全 文 ：林业科学研究　2007, 20 (5) : 699～704
Forest Research
　　文章编号 : 100121498 (2007) 0520699206
银腺杨转 Cry I Ac和 API双价抗虫基因的研究 3
李科友 1 , 樊军锋 13 3 , 赵　忠 1 , 李　玲 2 , 朱海兰 1
(1. 西北农林科技大学林学院 ,陕西 杨凌　712100; 2. 中国林业科学研究院林业研究所 ,北京　100091)
摘要 :在建立以银腺杨 (84K)叶片为外植体的再生系统基础上 ,通过农杆菌介导法把 C ry I A c和 A PI双价抗虫基因
导入银腺杨 (84K)基因组中。转化杨树叶片 ,在含有卡那霉素的培养基上诱导不定芽和诱导生根 ,获得了 400株卡
那霉素抗性转化再生植株。抗性植株经 PCR检测 ,有 70株呈阳性。通过 Southern杂交和 EL ISA检测进一步证明
C ry I A c和 A PI双价抗虫基因已整合到银腺杨 (84K)基因组中 ,拷贝数 1～2个 ,并得到了表达。转化植株用杨扇舟
蛾幼虫进行饲虫试验 ,结果表明昆虫幼虫的死亡率高达 60. 0% ～80. 0%。同时 ,存活幼虫的生长发育也受到了明显
抑制。本研究结果为杨树抗虫育种提供了新的种质资源。
关键词 :银腺杨 (84K) ; C ry I A c和 A PI基因 ;转化 ;抗虫性
中图分类号 : S722. 3 文献标识码 : A
收稿日期 : 2007203216
基金项目 : 国家转基因植物研究与产业化专项“耐盐抗虫转基因杨树新品种选育 (JY032B226202) ”。
作者简介 : 李科友 (1962—) ,男 ,陕西武功人 ,副教授. 主要从事生物技术和植物化学研究.3 本研究工作在国家林业局林木育种与生物技术重点实验室完成.3 3 通讯作者 :樊军锋 (1962—) ,男 ,陕西扶风人 ,副教授. 主要从事林木遗传育种研究.
Tran sforma tion of C ry I A c and A P I Two In sect2resistan t
Genes to Poplar( Popu lus a lba ×P. glandu losa )
L I Ke2you1 , FAN Jun2feng1 , ZHAO Zhong1 , L I L ing2 , ZHU Hai2lan1
( 1. College of Forestry, Northwest Sci2Tech of Agricultural and Forestry University, Yangling　712100, Shaanxi, China;
2. Research Institute of Forestry , CAF, Beijing　100091, China)
Abstract:Based on the established leaf exp lant regeneration system of pop lar ( Popu lus a lba ×P. g landu losa cv.
84K) , C ry I A c and A P I fused genes were introduced into the genome of pop lar 84K by A grobacterium tum efaciens2
mediated transformation. Through successive selection in the period of shoot and root induction under high level ka2
namycin2p ressure, 400 kanamycin2resistant regenerated p lants were obtained, 70 of them were positive resulted by
PCR detection. Southern hybridization and EL ISA detection were further showed that C ry I A c and A P I gene had
been integrated into the genome of 84K with one or two cop ies and exp ressed. The transformation p lants were given
insect feeding test with larvae of C lostera anachoreta. The results showed the mortality of insect larvae was accounted
for 60. 0% ～80. 0% , and the growth of the survival larvae were seriously inhibited. These p lants could p rovide new
resources for pop lar insect2resistant breeding.
Key words: pop lar( P. a lba ×P. g landu losa cv. 84K) ; C ry I A c and A P I gene; transformation; resistance to insect
银腺杨 ( Populus a lba L. ×P. g landu losa Dode
cv. 84K)是 20年来我国推广范围最广 ,数量最多 ,
产业化最好的两个杨树品种之一。但由于害虫严
重 ,每年都给杨树人工林造成巨大的损失。利用基
因工程技术培育抗虫杨树 ,是防治害虫的有效手
段 [ 1～3 ]。目前在杨树上应用的抗虫基因主要有两
林 　业 　科 　学 　研 　究 第 20卷
类 :一是从微生物苏云金杆菌中分离出的苏云金杆
菌杀虫结晶蛋白基因 ,简称 B t毒蛋白基因 ;二是从
植物中分离出的昆虫蛋白酶抑制剂基因。B t毒蛋
白基因已在欧洲黑杨 ( P. n igra L. ) [ 4～6 ]、杂交杨
[ (银白杨 ×大齿杨 NC5339 P. a lba ×P. grand iden t2
a ta M ichx. cl. NC5339,美洲黑杨 ×小叶杨 NL80106
P. deltoides Bartr. ×P. sim onii Carr. cl. NL80106,银
白杨 ×大齿杨 P. a lba ×P. grand iden ta ta ) [ 7～9 ]、741
杨 [ ( P. a lba L. ×P. david iana Dode + P. sim onii
Carr. ) ×P. tom entosa Carr. ] [ 10 ]、美洲黑杨 [ 11 ]、欧美
杨 [ P. ×euram ericana (Dode) Guineir ] [ 12 ]等杨树抗
虫育种中得到应用 ,并获得了良好的效果。导入杨
树的蛋白酶抑制剂有马铃薯胰蛋白酶抑制剂 ( Pin2
Ⅱ) [ 13～15 ]、水稻半胱氨酸蛋白酶抑制剂 (OC I) [ 16 ]、
拟南芥半胱氨酸蛋白酶抑制剂 (Accys) [ 17 ]和豇豆胰
蛋白酶抑制剂 (CPTI) [ 18 ]等。但 B t毒蛋白杀虫谱带
较窄 ,且易诱导昆虫对其产生耐受性。与 B t毒蛋白
相比 ,蛋白酶抑制剂具有抗虫谱广 ,对人畜无副作用
及昆虫不易产生耐受性等特点 ,但存在着在转基因
植株中表达量低等弱点。迄今为止 ,大多数的研究
工作都是将单一的抗虫基因转入植物 ,容易使害虫
产生耐受性。解决这一问题比较有效的方法就是同
时使用两种或两种以上不同抗虫机制的抗虫基因转
化植物 ,即使害虫对其中一种毒素产生抗性 ,转基因
植物的抗虫能力也不至于丧失 [ 19～22 ]。
银腺杨 (84K)是韩国杨树育种专家培育成功的
一个著名白杨派 ( Sect. L euce Duby)内种间杂种。
1984年引入我国 , 1987年通过中国林业科学研究院
引入陕西。其抗逆性强 (能耐 - 30 ℃低温 ) ,材质
好 ,生长快 (1年生苗最高达 5 m ) ,树干通直 ,树皮光
滑 ,树形优美 ,雄性不飞絮 ,根系十分发达 ,根蘖能力
强 ,固土效果好。银腺杨 ( 84K)不仅是一个优良的
工业用材树种 ,一个优美的城乡绿化树种 ,也是一个
良好的防护林树种。为提高该品种抗虫性 ,笔者采
用叶盘法开展了银腺杨 (84K)双价 B t (C ry I A c)和
A P I基因转化研究 ,以培育银腺杨 (84K)抗虫转基因
新品种。
1 材料和方法
1. 1 抗虫基因、植物表达载体及农杆菌菌株
1. 1. 1　抗虫基因 　本实验所转基因为中国科学院
微生物研究所构建的 B t ( C ry I A c) (部分改造 )和
A P I (慈菇蛋白酶抑制剂基因 )双抗虫基因。
1. 1. 2 植物双价双元表达载体 　如图 1所示 ,在
此表达载体中 ,两个抗虫基因分别处于两个达框架
中 ,所用的启动子都是具有双增强子的 CaMV 35S
启动子 ,在启动子下游和翻译起始位点上游都存在
一个 TMV 2RNA 的翻译增强子“Ω”片段 ,这种带
“Ω”的结构将有利于外源基因在植物中的高效
表达 [ 23 ]。
图 1　含有双抗基因的植物表达载体的构建
1. 1. 3　农杆菌菌株 　农杆菌菌株选用 LBA4404,将
pB tiA双价双元表达载体采用电击法转入 LBA4404。
1. 2　转化受体系统的建立
1. 2. 1　卡那霉素 ( Km)敏感性试验
1. 2. 1. 1　叶片 Km敏感性试验 　将叶片外植体沿
主脉横切后放入含有 0、20、30、40、50、60 mg·L - 1
Km的不定芽诱导培养基 MS + 0. 5 mg·L - 1 6 - BA
+ 0. 05 mg·L - 1 NAA中培养。每 10天换 1次培养
基。1月后根据叶片上不定芽分化及生长状况筛选
叶片外植体 Km临界耐受浓度。
1. 2. 1. 2　生根诱导 Km 敏感性试验 　将长度约 1
cm的不定芽放入含有 0、20、40和 60 mg·L - 1 Km
的生根培养基 1 /2 MS + 0. 05 mg·L - 1 NAA + 0. 05
mg·L - 1 IBA中培养。培养 30 d后 ,根据各浓度生
根状态 ,筛选适宜的不定芽生根诱导的 Km临界耐
受浓度。
1. 2. 2　抑菌抗生素种类和浓度的确定 　将头孢霉
素 (Cef)、羧卞霉素 ( Carb )的浓度设为 200、300、
500、600、800 、1 000 mg· L - 1。观察不同种类、不
同浓度的抑菌抗生素对农杆菌 LBA4404 的抑制
作用。
1. 2. 3　抑菌抗生素对叶盘分化不定芽的影响 　本
试验设立了无抗生素 , Cef 300 mg·L - 1、Carb 300
mg·L - 1三种处理 ,研究了不同种类的抑菌性抗生
007
第 5期 李科友等 :银腺杨转 C ry I A c和 A PI双价抗虫基因的研究
素对叶盘分化不定芽的影响。
1. 3　转化及筛选
采用优化的银腺杨 ( 84K)叶片最适转化系统 :
接 LBA4404单菌落到 YEP液体培养基 200 mL中 ,
28 ℃, 150 r·m in - 1 ,过夜振荡培养 ,活化菌液至稀
奶状后 ,用 MS液体培养基稀释 10倍 ,将银腺杨 (84
K)无菌苗叶片 ,沿主脉横切后 ,浸染 5 m in,共培养 4
d。不定芽筛选培养基 MS + 0. 5 mg·L - 1 62BA +
0105 mg·L - 1NAA + 500 mg·L - 1 Carb + 50 mg·
L - 1 Km。转化植株筛选培养基 1 /2 MS + 0. 05 mg·
L - 1 NAA + 0. 05 mg·L - 1 IBA + 500 mg·L - 1 Carb
+ 40 mg·L - 1 Km。
以上不定芽培养基中附加蔗糖 30 g· L - 1 ,生
根培养基均附加蔗糖 15 g·L - 1 ,两种培养基中 :琼
脂 6 g· L - 1 , pH值 5. 8;培养条件为 25 ±1 ℃,每天
光照 12～14 h,光照强度为 2 000～3 000 lx。
1. 4 卡那霉素抗性植株的 PCR检测
1. 4. 1　DNA提取
1. 4. 1. 1 银腺杨 ( 84K)叶片 DNA 提取 　采用
CTAB法 [ 24 ]。
1. 4. 1. 2 　阳性对照质粒 DNA 提取 　取少许
LBA4404农杆菌溶于 50μL无菌水中 ,在水浴中加
热煮沸 10 m in ,离心取上清液即可用于 PCR。
1. 4. 1. 3　PCR扩增及检测 　分别用 B t (C ry I Ab /
Ac)基因和 AP I基因的特异引物进行 PCR 扩增
反应.
B t ( C ry I A b /A c) 基因 ,上游引物 : GAAATG2
CAGCTCCACAACAACGT
下游引物 : GAAGTCGCTGGATTGGAGGT
A P I基因 , 上游引物 : GGAATTCGACCATGGC2
CTCCAAC
下游引物 : TAAGCTTTACTGCGGTGC
反应条件为 94 ℃变性 30 s, 55 ℃退火 1 m in, 72
℃延升 1 m in,共 35个循环。反应前 94 ℃预变性 5
m in,反应结束后 72 ℃延伸 10 m in。反应结束后取
反应混合液 5μL,放在 0. 8%的琼脂糖凝胶上电泳。
凝胶经 EB染色后 ,用自动凝胶成像记录 PCR产物
电泳结果。
1. 5　Southern杂交检测
对 PCR 检测为阳性的部分转基因植株进行
Southern杂交检测 ,取 10μg银腺杨 ( 84K)基因组
DNA ,用 HandⅢ完全酶切后在 0. 8%琼脂糖凝胶上
电泳分离。用毛细管转移法将 DNA转移到尼龙膜
上 ,然后与α232 p - dC TP标记的 B t基因探针杂交过
夜 ( 65 ℃) ,膜经漂洗后在 X2光胶片上进行放射自
显影 [ 25 ]。
1. 6　B t毒蛋白的 EL ISA检测
采用双抗夹心法 ,选用美国 Agdia公司提供的
B t (C ry I A b /A c) EL ISA试剂盒测定转化植株叶片中
B t毒蛋白的表达 ,具体方法按其说明书操作。
1. 7 植株抗虫性测试
每瓶放入 30头 1龄的杨扇舟蛾 [ C lstera ana2
choreta ( Fabr. ) ]幼虫 ,于 20 ℃的人工气候箱饲养 ,
每 2天更换叶片 1次 ,同时观察和记录幼虫的取食、
生长和存活状况 ,重复 3次 , 30 d后统计幼虫的死
亡率。
2 结果与分析
2. 1　转化系统的建立
2. 1. 1　卡那霉素 ( Km )敏感性试验 　银腺杨 (84K)
叶片外植体不定芽诱导 Km敏感性试验结果表明 ,
随着 Km浓度的增加 ,叶片形成不定芽的数量逐渐
减少 ,颜色变浅 ,当 Km为 50 mg·L - 1时 ,大部分叶
片发黄 ,不能产生不定芽。随着 Km浓度的增加 ,不
定芽生根率和根的长度 ,逐渐降低 ,当 Km为 40 mg
· L - 1时 ,不定芽的生根率为 44% ,根的长度不足对
照的一半。因此 ,银腺杨 ( 84K)叶片不定芽诱导的
卡那霉素临界耐受质量浓度以 50 mg·L - 1比较适
宜。银腺杨 (84K)不定芽生根诱导卡那霉素临界耐
受质量浓度为 40 mg·L - 1。
2. 1. 2　抗生素对浸染农杆菌的抑制效果 　外植体
与农杆菌共生培养后 ,其表面及浅层组织中共生有
大量农杆菌 ,为抑制或杀死农杆菌 ,选用对革兰氏阴
性菌有较好抑制作用的头孢霉素、羧卞霉素作为抑
菌的抗生素。观察不同种类、不同浓度的抗生素对
农杆菌的抑制效果。实验结果表明头孢霉素、羧卞
霉素两种抗生素都可以抑制农杆菌的生长 ,所需浓
度相同 ,当浓度达到 300 mg·L - 1以上时均可以抑制
农杆菌 LBA4404的生长。
2. 1. 3　抑菌抗生素对叶盘分化不定芽的影响 　不
同种类的抑菌性抗生素对叶盘分化不定芽的影响结
果表明 ,培养基中附加 Carb或 Cef对分化频率影响
不大 ,但比未添加抗生素的处理分化率 (90. 6% )稍
有下降。Carb与 Cef相比 ,培养基中附加 Cef时分
化频率 (87. 9% )较高 ,培养基中附加 Carb时分化系
数 (6. 0)较高 ,可以看到更多的丛生芽出现。
107
林 　业 　科 　学 　研 　究 第 20卷
2. 2　转化及筛选
一个高效的组培再生系统和遗传转化体系是植
物基因工程成功的先决条件。采用优化的银腺杨
(84K)叶片最适转化系统 ,不定芽筛选培养基 MS +
0. 5 mg·L - 1 62BA + 0. 05 mg·L - 1 NAA + 500 mg
·L - 1 Carb + 50 mg·L - 1 Km。转化植株筛选培养
基 1 /2 MS + 0. 05 mg·L - 1 NAA + 0. 05 mg·L - 1 IBA
+ 500 mg·L - 1 Carb + 40 mg·L - 1 Km。按此方法
银腺杨 (84K)叶片不定芽转化频率可达 35%。
2. 3　PCR产物的琼脂糖凝胶电泳检测
按方法 1. 4对所得 400株卡那霉素抗性 84K植
株均作了 PCR检测 ,其中银腺杨 (84K)有 70株呈阳
性。部分植株 B t ( C ry I A c)和 A P I这两个基因的
PCR检测结果见图 2和图 3。
电泳分析表明 ,转双价 B t (C ry I Ac)和 A PI抗虫
基因银腺杨 (84K)植株 ,经 PCR扩增各转基因植株
均得到一条与阳性对照作模板 PCR扩增带大小相
同的 680 bp条带和一条 660 bp条带 ,而未转化的银
腺杨 (84K)植株基因组中未出现 PCR扩增特异条
带 ,初步证明外源 B t (C ry I A c)和 AP I抗虫基因已整
合到银腺杨 (84K)基因组中。
2. 4　Southern杂交分析
为了进一步验证外源基因在染色体内的整合以
及拷贝数和插入位点 ,对经 PCR检测为阳性的部分
植株进行 Southern杂交分析。杂交结果表明 ,外源
基因是以单拷贝或低拷贝的形式插入到受体植株基
因组中 (图 4) ,并且各转基因植株的杂交带不一致 ,
说明转基因植株来自不同的转化事件。
2. 5　B t毒蛋白的 EL ISA检测
外源基因编码的蛋白在转基因植株中正常表达是
其发挥相应功能的主要依据。选用美国 Agdia公司提
供的 B t(Cry I Ab /Ac) EL ISA试剂盒测定 B t毒蛋白在
转基因植株 R1、R2、R3和 R4中的表达情况 ,实验结果
B t毒蛋白在转基因植株 R1、R2、R3和 R4中的平均表
达量分别为 0. 011 0%、0. 010 6%、01010 0% 和
0. 009 3% ,而未转基因对照植株中 B t毒蛋白的表达量
为 01000 0% (表 1)。由表 1可知 , 3次测定中 4个转化
植株 B t毒蛋白的表达平均变异系数为 6. 75% ,说明这
种测定方法较可靠 ,是一种理想的测定方法。
2. 6　植株抗虫性测试
用大田中转基因银腺杨 (84K)的幼嫩叶片喂养
杨扇舟蛾幼虫 ,虫试结果 (表 2)表明 ,转基因植株幼
虫平均死亡率为 60. 0% ～80. 0% ,而对照植株幼虫
平均死亡率仅为 10. 0%。方差分析 (表 3)表明它们
之间存在显著性差异 ,用 Duncan检验进行多重比较
结果见表 2,依据杨扇舟蛾幼虫的死亡率和统计分
析结果 ,可将参试植株分为 3类 (1)对照植株 (CK) ,
昆虫幼虫的死亡率为 10. 0%以下 ; (2) R5、R6、R7、
R8和 R9,昆虫幼虫的死亡率为 60. 0% ～67. 7% ;
(3) R1、R2、R3和 R4,昆虫幼虫的死亡率为 70. 0%
～80. 0%。 (2)和 (3)类转基因植株杀虫率高说明
基因表达水平较高 ,这与 B t毒蛋白的 EL ISA检测相
一致。在实验过程中还观察到取食转基因植株的幼
虫在死亡前出现麻痹 ,活动能力低下、停止取食等症
状。即使取食转基因植株叶片的幼虫能存活下来 ,
其生长发育也受到明显抑制。
L: 2 Kb Ladder; CK1 +阳性对照 (680 bp) ;
CK - 84K阴性对照 ; R1～R9:转抗虫基因植株
图 2　9株 84K杨植株 B t基因 PCR扩增产物电泳结果
L: 2 Kb Ladder; CK1 +阳性对照 (660 bp) ;
CK - 84K阴性对照 ; R1～R4:转抗虫基因植株
图 3　4株 84K杨植株 A PI基因 PCR扩增产物电泳结果
表 1 银腺杨 ( 84K)不同植株 B t毒蛋白表达量
株系 B t蛋白表达量 /% B t蛋白平均表达量 /% 标准差
变异系
数 / %
CK
R1
R2
R3
R4
0. 000 0
0. 011 0
0. 010 0
0. 009 3
0. 010 0
0. 000 0
0. 010 5
0. 011 0
0. 010 0
0. 009 5
0. 000 0
0. 011 5
0. 010 8
0. 010 7
0. 008 4
0. 000 0
0. 011 0
0. 010 6
0. 010 0
0. 009 3
0. 000 0
0. 000 5
0. 000 5
0. 000 7
0. 001 0
0. 00
4. 54
4. 72
7. 00
10. 75
207
第 5期 李科友等 :银腺杨转 C ry I A c和 A PI双价抗虫基因的研究
Ⅲmarker; 124:转基因银腺杨植株 ,分别为 R1、
基因片段 R2、R3和 R4 ; 5:未转化银腺杨 ;
6: Cry I A cM:λ/H ind I
图 4　部分转基因植株 Southern blot杂交
表 2 转基因银腺杨 ( 84K)对杨扇舟蛾幼虫死亡率的影响
植株
编号
接虫
数 /头
30 d成活
头数
30 d死亡
头数
平均死
亡率 /%
CK
R1
R2
R3
R4
R5
R6
R7
R8
R9
30
30
30
30
30
30
30
30
30
30
28
6
7
9
8
8
6
9
13
11
27
7
6
8
8
9
8
11
11
11
26
5
8
7
8
10
7
10
12
11
2
24
23
21
21
20
24
21
17
19
3
23
24
22
22
20
22
19
19
19
4
25
22
23
20
20
23
20
18
19
10. 0 a
80. 0 e
76. 7 de
73. 3 cde
70. 0 bcde
67. 7 bcd
76. 7 de
67. 7 bcd
60. 0 b
63. 3 bc
　　注 : CK未转化银腺杨 (84K) ; R1～R9:转双价抗虫基因银腺杨
(84K) ,具有相同字母的表示α = 0. 01时 Duncan检验没有显著性
差异。
表 3 表 2数据的方差分析
变异来源 平方和 自由度 均方 F值 临界值 显著性
植株间 950. 70 9 105. 63 27. 80 F0. 05 = 2. 39 显著
植株内 76. 00 20 3. 80 F0. 01 = 3. 46
(总和 ) 1 026. 70 29
3 结论和讨论
农杆菌介导法转化基因时 ,如果其标志基因为
抗 Km′基因 ,对于不同树种、不同器官以致继代多次
逐渐幼化了的组培材料等均要再次进行抗 Km′临界
浓度试验 ,这是基因转化能否成功的关键因素之
一 [ 20 ]。银腺杨 ( 84K)叶片不定芽诱导卡那霉素耐
受浓度为 50 mg·L - 1 ,不定芽生根诱导卡那霉素耐
受浓度为 40 mg·L - 1。本研究以农杆菌为介导的
叶盘法 ,通过优化的银腺杨 (84K)叶片最适转化系
统 ,进行双价基因 B t (Cyr I A c)和 A P I的转化 , South2
ern杂交和 EL ISA检测证明 B t (Cyr I A c)和 A P I双价
抗虫基因已成功转入银腺杨 (84K)。
为了提高 B t (Cyr I A c)基因在植物中的表达水
平 ,对 B t (Cyr I A c)基因的两端进行了改造 ,在 1～
273 bp这个区域共改变了 12个碱基 ,涉及到 11个
密码子的改变 ,一般是将第 3位的 AT改变为 GC。
还改变了 2个潜在的 mRNA转录终止信号 AATTAA
和 AACCAA。这一区域对提高基因表达是非常重要
的。在 1342～1836区域通过 9对引物共改变了 63
个碱基 ,涉及 60个密码子的改变 ,同时改变了 3个
可能引起 mRNA不稳定的 ATTTA基序和 8个 AT富
集区序。外源基因在植物 DNA中插入位置及各种
原因引起其失活会导致转基因植株表现出不同的抗
虫性 ,因此 , PCR等分子生物学检测证明是转基因植
株 ,还需要进行抗虫性生物测定试验 ,以观察其实际
抗性。抗虫性试验表明转基因植株对杨扇舟蛾幼虫
具有很好的杀虫效果 ,不同株系对杨扇舟蛾幼虫的
致死率不同 ,在参试的 9个株系中 ,有 4个株系幼虫
死亡率均在 70%以上 ,有 5个株系幼虫死亡率在
60% ～67. 7%。这与郑均宝等 [ 20 ]对 741杨和田颖
川 [ 5 ]、李明亮等 [ 21 ]对欧洲黑杨及王敏生等 [ 22 ]对毛
白杨三倍体的研究结论相一致。转基因植株不能将
害虫全部杀死 ,而且随着虫体的发育 ,杀虫效果降
低 ,表明害虫的抗性逐渐提高。同时 ,转基因植株对
害虫的发育也有很大的影响 ,存活昆虫生长发育明
显地受到抑制。用美国 Agdia公司提供的 B t ( C ry I
A b /Ac)试剂盒 ,对 4个株系进行了 EL ISA分析 ,测定
结果与虫试结果基本一致 ,表明这 2种方法结合使
用 ,可以准确、快速地对大量转化植株进行抗虫性
筛选。
杨树抗虫基因工程研究的一个重要问题 ,就是
如何延缓害虫对转基因株系形成抗性 ,联合使用 2
种或 2种以上杀虫机制不同或特异性结合位点不同
的抗虫基因转化植物 ,对于防止或延迟害虫产生耐
受性具有重要的作用 ,同时扩大了转基因植株的抗
虫谱。B t毒蛋白基因和其它基因 (如 P I、L ectin、V ip
基因等 )同时导入转基因植物中 ,其抗性和防止昆虫
307
林 　业 　科 　学 　研 　究 第 20卷
产生抗性的能力将会大大的提高 ,可能成为抗虫基
因工程的一个重要方向。在转化过程中 ,由于外源
基因的插入是随机的 ,具有一定的偶然性 ,因此 ,抗
虫转基因植株的培育应考虑其综合性状 ,既要有较
高的杀虫活性 (以杀虫率在 50%以上为宜 ) ,又要考
虑转基因植株的生长发育和表形特征。由于林木生
长周期长 ,有关抗虫转基因植株的抗虫性状、表型特
征及生长趋势还有待进行长期观察 [ 12 ]。西北地区
是我国杨树虫害的重灾区。通过基因工程提高杨树
品种的抗虫性 ,对于促进我国人工杨树用材林的发
展和生态建设具有极为重要的意义。
参考文献 :
[ 1 ] 王永芳 , 高宝嘉 ,郑均宝 ,等. 杨树抗虫基因工程进展 [ J ]. 河北
林果研究 , 2001, 16 (1) : 83～90
[ 2 ] 贺成林 ,李云. 杨树抗虫基因工程进展 [ J ]. 河北林果研究 ,
2004, 16 (1) : 82～89
[ 3 ] 王忠华 ,舒庆尧 ,崔海瑞 , 等. B t杀虫基因与 B t转基因抗虫植物
研究进展 [ J ]. 植物学通报 , 1999 , 16 (1) : 51～58
[ 4 ] 伍宁丰 ,范云六. 含苏云金芽孢杆菌杀虫蛋白基因的杨树工程植
株的建立 [ J ]. 科学通报 , 1991, 9: 705～708
[ 5 ] 田颖川 ,李太元 , 韩一凡 , 等. 抗虫转基因欧洲黑杨的培育 [ J ].
生物工程学报 , 1993, 9 (4) : 291～297
[ 6 ] W ang G J, Stefano C, Chen Y. et a l. pop lar ( Populus nigra L. )
p lants transformation with a B acillus thuringensis toxin gene: insecti2
cidal activity and genome analysis[ J ]. Transgenic Res. , 1996, 5:
289～301
[ 7 ] McCown B H, McCabe D E, Russel D R, et a l. Transformation of
Populus and incorporation of pest resistance by electric discharge par2
ticle acceleration[ J ]. Plant Cell Rep, 1991, 9: 590～595
[ 8 ] 饶红宇 ,黄敏仁. 杨树 NL280106转 B t基因植株的获得及抗虫性
[ J ]. 植物资源与环境学报 , 2000, 9 (2) : 1～5
[ 9 ] Howe G T, Goldfarb B, Strauss S H. A grobacterum 2mediated trans2
formation of hybrid pop lar suspension cultures and regeneration of
transformed p lants[ J ]. Plant cell, Tissue and O rgan Culture, 1994,
36: 59～71
[ 10 ] 郑均宝 ,张玉满 ,杨文芝 ,等. 741杨离体叶片再生及抗虫基因
转化 [ J ]. 河北农业大学学报 , 1995, 18 (3) : 20～25
[ 11 ] 陈颖 , 韩一凡 , 田颖川 , 等. 苏云金杆菌杀虫晶体蛋白基因转
化美洲黑杨的研究 [ J ]. 林业科学 , 1995, 21 (2) : 97～103
[ 12 ] 王学聘 ,韩一凡 , 戴莲韵 , 等. 抗虫转基因欧美杨的培育 [ J ]. 林
业科学 , 1997, 33 (1) : 69～74
[ 13 ] McNabb H S. Genetic transformation and its app lication to fulture
forests[ J ]. Trends B iotechnol, 1987, 5 (4) : 155～159
[ 14 ] Klopfenstein N B. Transformation of Populus hybrid exp resses a
wound2inducible potato p roteinase inhibiritor Ⅱ2CAT gene fusion
[ J ]. Can J For Res, 1991, 21: 1 321～1 328
[ 15 ] Klopfenstein N B, Mcnabb J H, Hart E R. Transformation of Popu2
lus hybrids to study and imp rove pest resistance[ J ]. Silvae Geneti2
ca, 1993, 42: 86～90
[ 16 ] Lep le J C. Toxicity to Chrysom ela trem ulae (Coleop tera: Chrysomel2
idae) of trandgenic pop lars exp ressing a cysteine p roteinase inhibi2
tor[ J ]. Molecular B reeding, 1995, 1 (4) : 319～328
[ 17 ] Delledonne M. Transformation of white pop lar ( Populus a lba L. )
with a novel A rabidopsis tha liana cysteine p roteinase inhibitor and
analysis of insect pest resistance[ J ]. Molecular B reeding, 2001, 7
(1) : 35～42
[ 18 ] 郝贵霞 ,朱祯 ,朱之悌. 豇豆蛋白酶抑制剂基因转化毛白杨的研
究 [ J ]. 植物学报 , 1999, 41 (12) : 1 276～1 282
[ 19 ] Barton K A. Insecticidal toxins in p lant2exp ress an insect2specific
toxin from a scorp ion[ P ]. C12N015 /82, European patent. patent
No, EP0431829A I, 1990
[ 20 ] 郑均宝 ,梁海永 ,田颖川 , 等. 转双价抗虫 741毛白杨的选择及
抗虫性 [ J ]. 林业科学 , 2000, 36 (2) : 13～19
[ 21 ] 李明亮 ,张辉 ,胡建军 ,等. 转 B t基因和蛋白酶抑制剂基因杨树
抗虫性的研究 [ J ]. 林业科学 , 2000, 36 (2) : 93～97
[ 22 ] 杨敏生 ,李志兰 ,王颖 ,等. 双价抗虫基因对三倍体毛白杨的转
化和抗虫性表达 [ J ]. 林业科学 , 2006, 42 (9) : 61～68
[ 23 ] 田颖川 ,郑均宝 ,虞红梅 ,等. 转双价抗虫基因杂种 741毛白杨
的研究 [ J ]. 植物学报 , 2000, 42 (3) : 263～268
[ 24 ] 王关林 ,方宏筠. 植物基因工程 (第二版 ) [M ]. ,北京 :科学出版
社 , 2002: 744
[ 25 ] Sambrook J, Russel D W. 分子克隆实验指南 (第三版 ) [M ]. 黄
培堂 ,王嘉宝 ,朱厚础 ,等译. 北京 :科学出版社 , 2005: 487～509
407