全 文 ：林业科学研究　２０１２，２５（１）：６ １０
ＦｏｒｅｓｔＲｅｓｅａｒｃｈ
　　文章编号：１００１１４９８（２０１２）０１０００６０５
密度对黑腹果蝇胚细胞系 Ｌ２／Ｍ ｄｅｌｔａ２３
冻存效果的影响
丁伟峰，冯　颖，张　欣，李　娴
（中国林业科学研究院资源昆虫研究所，国家林业局资源昆虫培育与利用重点实验室，云南 昆明　６５０２２４）
收稿日期：２０１１０９１２
基金项目：林业公益性行业科研专项（４３８）
作者简介：丁伟峰（１９８０—），男，新疆乌鲁木齐人，助理研究员，硕士．主要从事昆虫细胞工程相关研究．
通讯作者：ｙｉｎｇｆ＠ｈｏｔｍａｉｌ．ｃｏｍ
摘要：使用双翅目昆虫黑腹果蝇（ＤｒｏｓｏｐｈｉｌａｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒＦａｌｅｎ）胚细胞系 Ｌ２／Ｍｄｅｌｔａ２３作为研究材料，制备１０
个密度试验组（０８１×１０６ ２８８×１０７个·ｍＬ－１，每组跨度大于２００×１０６个·ｍＬ－１），分别在冻后第６、１０、１４个月
对各组细胞冻后活力、回复时间长短、以及生长状况进行观察和比较，研究密度因素对细胞系Ｌ２／Ｍｄｅｌｔａ２－３长期
冻存效果的影响。结果表明：冻存密度对细胞系Ｌ２／Ｍｄｅｌｔａ２３冻后活力和状态恢复均有显著影响（Ｐ＜００５）。
细胞冻后活力下降速率随冻存密度增高而减慢，复苏后细胞状态恢复所需时间较短。将 Ｌ２／Ｍｄｅｌｔａ２３的冻存密
度提高至１３×１０７个·ｍＬ－１以上有利于细胞活力的保持与冻后的恢复。
关键词：冻存密度；冻存时间；昆虫细胞；细胞活力
中图分类号：Ｓ７８９ 文献标识码：Ａ
ＣｒｙｏｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎｏｆＣｅｌＬｉｎｅＬ２／Ｍ ｄｅｌｔａ２３ｆｒｏｍＥｍｂｒｙｏｏｆ
Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ：ＴｈｅＥｆｅｃｔｓｏｆＣｅｌＤｅｎｓｉｔｙｏｎｔｈｅＣｙｔｏａｃｔｉｖｅ
ＤＩＮＧＷｅｎｆｅｎｇ，ＦＥＮＧＹｉｎｇ，ＺＨＡＮＧＸｉｎ，ＬＩＸｉａｎ
（ＲｅｓｅａｒｃｈＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＲｅｓｏｕｒｃｅＩｎｓｅｃｔｓ，ＣｈｉｎｅｓｅＡｃａｄｅｍｙｏｆＦｏｒｅｓｔｒｙ；ＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＣｕｌｔｉｖａｔｉｎｇａｎｄＵｔｉｌｉｚａｔｉｏｎｏｆ
ＲｅｓｏｕｒｃｅＩｎｓｅｃｔｓｏｆＳｔａｔｅＦｏｒｅｓｔｒｙＡｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ，Ｋｕｎｍｉｎｇ　６５０２２４，Ｙｕｎｎａｎ，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｉｎｏｒｄｅｒｔｏｅｖａｌｕａｔｅｔｈｅｅｆｅｃｔｓｏｆｄｉｆｅｒｅｎｔｃｅｌｄｅｎｓｉｔｙｏｎｐｏｓｔｔｈａｗｃｙｔｏａｃｔｉｖｅｓ（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇｃｅｌｖｉａｂｉｌｉｔｙ，
ｒｅｃｏｖｅｒｙｔｉｍｅ，ｅｔｃ．）ｏｆｉｎｓｅｃｔｃｅｌｌｉｎｅＬ２／Ｍｄｅｌｔａ２３ｆｒｏｍｅｍｂｒｙｏｏｆＤｒｏｓｏｐｈｉｌａｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒＦａｌｅｎ，１０ｔｅｓｔ
ｇｒｏｕｐｓｗｉｔｈｄｉｆｅｒｅｎｔｃｅｌｄｅｎｓｉｔｙ（ｆｒｏｍ０８１×１０６ｃｅｌｓ·ｍＬ－１ｔｏ２８８×１０７ｃｅｌｓ·ｍＬ－１，ｔｈｅｄｅｎｓｉｔｙｓｐａｎｏｆ
ｅａｃｈｇｒｏｕｐｗａｓｍｏｒｅｔｈａｎ２００×１０６ｃｅｌｓ·ｍＬ－１）ｗｅｒｅｐｒｅｐａｒｅｄａｓｔｈｅｃｒｙｏｐｒｅｓｅｒｖｅｄｃｕｌｔｕｒｅｓｐｒｅｓｅｒｖｅｄｉｎｌｉｑｕｉｄ
ｎｉｔｒｏｇｅｎｓｅｐａｒａｔｅｌｙｄｕｒｉｎｇ１４ｍｏｎｔｈｓ．Ｔｈｅｒｅｓｕｌｔｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｔｈｅｐｏｓｔｔｈａｗｖｉａｂｉｌｉｔｙｏｆｅａｃｈｔｅｓｔｇｒｏｕｐｄｅｃｒｅａｓｅｄ
ｗｉｔｈｔｈｅｃｒｙｏｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎｔｉｍｅｅｘｐｅｎｄｅｄ．Ｔｈｅｒａｔｅｏｆｐｏｓｔｔｈａｗｖｉａｂｉｌｉｔｙｄｅｃｌｉｎｅｄｅｃｒｅａｓｅｄｗｉｔｈｔｈｅｃｅｌｄｅｎｓｉｔｙｏｆ
ｃｒｙｏｐｒｅｓｅｒｖｅｄｃｕｌｔｕｒｅｓｉｎｃｒｅａｓｅｄ．Ｃｕｌｔｕｒｅｓｆｒｏｚｅｎａｔａｂｏｖｅ１３×１０７ｃｅｌｓ·ｍＬ－１ｃｏｕｌｄｏｂｔａｉｎａｂｅｔｅｒｅｆｅｃｔｏｆ
ｃｒｙｏｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ．
Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ｃｅｌｄｅｎｓｉｔｙ；ｃｒｙｏｐｒｅｓｅｒｖｅｉｎｇｄｕｒａｔｉｏｎ；ｉｎｓｅｃｔｃｅｌｓ；ｃｅｌｖｉａｂｉｌｉｔｙ
昆虫细胞系是现代生物学研究极有价值的模型
之一，被广泛应用于医学、农林业以及生物学的各个
领域，在昆虫生理学、生物化学、媒介昆虫行为、化学
药物和生物杀虫剂毒力测定；抗癌药物的研究；病
毒、微孢子虫生物杀虫剂研究等许多方面得到应
用［１－２］。长期高效保存已建立的昆虫细胞系可为研
究和应用这些细胞资源提供保证。
液氮低温保存是细胞系长期保存的重要手段。
通常认为，影响细胞系深低温保存效果的主要因素
有冻存保护剂种类，冻存速率，冻存密度等［３］。前期
第１期 丁伟峰等：密度对黑腹果蝇胚细胞系Ｌ２／Ｍｄｅｌｔａ２３冻存效果的影响
对几种昆虫细胞系长期冻存效果的研究发现，冻存
保护剂和冻存时间长短是影响这些细胞系冻存效果
的重要因素，细胞冻后活力随冻存时间的增长而逐
渐降低，不同种类来源的细胞系对保护剂的选择也
存在差异［４－５］。而冻存密度对昆虫细胞系的长期保
存是否有影响，目前还没有相关报道。
有关冻存密度对细胞系冻存效果影响的相关报
道很少，现有的研究对象主要为哺乳动物细胞系、生
殖细胞、植物细胞，以及藻类细胞等，结果发现，密度
因素对不同来源细胞的冻后生物学活性均有影响，
但影响效果各有不同［６－１０］。可见，弄清密度因素对
细胞冻存效果的影响是非常有必要的。为了研究密
度对昆虫细胞系长期冻存的影响，本文使用模式昆
虫黑腹果蝇（ＤｒｏｓｏｐｈｉｌａｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒＦａｌｅｎ）胚细胞
系Ｌ２／Ｍｄｅｌｔａ２３［１１］作为研究材料，通过观察和检
测冻后细胞活力及恢复状况，比较不同密度对细胞
系冻存效果的影响，为昆虫细胞系长期有效冻存提
供科学依据。
１　材料与方法
１．１　供试细胞系
Ｌ２／Ｍｄｅｌｔａ２３：使用Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ培养基添加１０％
ＦＢＳ（ＨｙＣｌｏｎｅ南美胎牛血清）于２５℃恒温培养。
１．２　细胞的冻存
１．２．１　细胞悬液制备　收集进入对数生长期的细
胞，通过培养基稀释和离心调节其密度，制成１０个
密度梯度试验组，冻前分别检测初始细胞活性。
１．２．２　细胞冻存液制备　使用１０％ ＤＭＳＯ作为冻
存保护剂，加入１０组调整好密度的细胞悬液中。
１．２．３　细胞冻存　将分装好的待冻细胞置于程控
降温仪（Ｃｒｙｏｌｏｇｉｃ公司 ＦＲＥＥＺＥＣＯＮＴＲＯＬＣＬ８０００
降温控制器 ）中，先以３℃·ｍｉｎ－１的速率降温至０
℃，再以１℃·ｍｉｎ－１的速率降温至 －５０℃，最后转
入液氮中保存。
１．３　冻后细胞活性检测
分别在６、１０、１４个月等３个不同时期对１０组
冻存的细胞进行随机抽样复苏，使用 Ｂｅｃｋｍａｎ公司
ＶｉＣＥＬＬ细胞活力分析仪检测细胞密度、细胞活力
（活细胞数占总细胞数的百分比）等特征量，其原理
是利用台盼蓝（ＴｒｙｐａｎＢｌｕｅ）染色法区分活死细胞，
并由软件完成相关指标的统计分析。根据获得的细
胞活力值计算各试验组不同时期的活力下降速率，
其公式为：细胞活力下降率＝初始活力－冻后活力。
１．４　细胞的复苏培养
将复苏后的细胞液转移至２５ｃｍ２细胞培养瓶
（ＢＤＦａｌｃｏｎ细胞培养瓶Ｔ２５），添加适量培养基，避
光２５℃恒温培养。每天观察细胞生长状况，定期检
测并记录细胞活力恢复情况。
１．５　数据分析
使用ＳＰＳＳ对获取的数据进行分析，Ｅｘｃｅｌ绘制
图表。
２　结果与分析
分别在冻后６，１０，１４个月时抽样检测，获得黑
腹果蝇细胞系 Ｌ２／Ｍｄｅｌｔａ２３冻后活力值（表１）。
细胞冻存密度从 ０８１×１０６个·ｍＬ－１开始逐渐递
增，第１０组递增至２８８×１０７个·ｍＬ－１，相邻组之
间跨度在２００×１０６个·ｍＬ－１以上，对应的冻后细
胞活力变化能够反映各组之间的差异。由表１结果
可见，不同密度试验组细胞均随冻存时间的延长活
力降低。
表１　细胞系Ｌ２／Ｍ ｄｅｌｔａ２３冻后活力
编号
冻存密度／
（×１０６个·ｍＬ－１）
冻后细胞活力／％
初始 ６个月 １０个月 １４个月
１ ０．８１±０．０２ ８５．９７±１．８３ ７３．９７±７．０１ ７２．００±４．８４ ６８．７３±１．７０
２ ３．５３±０．１７ ８０．７０±２．４０ ７７．２０±０．８３ ７２．４５±３．１１ ６３．２１±３．８１
３ ５．７４±０．１２ ８５．６５±１．００ ８３．９８±３．０４ ８２．８９±１．６３ ６９．８６±０．８２
４ ８．３４±０．０４ ８９．２２±０．１８ ８６．１３±１．３４ ８１．３１±１．６２ ６９．６０±０．９７
５ １０．３９±０．０６ ９５．３４±０．３７ ８９．２５±１．０７ ８９．２０±０．４７ ７９．２９±０．４３
６ １２．７４±０．１８ ９４．０５±０．２１ ８７．５０±０．７７ ８４．４３±２．０４ ７９．７９±０．３０
７ １３．９４±０．２０ ９４．５３±０．６５ ９２．３６±０．５２ ８８．５８±０．０２ ８５．６６±１．６５
８ １７．７０±０．１４ ９５．５０±０．１０ ９２．５０±０．００ ８７．９１±１．２３ ７９．９２±１．９２
９ １９．１２±０．２２ ９７．０７±０．０３ ９３．８３±０．０８ ９２．８５±１．１９ ８８．３６±０．５０
１０ ２８．７５±０．２４ ８６．２５±１．１１ ８５．９０±１．４０ ７６．３７±１．７０ ６９．７０±１．５０
　　注：细胞活力＝（活细胞密度／总细胞密度）×１００％。
７
林　业　科　学　研　究 第２５卷
为了消除各组初始细胞活力大小不同对分析结
果的影响，本文采用活力下降率作为统计分析的对
象（表２），活力下降率数值越大说明冻后细胞活力
下降幅度越大。从表２结果同样可以看出，冻存时
间越长，每组对应的细胞冻后活力下降率越大，说明
时间长短对昆虫细胞系Ｌ２／Ｍｄｅｌｔａ２３冻后活力有
影响。同时，各密度组之间，不同时间段细胞活力下
降幅度也各不相同。
表２　细胞系Ｌ２／Ｍ ｄｅｌｔａ２３冻后活力下降率
编号
冻后细胞活力下降率／％
６个月 １０个月 １４个月 平均
１ １２．０１±７．０１ １３．９８±４．８４ １７．２５±１．７０ １４．４１±４．５５ａ
２ ３．５０±０．８３ ８．２５±３．１１ １７．５０±３．８１ ９．７５±６．７５ｂ
３ １．６７±３．０４ ２．７７±１．６３ １５．７９±０．８２ ６．７４±７．２０ｃ
４ ３．１２±１．８９ ７．９５±２．２８ １９．６４±１．３６ １０．２３±７．７４ｂ
５ ６．０９±１．０７ ６．１５±０．４７ １６．０６±０．４３ ９．４３±５．１６ｂ
６ ６．５６±０．７７ ９．６３±２．０４ １４．２６±０．３０ １０．１５±３．６１ｂ
７ ２．１７±０．５２ ５．９６±０．０２ ８．８７±１．６５ ５．６７±３．１０ｃ
８ ３．００±０．００ ７．５９±１．２３ １５．５８±１．９２ ８．７２±５．７８ｂ
９ ３．２４±０．０８ １１．８７±２．９８ ８．７２±０．５０ ７．９４±４．１３ｂ
１０ ０．３５±１．４０ ９．８８±１．７０ １６．５５±１．５０ ８．９３±７．３８ｂ
　　注：平均为每组６、１０、１４个月细胞冻后活力下降率的平均值；ａ、ｂ、ｃ标示各组 ＬＳＤ多重比较结果，其中不同字母表示有显著性差异（Ｐ＜
００５）。
采用方差分析对不同冻存密度和复苏时间的细
胞活力下降率进行比较（表３），分析冻存密度和冻
存时间２个因素对细胞系Ｌ２／Ｍｄｅｌｔａ２３冻后活力
的影响力大小。由线性回归的负相关系数 Ｒ２＝
０９２１，说明冻后细胞活力与冻存密度和时间这２个
因素存在显著的线性相关关系；根据不同冻存密度
和时间，以及 ２个因素交互效应的显著性概率
（Ｓｉｇ．）均小于００５，可得出冻存密度、冻存时间长
短，以及二者的交互效应都对细胞系 Ｌ２／Ｍｄｅｌｔａ２
３冻后细胞活力下降有显著影响。
表３　细胞活力下降率主效应方差分析
源 Ⅲ型平方和 ｄｆ 均方 Ｆ Ｓｉｇ．
矫正模型 １８０５７１７ ２９ ６２２６６ １２０９４ ００００
截距 ５０７４１６９ １ ５０７４１６９ ９８５５４０ ００００
不同冻存密度 ２９９２１９ ９ ３３２４７ ６４５７ ００００
不同冻存时间 １１９６２６５ ２ ５９８１３３ １１６１７３ ００００
不同冻存密度×不同冻存时间 ３１０２３３ １８ １７２３５ ３３４８ ０００２
误差 １５４４５９ ３０ ５１４９
总计 ７０３４３４５ ６０
矫正总计 １９６０１７６ ５９
　　Ｒ２＝０９２１（ＡｄｊｕｓｔｅｄＲ２＝０８４５）．
在方差分析的基础上，选择密度作为比较因子，
使用ＬＳＤ多重比较以判断各密度组间活力下降率
的显著性差异（比较结果已标示在表２平均活力下
降率数值上）。结果可见，在这１０个密度梯度组中，
１ ３组两两之间均有显著差异，４ ６组之间差异
不显著，第７组与前后两组均有显著差异，８ １０组
之间又无显著差异。由此可划分出６个影响细胞系
Ｌ２／Ｍｄｅｌｔａ２３冻后活力的密度区间。为了确定这
６个区间对细胞系冻后活力影响大小程度，以表 １
中所列细胞活力值为基础，分别绘制第 １、２、３、５
（４ ６组选取中间组５）、７、９（８ １０组中选取中间
组９）组活力变化的线性趋势线（见图１），获得各组
直线斜率分别为 －１２０５５（Ｒ２ ＝０９１６８）、
－１１９４４（Ｒ２＝０９０１）、－０９９６３（Ｒ２＝０６８０４）、
－１０６２３（Ｒ２＝０８７）、－０６４３１（Ｒ２＝０９５４９）、
以及－０５７４９（Ｒ２＝０９１９１）。其中，冻存密度较
高的第７和９组的斜率值明显小于其他 ４个试验
组，说明提高冻存密度对于保持细胞系 Ｌ２／Ｍｄｅｌｔａ
８
第１期 丁伟峰等：密度对黑腹果蝇胚细胞系Ｌ２／Ｍｄｅｌｔａ２３冻存效果的影响
２３冻后活力具有积极作用。由此可见，在细胞系
Ｌ２／Ｍｄｅｌｔａ２３长达１年半左右的冻存中，将细胞
密度提高至１３×１０７个·ｍＬ－１以上时，其冻后活力
损失最小。
图下１ ９编号表示对应的各密度分组，各图纵坐标比例及代表数值均相同，横坐标为冻存时间，单位为月。
图１　细胞系Ｌ２／Ｍｄｅｌｔａ２３冻后活力变化趋势线
对各组不同时期复苏的Ｌ２／Ｍｄｅｌｔａ２３细胞系
进行培养和观察，比较冻存密度对细胞冻后恢复状
况的影响。发现相对低密度试验组（１ ５组）在冻
后第６和１０个月复苏并培养７２ｈ后，活力可达到
８５７６％ ９４５１％之间，在第 １４个月后复苏的细
胞，活力恢复至相同水平所需时间延长至 ９６ｈ左
右。高密度试验组（６ １０组）在冻后第６、１０，以及
１４个月复苏并培养 ４８ｈ后活力达到 ８６２０％
９６１２％，恢复所需时间少于低密度试验组，而细胞
密度明显高于前者，培养７２ｈ后已达到传代的密度
要求。对冻后细胞形态进行显微观察（图２）发现，
各组复苏后的细胞均有部分出现表面皱缩情况，但
细胞形态保持完整无破裂碎片，培养４８ｈ后细胞形
态即可恢复冻前状态，各组之间在形态上的变化差
异不明显。由此可见，对于细胞系 Ｌ２／Ｍｄｅｌｔａ２３
来说，在相同的复苏及培养条件下，细胞复苏密度越
高，状态恢复所需时间越少。提高冻存密度有利于
加快昆虫细胞系Ｌ２／Ｍｄｅｌｔａ２３冻后恢复进程。
Ａ为第１试验组细胞在冻后１４个月复苏当天拍摄的照片，Ｂ为培养１周后形态照片，
Ｃ为第１０试验组细胞在冻后１４个月复苏当天的形态照片。
图２　细胞系Ｌ２／Ｍｄｅｌｔａ２３冻后显微形态（４００倍）
３　结论与讨论
对１０个不同密度的黑腹果蝇胚细胞系 Ｌ２／Ｍ
ｄｅｌｔａ２３冻后活力变化及恢复状态进行的研究与观
察结果表明：冻存密度对 Ｌ２／Ｍｄｅｌｔａ２３冻后活力
和状态恢复均有显著影响，随着冻存时间的增长，采
用不同密度冻存的细胞系其冻后活性均逐渐下降；
细胞冻后活力下降速率随冻存密度增高而减慢，复
苏后细胞状态恢复所需时间较短。在实际应用中，
通过离心将 Ｌ２／Ｍｄｅｌｔａ２３的冻存密度提高到１３
×１０７个·ｍＬ－１以上有利于细胞活力的保持与冻后
的恢复。
通常认为密度达到１×１０６个·ｍＬ－１以上可满
足多数生物样品的低温保存要求［１２］，本文在设定的
１０个密度测试范围内所获得的结果也证实提高冻
存密度有利于加速细胞冻后状态恢复进程。但并非
所有来源的生物细胞或组织都符合这一结论。Ｊｅｎｓ
９
林　业　科　学　研　究 第２５卷
Ｉ．Ｆｉｎｄ等［６］使用欧洲云杉（Ｐｉｃｅａａｂｉｅｓ）和西加云杉
（Ｐｉｃｅａｓｉｔｃｈｅｎｓｉｓ）胚细胞悬液作为研究材料，发现冻
存密度过高或过低均不利于冻后胚发育。沈华萍［７］
对脐血造血干细胞冷冻复苏过程的研究结果认为，
当冻存密度高于某一阀值后细胞冻后回收率、活性
等生物学特性指标呈下降趋势。针对莱茵衣藻
（Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓｒｅｉｎｈａｒｄｔｉ）的冻存研究发现冻存密
度越高其冻后活力越低恢复所需时间越长［９］。由此
可见，冻存材料自身的生物学及生理生化特性是决
定冻存密度高低的重要因素。
细胞在生长繁殖过程中需要消耗培养液中各种
营养物质，同时释放大量代谢产物，包括能促进细胞
生长的因子以及抑制细胞分裂甚至引起细胞凋亡的
物质［１２］。复苏后为了修复由于低温所造成的损伤，
细胞器会加快代谢过程，消耗更多营养物质并产生
大量次生代谢物。当细胞密度过低时，胞间依赖生
长促进作用减弱，细胞增殖缓慢导致恢复期延长且
不易存活；密度过高时，会引起营养物质过度消耗有
害物质过量积累，造成细胞生长受限［１３］。因此，最
适密度范围实际为细胞冻后相互促进和抑制作用的
平衡域，密度过高或过低会打破细胞间这种平衡作
用，从而影响复苏效果。可见，研究不同细胞系的最
适冻存密度对于提高冻存质量，节省复苏时间和成
本十分必要。
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０１