全 文 ：林业科学研究　2009, 22 (3) : 449～453
Forest Research
　　文章编号 : 100121498 (2009) 0320449205
毛竹苯丙氨酸解氨酶基因的克隆及组织特异性表达分析
高志民 1 , 彭镇华 1, 23 , 李雪平 1 , 牟少华 1 , 马艳军 1
(1. 国际竹藤网络中心 ,国家林业局竹藤科学与技术重点开放实验室 ,北京　100102;
2. 中国林业科学研究院林业研究所 ,北京　100091)
关键词 :毛竹 ;苯丙氨酸解氨酶 ;克隆 ;组织特异性表达
中图分类号 : S795. 7 文献标识码 : A
收稿日期 : 2008209218
基金项目 : 国家林业局重点项目“重要竹种基因组测序及功能基因开发”(2007201) ;国际竹藤网络中心基本科研业务费专项资金“毛
竹细胞壁发育及其调控机制研究”(06 /072A03)
作者简介 : 高志民 (1971—) ,男 ,河北唐山人 ,副研究员 ,博士.3 通讯作者 : pengzh@ icbr. ac. cn
Isola tion and T issue Spec if ic Expression Ana lysis of Phenylan lan ine
Amm on ia lya se Gene from Phyllostachys edu lis
GAO Zhi2m in1 , PENG Zhen2hua1, 2 , L I Xue2ping1 , MU Shao2hua1 , MA Yan2jun1
(1. International Center for Bamboo and Rattan, Key Laboratory of Bamboo and Rattan Science and Technology, State Forestry
Adm inistration, Beijing　100102, China; 2. Research Institute of Forestry, CAF, Beijing　100091, China)
Abstract:A s a critical enzyme in secondary metabolism of p lant, Phenylanlanine ammonialyase ( PAL ) has
significant meaning to its development and strong tolerance ability against hard. A full2length cDNA of PAL gene was
isolated from Phy llostachys edu lis through RT2PCR and RACE methods, and named as PePAL1 ( GenBank accession
number: FJ195650). PePAL1 is 2 436 bp, which contains an open reading frame encoding 701 am ino acids. The
results of am ino acid sequence analysis showed that PePAL1 had high identities with other gram ineous PAL in O ryza
sa tiva, Zea m ays, Saccharum off icinarum , B am busa ven tricosa, B am busa oldham ii and Triticum aestivum , especially
with PAL from O. sa tiva up to 93. 0%. Phylogenetic analysis showed that PePAL1 and LLB1 were on different
branch sites. Tissue specific exp ression showed that PePAL1 exp ressed in leaf, sheath, stem and root, much higher
in stem.
Key words: Phy llostachys edu lis; Phenylanlanine ammonialyase ( PAL) ; isolation; tissue specific exp ression
　　苯丙烷类代谢途径是植物代谢中一条非常重要
的途径 ,一切含苯丙烷骨架的物质都是由这一途径
直接或间接生成。苯丙烷类代谢可生成类黄酮、木
质素等多种次生代谢产物 ,这些次生产物在植物的
生长发育、抗病、抗逆反应中起着重要的作用 [ 1 - 2 ] ,
而苯丙氨酸解氨酶 ( phenylalanine ammonia2lyase,
PAL)是连接植物初级代谢和苯丙烷类代谢、催化苯
丙烷类代谢第 1步反应的酶 ,是苯丙烷类代谢的关
键酶 [ 3 ]。分离编码苯丙氨酸解氨酶的基因 ,分析基
因的结构与表达特性 ,将有助于深入了解苯丙氨酸
解氨酶的表达调控机制。
近年来 ,越来越多的研究集中在苯丙氨酸代谢
途径关键酶方面 [ 4 ] ,以期通过调节这些酶的表达活
性 ,来实现有效地调节与之相应的次级代谢产物的
生物合成 ,培育出适合人类生产生活需要的植物新
品种 ,如适于造纸的低木质素含量树种、高异黄酮含
林 　业 　科 　学 　研 　究 第 22卷
量的大豆品种等。竹子作为我国重要的森林资源 ,
由于竹材具有强度高、韧性好、硬度大等特点 ,在建
筑、造纸、装饰材料等领域得到广泛的应用 [ 5 ]。毛竹
是我国重要的经济竹种 ,以毛竹为材料进行 PAL基
因的研究 ,对于更好地开发利用毛竹资源具有重要
的现实意义。本研究采用 RT2PCR及 RACE方法从
毛竹中克隆了 PAL基因 cDNA全长 ,并对其进行了
相关分析和组织特异性表达研究。
1　材料与方法
1. 1　实验材料
2007年 10月用购自广西省柳州地区的毛竹
( Phyllostachys edu lis ( Carr. ) H. de Lehaie)种子进
行播种 ,在国际竹藤网络中心培养室培养成实生苗 ,
盆植于直径为 15 cm的塑料盆中 ,培养介质为混合
土 (腐殖质土 ∶蛭石 = 7∶3)。培养条件为 25 ℃,每天
光暗培养时间为 16 h /8 h。2008年 3月取新鲜、无
病虫害的叶片、叶鞘、幼茎和根 ,用于 RNA提取。
1. 2　总 RNA提取与 cD NA合成
采用 Invitrogen公司的 Trizol reagent提取毛竹
新鲜材料的 RNA [ 6 ] ,用 Promega公司的反转录试剂
盒合成 cDNA。采用 Clontech 公司的 SMARTTM
RACE试剂盒合成 3′cDNA和 5′cDNA。
1. 3　基因的克隆与测序
根据已知苯丙氨酸裂解酶基因序列设计保守区
扩增引物 ,由上海生工生物工程技术服务有限公司
合成。引物 1: 5′2TGTCGACCAGCGTCAACGG23′;引
物 2: 5′2TACTCTTCGTCGTCGTCGCTGAC23′。
PCR反应体系为 : cDNA (0. 04μg·L - 1 ) 1μL,正
向引物 (10μmol·L - 1 ) 1μL,反向引物 (10μmol·
L - 1 ) 1μL, dNTP (各 2. 5 mmol) 3μL, 2 ×Buffer 10μL,
Taq酶 (5 U·μL - 1 ) 0. 2μL,加水至总体积为 20μL。
反应条件 : 94 ℃ 1 m in, 55～65 ℃1 m in, 72 ℃1 m in 30
s,共 35个循环。PCR产物电泳分析后 ,用上海申能
博彩生物科技有限公司试剂盒回收 ,按照 Promega的
pGEM2T easy载体快速连接试剂盒操作流程 ,将回收
的 DNA片段连接到载体上 ,转化大肠杆菌 ( Esherich ia
coli (M igula) Castellani et Chalmers) DH5α菌株 ,经蓝
白斑筛选 ,提取阳性克隆质粒并经酶切图谱分析后 ,
送北京三博远志科技有限公司测序。
根据保守区序列设计 RACE引物。5′2RACE引
物 : PAL521: 5′2CATCTCGTTGACCTTCTTGGCGTG2
GCTC23′; 3′2RACE引物 : PAL321: 5′2GCTCCAGTTC2
CTTGCCAACCCGATCACC23′, PAL322: 5′2CCGTGT2
TCAGCTACGCCGACGACCCG23′
PAL521、PAL321 分别与 UPM 配对的第 1 轮
PCR反应条件为 : 94 ℃ 30 s, 72 ℃ 3 m in, 5个循环 ;
94 ℃ 30 s, 70 ℃ 30 s, 72 ℃ 3 m in, 5个循环 ; 94 ℃
30 s, 68 ℃ 30 s, 72 ℃ 3 m in, 25个循环。PAL322与
NUP配对的巢式 PCR反应条件为 : 94 ℃ 30 s, 68 ℃
30 s, 72 ℃ 3 m in, 25个循环。 PCR产物经回收、连
接后送公司测序。
1. 4　PePAL 1基因的组织特异性表达检测
采用 RT2PCR法确定 PePAL1基因在不同器官
中的表达量。以毛竹 A ctin基因 ( FJ601918)作内标
(正向引物 : 5′2ATGGCTGAAGAGGATATCCAGC23′,
反向 引 物 : 5′2TTCCATGCCAATAAAAGATGGCTG2
3′, PCR反应条件 : 94 ℃, 5 m in; 94 ℃ 1 m in, 58 ℃ 1
m in, 72 ℃ 1 m in,循环数为 28个 ; 72 ℃延伸 10 m in。
2　结果与分析
2. 1　基因保守区片段的克隆与分析
以毛竹叶片 RNA反转录合成的 cDNA作为模
板 ,用引物 1和引物 2进行扩增反应 , PCR产物在 1%
的琼脂糖凝胶中电泳 , EB染色结果显示 :在 1 000 bp
左右有 1条亮带 (图略 ) ,与预测的基因片段基本相
符 ,初步确定为目的基因片段。将片段回收与 pGEM2
T easy载体连接 ,转化后将单克隆送公司测序。测序
结果表明 :插入片段位 1 063 bp。应用 B last在线软
件 ,将测序的序列与已报道的基因进行同源比较 ,发
现插入片段与苯丙氨酸裂解酶基因家族的保守区有
着较高的相似性 ,其中与玉米的一致性达 95% ,初步
确认为毛竹苯丙氨酸解氨酶基因的部分序列。
1: RACE产物 ;M: 1 kb分子量标记
图 1　5′2RACE产物电泳　　　　图 2　3′2RACE产物电泳
054
第 3期 高志民等 :毛竹苯丙氨酸解氨酶基因的克隆及组织特异性表达分析
2. 2　cD NA编码区全长的克隆与分析
为了获得基因的全长 ,根据已获得保守区片断
的序列设计了 5′2RACE引物 PAL521和 3′2RACE引
物 PAL321,与 SMARTTM RACE 试剂盒通用引物
(UPM )配对进行扩增。引物 PAL521和 UPM的产物
在 1 100 bp左右有 1条亮带 (图 1) ,而引物 PAL321
和 UPM的产物电泳呈现弥散状态 ,没有特异性条
带。将引物 PAL321和 UPM的 PCR产物稀释 50倍
作为模板 ,用引物 PAL322与 NUPM配对进行扩增 ,
电泳结果显示在 800 bp左右有 1条亮带 (图 2)。将
PCR产物回收、连接后转化 ,在得到的大量克隆中 ,
选取阳性克隆进行测序。通过测序并于保守区序列
拼接 ,去掉重叠部分 ,得到一个全长为 2 436 bp的基
因序列 , GenBank注册号为 FJ195650。
(下划线部分为保守域序列 ,阴影为 PAL2histidase信号 ,着重号部分为起始密码子 ,边框部分为终止密码子 )
图 3　PePAL1的核酸序列及其推导出的氨基酸序列
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林 　业 　科 　学 　研 　究 第 22卷
　　序列分析表明 : FJ195650包含一个完整的编码
区 2 106 bp, 5′非翻译区 (UTR ) 95 bp, 3′非翻译区
235 bp和 polyA尾巴 28 bp。FJ195650编码区 GC含
量达 66. 0% ,编码 701个氨基酸 ,第 41～450位为苯
丙氨酸解氨酶保守域 ,在第 185～201位为苯丙氨酸
解氨酶 -组氨酸酶 ( PAL2histidase)信号 (图 3) ,具备
苯丙氨酸解氨酶的特征 ,该基因命名为 PePAL1。Pe2
PAL1 编 码 蛋 白 的 等 电 点 为 6. 398, 分 子 量
为 75 697. 71 Da。
2. 3　氨基酸序列比较与系统进化树分析
通过 blast软件在线比较分析 ,结果显示 : PePAL1
编码的氨基酸序列与其它单子叶植物的 PAL具有较
高的一致性 ,尤其与同是来自禾本科的水稻 (O ryza
sativa L. )、玉米 ( Zea m ays L. )、甘蔗 (Saccharum off i2 cinarum L. )、小佛肚竹 (B am busa ventricosa McClure)、绿竹 (B. oldham i Munro)和小麦 ( Triticum aestivumL. )的 PAL的一致性都在 75%以上 ,其中与水稻的PAL ( P14717)的一致性最高 ,达 93. 0% ,与来自毛竹的 LLB1 (ABP96954)的一致性为 76. 9%。由此可见 ,PAL在系统进化中是比较保守的。应用 MEGA4. 0. 2软件构建了基于 PAL基因编码氨基酸序列的系统进化树 (图 4) ,分析表明 :来自毛竹的 2个 PAL聚类到了不同的分支位点上 ,其中LLB1 ( Ph. edu lis (1) )与绿竹的 PAL位置较近 ,位于同一个分支上 ,而与小佛肚竹的 PAL位置却较远 ;PePAL1 ( Ph. edu lis (2) )与水稻、小佛肚竹的 PAL位置较近 ,位于另一个分支上 ,而与同是来自竹亚科的绿竹的位置却较远。
　　构建系统进化树所选用的 PAL:水稻 ( P14717)、玉米 (NP_001105334)、甘蔗 (ABM63378)、小佛肚竹 (AAX97448. 1)、绿竹 (AAR24505)、
小麦 (Q43210)、毛竹 (1) (ABP96954)、毛竹 (2) ( FJ195650)、小果野蕉 ( (M usa acum inata) ACG56648)、欧洲甜樱桃 ( ( P runus avium ) O64963)
和烟草 ( (N icotiana tabacum ) P25872)。每个分支上的数字表示 1 000次重复搜索的靴带值。
图 4　基于 PAL基因编码的氨基酸序列构建的系统进化树
2. 4　PePAL 1基因的组织表达特异性分析
分别提取毛竹叶片、叶鞘、幼茎和根的 RNA,反
转录成 cDNA第 1链 ,用毛竹 A ctin基因作内标 ,调
整 cDNA用量和循环数 ,使内标基因的表达丰度一
致。以调整后的 cDNA模板量进行 PePAL1基因的
扩增。结果 (图 5)表明 : PePAL1基因在叶片、叶鞘、
幼茎和根中均有表达 ,其中在幼茎中的表达丰度最
高 ,在叶鞘中次之 ,在根中的表达丰度最低。
3　讨论
植物 PAL基因结构的普遍特点是由小的多基因
家族组成 [ 7 ]。GenBank中来自毛竹苯丙氨酸解氨酶
基因 LLB 1的序列为 2 363 bp,该基因组序列由 2个
1: 叶片 ; 2: 叶鞘 ; 3: 幼茎 ; 4:根
图 5　PePAL1在不同组织中的表达特性
外显子 (1～395, 517～2 263)和 1个内含子 (396～
516)组成 ,其编码的蛋白序列 (ABP96954)与 PeP2
AL1的一致性达 76. 9%。系统进化分析显示 ,同是
来自毛竹的苯丙氨酸解氨酶基因其编码的蛋白 PeP2
AL1和 LLB1却聚类到不同的分支位点 ,从一定程度
254
第 3期 高志民等 :毛竹苯丙氨酸解氨酶基因的克隆及组织特异性表达分析
上反应了竹类植物在系统进化上的复杂性。由此推
测 , LLB 1与 PePAL1分别编码毛竹苯丙氨酸解氨酶
的不同亚基 ,可能具有不同的功能。
PAL在植物组织中的表达具有组织特异性 ,本研
究中 PePAL1基因在叶片、叶鞘、幼茎和根中均有表
达 ,且在幼茎中的表达丰度最高 ,在根中的表达丰度
最低。这与某些植物 PAL在根部中表达量最高 [ 8 - 9 ]
的表达模式不同 ,这可能是由于物种差异造成的。
PAL基因的表达模式除受到不同部位的影响外 ,还受
发育时期的调控。如草莓 [ 10 ]的果实在发育过程中 ,
PAL活性有两个高峰 ,一个为幼果期 ,一个为果实成
熟期。本研究仅研究了毛竹幼苗期的表达模式 ,其在
笋期、成竹期的表达模式需要进一步研究。
目前 ,已经从拟南芥、番茄、松树、大豆、杨树、水
稻、胡萝卜等多种植物中分离了包含 PAL基因在内
的多类次生代谢调控基因 ,并对其进行了比较全面
的研究 [ 11 ] ,对 PAL的活性及其调控的次生代谢产物
的药用价值倍受关注 [ 12 ] ,然而对于竹子的相关研究
却刚刚起步。本研究从毛竹中分离了苯丙氨酸解氨
酶基因 ,并初步探讨了其表达模式 ,这仅仅是探索竹
子次生代谢调控的开始 ,但对于未来通过基因工程
手段来改变竹子木质素、纤维素的含量或改变其组
分的定向培育 ,形成新品系有着重要的现实意义。
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