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Tissue Culture Technique of Acacia mangium Elite Trees

马占相思优树组培快繁技术研究*



全 文 :林业科学研究 2012,25(2):227 230
ForestResearch
  文章编号:10011498(2012)02022704
马占相思优树组培快繁技术研究
黄烈健1,陈祖旭1,张赛群2,梁日高3
(1.中国林业科学研究院热带林业研究所,广东 广州 510520;2.厦门大学生命科学学院,福建 厦门 361005;
3.广东省江门市林业科学研究所,广东 江门 529000)
收稿日期:20100821
基金项目:国家“十一五”科技支撑计划项目(2006BAD01A155,2006BAD32B0103);农业科技成果转化项目(2009GB24320482)
作者简介:黄烈健(1971—),男,博士,副研究员,研究方向为林木遗传育种与森林培育,电话:02087033463,Email:hlj@ritf.ac.cn
感谢广东省江门市林业科学研究所的戴智明、福建厦门涌泉公司的赖桂星、广东省江门市新会区沙堆镇林业站的区炳钦、赵祖文等对
本研究提供的帮助.
关键词:马占相思;优树;组培
中图分类号:S723.1 文献标识码:A
TissueCultureTechniqueofAcaciamangiumEliteTrees
HUANGLiejian1,CHENZuxu1,ZHANGSaiqun2,LIANGRigao3
(1.ResearchInstituteofTropicalForestry,ChineseAcademyofForestry,Guangzhou 510520,Guangdong,China;
2.SchoolofLifeSciences,XiamenUniversity,Xiamen 361005,Fujian,China;
3.ResearchInstituteofForestryofJiangmenCity,Jiangmen 529000,Guangdong,China)
Abstract:TakingAcaciamangiumelitetreesasexplants,thetissueculturetechniquesystemfordormantbudof3
5yearoldelitetreeswasestablished.Thesystemincludesthegerminationinducingofthedormantbuds,themulti
plyingofshoots,therootingofadventitiousshoots,andthepretreatingandtransplantingofseedlings.Themedium
MS+Sucrose30g·L-1+BA0.5mg·L-1+NAA0.1mg·L-1wasusedforinducingthedormantbuds;the
mediumMS+BA1.0mg·L-1+NAA0.05mg·L-1wasusedformultiplying;whilethemedium1/2MS+
IBA2.0mg·L-1+NAA0.5mg·L-1wasusedforrooting.Theresultsrevealedthatitwasviabletoproducing
fieldseedlingswithmicropropagation.Althoughthebrancheswithdormantbudsharboredmanykindsofmicrobes
andtheadventitiousshootswerenoteasytoroot,20% to30% healthygerminationcouldbeyieldedandtherooting
rateofadventitiousshootscouldbehigherthan85%.PretreatedwithABTpowder(rootinghormone),boththe
rootingrateandsurvivalrateofadventitiousshootswerenearly100%.
Keywords:Acaciamangium;elitetrees;tissueculture
相思(AcaciaMil.)类树种(俗称相思树)属含
羞草科(Mimosaceae)金合欢属(AcaciaMil.),在我
国广东、海南、广西、福建、云南和江西等地均有栽
培。相思树植株高大挺拔,根系发达具根瘤,具有耐
干旱贫瘠及抗风的特性,是水土保持及改良土壤的
优良树种;同时,相思树还是优良的用材树种,其生
长迅速,木材可作为高档家具、装饰板、木地板等的
上好材料。因此,相思类树种成为我国南方短周期
工业原料林的主推树种之一[1-2]。
对相思树种开展组培技术研究虽有成功的报
道[3-8],但以前的研究,一般是采用经过扦插或者嫁
接后幼态化的腋芽、茎尖等为外植体进行诱导、增
殖,研究的时间不仅较长,而且其要求的技术环节也
较多,影响了相思优良无性系的推广应用进程。中
国林业科学研究院热带林业研究所历经“十五”、
“十一五”研究,选育了一批优良的马占相思(Acacia
林 业 科 学 研 究 第25卷
mangiumWild.)无性系,为了尽快使这些优良无性
系在生产中发挥其应有的作用,本研究以前期试验
林中筛选获得的优良马占相思无性系优树为材料,
开展了直接以马占相思、马大杂种相思(A.mangium
×A.auriculiformisCunn.exBench)等优良无性系的
大田休眠芽为外植体的组培技术研究,以期建立高
效、快速、繁殖系数高的组培技术体系。
1 材料和方法
1.1 植株材料
以中国林业科学研究院热带林业研究所前期建
立试验林中筛选获得的优良马占相思 Am166(5年
生)、Am97(5年生)、Am20(5年生),L14(3年生),
马大杂种相思AMA9801(3年生)5个无性系优树为
材料。
1.2 外植体选择与处理
从林地中优选植株的中上部,采集长势旺盛的
当年生半木质化带腋芽的健康枝条,剪去小叶,洗衣
粉液浸泡30min,刷洗后流水冲洗;弃两端并剪成带
1 2个腋芽的小段进行表面消毒,先用75%酒精浸
泡,然后以1‰升汞(每升加1 2滴吐温20)浸泡
消毒,并用无菌水多次洗涤。
1.3 萌芽培养基、增殖培养及生根培养基的筛选
试验采用MS及改良MS基本培养基,添加不同
浓度6BA、NAA进行不同培养基的筛选。
1.4 培养条件
培养温度为(26±2)℃,每日光照12h,光照强
度2500lx。
2 结果与分析
2.1 休眠芽的表面消毒效果分析
表1统计数据为春夏季采摘的枝条,去顶芽后
的消毒处理效果。从表1可以看出:直接采自林地
的3 5年生树的休眠芽组培时的污染比较严重。
在1个月左右的萌芽期中,都先后观察到不同接种
茎段于不同时间出现污染。由此,可以推测污染可
能是由内生菌引起,比较难以克服。可以采用表面
消毒条件为75%酒精浸泡15 20s,1‰升汞浸泡
12 15min,可以达到一个折中的效果,即在不完全
避免污染的情况下,保证一定的存活率和萌芽率。
表1 不同消毒方法对外植体培养的影响
处理 接种茎段数/个 污染茎段数/个 褐变茎段数/个 成活率/%
75%酒精浸泡15S,1‰升汞浸泡9min 27 24 0 11.1
75%酒精浸泡20S,1‰升汞浸泡12min 39 18 3 51.3
75%酒精浸泡15S,1‰升汞浸泡15min 31 17 2 45.2
75%酒精浸泡15S,1‰升汞浸泡18min 24 10 11 37.5
  注:有些茎段既发生褐变也有污染;外植体为春夏季采的枝条。
  研究发现:从4 5年生成年树上采的枝条,内
生菌的含量较高,而且内生菌的种类非常多,包括多
种细菌、真菌等,即使采用严格的表面消毒条件至枝
条褐化,都不可避免地在萌芽培养基上出现内生菌
的生长;顶芽的褐化情况比较严重,因此,在将枝条
剪成小段时,应以弃去顶芽为宜。春夏季为采摘外
植体较为适宜的时间;秋冬季外植体的污染更加严
重,很难得到萌芽。
2.2 休眠芽的诱导萌发
本研究中休眠芽的诱导萌发所采用的培养基配
方及诱芽效果见表2。综合不同诱芽培养基的效果
发现:(1)基本培养基对芽萌发时间没有太大的影
响,但激素质量浓度及比例对芽的状态具有较大的
影响,MS+BA0.5mg·L-1+NAA0.1mg·L-1为
各个品种都合适的培养基;(2)树龄对休眠芽的萌
发具有较大的影响,本研究中,3年生树的休眠芽萌
发时间集中在20 25d,而5年生树的休眠芽萌发
时间集中在30 35d;(3)萌发出的芽为单芽或丛
芽,与无性系有一定的关系,马大杂种相思
AMA9801及马占相思 Am20较易诱导出丛芽;
(4)不同无性系对不同激素有一定的差异,主要表
现为马大杂种相思 AMA9801及幼龄一点的 L14萌
芽对培养基中激素的水平要求更低一点。
利用上述筛选的诱芽培养基(MS+BA0.5
mg·L-1+NAA0.1mg·L-1),对不同无性系的休
眠芽进行诱导萌发,芽诱导萌发率在 20% 30%
(表3),而且芽生长良好。
822
第2期 黄烈健等:马占相思优树组培快繁技术研究
表2 不同培养基配方对休眠芽的诱导萌发
培养基
AMA9801
萌芽时间
/d
萌芽
状态
Am166
萌芽时间
/d
萌芽
状态
Am97
萌芽时间
/d
萌芽
状态
Am20
萌芽时间
/d
萌芽
状态
L14
萌芽时间
/d
萌芽
状态
MS+BA2.0+NAA0.2 30 35 玻璃化 30 35 玻璃化 30 35 玻璃化 30 35 玻璃化 20 25 玻璃化
改良MS+BA2.0+NAA0.2 30 35 玻璃化 30 35 玻璃化 30 35 玻璃化 30 35 玻璃化 20 25 玻璃化
MS+BA1.0+NAA0.2 30 35 玻璃化 30 35 玻璃化 30 35 玻璃化 30 35 玻璃化 20 25 玻璃化
改良MS+BA1.0+NAA0.2 30 35 玻璃化 30 35 玻璃化 30 35 大而舒展 30 35 玻璃化 20 25 玻璃化
MS+BA0.5+NAA0.1 30 35 大而舒展 30 35 大而舒展 30 35 大而舒展 30 35 大而舒展 20 25 大而舒展
MS+BA0.3+NAA0.07 30 35 大而舒展 30 35 舒展、小 30 35 舒展、小 30 35 舒展、小 20 25 大而舒展
  注:表中激素的质量浓度单位为mg·L-1;若无特别注明,蔗糖质量浓度为30g·L-1,下同。
表3 不同马占相思无性系休眠芽的诱导萌发率
无性系
接种茎段
数/个
未污染茎
段数/个
萌芽茎段
数/个
萌芽率
/%
AMA9801 43 19 13 30
Am20 27 10 7 26
Am97 33 14 7 21
Am166 45 18 9 20
L14 39 18 11 28
2.3 丛生芽的增殖
将诱导出的丛生芽进行切割,接种在增殖和伸
长培养基中进行培养,25d左右,每个芽即可分化出
2 3个芽,将这些芽再次进行切割,接种于培养基
中进行增殖培养。
马占相思的增殖与伸长培养中,激素起着重要
的作用,不同质量浓度的激素配比有着不同的表现
(表4)。在不加任何激素的MS基本培养基中,接种
下去的腋芽不能增殖,也不能伸长,最终老化而失去
价值;当附加BA(0.5 1.0)mg·L-1时,丛生芽的
增殖随BA质量浓度的增加而增加,且丛生芽表现
旺盛,有效芽苗多;当 BA浓度≥1.5mg·L-1时,丛
生芽密集,但不伸长,有的变成愈伤组织,有效苗少,
不利于下一步的增殖和生根培养。结果表明(表
4):培养基以 MS+BA1.0mg·L-1+NAA0.05
mg·L-1对芽的增殖与伸长效果最好,平均诱导芽
数达3.0个,芽苗平均长达2.5cm,且生长旺盛,利
于扩繁及生根成苗。增殖中,马大杂种相思
AMA9801耳状叶(叶状柄)较多,马占相思往往为羽
状复叶。不同无性系的繁殖系数略有差异,表4中
为各无性系的平均值。
2.4 组培苗的生根及移植
在丛生芽中选择高2.5 3.0cm、叶色正常、茎
干粗壮的芽苗从基部切下,接种于生根培养基上,经
30d左右,试管苗就会从基部长出白色的根,不同的
生长素配比对生根产生不同效果,不同培养基对马
大杂种AMA9801芽苗生根的影响结果见表5。
表4 不同培养基对芽增殖与伸长的影响
培养基
平均增
殖倍数
芽苗表现
MS+BA0.5mg·L-1+NAA0.05mg·L-1 2.0 少,生长慢
MS+BA0.2mg·L-1+NAA0.02mg·L-1 1.5 少,生长慢
MS+BA1.0mg·L-1+NAA0.50mg·L-1 2.5 快,较正常
MS+BA2.0mg·L-1+NAA0.10mg·L-1 3.5 芽多,有效苗少
MS+BA1.0mg·L-1+NAA0.05mg·L-1 3.0 芽多,有效苗多
MS+BA1.5mg·L-1+NAA0.10mg·L-1 3.5 芽丛密集,有效苗少
表5 不同培养基对马大杂种相思AMA9801
芽苗生根的影响
培养基
接种
数/个
生根
数/个
生根
率/%
MS 50 5 10
1/2MS+IBA0.5mg·L-1+NAA0.1mg·L-1 50 26 52
1/2MS+IBA1.0mg·L-1 50 33 66
1/2MS+IBA2.0mg·L-1+NAA0.5mg·L-1 50 43 86
1/2MS+IBA2.0mg·L-1+NAA0.1mg·L-1 50 40 80
马大杂种相思 AMA9801芽苗在不添加任何植
物生长调节剂的培养基上,生根效果差,30d后,叶
片变黄脱落,不能移植;在1/2MS+IBA2.0mg·L-1
+NAA0.5mg·L-1培养基上,生根效果较好,生根
率可达86%。当试管苗根长2 5cm时,便可将瓶
盖打开炼苗,3 5d后即可进移植。
生根苗直接移植,未生根苗用生根粉 1400
mg·L-1溶液浸泡2h后再移植,7 10d后观察发
现,几乎所有移植苗都形成了新根并存活。
3 小结与讨论
3.1 小结
本研究以优良马占相思无性系优树为材料,建
立了3 5年生优树休眠芽的组织培养技术体系。
萌芽培养基为 MS+BA0.5mg·L-1+NAA0.1
mg·L-1;增殖培养基为 MS+BA1.0mg·L-1+
NAA0.05mg·L-1;生根培养基为 1/2MS+IBA
922
林 业 科 学 研 究 第25卷
2.0mg·L-1+NAA0.5mg·L-1。
研究结果表明:利用3 5年生相思树休眠芽
进行组织培养并繁育生产用苗在技术上完全可行,
建立的技术体系可得到20% 30%的正常萌芽,而
且继代增殖效果良好,不定芽生根率达85%以上;
未生根苗在移植前用生根粉处理后,生根率和成活
率可接近100%。
3.2 讨论
利用休眠芽进行相思的组织培养快繁主要包括
三个环节,即休眠芽的诱导萌发、丛生芽的增殖以及
不定芽的诱导生根。通过研究,笔者成功建立了一
套相应的组培技术体系,同时,笔者也注意到以下几
个方面的问题:
3.2.1 外植体的选择  本研究采用了3 5年生
的相思树休眠芽进行组织培养诱导萌发及增殖,结
果发现:直接采自成年树枝条存在内生菌含量高,休
眠芽诱导萌发过程中污染严重;不同季节的成年树
休眠芽作为外植体可能关系到试验的成败。春夏季
为比较合适的季节,秋冬季则不太适宜,且应考虑适
当增大入瓶外植体数目。这可能是因为春夏季时,
外植体正处于萌发生长阶段,带菌较少,成活率高,
易诱导成苗。
3.2.2 休眠芽萌动的影响因素 本研究发现影响
休眠芽萌动的因素主要包括下面4个方面:
(1)树龄 树龄对休眠芽的萌发具有较大的影
响,3年生树的休眠芽萌发时间集中在20 25d,而
且生长势也稍强;而5年生树的休眠芽萌发时间则
相对长一些,萌芽时间集中在30 35d。
(2)培养基的激素水平 BA的质量浓度对萌
芽的状态有很大的影响,较高的 BA质量浓度会导
致芽的玻璃化,叶片畸形、卷曲等现象;同时笔者也
发现,不同幼嫩程度的枝条上的休眠芽对激素的反
应也有区别,木质化程度稍高的枝条对激素敏感程
度比较低,在 BA质量浓度1.0 2.0mg·L-1时,
都可以得到正常的萌芽。
(3)枝条的营养状况 枝条的木质化化程度及
营养状况对休眠芽萌芽的强壮程度有一定的影响,
表现为比较粗壮的外植体产生的萌芽相对比较
强壮。
(4)无性系 马大杂种相思及马占相思 Am20
较易诱导出丛芽,而其他无性系则往往诱导出单芽。
这说明不同的无性系形成芽原基的数量可能存在一
定的差别。另外,在芽的增殖过程中,笔者也发现了
无性系对增殖芽状态的影响,主要表现为马大杂种
相思耳状叶(叶状柄)较多,马占相思往往为羽状
复叶。
3.2.3 增殖中应注意的事项 在增殖过程中有一
个矛盾:即若想提高增殖倍率,则往往得到的苗比较
细弱;而如果为了让苗长得比较强壮,则增殖倍率就
会相对降低。本研究结果表明:培养基以 MS+BA
1.0mg·L-1+NAA0.05mg·L-1对芽的增殖与伸
长效果最好,增殖时间为25d左右,平均诱导芽数
达3.0个,芽苗平均长达2.5cm,且生长旺盛,利于
扩繁及生根成苗。
3.2.4 生根过程中的特殊现象 在诱导生根过程
中,笔者发现了2个比较特殊的现象:(1)在丛生芽
的增殖过程中,如果较长时间不及时进行继代,培养
基体积变小,部分丛生芽可直接生根;(2)未生根的
不定芽,用生根粉处理后进行移植,可以生根和存
活。从这2个现象笔者可以推测,马占相思可能是
比较容易组培生根的树种,生根过程对养分的要求
比较低,但对通气状况可能有比较高的要求。
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