全 文 ：林 业科 学研 究 2010, 23( 2) : 170～ 176
Forest Research
᭛ゴ㓪ো : 1001-1498( 2010) 02-0170-07
ᢳफ㡹 MYB෎಴ᇍ⃵⫳㓈ㅵ㋏㒳থ㚆ⱘᕅડ
൹ ֹ1, 3, ฆਖ਼ࠍ1, 3, ཷںע1, 2 , ვ೮൶1, 3, ঳਴ᅘ1, 3*
( 1. 中国林业科学研究院林业研究所 ,国家林业局林木培育重点实验室 , 北京 100091; 2. 内蒙古农业大学林学院 ,
内蒙古 呼和浩特 010019; 3. 中国林业科学研究院重点开放实验室 , 北京 100091)
ᨬ㽕: 根据拟南芥 ATH1 全基因芯片分析毛白杨维管再生过程中基因表达谱的结果, 选取了在芯片中特异表达且表
达量较高的 MYB转录因子家族的 7 个基因, 通过拟南芥突变体研究其对次生维管系统发育的影响及与木材形成相
关的关系。通过“三引物法”的纯杂合鉴定和切片显微观察 , 发现其中 1 个突变系只有纯合突变体没有杂合体, 并
且茎基部维管束间纤维细胞壁和野生型相比明显增厚 ,细胞数量减少 , 细胞腔也随之减小 , 推测该突变体可能与次
生壁的沉积有关系。
݇䬂䆡 : 拟南芥; 突变体; MYB;木材形成; 次生壁
Ё೒ߚ㉏ো : Q945 ᭛⤂ᷛ䆚ⷕ : A
收稿日期 : 2009-06-04
基金项目 : 国家自然科学基金项目 ( 30771697, 30671656) ;国际先进农业科学技术 ( 948 )重大创新项目 ( 2006-4-C01)
作者简介 : 唐芳 ( 1983— ) ,女 , 硕士研究生 , 从事分子生物学研究 . E-mail: tangfangcaf@ 126. com
* 通讯作者 :卢孟柱 ( 1964— ) , 男 , 研究员 ,博士生导师 , 从事分子生物学研究 . E-mail: Lumz@ caf. ac. cn
Influence of MYB Genes on Secondary Vascular System Developement
of Arabidopsis thaliana
TANGFang1, WANGMin-jie1, YANGHai-feng1, 2, ZHAO Shu-tang1, LUMeng-zhu1
( 1. Reaserch Institute of Forestry, Chinese Academy of Forestry; Key Laboratory of Tree Breeding and Cultivation, State Forestry Administration,
Beijing 100091, China; 2. College of Forestry, Inner Mongolia Agricultural University, Hohhot 010019, Inner Mongolia, China;
3. Key Laboratory of Chinese Academy of Forestry, Beijing 100091, China)
Abstract: The Affymetrix whole-transcriptome ATH1 chips were used in laboratory to analyze the gene expression
profiles during regeneration of secondary vascular system in poplar, and differentially expressed genes were obtained
which might involve in cambium initiation, differentiation and xylem development. In this study, the authors chose
7 genes coding for MYB transcription factors that highly expressed during this process, and studied the gene function
using Arabidopsis insertion mutants. One of them was found homozygous in mutant alleles and its secondary walls
were clearly thickened, while the cell cavity and quantity of interfascicular fiber from inflorescence stem reduced
relatively. Therefore this mutant exhibited changes in secondary cell wall deposition.
Key word: Arabidopsis thaliana; mutation; MYB; wood formation; secondary cell wall
树木维管系统次生生长所产生的木材能为建筑、
制纸业和能源提供原料,同时它也是最经济环保的可
再生资源 [ 1]。尽管树木具有显著的经济和生态效益,
但由于树木特有的生物学特性,如生长周期长、体积
大、林木遗传杂合度高等,给树木的遗传学研究带来
了很大困难,导致树木性状缺乏精细的遗传分析。传
统杂交育种在材性改良方面进度缓慢,而应用分子育
种技术进行林木材性的改良不仅可以缩短育种周期,
还可以提高育种的目的性和可操作性 [ 2]。
近年来,树木木材形成的分子水平的研究取得
了较大进展,通过基因组学技术成功获得了黑洋槐
( Robinia pseudoacacia Linn. )
[ 3 ]、火炬松 ( Pinus taeda
第 2 期 唐 芳等:拟南芥 MYB基因对次生维管系统发育的影响
Linn. )
[ 4 - 5 ]和杨树属 ( Populus Linn. ) [ 6 - 8] 中参与木
材形成相关的基因表达谱,发现了大量可能参与或
调控木材形成的基因;但因上述树木特有的生物学
特性,不能直接对所获得的大量基因进行基因功能
和分子机理的快速分析,需要通过分子生物学研究
更为深入的模式植物来揭示。
目 前, 拟 南 芥 ( Arabidopsis thaliana ( L. )
Heynh. ) 是研究比较深入的模式植物, 通过调节光
周期和温度、去除花枝和密植等方法 [ 9 ] 来诱导拟南
芥的次生生长,会产生相当数量的次生木质部 ( 木
材) ,尤其是经过次生生长诱导的下胚轴, 会形成一
定厚度的次生木质部,其结构和木本植物的次生结
构极其相似 [ 10 - 1 1] 。通过杨树 EST数据库与拟南芥
基因组数据库比较 [ 12] ,发现二者编码基因有很高的
相似性,因此,可以通过研究诱导次生生长的拟南芥
的维管系统发育来揭示树木木材形成的分子机理。
王敏杰等 [ 13 ] 通过拟南芥 ATH1 全基因芯片跨
物种杂交分析毛白杨( Populus tomentosa Carr. ) 维管
再生过程的基因表达谱,得到了可能参与形成层发
生、分化以及木质部发育相关的基因,包括信号转导
相关蛋白和 MYB、AP2、锌指结构域转录因子及调控
因子等基因,还有细胞壁多糖生物合成相关基因以
及细胞壁蛋白基因。本文选取在次生维管再生后期
特异表达且在木质部表达量高的 MYB转录因子家
族的 7 个基因,利用拟南芥突变体经次生诱导条件
培育,初步鉴定 MYB基因与维管系统发育的关系,
为木材形成的分子机理研究奠定基础。
1 ϫॸူֺ֥
1. 1 ỡ⠽ᴤ᭭
拟南芥 T-DNA突变系购自 The Nottingham Arabi-
dopsis Stock Centre ( NASC,拟南芥突变体资源中心) ;
野生型拟南芥为哥伦比亚生态型( WT) ,由中国林科院
林业研究所国家林业局森林培育重点实验室保存。
1. 2 ᮍ⊩
1. 2. 1 થ઒ࠗ෌έ඘ԅ༪႔ 根据拟南芥 ATH1
全基因芯片分析毛白杨维管再生过程中基因表达的
情况 [ 13] ,选择再生过程后期表达有显著差异且在木
质部表达量高的 MYB转录家族的部分基因作为研
究对象。由 SIGnAL、GABI、RIKEN等拟南芥突变体
库搜索相应基因突变体信息后, 根据基因组中 T-
DNA的插入位点, 选择插入点在外显子、基因上游
启动子区域的突变体,最终由欧洲拟南芥资源中心
( NASC) 收集到 7 个相应突变系 T1 代的种子, 分别
将这 7 个突变系命名为 SK-1 至 SK-7。
1. 2. 2 થ઒ࠗᄵᄑۤұಓಓЩယӽ 将突变系 T1
代种子和野生型种子均匀撒于垫有浸湿滤纸的干净
培养皿里,避光 4 ℃条件下春化处理 5 d。种植土壤
为腐殖土和蛭石按 1∶1 比例混匀并高温灭菌 20
min。将春化好的拟南芥种子点播于盛有灭菌后土
壤的培养钵( 直径 ×高 = 10 cm×10 cm) 中,每个培
养钵点播 2 ～ 3 粒种子,盖上透明塑料薄膜保湿,放
置于光照培养箱中培养。3 ～ 5 d 出苗后,揭掉薄
膜。在 16 h黑暗、8 h光照、23 ℃的次生诱导条件下
连续培养 4 ～ 6 个月。
1. 2. 3 ෌έݮ࿙ԅҢၶۦ޿Љ 根据拟南芥突变
体库提供的检测方法 [ 14 ] , 检测 T-DNA 插入造成突
变( SALK系列) 的纯杂合型。在外源 T-DNA上设计
一个引物 BP, 距 T-DNA 3’末端约 110 bps, 在 T-
DNA插入基因位点的 5’和 3’两个方向各设计一个
引物,即 LP和 RP, 两引物间设计的长度约 900 ～
1 100 bps( 图 1A) 。野生型植株目的基因的 2 条染
色体上均未发生 T-DNA插入,所以其 PCR产物只有
1种,即从 LP到 RP( 图 1B WT) ,片段长度约 900 ～
1 100 bps。纯合突变体植株( homozygous lines, HM)
目的基因的两条染色体上均发生 T-DNA插入,而 T-
DNA本身的长度约为 17 kb, 过长的模板会阻抑目
的基因特异扩增产物的形成, 所以也只能得到 1 种
以 BP与 RP为引物进行扩增的产物( 图 1B HM) ,片
段长度约 410 + N bp( 即从 RP到 T-DNA 插入位点
的片段,长度为 300 + N,加上从 BP到 T-DNA载体
右边界的片段, 长度为 110 bps) 。杂合突变体植株
( heterozygous lines, HZ) 只在目的基因的 1 条染色体
上发生了 T-DNA插入,所以 PCR扩增后可同时得到
410 + N bps和 900 bps 2 种产物( 图 1B HZ) 。
以幼嫩叶片为材料, CTAB法[ 15] 分别提取拟南芥
突变体植株和野生型植株的 DNA。纯杂合检测 PCR
反应体系共 25 μL: 2. 5 μL 10×PCR buffer(含 25 mmol
·L- 1 Mg2 + ) , 0. 5 μL dNTP( 10 mmol·L- 1) , 1.0 μL 5’
端引物( 10 mmol·L- 1) , 1. 0 μL 3’端引物( 10 mmol·
L - 1 ) , 1. 0 μL模板 (约 50 ng) , 0. 2 μL Taq 酶( 10 U·
μL- 1) , 18. 8 μL DDH2 O。分别用 LP和 RP以及 BP和
RP作为一对引物进行 PCR扩增。PCR程序包括 94 ℃
预热5 min, 94℃ 30 s、55 ℃ 30 s、72 ℃ 45 s 3个控温步
骤进行 35个循环,最后于 72 ℃保温 7 min。扩增产物
在 1%的琼脂糖凝胶中电泳分析,照相记录。
171
林 业 科 学 研 究 第 23卷
N: T-DNA 实际插入位点到侧翼序列的片段 , 约 0 ～ 300 bps; LP、RP: 基因组上的左右引物 ; BP: T-DNA3’端引物
图 1 SALK T-DNA纯杂合检测引物设计 ( A) 及 PCR产物电泳示意图 ( B)
纯杂合鉴定的最终产物经 Axyprep凝胶回收试
剂盒( Axygen 公司, 美国 ) 回收纯化后, 与 pGEM-T
easy载体( Promega 公司, 美国) 连接后转化大肠杆
菌( E. coli) DH5α感受态细胞 ( TianGen 公司, 中
国) ,蓝白斑筛选阳性克隆后, 以载体的 M13F 和
M13R序列为引物做 PCR验证,挑取 PCR 结果大小
片断符合的菌斑测序,判断突变插入的位点。
1. 2. 4 ࠴ԅςՒ஭ଫۤມฑڔГ 次生诱导拟南
芥培养 3 ～ 4 个月,待植株抽苔、开花、成熟后收取
种子。待次生诱导植株的种子收获完后,选择植株
的下胚轴和花茎的基部部分, 切取 3 ～ 5 mm的茎
段,立即浸入 FAA 固定液,抽气 15 min ×2。更换 1
次固定液,室温下固定 24 h以上。根据林月惠等 [ 16 ]
的方法,将固定后的材料转入到 10% 的甘油中浸泡
过夜,水洗 2 ～ 3 次后将材料摆放到组织支承器上,
周边滴上包埋剂,速放于冷冻台上冰冻。把样品台
连同已经冷却的材料移至切片机的机头上固定好,
调整切片厚度到所需的厚度( 通常为 10 ～ 18 μm) ,
摇动机身外的旋转杠杆进行切片。材料被切下后用
毛笔或镊子轻轻转移到滴有水的载玻片上展片。待
切片完全展开时,用甲苯胺蓝 O( TBO) 滴染几秒,盖
上盖玻片后吸去多余水分即可以在显微镜下观察。
1. 2. 5 ࠴ԅದࣺ஭ଫۤມฑڔГ 材料的选取和
固定方法同 1. 2. 4,将固定的材料依次通过叔丁醇
( TBA) 梯度, 逐级脱水至 100% 叔丁醇, 每级 2 h。
在有样品的叔丁醇中加入等体积融化的石蜡,于 60
℃放置 24 h以上,其间用纯石蜡替代 4 次以上。将
材料连同融化的纯石蜡倒入小纸盒内包埋材料,蜡
块凝固后修整蜡块粘在木块上,用滑走切片机切出
10 μm厚度的切片,多聚赖氨酸粘片,在 45 ℃温箱
中过夜烤片。经二甲苯、乙醇逐级脱蜡后甲苯胺蓝
O( TBO) 滴染约 1 min,在染色缸漂洗浮色, 80%甘油
封片,显微镜观察拍照。
2 ࠒڴူד๥
2.1 㸼ൟ㾖ᆳ
突变系 T1 代种子春化播种后,经次生诱导条件
处理,获得突变系 T2 代植株。通过次生诱导, 野生
型和突变系植株都比未经诱导的植株生长发育的
慢,开花结荚要晚, 植株更强壮,叶片变大、变厚,茎
更加粗壮;而突变系植株在形态上与野生型植株相
比没有特别大的表型变化,一部分突变系植株的茎
比野生型植株的略细。植株成熟后, 分别收取不同
突变系和野生型植株的种子,作为突变系 T2 植株的
种子继续种植, 以观察其后代植株表型是否发生
分离。
2.2 さবԧ㒃ᴖড়䡈ᅮ
利用拟南芥突变体网站提供的特异引物进行突
变体纯杂合 PCR检测。通过“三引物法”鉴定了 7
个突变体系第 2 代植株的纯杂合突变型,检测结果
见表 1。从表 1 可以看出: SK-1 没有检测出纯合突
变体, SK-5没有检测出杂合突变体,其余各突变系
均检测出了纯合和杂合突变体,并且每个突变体株
系都检测出了野生型的植株。
㸼 1 7Ͼさবԧ㋏㒃ᴖড়䡈ᅮ㒧ᵰ
突变系
野生型
( WT)
纯合突变体
( HM)
杂合突变体
( HZ)
总计
SK-1 20 0 2 22
SK-2 23 15 18 56
SK-3 8 6 3 17
SK-4 19 18 5 42
SK-5 24 6 0 30
SK-6 27 14 5 46
SK-7 6 9 2 17
图 2 显示 :在 LP + RP的片段中 , SK-5 突变系
中的 1、2、8 号植株只得到了 1 条约 1 000 bps的条
带 ,而没有 750 bps 的条带, 所以可以鉴定这 3 个
植株是野生型;而在 LB + RP的片段中 3、4、5、6、7
271
第 2 期 唐 芳等:拟南芥 MYB基因对次生维管系统发育的影响
号植株只得到 1 条约 750 bps的条带,可以鉴定它
们是纯合突变体植株。SK-5 突变系没有检测出杂
合突变体。
1 ～ 8 分别表示 SK-5 突变系中 8 个植株的纯杂合检测结果 : 1、2
和 8 号植株检测为野生型 ; 3 ～ 7 号植株检测为纯合突变体
图 2 SK-5 突变体系植株纯杂合检测 PCR扩增片断电泳图
通过纯杂合 PCR鉴定得到的 2 个片段( LP + RP
和 BP + RP) 的测序结果表明: T-DNA插入的位点和
拟南芥信息资源中心中公布的插入位点一致, 说明
该突变系的基因上确实发生了 T-DNA的插入,基因
完整性受到了破环。
2.3 SK-5さবԧ㣢෎䚼⃵⫳᳼䋼䚼㒚㚲ຕ๲८
拟南芥通过次生诱导后产生较多的次生生长,
根据突变体纯杂合检测的结果,分别切取同一拟南
芥突变系纯合突变、杂合突变和野生型植株的下胚
轴和茎基部,通过冰冻切片后显微观察,可以快速地
对得到的突变体进行结构分析。与经过同样次生诱
导后的哥伦比亚野生型拟南芥比较,除 SK-5 外,大
部分的突变体茎基部及下胚轴的显微结构没有明显
的变化。
SK-5 突变系中检测为野生型的植株 ( 图 3 C、
G) 和 WT( 图 3 A、E) 相比,茎基部次生木质部分细
胞数量减少, 细胞腔相对增大, 细胞壁没有明显变
化;而检测是纯合突变的植株 ( 图 3 B、F和 D、H) 与
WT相比,茎基部维管束间次生木质部分变少,细胞
数量也减少, 细胞壁明显增厚。野生型植株 ( 图 3
A、E) 在茎基部维管束间次生木质部离心方向的细
胞壁加厚程度最大,之后向里逐渐减少,而纯合突变
体植株( 图 3 B、F和 D、H) 在该部位的各层细胞壁
加厚程度到髓的位置一直很高,且该纯合突变体只
在次生木质部细胞壁加厚,在周皮和髓部分均没有
发现壁的增厚。
切片材料取自各突变类型的拟南芥生长末期的花茎基部 1 ～ 2 cm处 ; 采用冰冻切片经甲苯胺蓝 O 滴染形成 ; A、E为
哥伦比亚野生型的茎基部解剖图 ; C、G为检测是野生型植株的茎基部解剖图 ; B、F 和 D、H为纯合突变体植株的茎基部解
剖图。 co, 皮层 ; if, 维管束间区域 ; xy, 次生木质部 ; ph, 韧皮部 ; pi, 髓
图 3 拟南芥 SK-5 突变 T2 代植株和野生型茎基部的横切面解剖结构图 ( Bar = 50 μm)
2. 4 さবԧさবᗻ⢊〇ᅮ䘫Ӵ
将 SK-5 检测为纯合突变植株收获的突变 T2 代
种子和野生型种子按 1. 2. 2 的方法种植,并在次生
条件下诱导培养。观察到突变 T3 代植株的表型以
及生长时期和同期种植的拟南芥野生型没有很大差
异,与突变 T2 代相比, 形态上也没有发生变化。突
变 T2 代和 T3 代部分植株的检测结果见图 4,突变 T2
代中的 3、5、6、7 号植株检测是纯合突变体,它们相
对应的后代即突变 T3 代植株检测后也都是纯合突
变体,说明 T-DNA插入突变能稳定遗传。
371
林 业 科 学 研 究 第 23卷
3、5、6、7 号是 SK-5 突变系 T2 代中检测为纯合突变体的植
株 ; 3-1、5-1、6-1、6-2 和 7 -1 分别是 3、5、6、7 号植株的下 1 代 , 即突
变 T3 代植株 , 检测结果表明它们均为纯合突变体植株
图 4 SK-5 突变 T2 代和 T3 代植株纯杂合检测
PCR扩增片断电泳图
石蜡切片后显微观察发现:纯合突变 T3 代植株
的茎基部结构变化同突变 T2 代一致( 图 5) 。纯合
突变体植株 ( 图 5 B、D、F) 与 WT( 图 5 A、C、E) 相
比,茎基部维管束间次生木质部的细胞数量减少,细
胞壁明显增厚,说明该突变体系产生的突变性状可
以稳定遗传。因没有得到杂合体,突变产生的性状
也没有发生分离。
切片材料取自各突变类型的拟南芥生长末期的花茎基部 1 ～ 2 cm处 ;采用冰冻切片经甲苯胺蓝 O 滴染形成 ;
A、C、E哥伦比亚野生型的茎基部解剖图 ; B、D、F检测为纯合突变体植株的茎基部解剖图。 co, 皮层 ; if, 维管束间
区域 ; xy, 次生木质部 ; ph, 韧皮部 ; pi,髓
图 5 拟南芥 SK-5 突变 T3 代植株和野生型茎基部的横切面解剖结构图 ( Bar = 50 μm)
471
第 2 期 唐 芳等:拟南芥 MYB基因对次生维管系统发育的影响
3 ࠒৢူඉৢ
MYB转录因子在真核生物中广泛存在,它们含
有一个保守的 DNA结合域,即 MYB域,它由 1 ～ 3
个约 50 个氨基酸不完全螺旋 - 转角 - 螺旋重复顺
序( R1、R2、R3) 组成。根据这些重复顺序的多少,
MYB蛋白可分为 3 类: R1R2R3- MYB 蛋白, R2R3-
MYB蛋白和 R1 /2 /3-MYB蛋白,植物中则以 R2R3-
MYB为主。己发现的植物 MYB转录因子在次级代
谢调控、细胞形态建成和分化、植物激素应答、抗病
反应以及细胞周期调控和细胞程序化死亡等过程中
起重要作用 [ 17 - 1 9] ;同时, MYB转录因子在木质部合
成和分化过程中也起到非常重要的调控作用。MYB
家族中 R2R3-MYB可能是最直接调控木质素生物
合成与沉积的因子 [ 20] ,它能调控参与苯丙烷类物质
合成相关基因的表达,从而影响木质素的含量和酚
类物质的积累 [ 21 - 23 ]。拟南芥诱导次生生长过程的
转录组分析指出, MYB转录因子家族能调控木质部
和韧皮部细胞的分化和发育 [ 24] 。因此,本文根据拟
南芥 ATH1 全基因芯片跨物种杂交分析毛白杨维管
再生过程的基因表达谱结果,选取在次生维管再生
后期特异表达且在木质部表达量高的 MYB转录因
子家族的 7 个基因, 利用拟南芥突变体经次生诱导
条件培育,成功筛选到与野生型茎基部次生木质部
产生很大变化的突变体系 SK-5,初步鉴定 MYB基因
家族与维管系统发育的关系。
SK-5 突变体系经“三引物法”纯杂合检测没有
杂合突变体,只有纯合突变和野生型的植株。通过
切片显微观察发现:突变体位于茎基部维管束间的
次生木质部细胞数量减少,细胞壁明显增厚,细胞腔
减小。该部位的各层细胞壁都有加厚而周皮和髓位
置的细胞壁没有增厚,不同于野生型植株在该位置
向心方向的细胞壁增厚程度逐渐减小。有研究表
明, MYB 过量表达转基因烟草植株 [ 18 ] 的木质部细
胞壁增厚;拟南芥 MYB58 和 MYB63 的过量表达会
引起木质素生物合成基因的异常表达从而使非木质
化的细胞产生了异常的木质素积累, 而抑制 2 个基
因的表达会减少次生壁的增厚和木质素的沉积 [ 25] ;
而 MYB58 和 MYB63 是拟南芥次生壁形成过程中激
活木质素生物合成相关基因的转录因子,在次生增
厚的纤维和导管中特异表达 [ 25 - 26 ]。本文中的 SK-5
纯合突变体直接破坏了所插入的 MYB基因,却获得
了和上述 MYB基因过表达一致的性状变化。可以
推测该 MYB基因和其他 MYB基因可能存在负调控
关系, 该基因的缺失使得其他 MYB 基因表达量增
高,促使木质素合成和沉积的相关基因过表达,次生
壁相对增厚。也有可能该基因功能的破坏促使了除
MYB基因家族成员以外的其他基因可协同或竞争
性地参与木质素合成和积累,使得细胞壁异常增厚。
要想了解该 MYB基因的具体功能,还需更深入了解
其作用机制,对 MYB转录因子家族其他相关基因分
别进行功能分析,进行多基因协调网络作用的研究。
由于与该突变体处于同一代的野生型纯合体出
现了与野生型不同的表型,因此要判断是否是该基
因的突变引起的表型变化,还需要进行更深入的研
究。首先要判定 T-DNA的插入位点是否唯一,如果
唯一,需要分离该基因,并通过 RNAi 抑制或正义超
量表达鉴定其基因的生物学功能;如果不唯一,还需
要进一步确定 T-DNA插入的真正位点,对插入位点
所在基因的基因功能进行研究,找出基因与表型的
对应关系。无论如何, 本突变体的发现对下一步进
行基因功能和分子机理的研究,进而揭示 MYB转录
因子家族和木质部发育的关系有重要意义。
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