全 文 ：林业科学研究　2008, 21 (1) : 122～125
Forest Research
　　文章编号 : 100121498 (2008) 0120122204
草地早熟禾耐盐愈伤组织筛选的适宜
NaCl浓度和继代次数研究
李银凤 , 孙振元 , 韩 　蕾 , 刘彩霞
(中国林业科学研究院林业研究所 ,北京 100091)
关键词 :草地早熟禾 ;愈伤组织 ;耐盐 ;继代培养
中图分类号 : S543 文献标识码 : A
收稿日期 : 2007204223
基金项目 : 国家“863”项目“优质、抗逆草坪草早熟禾新品种选育 (2002AA241061) ”
作者简介 : 李银凤 (1979—) ,女 ,河南信阳人 ,硕士研究生 ,主要从事草坪草组织培养技术研究.
通讯作者 : 孙振元 , Email: sunzy@263. net
Study on the NaC l Concen tra tion and Subculture T im es of
Bluegra ss Sa lt2toleran t Ca llus Selection
L I Yin2feng, SUN Zhen2yuan, HAN Lei, L IU Cai2xia
(Research Institute of Forestry, CAF, Beijing　100091, China)
Abstract: The calluses induced from bluegrass seeds were treated with different concentrations of NaCl to test their
survival rate and quality. The results showed that the suitable concentration was 15 g·L - 1 for NaCl2tolerant callus
selecting. The analysis of survival rate and growth of callus showed that the most op timal subculture timeswere 6 for
NaCl2tolerant callus induction of bluegrass under the suitable NaCl concentration. NaCl2tolerant stability test p roved
that the gained bluegrass callus had steady NaCl2tolerance.
Key words: bluegrass; callus; NaCl2tolerant; subculture
草地早熟禾 ( Poa pra tensis L. )是禾本科早熟禾
属多年生草本植物 ,是我国北方地区应用最广泛的
冷季型草坪草。近年来 ,由于土壤的盐化问题日益
严重 ,培育耐盐的草地早熟禾品种显得尤为重要。
体细胞无性系变异是来源于已经存在的细胞变异和
培养过程中诱导的变异 [ 1 ]。变异的诱导与选择为提
高植物的耐盐性提供了一条有效的途径。通过在富
含 NaCl或其它盐的培养基上选择 ,已经在许多植
物 ,如苜蓿 (M edicago sa tiva L inn. ) [ 2 ]、水稻 (O ryza
sa tive L. ) [ 3 ]、高粱属 ( Sorghum Moench ) [ 4 ]、玉米
( Zea m ays L. ) [ 5 ]上获得了耐盐培养细胞系。有关
草地早熟禾耐盐突变体的诱导与筛选尚未见报导。
Nabors等 [ 6 ]对烟草耐盐离体筛选的研究认为 ,
在盐胁迫条件下能否产生耐盐突变体与添加盐的质
量浓度和筛选时间有关。在低水平选择压力下有利
于形成生理适应性细胞 ,但不利于突变细胞的产生。
选择压力必须大到足以抑制绝大多数细胞分裂和生
长的程度 ,正常细胞几乎不能生长、分裂的情况下才
有可能筛选出突变的细胞。因此 ,本实验以草地早
熟禾种子为材料诱导愈伤组织 ,研究了在继代培养
过程中不同浓度 NaCl胁迫对愈伤组织成活率和质
量的影响 ,以选择草地早熟禾耐 NaCl愈伤组织的适
宜浓度 ;在适宜盐浓度下通过多次继代培养 ,确定草
地早熟禾耐盐愈伤组织筛选的最佳继代次数。以期
获得真正的耐盐愈伤组织 ,为草地早熟禾通过离体
诱变筛选抗盐品种奠定基础。
第 1期 李银凤等 :草地早熟禾耐盐愈伤组织筛选的适宜 NaCl浓度和继代次数研究
1　材料与方法
1. 1　草地早熟禾愈伤组织诱导与增殖培养
取草地早熟禾纳苏 ( Poa pra tensis L.‘Nassau’)
种子 ,流水冲洗 8～12 h,用 70%的酒精消毒 30 s,无
菌水冲洗 3次 , 1 g·L - 1 HgCl2溶液消毒 8 m in,无菌
水冲洗 5次。将种子横切后接种于诱导培养基 (MS
基本培养基每升附加 3 mg 2, 42D、2 mg CuSO4、0. 05
mgTDZ、300 mg CH 、30 g蔗糖、7. 0 g琼脂 , pH值 5.
8)中诱导愈伤组织 ;接种 40 d后 ,选取生长状态一
致的淡黄色、颗粒状愈伤组织转入继代培养基 (MS
基本培养基每升附加 2 mg 2, 42D、1 mg CuSO4、0. 25
mgTDZ、30 g蔗糖、7. 0 g琼脂 , pH值 5. 8)中 ,于 (26
±2) ℃的条件下暗培养 , 30 d继代 1次 ,连续继代 3
次 ,使其大量增殖。
1. 2　不同浓度 NaC l对愈伤组织的胁迫处理
将以上继代 3次的愈伤组织切成 0. 5 cm3左右
的小块分别接种到 NaCl浓度为 0、5、10、15、20 g·
L - 1的继代培养基中 , 10块 ·皿 - 1 ,重复 8次 ,于 ( 26
±2) ℃的条件下暗培养。30 d后 ,统计愈伤组织的
成活率。
愈伤组织成活率 = (成活愈伤组织块 /接种愈伤
组织块 ) ×100%
1. 3　耐 NaC l愈伤组织最佳继代次数的确定
将以上继代 3次的愈伤组织切成 0. 5 cm3小块接
种到含适宜 NaCl浓度 (15 g·L - 1 )的继代培养基中 ,
10块·皿 - 1 ,重复 20次 ,于 (26 ±2) ℃的条件下暗培
养。30 d继代 1次 ,每次继代前随机选取 10块愈伤
组织称鲜质量 ,继代后从中取 5块成活的愈伤组织称
鲜质量 ,统计愈伤组织生长量 ,并记录其生长状态。
愈伤组织生长量 =继代后愈伤组织鲜质量 - 继
代前愈伤组织的鲜质量
1. 4　耐盐愈伤组织稳定性鉴定
将在 NaCl浓度为 15 g·L - 1的继代培养基上继
代 6次后稳定生长的愈伤组织 ,转移到不含 NaCl的
培养基上 ,于 (26 ±2) ℃的条件下暗培养 ,每 30 d继
代 1次 ,连续继代 3次 ,再回到 NaCl浓度为 15 g·
L - 1的继代培养基上培养 ,检验其耐盐稳定性。
2　结果与分析
2. 1　不同浓度 NaC l胁迫对愈伤组织成活率的影响
在不同浓度 NaCl的继代培养基中愈伤组织的
成活率和生长状况如图 1、2。随着 NaCl浓度的增
加 ,愈伤组织的成活率逐渐降低 ,在不加 NaCl的培
养基中愈伤组织为淡黄色、颗粒状、生长较快 ,成活
率为 100% ; NaCl浓度为 15 g·L - 1时 ,愈伤组织为
淡黄色、颗粒状、生长较慢 ,成活率为 60. 3% ; NaCl
浓度为 20 g·L - 1时 ,愈伤组织变黄、粘稠状 ,基本上
停止生长 ,无再生能力 ,成活率为 30. 9%。这表明
NaCl浓度在 15 g·L - 1时 ,达到或接近愈伤组织最
大耐受范围 , 是耐盐愈伤组织筛选的适宜 NaCl
浓度。
图 1　不同 NaCl浓度胁迫对愈伤组织成活率的影响
2. 2　NaC l胁迫条件下继代次数对愈伤组织的影响
在 NaCL浓度为 15 g·L - 1的继代培养基上 ,继
代次数对愈伤组织的生长量和成活率有明显影响
(图 3、4) ,随着继代次数的增加 ,愈伤组织的生长量
逐渐增加 ,成活率也逐渐提高。当继代到第 6次时 ,
草地早熟禾愈伤组织的生长量和成活率都基本趋于
稳定 ,且仍保持淡黄色、颗粒状。
2. 3　耐盐愈伤组织稳定性鉴定
在 NaCl浓度为 15 g·L - 1的继代培养基中继代
6次后稳定生长的愈伤组织转接到不加 NaCl的继
代培养基中再继代 3次后 ,转到 NaCl浓度为 15 g·
L - 1的继代培养基中愈伤组织仍为淡黄色、颗粒状 ,
长势良好 ,成活率 100% ,且具有一定的分化能力
(图 2: F)。这表明所获得的耐 15 g·L - 1 NaCl草地
早熟禾愈伤组织在不含 NaCl的培养基中再继代 3
次后 ,仍保持其耐盐的能力 ,具有稳定的耐盐性。
3　结论与讨论
获得耐盐愈伤组织一般有 2种方法 ,一是将外
植体直接接种到含盐培养基上诱导耐盐愈伤组织 ,
二是将愈伤组织转移到盐质量浓度恒定或逐次递增
的培养基上通过多次继代 ,选出稳定生长的愈伤组
织 [ 7 - 9 ]。作者用这 2种方法都做了研究 ,发现通过
第 1种方法在诱导培养基中加入不同浓度的 NaCl
对愈伤组织的诱导有明显抑制作用 ;随着培养基中
321
林 　业 　科 　学 　研 　究 第 21卷
图 2　不同 NaCl浓度对草地早熟禾种子愈伤组织生长状况的影响
A: NaCl浓度为 0g·L - 1 ; B: NaCl浓度为 5g·L - 1 ; C: NaCl浓度为 10 g·L - 1 ;
D NaCl浓度为 15g·L - 1 ; E: NaCl浓度为 20g·L - 1 ; F:耐盐愈伤组织的分化情况
图 3　继代次数对愈伤组织生长量的影响
图 4　继代次数对愈伤组织成活率的影响
NaCl浓度的不断上升 ,愈伤组织的诱导率明显降
低 ,当培养基中 NaCl浓度为 10 g·L - 1时 ,所诱导出
的愈伤组织基部粘稠状、生长缓慢 ,其诱导率仅为
215% ; 12 g·L - 1时 ,诱导率为 0。通过第 1种方法
没有得到草地早熟禾耐盐愈伤组织。
张建华等 [ 10 ]在番茄耐盐体细胞变异体的离体
筛选时 ,通过在培养基中分别附加 225、300 mmol·
L - 1的 NaCl直接高盐筛选 ,获得了耐盐的番茄植株 ,
并且发现经过系列 NaCl浓度胁迫筛选到的耐盐植
株大多属生理适应性 ,直接高盐胁迫下筛选到的耐
盐植株才有可能成为真正的耐盐突变体。因此 ,本
文作者通过在继代培养基中添加不同浓度 NaCl,研
究了培养基中 NaCl含量对愈伤组织的成活率和生
长状态的影响 ,发现 NaCl浓度为 15 g·L - 1时 ,达到
或接近草地早熟禾愈伤组织最大耐受范围 ,选择效
果好 ;在 NaCl浓度为 15 g·L - 1的继代培养基中连
续继代筛选 6次后 ,愈伤组织的生长量和存活率已
基本趋于稳定 ,是草地早熟禾耐盐突变体筛选较为
适宜的继代次数。继续继代培养会使愈伤组织的变
异频率增加 ,影响愈伤组织的分化。
耐盐性鉴定结果也表明 ,所获得草地早熟禾耐
盐愈伤组织变异体能保持稳定的耐盐性 ,但耐盐稳
定性检验是一个长期的过程 ,要经过大田实际检验
才能进一步验证 ,本研究的检验只是证明了在一定
的时间内选择出的草地早熟禾耐盐愈伤组织的耐盐
能力在细胞水平上能够稳定保持 ,对由此诱导出的
再生植株的耐盐能力是否能够稳定保持 ,还有待做
进一步的探讨。草地早熟禾品种纳苏的无融合生殖
率达 95%以上 ,其母体获得的某种抗性不会因为在
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第 1期 李银凤等 :草地早熟禾耐盐愈伤组织筛选的适宜 NaCl浓度和继代次数研究
繁殖过程中丧失 ,故能保持较长的时间 ,因此在草地
早熟禾上进行耐盐变异体的筛选是很有意义的 ,并
为进一步在大田耐盐变异体的验证及筛选奠定了
基础。
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