全 文 ：林业科学研究!"#$"!"%"%#$*#& *$$
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!!文章编号!$##$$&()""#$"##%#*#&#)
栗疫菌营养体亲和型多样性比较及
野生栗栗疫菌交配型的分子检测
潘!琪$! 张国珍"! 贺!伟$ #! 费松林.! 陈余朝&! 张海旺"
"$P北京林业大学林学院!北京林业大学森林培育与保护教育部重点实验室!北京!$###).*
"P中国农业大学植物病理学系!农业部植物病理学实验室!北京!$###(&*
.P普渡大学林业与自然资源系!美国!&/(#/* &P陕西省安康市林业技术推广中心!陕西 安康!/"%####
收稿日期$ "#$"#$#*
基金项目$ 由美国板栗协会部分资助"0,GC"##( U$.#
作者简介$ 潘!琪"$()%(#!男!河南人!硕士研究生!主要从事森林病理学研究P
#
通讯作者$ 贺伟!博士!教授!主要从事森林病理学研究
摘要!在北京周边县区湖北大老岭山区以及陕西安康地区分别调查栗疫病发生情况!采集病原栗疫菌"+#H@*"0$)2
&#=( @(#(%=&=)(#菌株并进行营养体亲和性试验) 结果表明$北京板栗栽培区和陕西安康地区野生栗栗疫病发病率较
高!局部地区危害严重*湖北大老岭山区栗疫病发病率低!危害轻微) 北京地区菌株群体营养体亲和型多样性指数
"4;8==A=`?6=69T7D?O697?>H?=D6S#极显著低于湖北菌株群体和陕西菌株群体!而陕西与湖北菌株群体营养体亲和型
多样性指数差异不显著) 随机选取湖北陕西野生栗栗疫菌部分菌株!利用特异性引物!通过普通 _G5和巢氏
_G5!对其交配型进行测定!发现陕西与湖北野生栗菌株群体中均存在 1,0$ 与 1,0" 两种交配型的菌株) 通过
_G5扩增!在两地的野生菌株群体里均发现同时具有两种交配型基因的菌株!其中!陕西群体此类菌株比例较大!湖
北菌株比例较小
关键词!野生栗*栗疫菌*营养体亲和型*交配型*香农维那指数
中图分类号!4/$)P) 文献标识码!,
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f6He8NA98>A9HAB_L8=>_8>;ALAJH! 1?=?7>9HAB,J9?:@L>@96! +6?I?=J!$###(&! G;?=8*
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H?=J8::A9D?=J>AD?B696=>7?>6:A=D?>?A=7!M87;?J;69>;8= >;8>?= \@N6?P0;64;8==A=`?6=69T7D?O697?>H?=D6S67AB
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第 % 期 潘!琪等$栗疫菌营养体亲和型多样性比较及野生栗栗疫菌交配型的分子检测
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7>98?=7M?>; >MAE8>?=J>HK67?= 87?=JL67>98?= M696D6>6:>6D 87M6L! 7;AM?=J;?J;69K9AKA9>?A= ?= 4;88=S?KAK@L8
>?A= >;8= ?= \@N6?KAK@L8>?A=P
=(+ >,/*2$ M?LD:;67>=@>*+#H@*"0$)&#=( @(#(%=&=)(*O6J6>8>?O6:AEK8>?N?L?>H*E8>?=J>HK6*4;8==A=`?6=69T7D?O69
7?>H?=D6S
栗疫病是世界上著名的森林病害!$( 世纪末到
"# 世纪初!该病的大流行使北美板栗遭到全面灭种
的威胁!成为植物病害摧毁自然物种的唯一例子+$, )
自 $($. 年起!我国也发现了此病!部分板栗"+(%&(2
0$( C"F=%=C( +LP#栽培地区此病害还较严重+", ) 近
年来!随着气候条件变化及粗放经营模式下的栽培
生产!栗疫病有加重的趋势!需要加强病害监测和防
治研究!而抗病种质资源的发掘则成为了病害防治
研究的重点)
关于栗属"+(%&(0$( 1?LP#植物种质资源的问
题!世界各国学者!如 5@>696>R8H=67等认为!其起
源地及遗传多样性中心是中国大陆!但长期以来缺
乏直接的证据+., ) 郎萍等+&,通过对分布于亚洲欧
洲和北美的栗属植物的遗传多样性的研究发现!中
国大陆地区板栗的遗传多样性显著大于茅栗"+S
%$14=0= -AD6# 美 洲 栗 " +SB$0&(&( " 1897;P#
+A9Q;P#和欧洲栗"+S%(&=_( 1?LP#!而长江流域中国
板栗的遗传多样性大于中国其他品种群) 除板栗
外!我国也是世界栗属植物中锥栗"+S*$0#H="4Q8=#
56LDP6>` ?L7P#和茅栗的原产地!并拥有丰富多样的
野生栗资源*一般来说!我国栗属植物对栗疫病有较
强的抗性+%, !是重要的抗病种质资源) 位于长江流
域的大巴山神农架一带!板栗茅栗锥栗处在野生
状态!人为因素影响较小!是寻找栗疫病抗病种质资
源较为理想的地区!同样也是调查病原菌遗传多样
性较为适宜的地区)
王克荣等+* U/,对分布在中国东部板栗区栗疫菌
"+#H@*"0$)&#=( @(#(%=&=)("1@9P#+89#的营养体亲和
组"dG[#"或称营养体亲和型#和交配型进行过测
定!并描述了栗疫菌在这一区域的大致情况!但其所
研究的栗疫菌寄主对象多数为栽培板栗!而关于我
国野生栗树栗疫菌的营养体亲和型和交配型的研究
资料有限) 本文选择湖北大老岭陕西安康地区野
生栗分布区进行栗疫菌营养体亲和型研究!也研究
了北京周边地区栽培板栗栗疫菌的营养体亲和型!
并与上述两地栗疫菌的营养体亲和型多样性进行比
较) 此外!利用特异性引物和 _G5扩增试验!对湖
北陕西部分野生栗栗疫菌的交配型进行了测定!以
判断是否有可能在自然条件下进行有性杂交或者自
交!从而预测此两地野生栗栗疫菌营养体亲和型变
化的情况)
对栗疫病发生情况以及病原菌遗传多样性开展
调查!不仅能够大致了解野生栗栗疫菌营养体亲和
型多样性情况!也可为抗病种质资源的保护和利用
病害流行学和防治研究提供依据)
$!材料与方法
@P@A菌株来源
"##*("##/ 年"##(("#$# 年!分赴北京周边
县区湖北大老岭山区以及陕西安康等地区实地调
查并采集栗疫菌菌株 "%.%$.$ 株!共 $($ 株"表
$#!其中!北京周边县区所采 "% 株栗疫菌的寄主均
为栽培板栗*湖北 .% 株栗疫菌的寄主分别为野板
栗茅栗锥栗!前 " 种寄主各分离菌株 $ 株!其余菌
株寄主均为锥栗*陕西菌株中!&) 株的寄主为锥栗!
&& 株的寄主为茅栗!.) 株的寄主为野板栗!$ 株的
寄主为日本栗"+S)#$0(&( 4?6NP6>k@::P#)
采用样方法!每个样方大小为 .# El.# E!每
一样方中采集所有能够采集的病样) 行政村和自然
生境为采样基本单位!从中分离的菌株属于 $ 个群
体!群体间相距至少 $# QE!有的群体含子群体!子
群体相距 $2% QE左右)
在所采的菌株中!大部分为单病斑分离菌株!少
数为同一树上不连续病斑分离菌株与大病斑菌株)
病组织块面积为 $# :El$# :E!其来源与获取时间
见表 $) 所有用于营养体亲和型检测的菌株都是经
纯化的单分生孢子后代)
单孢分离方法见张海旺等+),的方法)
%#*
林!业!科!学!研!究 第 "% 卷
表 @ A菌株来源%N6J分组以及香农I维那多样性指数统计表
采集
地区
具体地点 菌株编号及营养体亲和组
亲和型数
"dG[7#
菌株数
a株
香农维那
多样性
指数",#
寄主
采集时间
"年月#
北京 怀柔区桥梓镇
"i]8$$% i]N$) i]:$"# i]D$"" i]6$"&
i]B$"*i]J$")i];$"(i]?$.$i]I$..#
$ $# #P# 栽培板栗 "##*#/
怀柔区九渡河镇吉寺村 "R78$.%R7N$.(R76$&.R7J$&)R7L$%$# $ % #P# 栽培板栗 "##/#)
怀柔区渤海镇渤海所村 "+;7$+;7.# $ " #P# 栽培板栗 "##/#(
密云区不老屯镇大窝铺村 "-MK"#.-MK"#/# $ " #P# 栽培板栗 "##*#)
房山区十渡镇西关上村 "[7:$($[7:$("# $ " #P# 栽培板栗 "##*#)
延庆县四海镇海字口村 "\]"*)\]"/$# $ " #P# 栽培板栗 "##*#)
昌平区兴寿镇下庄村 "o]"&)o]"%/# $ " #P# 栽培板栗 "##*#)
总计$"% 个菌株 ! ! 平均 # ! !
湖北 !!!!!!鼓浆坪 "_"&_"%_"*#*"_"/_")# " % #2*/ 锥栗 "##($#
宜昌大老
!!长冲 "_"(_.##*_.$*_."*"_.._./_&##*_.)*
_.(*_&$
/ $# $2). 野板栗锥栗 "##($#
岭国家森!!大垭 _$$*_$&*_$% . . $2$$ 锥栗 "##($#
林公园!!!板壁岩 _$**_$/*_$)*_$( & & $2.( 茅栗锥栗 "##($#
!!!!!!猪槽沟东 "_$_.#*_"*_/*_)*_( % * $2%/ 锥栗 "##($#
!!!!!!猪槽沟南 "_S$_S._S*#*_S&*_S%*_H$*_H& % / $2&* 锥栗 "##($#
总计$.% 个菌株 ! !
!!平均 $2.&##!!
陕西 岚皋县南宫山长梁子 $F*".F&F%F#*")F(F#*$#F & / $2"/ 茅栗锥栗 "#$#$#
岚皋县蔺河乡大湾村山沟
")$F)%F#*).F*)&F*")/F("F(.F#*))F*
)(F*(#F*($F*(%F*(*F
$# $. "2"# 茅栗锥栗 "#$#$#
蔺河乡大湾村北坡
.#F*."F*..F*.%F*.*F*./F*.)F*.(F*&$F*
&"F*&.F*&%F*&*F*&/F*&(F
$% $% "2/$ 茅栗锥栗 "#$#$#
蔺河乡大湾村柏树堡 %%F*%*F*%/F**$F**"F % % $2*$ 茅栗 "#$#$#
蔺河乡大湾村 $ 组 */F**)F*/$F*/"F*/.F*/&F * * $2/( 茅栗锥栗 "#$#$#
蔺河乡大湾村 " 组
/%F* /*F* //F* /)F* /(F* )#F* )"F* )*F*
(&F*(/F
$# $# "2.# 茅栗锥栗 "#$#$#
蔺河乡草垭村 $ 组
()F*((F*$#"F*$#(F*$$$F*$$)F*$".F*$.#F*
"$.&F$.%F#*$.*F*$&#F*$&"F
$" $. "2&* 茅栗锥栗 "#$#$#
蔺河乡草垭村 " 组
$#$F*$#.F*$#&F*$#%F*$#/F*$#)F* "$$#F
$$"F$$.F$$&F$$/F#*$$*F
) $" $2)$ 锥栗 "#$#$#
蔺河乡草垭村 . 组
$"#F*$"$F*"$""F$"(F#*$"%F*$.$F*$."F*
$..F*"$./F$&$F#*"$.(F$&.F#
( $" "2$& 锥栗 "#$#$#
平利县女娲山乡七里村
九道梁地区
"$%)F$%(F#*$*#F*$*$F*$*"F*$*.F % * $2%) 野板栗 "#$#$#
平利县女娲山乡
女娲山村 ) 组
$&&F* $&/F* $&(F* $%#F* $%$F* $%"F* $%.F*
$%&F*$%/F
( ( "2"$ 野板栗 "#$#$#
安康市汉滨区吉河镇 $*%F*$*)F*$/#F . . $2$$ 日本栗野板栗 "#$#$#
!!!!!迎风乡红霞村 "$/$F$/.F$/&F$/%F#*$/"F " % #2%# 野板栗 "#$#$#
安康市
!!油房村
"$//F$)$F#*$/(F " . #2*. 野板栗 "#$#$#
汉滨区
吉河镇
!!东西沟村 $)"F* $).F* $)%F* $)*F* $)/F* $))F*
$)(F*$($F
) ) "2#) 野板栗 "#$#$#
!!!!!国庆村 $("F*$(.F*$(&F*$(*F & & $2.( 野板栗 "#$#$#
总计$$.$ 个菌株 平均 $2/&##
!!注$相同营养体亲和型的菌株用%"#&包括!不同营养体亲和型的菌株"组#用%*&分隔开*
##
表示在
#
c#2#$ 的水平上差异极显著)
*#*
第 % 期 潘!琪等$栗疫菌营养体亲和型多样性比较及野生栗栗疫菌交配型的分子检测
@P?A营养体亲和型测定方法
$P"P$!_-,培养基与 _-,EN 培养基"*#!_-,培
养基配方$去皮马铃薯 "## J!葡萄糖 $# J!琼脂粉 $)
J!水 $ ### Ee*_-,EN 培养基配方$每升 _-,培养
基配方中再加入 $## EJ甲硫氨酸和 $ EJ生物素!
用 "2# EAL/eU$氢氧化钠水溶液或者乳酸调节 K值为 *2& /2#)
$P"P"!对峙培养法"*#!将保存好的单分生孢子菌
株转移到_-,培养基上!"% V光照培养!至菌落直
径扩展为 & % :E!然后用直径为 #2% :E的打孔器
在栗疫菌菌落边缘打取菌饼!用灭菌牙签将来自不
同菌株的菌饼相距 #2% :E放置在直径 * :E的
_-,EN培养基平板上对峙培养!每个处理 . 个重
复!"% V暗培养) 培养 $# $" 天后!观察记录对峙
菌株是否亲和) 判断标准如下$两配对菌株菌落融
合!记为亲和*两配对菌株菌落边缘出现分界线!记
为不亲和)
对峙培养实验组合包括$"$#每一个小生境中
的所有菌株之间两两进行的对峙培养实验*""#随
机选取来自北京湖北陕西共 $* 个菌株组成一个
群体"北京 " 个菌株!湖北 . 个!陕西 $$ 个#!该群体
中所有菌株两两进行的对峙培养实验*".#北京不
同小生境间所有菌株两两进行的对峙培养实验)
@PBA栗疫菌交配型分子测定方法
$P.P$!供试菌株及试剂!供试菌株采用从单病斑
上分离并多次纯化后试管斜面保存的原始菌株!能
更真实地反应自然界菌株的交配型分布情况*对分
离到的湖北陕西野生栗疫菌选取一定数量的随机
菌株进行_G5扩增!检测其群体交配型比例) 根据
季哲等+(,二项式通项的理论!按照每个交配型在自
然群体中出现的频率为 %#3计算!那么在 ((2(3的
保证率下!需要 0个菌株才能出现全部 " 种交配型!
其二项式为$$ U+"$O"# 0 n"$O"# 0,
$
((2(3!计算
得到 0
$
$$!即用于试验中的菌株数量大于等于 $$
时!就可以保证 " 种交配型全部出现的概率在
((2(3以上) 因此!检测的每个群体随机选取大于
等于 $$ 的菌株进行交配型的检测!以获得能够代表
该群体的交配型比例的群体) 本实验随机选取来源
于湖北的菌株的数量为 $/ 株!来源于陕西的菌株的
数量为 .% 株)
所用培养基以及试剂为$_-,培养基"用于菌
株的活化和培养#真菌 -Z,提取裂解液YS08F
套装)
真菌-Z,提取裂解液配方$$# EEAL/eU$09?7
\GL!"%# EEAL/e
U$
Z8GL!$2# EEAL/e
U$
Y-0,!$3
4-4"以上浓度均为终浓度#用 "2# EAL/eU$ Z8b溶液调 K\c)2#)
YS08F套装!08f858公司产品$ YS08F _ALHE69
876"% =?=>/e
U$
#$# lYS08F _G5+@B69"含1J"n#
DZ0_7""2% EEAL/e
U$
#* leA8D?=J+@B69)
$P.P"!菌丝体收集!将保存于试管斜面的菌株转
移至直径 ( :E的_-,平板上!置于 "% V培养箱培
养数日!待菌落长满_-,平板后用灭菌小勺收集菌
丝体至无菌_G5管内!U"# V低温保存)
$P.P.!栗疫菌基因组 -Z,提取!采用林彩丽
等+$#,的方法)
$P.P&!引物条件!1898+$$,利用 -Z,杂交技术最
终设计出栗疫菌交配型特异性引物以及配套巢氏引
物!后经葡萄牙 +98J8=:8等+$",验证!能够达到区分
栗疫菌 " 种交配型的结果) 本试验采用的即是此套
引物!并将_G5条件优化) 实验引物均由 ?=O?>9AJ6=
英潍捷基"上海#贸易有限公司合成)
$P.P%!_G5扩增体系及扩增程序
"$#_9?E89H_G5.#
!
e体系$$# lYS08F _G5
+@B69"含1J"n#.
!
e!DZ0_7""P% EEAL/e
U$
#"2&
!
e!YS08F _ALHE69876"% =?=>/
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e
U$
##2$%
!
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$ 或者1,0""_9?E89HaZ67>6D#引物每种 #P*
!
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板-Z,#P/
!
e!双蒸水补足至 .#
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+@B69"含 1J"n#.
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_9?E89H_G5产物 $P"
!
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!
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".#扩增程序$(% V预变性 .# 7!然后 (% V .#
7!** V$ E?=!/" V& E?=!.# 个循环"_9?E89H_G5#a
"" 个循环"Z67>6D _G5#之后 /" V延伸 . E?=!& V
保存) 所用的 _G5仪为 [6=6,EK) _G5 4H7>6E
(/## 或者 ,KKL?6D +?A7H7>6E7d69?>?(*`6L0;69=8L
GH:L69)
$2.2*!琼脂糖凝胶电泳及紫外成像!以-e"###-Z,
分子量作为标记!将 _G5扩增产物取 %
!
e!用 * l
eA8D?=J+@B69$
!
e混匀!再加入到 $2"3琼脂糖凝
胶的点样孔内!$$# d恒压直流电条件下!在 #2% l
0+Y电泳缓冲溶液中电泳 .# E?=*将琼脂糖凝胶放
入浓度为 #2%
!
J/Ee
U$溴化乙锭溶液中染色 $#
$" E?=*染色完毕!在紫外透射成像仪下检查结果!
/#*
林!业!科!学!研!究 第 "% 卷
并拍摄电泳图片!所用软件为 [6=64=8K B9AE4H=[6
=6)
"!结果与分析
?P@A栗疫病病害调查概况
"P$P$!湖北大老岭地区栗疫病发生情况!湖北大
老岭地区栗属植物以锥栗为主) 所采集的 "% 株病
树中!". 株为锥栗!茅栗和野生板栗各 $ 株) 该地
区野生栗树栗疫病发病地点分散!发病率整体较低
" q)3#!发病栗树主要为锥栗!有的锥栗病株上产
生多个病斑)
"P$P"!陕西安康地区栗疫病发生情况!所调查地
区位于大巴山北坡!植被丰富!栗属植物中国特有种
板栗茅栗及锥栗均有较为广泛的分布!而栗疫病在
此 . 种栗属植物上均有发生) 发病率与严重程度随
地点不同差别很大!其中!锥栗分布区内!栗疫病发
病率达 .#3 ) 调查中还发现!野生板栗的栗
疫病老病斑较多!在之后进行的栗疫菌分离试验中!
部分老病斑能分离到栗疫菌)
"P$P.!北京周边县区栗疫病发生情况!所调查地
区为北京周边板栗栽培种植区!所有菌株都是从板
栗树体上分离得到) 该地区各个调查点栗疫病发病
率为 $.3 $)3!严重程度随地点不同差别较大)
?P?A菌株间营养体亲和性反应的类型
本试验的观察结果中出现了菌株间营养体亲和
"同为一个营养体亲和型#与菌株间营养体不亲和
"分属不同的营养体亲和型#两大类) 同一亲和型
菌株菌丝间相互融合!菌落间无抗衡区) 本试验观
察到的不同营养体亲和型反应现象可细分为以下 .
类$
$
菌株间形成明显的抗衡区!抗衡区两侧产生
密集的呈带状分布的分生孢子器*
%
菌株间形成明
显抗衡区!但只在抗衡区一侧形成分生孢子器带!另
一侧菌株在抗衡区不形成分生孢子器*
&
菌株间菌
丝不融合或者极少融合!有抗衡区!但分界线两侧无
分生孢子器形成)
在所观察到的对峙培养反应中!不亲和占大多
数!亲和的占组合总数的 $*2%"3!其中!北京菌株
之间亲和的比例最高!达 &&2#(3*湖北菌株之间亲
和的比例为 (2*)3*陕西菌株之间亲和的比例为
%2#.3) 所观察到的不亲和组合中!
$
型和
%
型占
绝大部分" t(#3#)
?PBA营养体亲和型多样性比较
根据上述判断菌株间是否亲和的标准!分别对
湖北大老岭陕西安康以及北京周边县区的栗疫菌
营养体亲和型多样性进行统计!所用标准为香农维
那多样性指数+$., $
,cU
!
Y=L=Y=
式中$Y=为该群体内某一亲和型菌株所占比例)
根据上述公式!统计湖北大老岭陕西安康以及
北京周边县区三地栗疫菌营养体亲和型香农维那
多样性指数"表 $#) 此外!具体的营养体亲和型分
布在表 $ 中有所体现)
对此三地栗疫菌菌株营养体亲和型香农维那
多样性指数平均值做多重比较"邓肯比较#!结果表
明$在
#
c#2#$ 的水平下!湖北陕西菌株营养体亲
和型香农维那多样性指数平均值"湖北为 $2.&!陕
西为 $2/&#都与北京菌株营养体亲和型香农维那多
样性指数平均值"##差异极显著!而湖北菌株与陕
西菌株营养体亲和型香农维那多样性指数平均值
之间差异不显著)
选取的来自三地的 $* 个菌株 [7:$("R7J$&)
"来源北京#!_.$_$(_$$"来源湖北#及 %F.)F
/$F$$$F $$*F $&.F $%)F $*)F $/%F $)"F 和
$(*F"来源陕西#!两两进行的对峙培养实验结果表
明这 $* 个菌株属于 $* 个不同的dG[)
此外!试验结果显示$在北京周边!不同板栗栽
培区的栗疫菌一般属于不同营养体亲和型!但是有
些不同的栽培区的菌株具有同样的营养体亲和型!
如代表菌株为来源于密云区不老屯镇大窝铺村的
-MK"#. 的营养体亲和组!还包含o]"%/\]"/$ 等来
自昌平延庆的菌株)
?PCA栗疫菌交配型的_G5扩增及分子检测
交配型 _G5扩增结果表明$在 _9?E89H_G5扩
增试验中!1,0$ 型1,0" 型特异性引物结合菌
株 -Z,模板获得的 _G5产物分别约是 "2"$2)
QN的片段*在 Z67>6D _G5扩增试验中!1,0$ 型
1,0" 型特异性引物结合 _9?E89H_G5产物 -Z,
模板获得的 _G5产物分别约是 $2*#2* QN 的片
段!这和 18998+$$, 1:[@?96等+$&,的研究吻合) 部
分菌株 _9?E89H_G5以及 Z67>6D _G5扩增结果见
图 $"左为 _9?E89H_G5产物电泳结果!右为 Z67>6D
_G5产物电泳结果#)
由图 $ 左显示$用 _9?E89H_G5及其配套引物
即可将 1,0$ 与 1,0" 型菌株区分开来!但有一
些菌株!用 _9?E89H_G5及其某一交配型配套引物
扩增后电泳有目的条带!而用另一交配型配套引物
)#*
第 % 期 潘!琪等$栗疫菌营养体亲和型多样性比较及野生栗栗疫菌交配型的分子检测
扩增后电泳无目的条带!但用无目的条带产生的
_G5扩增产物作为模板再加以相反交配型的 Z67
>6D _G5配套引物后!也能出现该 Z67>6D _G5引物
扩增目的条带) 这一现象和 18998+$$,的研究相一
致!在排除其余如污染因素等的前提下!推测可能
为同一野生栗栗疫菌单病斑菌株同时具有 " 种交
配型基因"表 "#)
!!左图泳道"_9?E89H_G5#$$ . 分别为 K."*"F$."F"1,0$ 型#*& * 分别为 K((*F$$$F"1,0" 型#*/ 为阳性对照 $
"1,0$ 型#!) 为阳性对照 ""1,0" 型#!( 为阴性对照) 右图泳道"Z67>6D _G5#$$ . 分别为 K$*)#F$*)F"1,0$ 型#*&
* 分别为 K$$%)F$))F"1,0" 型#*/ 为阳性对照 $"1,0$ 型#!) 为阳性对照 ""1,0" 型#!( 为阴性对照) 1$-e"### e8DD69
图 $!部分野生栗栗疫菌菌株的_G5扩增电泳图
表 ?A湖北%陕西野生栗交配型基因片段R69扩增结果
来源
菌株数
a株
1,0$ 型 1,0" 型 1,0$ 型a1,0" 型
1,0$$1,0"
分离比
湖北 $/
_.""共 $ 个#
_$!_"!_/!_(!_"&!_"%!_"*!
_")!_.#!_./!_o&!_o*!_j$
"共 $. 个#
_$%!_$*!_j&"共 . 个#
$ $^.
陕西
!
.% *"F!$."F!$*.F
"共 . 个#
!
.(F!&$F!%%F!/$F!(*F! $$$F!
$/%F!$))F"共 ) 个#
!
""F!"%F! %#F! *$F! /&F! )#F! )$F! )&F! (.F! (%F!
$#&F! $#/F! $$"F! $$)F! $"#F! $.%F! $.*F! $.(F!
$%)F! $*/F!$*)F!$/(F!$)$F! $)"F"共 "& 个#
. )^
!
两地的野生栗栗疫菌群里均发现了同时具有 "
种交配型的菌株!湖北的比例为 $/2*%3!陕西的比
例为 *)2%/3) 由于选取的是单病斑分离的原始菌
株!故不能确定出现 " 种交配型基因的菌株是由于
本身是异核"同一菌株同时具有 " 种相反的交配型#
菌株还是同一病斑分离的菌株含有不同交配型的多
来源混合体菌株!但陕西来源的此种野生栗栗疫菌
株的比例显然大于湖北来源的野生栗栗疫菌菌株!
这也许能部分解释为何陕西菌株的香农维那多样
性指数大于湖北)
.!结论与讨论
本研究结果表明$我国栗疫菌存在着广泛的营
养体亲和型!其中!湖北大老岭地区以及陕西安康野
生栗栗疫菌的营养体亲和型多样性比北京周边县区
的栽培板栗栗疫菌的营养体亲和型多样性高) 通过
进一步的营养体亲和型分析发现$分离自上述两地
同一株树上不相连病斑的栗疫菌均属于不同的营养
体亲和型!这说明即使在同一株栗树上!不同病斑病
菌来源也可能不同) 此外!对北京地区菌株的观察
表明!同一栽培地块的栗疫菌营养体亲和型基本一
致!而不同栽培地块的栗疫菌营养体亲和型一般
不同)
关于北京地区栗疫菌营养体亲和型相对较少的
问题!可能有以下几方面解释$第一!由于北京周边
特定栽培区的板栗苗来源一致!致使带菌情况相同*
第二!在栽培过程中!果农会有意识的淘汰一些患有
栗疫病的病树!从而造成随树携带的栗疫菌的损失*
第三!在北京周边地区采集及在实验室分离栗疫菌
时未观察到有子囊壳的存在!分析认为栗疫菌有性
生殖在北京的气候条件下不常见!也就无法造成
dG[的数量增长) 之所以存在不同栽培区的栗疫
(#*
林!业!科!学!研!究 第 "% 卷
菌有相同的dG[现象!可能是因为不同栽培区之间
存在种质资源的交流!或者病菌易于传播的结果!当
然这些都有待于进一步的研究) 针对北京地区栗疫
菌营养体亲和型整体数量较多而局部数量少这一特
点!在局部范围内利用栗疫菌弱毒菌株控制栗疫病
是一个合理的手段)
本文还分别随机选取了湖北陕西和北京来自
不同子群体的共计 $* 个菌株进行对峙培养实验!结
果这 $* 个菌株分属 $* 个不同的营养体亲和型) 这
一统计结果说明!北京地区的栗疫菌营养体亲和型
多样性虽然较低!但类型却与湖北陕西等地栗疫菌
的营养体亲和型并不相同)
在我国!针对不同地区栗疫菌的营养体亲和型
已开展过一些研究!王克荣等+*,对苏皖板栗产区栗
疫菌的营养体亲和型调查发现!其栗疫菌营养体亲
和型种类丰富!"$( 个菌株分属 $.$ 个营养体亲和
型!平均 $ 个dG[含 $2*/ 个菌株*而罗正均等+$%,采
取同样方法对湘渝栗疫菌的营养体亲和型进行调
查!%* 个菌株可分为 .# 个 dG[7!平均 $ 个 dG[含
$P)/ 个菌株) e?@ 等+$*,对中国大陆东部三省栗疫
菌和日本栗疫菌的dG[多样性做一小结!发现在中
国东部局部地区和日本!几乎每一个菌株就属于一
个唯一的dG[) 本试验中!湖北陕西各个栗疫菌子
群体中营养体亲和型多样性较大"湖北菌株各个子
群体中含菌株数最多的 dG[所含菌株数为 .!大部
分dG[只含 $ 个菌株*陕西菌株各个子群体中含菌
株数最多的dG[所含菌株数为 %!且只有一个!大部
分dG[只含 $ 个菌株#) 上述数据均可表明!我国
野生栗栗疫菌的营养体亲和型多样性程度高)
在应用方面!关于栗疫病营养体亲和型的研究
主要是寻求一些特殊的菌株!这些菌株细胞中含有
弱毒力因子 D75Z,!通过与属于同一dG[的强毒力
菌株菌丝融合传播 D75Z,!使得被传播的菌株也变
成低毒力菌株从而防治栗疫病) 在这一系列研究当
中!,=8J=A7>8Q?7+$/,于 "# 世纪 /# 年代首次在国际上
报道栗疫菌的营养体亲和性反应现象!将栗疫菌不
亲和反应类型分为 " 种"即本文中的
$
型和
&
型#!
并将这 " 种类型分别称为强不亲和性和弱不亲和
性) 王克荣等+/,根据自己研究结果!对 ,=8J=A7>8Q?7
的结论进一步发展和完备!认为栗疫菌营养体不亲
和性可细分为 . 种!即本实验所出现的 . 种营养体
不亲和类型!并认为除了同一dG[的菌株之间能进
行低毒力传递转移之外!弱不亲和的菌株间也有可
能出现该过程) 本试验结果中的
$
型和
%
型属于强
不亲和性!且比例很大!依据王克荣的结论!可判断
我国野生栗栗疫菌在自然条件下进行低毒力传递
转移的难度较大)
另外!1898+$$,与 1:[@?96+$&,的研究表明!栗疫
菌中存在 " 种交配型!并且部分栗疫菌菌株具有异
核"同一菌株同时具有 " 种相反的交配型#现象!本
实验中也证明了这点$通过_9?E89H_G5以及Z67>6D
_G5的联用!在湖北大老岭和陕西安康野生栗栗疫
菌群体以及部分子群体中!均既发现了只有 $ 个交
配型的菌株!也发现了同时具有 " 种交配型的菌株)
在影响栗疫菌营养体亲和型多寡的诸多因素
中!不同营养体亲和型的异交配型菌株之间的有性
生殖过程是造成栗疫菌营养体亲和型数量增多的一
个主要因素*虽然外来菌株的引入也是主要因素之
一!甚至是某些栽培果园里可能的唯一因素!但是在
湖北和陕西采样地点!由于野生栗林受人为影响很
小!故可忽略由于菌株的引入造成dG[数量较多的
可能性) 因此!不同dG[的异交配型栗疫菌菌株分
别在湖北陕西两地区的同一地方共存有特殊的意
义!这使得栗疫菌进行有性杂交的内在因素已经具
备!一旦外部条件适合!这些不同交配型菌株之间
双交配型菌株和单一交配型菌株之间!乃至不同双
交配型菌株之间都有可能发生有性杂交!这在增加
了野生栗栗疫菌遗传多样性的同时!也不可避免的
使其dG[的数量增加+/!$), !而该过程也是使湖北及
陕西栗疫病菌营养体亲和型多样性较大的成因!而
在采样及分离过程中!能够观察到栗疫菌子囊存在
也佐证了这一点) 笔者还可推断出此两地栗疫菌营
养体亲和型数目有进一步增多的趋势*至于双交配
型菌株是如何产生!且为什么在陕西安康地区的比
例如此之大!这可能涉及到单病斑菌系来源!也可能
涉及到栗疫病菌其他复杂的遗传机制!这都需要进
一步的研究)
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7?78=D 76LB?=J?= +#H@*"0$)&#=( @(#(%=&=)( +R,PC@=J8L[6=6>?:7
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K8>?N?L?>H>HK67?= +#H@*"0$)&#=( @(#(%=&=)( ?= R8K8= 8=D G;?=8+R,P
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