全 文 ：林 业科 学研 究 2010, 23( 6) : 823 827
Forest Research
文章编号: 1001-1498( 2010) 06-0823-05
白蜡虫阔柄跳小蜂体内 Wolbachia 的 wsp 基因分子
检测及序列分析 *
杨 璞, 陈晓鸣* * , 李 萌, 文 灿
( 中国林业科学研究院资源昆虫研究所 , 云南 昆明 650224)
摘要: 采用 Wolbachia 的通用引物对白蜡虫优势寄生蜂之一, 白蜡虫阔柄跳小蜂 ( Metaphycus ericeri Xu et Jiang) 体内
Wolbachia的 wsp基因进行 PCR 扩增, 以此为模板结合 Wolbachia的 A 大组和 B 大组的特异性引物进行巢式 PCR 扩
增, 结果表明: 白蜡虫阔柄跳小蜂被 A 大组和 B 大组 Wolbachia 复合感染, 将两种寄生蜂感染的 A 大组和 B 大组
Wolbachia 基因片段以及采用通用引物获得的基因片段分别命名为 wMeeriA 、wMeeriB 和 wMeeri, 对应的片段长度分
别为 554、439、599 bp。系统发育分析表明: 白蜡虫阔柄跳小蜂感染的 Wolbachia 分属于 A 大组以及 B 大组的 Con亚
组。所获得的序列已经递交到 NCBI, 登录号分别为: HQ161162、HQ161163 和 HQ161164。
关键词: 白蜡虫阔柄跳小蜂; Wolbachia; wsp
中图分类法: S899. 1 文献标识码: A
收稿日期 : 2010-07-12
基金项目 : 中国林科 院资源 昆虫 研究所 中央级 公益性 科研院 所基 本科研 业务费 专项资 金 ( 7-015 -3 ) 、云 南省 应用 基础 研究 基金
( 2010ZC235) 和国家自然科学基金青年科学基金 ( 31000983 / C040506) 资助 .
作者简介 : 杨 璞 ( 1979— ) , 男 , 硕士 , 助理研究员 , 主要从事白蜡虫分子生物学研究 . E-mail: zjuyangpu@ yahoo. cn.
* 致谢 : 本单位的赵敏博士和吴海霞博士在数据分析过程给予帮助 , 在此表示感谢 !
* * 通讯作者 .
Molecular Detection and Sequence Analysis of wsp Gene from Wolbachia
in Metaphycus ericeri Xu et Jiang in Ericerus pela
YANG Pu, CHEN Xiao-ming, LI Meng, WEN Can
( Research Institute of Resource Insects, Chinese Academy of Forestry, Kunming 650224, Yunnan, China)
Abstract: Universal primers were used to amply wsp gene from Metaphycus ericeri DNA by PCR, and the product was used
as templates for the following nested PCR amplification using the specific primers for A and B groups of Wolbachia. The re-
sults showed that, M. ericeri was infected by both A and B group of Wolbachia. The sequences were named as wMeeriA,
wMeeriB and wMeeri, and the length were 554, 439 and 599 bp, respectively. Wolbachia in M. ericeri were classified as A-
Wolbachia and Con group of B-Wolbachia by phylogenetic analysis of wsp genes. Sequences obtained from this study have
been submitted to GenBank and the accession numbers assigned were HQ161162, HQ161163 and HQ161164.
Key words: Metaphycus ericeri; Wolbachia; wsp
Wolbachia 是一类寄生在节肢动物体内, 可以引
起节肢动物生殖行为改变的细胞质遗传的共生
菌 [ 1 - 2 ] , 最早是 1924 年 Hertig 和 Wolbach 在尖音库
蚊( Culex pipiens) 的卵巢中发现并命名 [ 3 ] 。Wolba-
chia 在昆虫纲的鞘翅目、双翅目、半翅目、鳞翅目、直
翅目、蜻蜓目、等翅目、弹尾目 [ 4 ] 和膜翅目 [ 5] 中都有
广泛分布 [ 6] 。Wolbachia 可以在同种宿主的不同个
体间进行传播, 也可以在系统关系较远的昆虫种间
进行水平传播。在以 PCR 为基础的分子检测技术
出现之前, 曾用 DAPI 染色法和电镜分析的方法对
Wolbachia 进行判断 [ 7 - 8 ] 。20 世纪 90 年代以来用
PCR 的方法对 16SrDNA、23S rDNA、ftsZ 和 wsp 等基
林 业 科 学 研 究 第 23 卷
因进行分子检测。据报道, wsp ( Wolbachia surface
protein, Wolbachia 表面蛋白编码基因) 是进化最快的
基因, 因而被广泛用于 Wolbachia 的 PCR 检测 [ 9 - 12] 。
Zhou 等 [ 10 ] 根据 wsp 基因, 将主要感染昆虫、螨以及
甲壳类动物的 A 大组和 B 大组 Wolbachia 又细分为
12 个亚组。随着对 Wolbachia 的深入研究, 不断有
新的亚组被发现。
白蜡虫 ( Ericerus pela) 是我国一种重要的资源
昆虫, 该虫被多种寄生蜂寄生, 其中白蜡虫阔柄跳小
蜂( Metaphycus ericeri) 为白蜡虫优势寄生蜂之一, 对
白蜡虫生产造成严重危害 [ 13 ] 。关于该寄生蜂的生
物学特性研究较多, 但关于该寄生蜂体内共生菌
Wolbachia 的研究还未见报道, 为此, 作者对白蜡虫
阔柄跳小蜂体内 Wolbachia 的 wsp 基因进行 PCR 检
测, 并对基因序列进行系统进化分析, 了解 Wolba-
chia 在白蜡虫阔柄跳小蜂体内的感染情况, 为进一
步讨论 Wolbachia 对其生殖方式的影响以及白蜡虫
寄生蜂防治提供理论依据。
1 材料与方法
1. 1 供试虫源
所用白蜡虫阔柄跳小蜂采自昆明资源昆虫研究
所人工大棚内的白蜡虫上, 于 - 20 ℃冻存。
1.2 基因组 DNA 提取
采用改良的蛋白酶 K 法 [ 14 ] 。取 5 头白蜡虫阔
柄跳小蜂放在 1. 5 mL的离心管中, 加入 200 μL 裂
解液( 100 mmol Tris-HC1, 25 mmol EDTA, 500 mmol
NaCl, 1% SDS, pH值 8. 0) 研磨, 300 μL裂解液冲洗
研磨棒, 加蛋白酶 K 至终浓度为 100 μg·mL- 1 , 50
℃水浴 4 h, 加入等体积的酚: 氯仿: 异戊醇( 25∶24∶
1) , 14 000 g 离心 5 min, 用氯仿: 异戊醇( 24∶1) 重复
抽提 1 次, 取上清加入 1 mL 预冷的无水乙醇, 14
000 g离心 10 min, 沉淀用 75% 乙醇洗涤, 充分干燥
后 0. 5 ×TE 溶解沉淀, 4 ℃保存备用。
1.3 PCR 扩增
参照 Zhou 等 [ 10 ] 设计的 wsp 基因的引物: 81F
( 5′-TGGTCCAATAAGTGATGAAGAAAC-3′) 、 136F
( 5′-TGAAATTTTACCTCTTTTC-3′、 522R ( 5′-AC-
CAGCTTTTGCTTGATA-3′) 、691R ( 5′-AAAAATTA-
AACGCTACTCCA-3′) , 其中, 81F/691R 为 Wolbachia
的 wsp 基因的通用引物, 136F/691R 为 A 大组特异
性引物, 81F/522R 为 B 大组特异性引物, 3 对引物
所用扩增体系和 PCR 反应程序相同。扩增体系为
50 μL体系: ddH2 O 34. 5 μL, 10 ×PCR buffer 5 μL,
10 μmol·L - 1 primer F 1. 25 μL, 10 μmol·L - 1 prim-
er R 1. 25 μL, 10 mmol·L - 1 dNTP 1. 25 μL, 5 μ·
μL Taq polymerase 0. 5 μL, 25 μmol· L - 1 MgCl2
3. 75 μL, DNA 模板 2. 5 μL。PCR 程序为: 94 ℃, 4
min; 94 ℃, 1 min, 48 ℃, 1 min, 72 ℃, 1 min, 35 个循
环; 72 ℃, 10 min。以基因组 DNA 为模板结合通用
引物获得的 PCR 产物作为巢式 PCR 扩增的模板, 反
应体系和 PCR 程序同前。1% 琼脂糖凝胶电泳检
测, 紫外灯下检测拍照。
1.4 克隆及序列测定
紫外灯下切下相应条带, 按照 Axygen 凝胶回收
试剂盒操作, 将纯化的产物与 pMD19-T 载体 4 ℃连
接过夜, 转化大肠杆菌 DH5-α感受态细胞 ( 按照
Takara的载体试剂盒操作) , 通过蓝白斑筛选以及菌
液 PCR 检测阳性重组克隆。菌液送交南京金斯瑞
公司测序。
1.5 序列分析
将引 自 NCBI 的 26 条 序列 以及 wMeeriA 和
wMeeriB 序 列 用 clustalX1. 83 比 对 后, 输 入
MEGA4. 1, 采用 Kimura-2 Parameter 模型建 NJ树( 图
2) , 各分支的 bootstrap 置信度用 1 000 次自导复制
来评价。
2 结果与分析
2.1 wsp基因的 PCR 检测
以基因组 DNA 为模板, 结合 wsp 基因的通用引
物进行 PCR 扩增, 获得的条带较弱, 以该 PCR 产物
为模板, 采用通用引物、A 大组和 B 大组特异性引物
均扩增出了目的片段( 图 1) 。
泳道 1 为采用通用引物以基因组 DNA 为模板进行的 PCR 扩
增 , 泳道 2 4 是以 PCR 产物为模板 , 结合通用引物、B 大组和 A 大
组特异引物进行巢式 PCR 扩增 获得的 wMeeri、wMeeriB 和 wMeeriA
基因片段。 M为 Marker, 箭头所指条带分别为 750、1 000 bp。
图 1 采用通用引物、A 大组和 B 大组特异引物进行
PCR 扩增获得的白蜡虫阔柄跳小蜂体内
Wolbachia 的 wsp 基因片段的电泳图
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第 6 期 杨 璞等: 白蜡虫阔柄跳小蜂体内 Wolbachia的 wsp 基因分子检测及序列分析
白蜡虫阔柄跳小蜂体内 Wolbachia 的 wsp 基因
片段长度为 599 bp, 命名为 wMeeri, 采用 A 大组特异
性引物获得的片段为 554 bp, 命名为 wMeeriA, 采用
B 大组特异性引物获得的片段为 439 bp, 命名为
wMeeriB, 所获得的片段已经在 genebank 登录, 登录
号分别为 HQ161162、HQ161163 和 HQ161164。
2.2 wsp基因的序列分析
wMeeri 和 wMeeriB 2 条基因片段在对应位置碱
基序列完全相同, wMeeri 和 wMeeriA 2 条序列在对应
位置 碱 基 序 列 差 异 很 大 ( 图 2 ) , 一 致 性 仅 为
77. 44% 。将采用 A 大组和 B 大组特异引物获得的
wMeeriA和 wMeeriB 序列与 GenBank 中昆虫共生菌
Wolbachia 的 wsp 基因序列进行系统发育分析, 结果
表明: wMeeriA 属于 A 大组, wMeeriB 属于 B 大组的
Con亚组( 图 3) 。表明白蜡虫阔柄跳小蜂被 A 大组
和 B 大组 Wolbachia 复合感染。
“- ”为相同碱基 , “. ”为缺失碱基 , 阴影部分为引物名称
图 2 白蜡虫阔柄跳小蜂体内 Wolbachia 共生菌 wsp 基因序列比较
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林 业 科 学 研 究 第 23 卷
CI: 细胞质不亲和作用 ; FEC: 增强繁殖力 ; T: 产雌孤雌生殖 ; F: 雌性化
图 3 基于 wsp 基因序列的白蜡虫阔柄跳小蜂体内 Wolbachia 的系统进化树
3 讨论
聚类结果表明: wMeeriA 和 wMeeriB 分属于 A 大
组和 B 大组 Wolbachia, wMeeriB 与 B 大组的 Con 亚
组聚类在一起, 属于 Con 亚组。wMeeriA 与 wSdagA5
品系聚类在一起, 但支持率较低 ( 72% ) , 采用多种
聚类方法得到的结果相似, 无法确定 wMeeriA 与 wS-
dagA5 品系是否为同一亚组。虽然 wMeeriA、wSda-
gA5 品系与 Mel 亚组聚为一个类群, 但不能确定它
们是否属于 Mel 亚组。因此, wMeeriA 属于哪一亚组
有待进一步研究。
自然界中约 16% 的昆虫感染 Wolbachia[ 15 ] , 本
研究表明: 白蜡虫阔柄跳小蜂体内感染了 2 种 Wol-
bachia, 虽然单个寄主昆虫复合感染的来源并不清
楚, 但已知 Wolbachia 在不同寄主之间可以水平传
播 [ 5 , 16 ] , 白蜡虫寄生蜂之间是否存在 Wolbachia 的水
平传播需要对白蜡虫其它寄生蜂进行 wsp 基因的分
子检测。
Wolbachia 对寄主的生殖调控具有很重要的作
用, 但有研究认为 Wolbachia 对不同种类的寄主所起
的生殖调控作用可能不同, 而且 Wolbachia 密度不同
时其作用可能也会有所不同 [ 17 - 18 ] 。采用通用引物
分析只能说明寄主被一种 Wolbachia 感染, 而用 A 大
组和 B 大组引物则可检测到寄主被 2 种 Wolbachia
复合感染, 这说明 2 种 Wolbachia 在寄主体内的丰度
并不相同, 白蜡虫阔柄跳小蜂如何获得 2 种品系的
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第 6 期 杨 璞等: 白蜡虫阔柄跳小蜂体内 Wolbachia的 wsp 基因分子检测及序列分析
Wolbachia? 它们对寄主调控机制如何? 有待进一步
探讨。
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