 1 植物材料及损伤处理
新疆杨幼苗采自宁夏回族自治区固原市 ,栽植
在北京中国林科院。当杨树约 50 cm高 (具有约 25
片叶子 )时用钳子对下部 10 片叶子进行损伤处
理 [ 16 ] , 48 h后 ,采集上部 4片叶子提取总 RNA。
1. 2 总 RNA的提取
使用 TR IZOL 试剂 ( Invitrogen ) 提取叶片总
RNA。取 50～100 mg叶片放在研钵中 ,液氮速冻后
立即研磨成粉末 ,加入 1 mL TR IZOL试剂 ,并进行氯
仿抽提 ,异丙醇沉淀后溶于 DEPC处理的水。
1. 3 PaT I 1基因 cD NA部分片段的序列测定
根据克隆自香脂杨 ×美洲黑杨 ( P. ba lsam ifera
Duroi ×P. deltoides Bartr. ) 的蛋白酶抑制剂基因
PSCH ID, PSCH IF, PSCH IH ( GenBank登录号分别为
M25339,M25341和 M25343)设计引物扩增新疆杨
胰蛋白酶抑制剂基因的部分片段。反转录使用的引
物为 P I3R ( 5′2TTATTGTCCAAACTCCGAACC23′) ,反
应条件为 42 ℃ 1 h。PCR使用引物 P I5F (5′2GATA2
ATAGGCAATCGACTTCC23′)和 P I3R,反应条件为 :
94 ℃, 30 s, 55 ℃, 30 s, 72 ℃, 60 s, 35个循环。用博
大泰克 DNA凝胶回收试剂盒将 PCR产物回收后连
接到 pMD182T ( Takara)载体上。转化、筛选后由申
友公司对重组克隆测序 ,并对所测序列进行 BLAST
分析。
1. 4 PaT I 1基因编码区序列的测定
参照 Murray和 Thomp son[ 17 ]的方法提取植物总
DNA。根据克隆自毛果杨 ×美洲黑杨 ( P. trichocar2
pa Torr. et Groy ×P. deltoides Bartr. )的 Gw in 3基因
( GenBank登录号 X15516)和克隆自美洲山杨 ( P.
trem uloides M ichx. )的 P tTI 2基因 ( GenBank登录号
AF349442)的序列设计引物 ,用以扩增 PaTI 1基因。
PCR反应引物为 P IFL5F / P IFL3R: 5′2AACCTATAT2
GACAACTCGTCG23′/5′2CCTCAATATCATTCTGA2
CACC23′,反应条件为 94 ℃, 30 s, 55 ℃, 30 s, 72 ℃,
30 s, 35个循环。克隆和测序方法同前。
1. 5　序列比较
用 DNAMAN软件 (Lynnon B iosoft,版本 4. 0)将
DNA序列翻译为氨基酸序列 ,并且将其与 GenBank
中的序列进行 BLAST分析。多重比对使用 DNA2
MAN软件。
1. 6　原核表达
以提取的杨树总 DNA为模板扩增 PaTI 1基因
的编码区 (不包括信号肽序列 ) ,正向引物为 P IX5F
( 5′2GCCAAGCTTGAAGATCCTGCAGCAGTG23′) , 反
向引物为 P IX3R ( 5′2CGTCTCGAGCTCAATATCAT2
TCTGACACC23′)。PCR 产物纯化后用 H ind Ⅲ和
X hoⅠ酶切 ,质粒 pET222b ( + ) (Novagen)同样用
H ind Ⅲ和 X hoⅠ双酶切。将经酶切处理的 PCR产
物及载体进行连接 ,转化大肠杆菌 DH5α。对重组
质粒进行测序以验证读码框的正确性。将读框正确
744
林 　业 　科 　学 　研 　究 第 19卷
的重组子及 pET222b ( + ) 转化大肠杆菌 BL21
(DE3) ,挑取单菌落于 3 mL含 Amp 60μg·mL - 1的
LB液体培养基中 , 37 ℃振动培养过夜后 ,按 1∶100
稀释到新鲜的含 Amp 60μg· mL - 1的 LB液体培养
基中 ,振荡培养至 OD600达到 0. 4～1. 0,加入 IPTG
至终浓度为 1 mmol·L - 1 ,继续于 37 ℃培养 3～4 h。
离心收集菌体 , SDS2PAGE[ 18 ]检测蛋白表达情况。
电泳完毕后 ,电转移法转膜 ,丽春红 S染色检测转移
效率。转移后的硝酸纤维素膜先以 5%的脱脂奶粉
封闭 ,然后分别以 PtTI 2抗体、碱性磷酸酯酶标记的
A蛋白 ( Sigma)温育 ,最后用 NBT/BC IP显色对表达
产物进行 W estern blot分析 [ 19 ]。
1. 7　融合蛋白的纯化与活性测定
收集的菌体用抽提缓冲液重悬 ,反复冻融 3次
后 , 12 000 g离心 15 m in收集包含体 [ 20 ] ,溶解后 ,使
用脲浓度逐渐降低的溶解缓冲液对融合蛋白进行透
析 ,使之复性。当脲的浓度达到 1 mol·L - 1时 ,加入
3 mmol·L - 1还原型谷胱苷肽和 1 mmol·L - 1氧化型
谷胱苷肽 ,然后于 4 ℃透析过夜。根据 B radford的
方法 [ 21 ]测定融合蛋白的浓度。根据 Kim 等的方
法 [ 22 ]测定融合蛋白的活性。首先将 0. 1 mL融合蛋
白与 0. 1 mL胰蛋白酶 (10μg)混合 , 30 ℃温育 10
m in,然后加入浓度为 1 mmol·L - 1的 BAEE ( Sigma)
218 mL,以不含融合蛋白的上述溶液为对照测定
253 nm处的吸光值变化 ,每分钟读数 1次 ,反应持
续 9 m in。
2 结果
2. 1 PaT I 1基因 cD NA部分片段的序列测定
分别从损伤处理后和损伤处理前的杨树叶片中
提取总 RNA, RT2PCR后 ,电泳检测 ,发现从前者中
扩增出了一 180 bp的 cDNA片段 ,但后者没有 ,序列
分析显示 PCR产物编码胰蛋白酶抑制剂 ,说明此基
因是损伤诱导表达型基因。BLAST分析证明此 cD2
NA与克隆自 P. trem u loides的 P tTI 2基因和克隆自
P. trichocarrpa ×P. deltoides的 Gw in 3基因同源性
最高。
2. 2 PaT I 1基因编码区序列的测定
为从新疆杨基因组 DNA中分离出胰蛋白酶抑
制剂基因 ,根据 P tTI 2基因和 Gw in 3基因序列设计
引物 ,以新疆杨基因组 DNA为模板进行 PCR扩增。
电泳检测 ,扩增出一 846 bp片段。此片段中最大的
开放阅读框架能编码 213个氨基酸 ( GenBank登录
号 AY671800) ,且不含内含子 ,在翻译起始位点上游
合理位置处有转录控制元件“TATA”框和“CCAAT”
框 (图 1)。
1 AACCTATATGACAACTCGTCGCCCTAGGACTATAATTTTTAGTTTTGTCGGAAATCAGCA
61 CGAGTAAAACACT CCAAT TTATATTCCAAATAATCCAAATGCTTGCTCCA TATAAAT ATA
121 CGCTCTCCATGCGTTGTTTCAACACAAGATCAACAAGACACAATATTGAGATAACTAATA
181 CTCATATTCAACAAATATGAAGATCACTAAATTTCTAGGGCTCTCTTTCCTTCTCTTTGC
1 M K I T K F L G L S F L L F A
241 CTTCGCAGCAACTTTATTTCCTGAGGGCGTTCATGCCGAAGATCCTGCAGCAGTGCTCGA
16 F A A T L F P E G V H A E D P A A V L D
301 TTTCTACGGTCGTGAGGTGCAAGCTGGTACTCCCTATTTAATCCAAGATCTCTCTTACGA
36 F Y G R E V Q A G T P Y L I Q D L S Y E
361 ACCGGGTAATACATCAAATTTTGTGGTCGGTGCGACTATCAACCCCATATGCAATTCAGA
56 P G N T S N F V V G A T I N P I C N S D
421 TGTTGTACTTTCCTACGAGAACGACGGCCTCCCAGTAACATTTTCACCAGTTACAGAATC
76 V V L S Y E N D G L P V T F S P V T E S
481 CACCGATGGTGTCATCCGCGAAGGAACTCTTRTAACTGTGAGCTTTGATGCAGACACATG
96 T D G V I R E G T L X T V S F D A D T C
541 TAATATGACAGGCGTGACACCCATGTGGAAGATTGGATTCAATTCAAAAAGGAGAGGATA
116 N M T G V T P M W K I G F N S K R R G Y
601 CATTGTGACCACAGGAGGTGTTGATCAATTGAATCAGTTTATGATCACCAAGGATAAAAA
136 I V T T G G V D Q L N Q F M I T K D K N
661 TGAGAGTAGTTTTTATCAGCTTTCTTATTGTCCAAAGTCCGATCCCTTTTGTGAATGCTC
156 E S S F Y Q L S Y C P K S D P F C E C S
721 ATGCGTCCCAGTTGGCGCCACCAATGACAAGTACTTGGCTCCCAAAGCCGCCGTTGTCGT
176 C V P V G A T N D K Y L A P K A A V V V
781 TGATGTTAGGTTTAAACCGGAATTAAATATTTATGGTGATAAAATGGTGTCAGAATGATA
196 D V R F K P E L N I Y G D K M V S E 3
841 TTGAGG
图 1　PaTI1基因核苷酸及其推测的氨基酸序列
(下划线部分表示信号肽 ,“TATA”框和“CCAAT”框用方框标出 )
844
第 4期 梁文星等 :新疆杨胰蛋白酶抑制剂基因的克隆与表达
序列分析显示所克隆的 PaTI 1在核苷酸水平
上与 P tTI 2 、P tTI 1 和 Gw in 3 的同源性分别为
98%、90%和 85%。将此基因的核苷酸序列翻译成
氨基酸序列后发现其氨基端可能存在一长度为 27
个氨基酸的信号肽 ,切割后会产生一分子量为 2013
kD的多肽。将此氨基酸序列进行 BLAST分析 ,发
现其与 PtTI 2、PtTI 1 ( P. trem u loides)、PnTIH 1. 1
( P. n igra L. )、Gwin 3、PnTIH 112 ( P. n igra)和 W in
3112 ( P. trichocarpa ×P. deltoides)的同源性最高 ,
分别为 95%、80%、74%、73%、73%和 72% ,但其中
只有 PtTI 2的胰蛋白酶抑制剂活性已被证明。比对
分析发现 ,此 7个多肽氨基酸序列的信号肽部分比
其编码区更为保守 ,因此 ,这 7个多肽可能在细胞内
相同的位置起作用。根据构建的进化树可以看出 ,
PaTI 1 与 PtTI 2 和 PtTI 1 具有较近的亲缘关系
(图 2)。　
图 2　PaTI 1与其它杨树中 6种蛋白酶抑制剂的系统进化树分析。
由 DNAMAN软件构建
2. 3 PaT I 1基因的原核表达
将重组子 pET2PaTI 1进行 PCR和酶切验证后 ,
转化大肠杆菌 BL21,并进行 IPTG诱导表达。 SDS2
PAGE后 ,考马斯亮蓝染色结果表明 :含 pET2PaTI 1
的菌株特异地产生了一分子量为 2715 kD的条带。
由于 PtTI 2与 PaTI 1氨基酸序列的同源性为 95% ,
因此以 PtTI 2抗血清对融合蛋白进行免疫检测。
W estern blot显示 , PtTI 2抗血清仅与此 2715 kD的
诱导表达产物反应 ,而与其它条带之间均无反应 ,证
明此条带即为所需要的产物 (图 3)。
2. 4 融合蛋白的纯化与活性测定
融合蛋白用前面所述的方法进行纯化及复性
后 , B radford法测定其浓度为 245 μg·mL - 1。用
2415μg的融合蛋白与 10μg的牛胰蛋白酶温育后 ,
图 3　表达产物的 SDS2PAGE和 W estern blot分析
胰蛋白酶的活性低于对照。根据活性测定曲线可
知 ,每 815μg融合蛋白可完全抑制 1μg胰蛋白酶的
活性 (图 4)。
图 4　融合蛋白的体外活性测定。系列 1为融合蛋白的
活性测定曲线 ;系列 2为对照
3 讨论
新疆杨在中国西北地区广泛种植 ,包括甘肃、陕
西、青海以及宁夏等。虽然新疆杨对害虫和病原表
现出较高抗性 ,但人们对与抗性相关的蛋白质及其
相应基因却了解很少。对损伤的系统反应是蛋白酶
抑制剂基因的一个典型特征。通过 PCR从新疆杨
未受损伤的上部叶片 (对其下部叶片进行损伤处
理 )中分离了一个胰蛋白酶抑制剂基因 ,“TATA”框
和“CCAAT”框位于翻译起始位点上游合理位置处 ,
而且基因内部没有内含子。此蛋白酶抑制剂与一功
能已知的、损伤诱导型的胰蛋白酶抑制剂 PtTI 2有
较高的同源性。由于 PaTI 1与其它已分离的胰蛋白
酶抑制剂在信号肽部分有较高的同源性 ,因此推测
这些蛋白酶抑制剂定位于细胞内相同位置。推测
PaTI 1基因为多基因家族的一员 ,理由为 : (1)从杨
944
林 　业 　科 　学 　研 　究 第 19卷
树中分离的其它胰蛋白酶抑制剂基因都属于多基因
家族 ; (2)新疆杨对许多害虫有较高的抗性 ,一种蛋
白酶抑制剂对一些害虫中的蛋白酶有效 ,但对另一
些害虫中的蛋白酶则无效 [ 23 ]。为抵御含有不同活
性蛋白酶的害虫的侵害 ,新疆杨应含有多种具不同
特异性的蛋白酶抑制剂 ; ( 3)已发现一些害虫中的
胰蛋白酶对一些胰蛋白酶抑制剂具有抗性 ,新疆杨
含有多种具不同活性的胰蛋白酶抑制剂应该是对此
现象的一种适应 [ 13 ]。
损伤导致 PaTI 1基因的过量表达 ,而 PqsaT I
蛋白的过量产生可能有助于杨树抵抗病虫为害。调
查表明 ,白杨派包括新疆杨、毛白杨 ( P. tom entosa
Carr. )比青杨派 ( Sect. tacam ahaca Spach)的大关
杨、小叶杨对天牛和溃疡病有相对较高的抗性 [ 24 ]。
尽管以前曾经对此做过不少研究 ,但是到目前为止
其抗性机制仍然不甚清楚。在本项实验的基础上 ,
可以合成 DNA或 RNA的探针用以检测具有不同抗
性特征的不同杨树品种中 PaTI 1基因的表达情况。
据估计 , PaTI 1基因的反应时间、特异性、活性及 Pa2
TI 1蛋白的量都可能与抗性机制相关。由昆虫取食
或病原侵染诱导而产生的损伤信号可能最先引起杨
树的一系列特异的及非特异的损伤诱导的防卫反
应 ,包括蛋白酶抑制剂、几丁质酶 ,β21, 32葡聚糖酶
和过氧化物酶的产生 ,而这些酶的产生都与各种逆
境有或多或少的关系 [ 11 ]。
本研究中所表达的融合蛋白的活性远远低于
PtTI2 (0175μg PtTI2能完全抑制 1μg牛胰蛋白酶
的活性 ) ,可能是因为 : ( 1)纯化后的融合蛋白复性
不完全 ; (2)以融合蛋白形式存在 ,折叠时遮盖了其
活性位点 ; ( 3)在大肠杆菌中表达的蛋白其翻译后
的修饰不同于真核生物 ,虽然曾有报道翻译后的修
饰对胰蛋白酶抑制剂的活性影响很小 [ 25 ] ; ( 4)两种
抑制剂的氨基酸序列差异。
虽然有些蛋白酶抑制剂在体外具有抑制蛋白酶
的活性 , 但在转基因植物中其抗虫活性并不明
显 [ 26 ]。将此基因导入杨树、果树和作物 ,并测定转
基因植物的抗虫活性 ,尤其是对编码丝氨酸蛋白酶
的病毒的抗性作用值得进一步研究。
参考文献 :
[ 1 ] Ryan C A. System ic response to wounding[A ]. In: Denno R, Mc2
Clure M. Variable Plants and Herbivores in Natural and Managed
System s[M ]1 Academ ic Press, New York, 1983: 43 ～ 60
[ 2 ] Ryan C A. Proteinase inhibitor gene fam ilies: Strategies for trans2
formation to imp rove p lant defenses against herbivores [ J ]. B ioEs2
says, 1989, 10: 20 ～ 24
[ 3 ] Ryan C A. Protease inhibitors in p lants: genes for imp roving defen2
ses against insects and pathogens [ J ]. Annu Rev Phytopathol,
1990, 28: 425 ～ 449
[ 4 ] L ipke H, Fraenkel G S, L iener I. Effect of soybean inhibitors on
growth of Tribolium confusum [ J ]. Agric Food Chem, 1954, 2: 410
～ 414
[ 5 ] Peng L H, B lack L L. Increased p roteinase inhibitor activity in re2
sponse to infection of resistant tomato p lants by Phytophthora infes2
tans[ J ]. Phytopathol, 1976, 66: 958 ～ 963
[ 6 ] Geoffroy P, Legrand M, Fritig B. Isolation and characterization of a
p roteinaceous inhibitor of m icrobial p roteinases induced during the
hypersensitive reaction of tobacco to tobacco mosaic virus [ J ]. Mol
Plant2M icrobe In, 1990, 3: 327 ～ 333
[ 7 ] Pautot V, Holzer F M, W alling L L. D ifferential exp ression of to2
mato p roteinase inhibitor Ⅰand Ⅱ genes during bacterial pathogen
invasion and wounding [ J ]. Mol Plant2M icrobe Interact, 1991, 4:
284 ～ 292
[ 8 ] Roby D, Toppan A, Esquerre2Tugaye M T. Cell surface in p lant
m icroorganism interactions. Ⅷ. Increased p roteinase inhibitor activ2
ity in melon p lants in response to infection by Colletotrichum lagena2
rium or to treatment with an elicitor fraction from this fungus [ J ].
Physio Mol Plant Pathol, 1987, 30: 453 ～ 460
[ 9 ] H ilder V A, Gatehouse A M R, Sheerman S E, et a l. A novel
mechanism of insect resistance engineered into tobacco [ J ]. Na2
ture, 1987, 330: 160 ～ 163
[ 10 ] B radshaw H D Jr, Hollick J B , Parsons T J, et a l. System ically
wound2responsive genes in pop lar trees encode p roteins sim ilar to
sweet potato sporam ins and legume Kunitz tryp sin inhibitors [ J ].
PlantMol B iol, 1989, 14: 51 ～ 59
[ 11 ] Parsons T J, B radshaw H D Jr, Gordon M P. System ic accumula2
tion of specific mRNA s in respone to wounding in pop lar trees [ J ].
Proc Natl Acad Sci, USA, 1989, 86: 7895 ～ 7899
[ 12 ] Hollick J B, Gordan M P. A pop lar tree p roteinase inhibitor2like
gene p romoter is responsive to wounding in transgenic tobacco [ J ].
PlantMol B iol, 1993, 22: 561 ～ 572
[ 13 ] Haruta M, Major I T, ChristopherM E, et a l. A Kunitz tryp sin in2
hibitor gene fam ily from trembling aspen ( Populus trem uloides
M ichx. ) : cloning, functional exp ression, and induction by woun2
ding and herbivory [ J ]. PlantMol B iol, 2001, 46: 347 ～ 359
[ 14 ] N ishiguchi M. A genom ic DNA clone encoding tryp sin inhibitor
homolog [D ].
[ 15 ] 秦锡祥 , 高瑞桐 , 曹桂洪 , 等. 抗光肩天牛杨树品种的筛选研
究 [ J ]. 林业科学研究 , 1993, 6 (专刊 ) : 42 ～ 45
[ 16 ] Larson P R, Isebrands J G. The p lastochron index as app lied to de2
velopmental studies of cottonwood [ J ]. Can J Forest Res, 1971,
1: 1 ～ 11
[ 17 ] Murray M G, Thomp son W F. Rap id isolation of high molecular2
weight p lant DNA [ J ]. Nucl Acids Res, 1980, 8: 4321 ～ 4325
[ 18 ] Sambrook J, Fritsch E F, Maniatis T. Molecular Cloning: A Labo2
ratory Manual [M ]. Cold Sp ring Harbor Press, 1989
054
第 4期 梁文星等 :新疆杨胰蛋白酶抑制剂基因的克隆与表达
[ 19 ] Towbin H. Electrophoretic transfer of p rotein from polyacrylam ide
gels to nitrocellulose sheets: p rocedure and some app lication [ J ].
Proc Natl Acad Sci, USA, 1979, 76: 4350 ～ 4354
[ 20 ] 方敏 ,黄华樑. 包涵体蛋白质体外复性的研究进展 [ J ]. 生物
工程学报 , 2001, 17: 608 ～ 612
[ 21 ] B radford M. A rap id and sensitive method for the quantitation of
m icrogram quantities of p rotein utilizing the p rincip les of p rotein2dye
binding [ J ]. Anal. B iochem, 1976, 71: 248 ～ 254
[ 22 ] Kim S H, Hara S, Hase S, et a l. Comparative study on am ino acid
sequences of Kunitz2type soybean tryp sin inhibitors, Tia, Tib, and
Tic1 [ J ]. J B iochem, 1985, 98: 435 ～ 448
[ 23 ] R ichardon M. Seed storage p roteins: the enzyme inhibitors [ J ].
Meth Plant B iochem, 1991, 5: 259 ～ 305
[ 24 ] 赵天锡 ,陈章水. 中国杨树集约栽培 [M ]. 北京 :中国科学技
术出版社 , 1994: 269 ～ 307
[ 25 ] Yeh K W , Chen J C, L in M I, et a l. Functional activity of spo2
ram in from sweet potato ( Ipom oea bata tas Lam. ) : a tuber storage
p rotein with tryp sin inhibitor activity [ J ]. Plant Mol B iol, 1997,
33: 565 ～ 570
[ 26 ] Confalonieri M, A llegro G, Balestrazzi A, et al. Regeneration of
Populus n igra transgenic p lants exp ression a Kunitz p roteinase in2
hibitor ( KTi3) gene [ J ]. Mol B reed, 1998, 4: 137～145
154