全 文 ：林业科学研究 2013，26(2) :200 206
Forest Research
文章编号:1001-1498(2013)02-0200-07
毛竹 PeAP2 基因及其启动子的克隆与表达初步分析
陈东亮，彭镇华1，2，高志民1*
(1. 国际竹藤中心，竹藤科学与技术重点实验室，北京 100102;2. 中国林业科学研究院林业研究所，北京 100091)
收稿日期:2012-12-03
基金项目:“十二五”国家科技支撑计划课题(2012BAD23B0504)
作者简介:陈东亮(1984—) ，男，河北邯郸人，在读博士，主要从事林木遗传育种研究．
* 通讯作者:高志民，男，河北唐山人，研究员，博士，主要从事生物技术与功能基因组研究．
摘要:APETALA2 (AP2)基因在植物生长发育过程中发挥着重要作用。利用 RT-PCR和 RACE方法，从毛竹中克隆到 1
个 AP2同源基因的全长 cDNA序列，命名为 PeAP2。序列分析表明:PeAP2基因全长 1 750 bp，其中，5端非编码区 106
bp，3端非编码区174 bp，开放阅读框1 470 bp，编码1个489 aa的蛋白，该蛋白含有2个AP2结构域，属于AP2 /EREBP
家族的 AP2亚家族。PeAP2蛋白与来自其它单子叶植物的 AP2 蛋白均有着较高同源性，其中，与二穗短柄草的 AP2
蛋白同源性最高，达 74． 85%。实时定量 PCR分析显示:PeAP2基因在毛竹的根、茎、叶、鞘和节 5 种器官中均有表达，
其中，叶片中的表达丰度最高，鞘中次之，而在根、茎、节中的表达丰度接近，均较低。利用 hiTAIL-PCR方法克隆获得
了 PeAP2上游启动子区序列 1 359 bp，分析显示其含有光、激素等多种信号应答相关的作用元件。
关键词:毛竹;AP2 基因;组织特异表达;启动子
中图分类号:S795 文献标识码:A
Cloning and Express Analysis of PeAP2 Gene and Its Promoter
in Phyllostachys edulis
CHEN Dong-liang1，PENG Zhen-hua1，2，GAO Zhi-min1
(1． International Centre for Bamboo and Rattan，Key Laboratory on the Science and Technology of Bamboo and Rattan，Beijing 100102;
2． Research Institute of Forestry，Chinese Academy of Forestry，Beijing 100091，China)
Abstract:APETALA2 (AP2)gene plays an important role in plant development． A full-length cDNA sequence of
AP2 homologous gene was cloned from Phyllostachys edulis by reverse transcription polymerase chain reaction (RT-
PCR)and rapid amplification of cDNA ends (RACE)methods，and named as PeAP2． The PeAP2 is 1 750 bp and
consists of a 5-untranslated region (UTR)of 106 bp，a 3-UTR of 174 bp and an opening reading frame of 1 470
bp． The sequence analysis showed that PeAP2 encoded a protein of 489 aa containing two AP2 domains which indi-
cated that it belonged to the AP2 subfamily of AP2 /EREBP family． Comparison analysis showed that PeAP2 protein
shared high homology with AP2 protein from other monocotyledon plants，especially with that of Brachypodium dis-
tachyon up to 74． 85% ． Real time PCR analysis showed that PeAP2 expressed all in root，stem，leaf，sheath and
joint． The highest expressed level presented in leaf，followed by sheath and much lower in root，stem and joint． A
1 359 bp promoter sequence of PeAP2 gene was cloned by hiTAIL-PCR methods． The sequence analysis showed that
it contained many cis-acting elements that response to light，hormone，and other factors．
Key words:Phyllostachys edulis;AP2 gene;tissue specific expression;promoter
转录因子通过与顺式作用元件结合调控下游基
因表达，是许多基因表达过程中的调控方式之一。
AP2 /EREBP蛋白家族是植物中重要的一类转录因
子，其家族成员在植物的生长发育、抗逆反应等过程
第 2 期 陈东亮等:毛竹 PeAP2 基因及其启动子的克隆与表达初步分析
中发挥着重要作用，如金鱼草(Antirrhinum majus
L．)AP2 同源基因 LIP1 和 LIP2，在萼片、花瓣和胚珠
发育中都起重要作用［1］;水稻(Oryza sativa L．)AP2 /
EREBP家族基因 OsDREB 参与对干旱、高盐以及低
温等胁迫的抗逆反应［2］。AP2 (APETALA2)亚家族
是 AP2 /EREBP家族的一个分支，研究证明，该亚家
族基因在植物花器官外轮发育中发挥着重要作
用［3 － 4］，属于花发育 ABC 模型中的 A类基因。对模
式植物拟南芥(Arabidopsis thaliana (L．)Heynh．)的
研究表明:AP2 基因还能影响种子中脂肪、蛋白质和
糖等物质的积累，从而影响拟南芥种子的大小和质
量［5 － 6］，拟南芥 AP2 亚家族成员 SMZ和 SNZ具有抑
制开花的功能［7］，而 PLT1 和 PLT2 对拟南芥根尖静
止区的大小和干细胞活性的维持有着重要调节
作用［8］。
竹林作为重要的森林资源倍受世人关注，竹子
生理生化、培育经营、加工利用等方面的研究得到广
泛开展。随着对竹子开发利用的不断深入，竹类植
物分子生物学研究日益成为热点。目前，在竹类植
物分子标记、基因分离与功能鉴定、高通量测序以及
比较基因组学等方面已取得一定成果［9］，但对其分
子生物学研究仍处于起步阶段，远落后于农作物及
其它经济树种。关于竹类植物转录因子的研究较
少，且主要集中在与开花、抗逆等相关的少数几类，
如 MADs-box［10 － 11］、ZFP［12］等，有关竹类植物 AP2 转
录因子的研究尚未见报道。本研究以我国重要经济
竹种毛竹(Phyllostachys edulis (Carr．)H． de Le-
haie)为材料，从 AP2 基因入手，利用基因同源克隆的
原理，采用 RT-PCR和 RACE技术从毛竹中克隆 AP2
同源基因的 cDNA全长，并利用实时定量 PCR技术检
测该基因在毛竹幼苗不同组织中的表达情况，以期为
开展 PeAP2基因的功能研究，从分子水平揭示竹子发
育过程中的相关生命现象提供基础材料。
1 材料与方法
1． 1 试验材料
毛竹种子用 0. 4% KMnSO4 进行表面消毒 6 h
后，用清水浸泡 12 h，撒播于铺有蛭石的塑料盘里，
并以蛭石覆盖。置于培养室培养(温度 25 ℃，光周
期:光照 /黑暗 = 16 h /8 h) ，待苗高 3 5 cm 时，移
植到含有蛭石和腐殖土(1∶ 3)的塑料小盆中，每盆 3
株。竹苗培养 3 个月左右(苗高约 10 cm)时取样，
分别剪取根、茎、叶、鞘和节，迅速液氮冷冻，－ 80 ℃
保存备用。
1． 2 RNA的提取及基因克隆
采用 Trizol 法提取毛竹各组织的总 RNA［13］，
cDNA合成使用美国 Promega公司的反转录试剂盒，
叶片 5RACE和 3RACE cDNA 的合成采用 SMART
RACE试剂盒(美国 Clontech 公司产品)。参考单子
叶植物 AP2 基因设计保守区引物，P1:5-GTCTGGT-
TGTTTGGGTTTGAGG-3， P2: 5-TGAATCCAATC-
CACTACAAGAAACC-3。PCR 扩增条件:94 ℃预变
性 5 min，94 ℃变性 1 min，48 ℃退火 1 min，72 ℃延
伸 2 min，共 35 个循环，72 ℃延伸 10 min。PCR 产
物用 1%琼脂糖凝胶电泳检测后，回收目的片段连
接于 pGEM-T Easy载体(美国 Promega公司产品)后
送华大基因测序。
根据保守区序列设计 RACE 引物，3-1:5-GTG-
CAGGGTGACGCCTCTGTATTTGGA-3;3-2:5-GCGA
TCAAATGCAATGGTAGAGAAGCCG-3;5-1:5f-GTG-
CAGGGTGACGCCTCTGTATTTGGA-3;5-2:5-GCCTG-
GCGGGAGCGGCAAGATTCTGATGT-3。反应体系和
反应程序按照 SMART RACE试剂盒操作说明进行。
1． 3 生物信息学分析
利用 DNASTAR 5. 01 软件对获得序列进行初步
分析，应用在线软件 ProtScale［14］分析氨基酸链的亲
水性 /疏水性，SOMPA［15］分析蛋白折叠结构，SWISS-
MODEL［16］构建其三维结构模型。Mega 4． 0 软件邻
接法(Neighbor-Joining，NJ)构建基于 AP2 同源蛋白
的系统进化树。
1． 4 组织表达分析
根据获得的基因序列设计实时定量 PCR 引物，
PeAP2-1: GAGCCACCACCGCTGAGT， PeAP2-2:
CCAATCCACTACAAGAAACCA。分别以毛竹根、茎、
叶、鞘和节 5 种组织的 cDNA 为模板，并以毛竹 Ac-
tin-7 基因(FJ601918)为内参［17］，利用罗氏 480 荧光
定量 PCR仪和 SYBR Premix Ex TaqTM(TaKaRa)实
时定量 PCR 试剂盒进行 PCR 扩增和实时定量检测
分析。PCR 扩增反应体系为:2 × SYBR Premix Ex
Taq 10 μL，引物 PeAP2-1、PeAP2-2 各 0. 4 μL(10
μmol) ，模板 cDNA 2 μL用水补充至 20 μL。采用两
步法标准程序:95 ℃预变性 30 s;95 ℃变性 5 s，60
℃复性 34 s，共 45 个循环。每种材料设置 3 次重
复，数据采用 2 － ΔΔCt法进行分析［18］。
1． 5 PeAP2 上游调控序列的克隆及分析
毛竹 DNA的提取采用 CTAB法，根据 PeAP2序列
102
林 业 科 学 研 究 第 26 卷
设计 3 个巢式引物，SP1:5-ACACCCCTCAAACCCAAA-
CAACCAGA-3; SP2:5-TCCTCCTCCACCTCCTCAAC-
CAAGA-3;SP3:5-ATCGGCAACGCCCACGTCTTTCT-3。
随机引物序列、反应体系和反应程序参考 Liu 等［19］的
方法。启动子预测及顺式元件分析分别采用 Neural
Network Promoter Prediction和 PLACE［20］在线软件。
2 结果与分析
2． 1 基因全长 cDNA获得
以毛竹叶片 cDNA 为模板，用引物 P1 和 P2 进
行 PCR扩增，得到一个 1 395 bp的克隆片段。NCBI
blast分析表明:该片段与多个物种 AP2 基因同源性
较高，表明其为毛竹 AP2 基因的部分序列。分别利
用 RACE 引物 3-1、5-1 与 RACE 试剂盒通用引物
UPM进行第一轮扩增，之后再以第一轮的 PCR产物
为模板，分别利用 RACE引物 3-2、5-2 与 RACE试剂
盒通用引物 NUP进行巢式扩增，分别得到 5端片段
526 bp，3端片段 772 bp，通过拼接最终获得全长
cDNA序列为 1 750 bp，其中，5端和 3端非编码区
分别为 106 bp和 174 bp，编码框为 1 470 bp，共编码
489 个氨基酸(图 1) ，将该基因命名为 PeAP2(Gen-
Bank登录号为 JX402084)。
划线:核定位序列;双下划线:AP2 结构域;方框:miR172 结合位点
图 1 PeAP2 全长 cDNA序列及推导的氨基酸序列
202
第 2 期 陈东亮等:毛竹 PeAP2 基因及其启动子的克隆与表达初步分析
2． 2 生物信息学分析
DNASTAR软件分析表明:PeAP2 蛋白的预测分
子量为 52. 7 kDa，等电点为 6. 977。结构域分析显
示:PeAP2 蛋白含有 2 个保守的 AP2 结构域和 1 个
核定位信号序列(图 1) ，除此之外还含有酰胺化位
点，N端糖基化位点，酪蛋白激酶 II磷酸化位点等功
能区域。氨基酸疏水性对蛋白的折叠方式及功能具
有重要影响［21］，疏水性 /亲水性分析表明，PeAP2 蛋
白同时具有疏水性和亲水性区域，但整体呈现很强
的亲水性。
以拟南芥 GBD(GCC-box binding domain)三维
构型做模板(1gccA) ，预测 PeAP2 蛋白的三维构型，
得到其 2 个 AP2 结构域的三维结构，PeAP2 蛋白 2
个 AP2 结构域与模板的相似度分别为 46. 77%和
32. 79%，且均具有 AP2 结构域典型的 3 个 α螺旋和
3 个 β 回转(图 2)。基因的多重比较分析结果表
明:PeAP2 蛋白与其它禾本科(Poaceae)植物的 AP2
蛋白均具有较高的同源性，其中，与二穗短柄草
(Brachypodium distachyon (L．)P． Beauv．)的 AP2
蛋白同源性最高，达 74. 85%。利用公共数据库中
一些已知的 AP2 蛋白序列和 PeAP2 蛋白构建系统
进化树(图 3) ，结果显示:单子叶植物与双子叶植物
的 AP2 蛋白分别聚类到 2 个不同的蛋白簇;在单子
叶植物簇中，PeAP2 与水稻、大麦(Hordeum vulgare
Linn．)、二穗短柄草的 AP2 蛋白聚在一起，而高粱
(Sorghum bicolor (L．)Moench)、玉米(Zea mays
L．)的 AP2 则在另一分支，这与形态分类学的描述
基本一致。
A:AP2(167-255)三级结构预测;B:AP2(251-317)三级结构预测
图 2 PeAP2 蛋白三级结构预测
图 3 基于 AP2 同源蛋白的不同物种系统进化树
2． 3 组织表达分析
以毛竹 Actin-7 基因为内参，确定 PeAP2 基因在
不同组织中的表达特异性，实时定量 PCR 结果(图
4)表明:PeAP2 基因在毛竹根、茎、叶、鞘和节 5 个组
织中均有表达，其中，在叶中的表达丰度最高，其次
为鞘中，在根、茎、节 3 个组织中的表达丰度相似，均
较低。
2． 4 启动子的克隆与分析
以毛竹叶片 DNA为模版，利用 hiTAIL-PCR方法
图 4 PeAP2 在不同组织中的表达
302
林 业 科 学 研 究 第 26 卷
表 1 PeAP2 启动子片段功能预测
起始位点 终止位点 分值 启动子序列
108 158 0． 82 CTCGCTAATTTATAGCCGGGAGTGAATCCTTCCCCCGCGCACGATCGATT
643 693 0． 85 GCCAAATAAATAAATAAATTGGGACGATCATTTCTATATATACCATGTGA
667 717 0． 92 CGATCATTTCTATATATACCATGTGAAAACGTGACAATACGGCCAAAAAA
999 1 049 0． 93 CAAGGAAGGGAAAAAAAACCGTGTTGAACTTGAATCCAACGGTAGAGACA
1 231 1 281 1． 00 CCCTCTTCTATATATACCACCCGCCTCTTTTTCCATCTTCACACACGCCC
1 559 1 609 0． 92 CGTGGAGGAGGCTAAATGTACCGCAGGAACGACTCGGCCCTATCCTGCTT
注:放大黑体字母是预测的转录起始位点。
进行了 3 轮巢式 PCR扩增，对 1 000 bp 以上的特异
片段进行回收并测序，获得了 1 359 bp 的 PeAP2 上
游启动子区序列，对该段序列进行转录起始功能预
测，得到可能的起始位点 6 个(表 1) ，其中，满分位
点 1 个，表明该序列具有明显的启动子结构。顺式
作用元件分析显示:除了核心启动子元件 TATA box
和 CAAT box，之外还含有大量的光、激素等信号的
应答元件(表 2)。
3 讨论
AP2 /EREBP 蛋白家族是植物中非常重要的一
类转录因子，该家族蛋白的共有特征是含有至少 1
个 AP2 结构域，根据蛋白结构域和数量差异 AP2 /
EREBP 家 族 又 分 为 3 个 亚 家 族［22］:AP2
(APETALA2)亚家族(含有 2 个 AP2 结构域)、
EREBP(ethylene － responsive element binding pro-
tein)亚家族(含有 1 个 AP2 结构域)和 RAV(Related
to ABI3 /VP1)亚家族(含有 1 个 AP2 结构域和 1 个
B3 结构域)。本研究从毛竹中克隆到的 PeAP2 基因
编码的蛋白具有 2 个 AP2 结构域和 1 个具有引导蛋
白进入细胞核的核定位序列［23］，符合 AP2 亚家族的
特征。构建基于 AP2 同源蛋白的进化树，结果显
示:PeAP2 蛋白与来自单子叶植物的 AP2 蛋白聚为
1 支，明显区别于来自双子叶植物的 AP2 蛋白，且与
形态分类学上进化关系较近的二穗短柄草、水稻等
分支点较近，表现出与形态分类学的一致性。
MicroRNAs(miRNAs)是存在于真核生物的一
类长约 21 25 nt的非编码 RNA，它们可以通过碱
基配对与靶基因 mRNA结合而降解 mRNA，从而抑
制基因的表达。miRNA 与其结合位点序列高度匹
配，它们是基因表达过程中一种重要的调节方式。
研究表明:miRNA172(miR172)是某些 AP2 基因的
抑制因子［24 － 25］，根据是否含有 miR172 结合位点，
AP2 亚家族进一步划分为 AP2 组(含 miR172 结合
位点)和 ANT(AINTEGUMENTA)组。目前，在大麦、
表 2 PeAP2 启动子区段作用元件
名称 数量 功能描述
AAAC-motif 1 光响应元件
AAGAA-motif 1
ABRE 10 参与脱落酸响应的顺式元件
AC-II 1 参与光响应的顺式元件
ACE 2
AE-box 1 光响应组件的一部分
ATCT-motif 1 光响应相关保守组件的一部分
ATGCAAAT motif 1 与 TGAGTCA motif相关的顺式调控元件
Box 4 1 光响应相关保守组件的一部分
CAAT-box 29 启动子和增强子区域常见的顺式元件
CAG-motif 1 光响应元件的一部分
CCAAT-box 2 MYBHv1 结合位点
CGTCA-motif 1 参与茉莉酸甲酯响应的顺式调控元件
G-Box 7 参与光合响应的顺式调控元件
G-box 14 参与光合响应的顺式调控元件
GATA-motif 2 光响应元件的一部分
GAG-motif 1 光响应元件的一部分
GARE-motif 1 赤霉素响应元件
GC-motif 1 参与缺氧诱导的类似于增强子的元件
GT1-motif 2 光响应元件
I-box 2 光响应元件的一部分
LTR 2 参与低温响应的顺式作用元件
MSA-like 1 参与细胞周期调控的顺式作用元件
O2-site 1 参与玉米醇溶蛋白代谢的顺式调控元件
P-box 1 赤霉素响应元件
Skn-1_motif 2 胚乳表达所必须的顺式调控元件
Sp1 7 光响应元件
TATA-box 32 转录起始位点-30 处核心启动子元件
TATC-box 1 参与赤霉素响应的顺式作用元件
TCT-motif 1 光响应元件的一部分
TGA-element 1 生长素应答元件
TGACG-motif 1 参与茉莉酸甲酯应答的顺式调控元件
Unnamed_1 6
Unnamed_10 1
Unnamed_12 1
Unnamed_14 1
Unnamed_3 6
Unnamed_4 23
Unnamed_8 1
Unnamed_9 1
circadian 1 参与昼夜节律调控的顺式调控元件
motif I 1 根部特异性的顺式作用元件
402
第 2 期 陈东亮等:毛竹 PeAP2 基因及其启动子的克隆与表达初步分析
小麦(Triticum aestivum Linn．)等［26］植物中克隆的某
些 AP2 类基因中含有 miR172 结合位点。本研究中
的 PeAP2 基因在编码框靠近 3端处含有 1 个高度匹
配的 miR172 结合序列，表明 PeAP2 基因表达过程
中可能受到 miR172 调控;然而，在竹子中 miR172
是如何调控 PeAP2 基因表达的，需要进一步深入
研究。
大量实验已证明 AP2 基因在外轮花器官发育中
扮演着非常重要的角色［3 － 4］，但 AP2 在植物各个组
织均有表达［27 － 29］，表明 AP2 的作用不只局限于花器
官发育，模式植物拟南芥的研究也说明了这一
点［5 － 8］。AP2 基因在不同物种和组织中的表达差异
较大:任磊等［28］对牡丹花(Paeonia suffruticosa An-
dr．)不同组织 AP2 基因的表达分析表明，AP2 在花
瓣中表达丰度最高［28］;而宿红艳等［27］对草莓(Fra-
garia × ananassa Duch．)的研究显示，AP2 基因在花
瓣中的表达丰度最低，而花芽最高。这种差异可能
是由于种间差异或研究材料所处的发育时期不同造
成的，或者本来就是这个多基因家族不同功能基因
间的差异。本研究以旺盛营养生长期的毛竹实生幼
苗为材料，实时定量 PCR 证实 PeAP2 为组成型表
达，表明 PeAP2 作为转录因子可能在毛竹的整个生
长发育过程中均具有一定的调节作用。
真核基因的 5端上游区域包含有启动子和众多
顺式作用元件，它是基因转录起始的重要调控区域，
决定着基因表达的时期、位置以及表达的程度，它对
植物的作用甚至比基因本身都重要。TAIL-PCR 末
端克隆是获取 DNA未知序列最经典的方法，利用改
良的 TAIL-PCR 方法［19］克隆获得了 1 359 bp 的
PeAP2 基因的上游调控序列，分析显示该序列具有
明显的启动子结构特征。顺式作用元件分析显示其
有许多与光、激素等信号应答相关的元件，表明
PeAP2 的表达可能受到光、激素等因子的调节。组
织特异表达分析显示，PeAP2 在叶片和叶鞘等绿色
组织中表达丰度均较高，这意味着该基因在绿色组
织发育过程中可能扮演着光、激素等信号的调节
角色。
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