全 文 ：林业科学研究!"#$%!"&"$#$#"* #%%
!"#$%&$%$(#)*
!!文章编号!$##$($)*+""#$%##$(##"*(#-
6%1!J/L?=A 的人工 J/1.)L-8植物表达载体的
构建及遗传转化!
谢丽华! 蒋!晶! 刘明英! 乔桂荣! 邱文敏! 杨惠琴! 卓仁英!!
"中国林业科学研究院亚热带林业研究所!浙江 富阳!%$$)###
收稿日期$ "#$"(#-("+
基金项目$ 浙江省科技厅重大专项(重要生态经济树种转基因平台建立及耐盐转基因研究)""#$#2$"#$##%浙江省自然科学基金项目
"%#*"%)##
作者简介$ 谢丽华"$*+-,#!女!河南三门峡人!硕士研究生!主要从事植物分子生物学研究V
!
Q=;%## 质粒b/<由浙江省农业科学院王伏林博士赠送!特此致谢V谢丽华&蒋晶对本文贡献相同V
!!
通讯作者$卓仁英!研究员!从事林木抗逆分子生物学研究V](K3DP$ YBEF@Ih6K3DPVAFKV
摘要!Q9AUKD="$% 是在构建盐胁迫条件下青杨 KDA@F=/<文库中发现的!预测其靶基因为 N+T)&@@"3&蛋白激酶
等!其中5gL家族与植物的耐盐性密切相关 为了探索 Q9A(KD="$% 在植物盐碱胁迫应答方面的作用!实验构建了
植物表达载体 Q2<5"%##(3KD"$%!经根癌农杆菌 ]N<$#- 介导转化拟南芥!成功获得转基因植株 =O(72=分析表
明3KD="$% 在转基因拟南芥中能够超量表达 本研究为分析 Q9A(KD="$% 及其靶基因参与植物盐碱胁迫应答奠定了
基础
关键词!3KD=/<%拟南芥%花序浸染%盐胁迫
中图分类号!;$+V)& 文献标识码!<
0)*:%.&1%/)*)48.%/4/1/72J/L-8)46%1!J/L"$% GW6.,::/)*N,1%).7*
X.7*:4).J7%/)*/*%) 8+(*$-9.$.:2(;$(/(
<:A901*2(! S:,-.S045! 9:=N0451?045! >:,8.201#"45! >:=Q$41L04! +,-.D201;04! BD=8$41?045
"=>?>3@AB .C?9D9E9>FG;ES9@FQDA3PHF@>?9@I! 2BDC>?>
89:%.71%$ OB>Q9A(KD="$% R3?DJ>C9DGD>J G@FK@"G2H2%)(&*(?(4( SIKDA@F=/
GD@K>J 9B399B>Q9A(KD="$% D?DCJEA>J SI?3P9?9@>??VOB>QE939DT>93@6>9?3@>N+T)! @@"33CJ Q@F9>DC :DC3?>! DC
RBDAB 5gLK3IQP3I3C DKQF@93C9@FP>DC @>?QFC?>9F?3P9?9@>??VOFDCT>?9D639>9B>GECA9DFC FGQ9A(KD="$%! 9B>3@(
9DGDAD3PKD=/<"$% >WQ@>??DFC T>A9F@R3?AFC?9@EA9>J 3CJ 9@3C?GF@K>J DC9F,#(J06"G%0%&*(H0(4(VOB>9@3C?6>CDA
QP3C9?R>@>AFCGD@K>J SI72=3CJ =O(72=VOB>@>?EP9??BFR>J 9B393KD=/<9@3C?A@DQ9P>T>PR3?K3@:>JPIDK(
Q@FT>J DC 9@3C?6>CDAQP3C9AFKQ3@>J RD9B CFC(9@3C?6>CDAQP3C9?V
;,( <).:$ 3KD=/<% ,#(J06"G%0%&*(H0(4(% GPF@3PJDQ K>9BFJ% ?3P9?9@>??
KDA@F=/<"简称 KD=/<#是一类在真核生物中
广泛存在的长度约 "$ C9的非编码单链 =/<分子!
KD=/<能够降解靶基因 K=/<或抑制靶基因的翻
译!从而调节基因表达 越来越多的研究表明其在
基因表达&生长发育&抵抗胁迫等方面起着至关重要
的作用 第一个克隆到的 KD=/<是由 Z>>等*$+于
$**% 年在秀丽隐杆线虫"3F$H$5(4%#中发现的!"##"
年ZP3T>等*"+ &=>DCB3@9*%+等发现植物中也存在 KD=(
/<
盐害是影响作物生长发育的重要非生物胁迫之
一 研究发现KD=/<参与植物盐碱胁迫应答!影响
植物耐盐性的形成 mB3F等*)+对水稻"8#?C( %(&0E(
林!业!科!学!研!究 第 "& 卷
ZDCCV#KD=/<$&* 家族进行分析显示!KD=($&* 能够
选择性地清除 ?`#%6"*&#! ?`#%6"*&# 是 22<
等*-+的研究发现拟南芥 ",#(J06"G%0%&*(H0(4(# 的
KD=%*% 和KD=%* 在高盐处理后表达量显著提高!
导致 Z<2?和 24L%K=/<表达水平下降!并且转
KD=%* 基因的拟南芥耐盐性提高 并不是全部响
应盐胁迫的KD=/<都与植物对盐的耐受性成正相
关!83F等*&+的研究显示超表达"%(1N:%*&)导致水
稻和拟南芥的耐盐能力的降低!cEC6等*+和鲍乾
等*++分别以拟南芥和盐穗木"D(H"%&()*?%)(%G0)( 2V
行了研究!表明在盐胁迫条件 <9KD=/<)$ 和 NA(
KD=)$ 的表达对种子萌发和幼苗存活具有负调控
作用
青杨"@"G2H2%)(&*(?(4( =>BJV#产于我国东北&
华北&西北和西南各省区!生长在海拔 +## % "##
K的沟谷&山麓&溪边!具有耐干旱&生长快&萌蘖性
强的特性!但不耐盐碱 Q9A(KD="$% 是本实验室周
婧等**+在构建盐胁迫条件下青杨的小 =/<文库得
到的!通过生物信息学分析发现 Q9A(KD="$% 的靶基
因为N+T)&@@"3&蛋白激酶等!其中5gL家族与盐
胁迫响应密切相关!X=O(72=分析表明 Q9A(KD="$%
在盐胁迫"$## KKFP-ZU$/32P#" B 后表达量明显
提高!且其表达具有叶的组织特异性 本试验利用
青杨 Q9A(KD="$% 序列和载体 Q=;%## "含有拟南芥
KD=%$* 前体#构建了 3KD=/<的植物表达载体!经
=O(72=鉴定得到了转基因拟南芥!该研究为进一步
了解 Q9A(KD="$% 及其靶基因的功能奠定了基础
$!材料与方法
=V=>植物材料$菌株和载体
野生型拟南芥"2FP(##&大肠杆菌"bN-
$
#&根癌
农杆菌"]N<$#-#&植物表达载体 Q2<5"%##(%-;(
A`?均由本实验室保存$Q=;%## 质粒由浙江省农业
科学院王伏林博士赠送%Q8]5(O]3?I载体购自美
国7@FK>63公司
=V?>酶和主要试剂
9,M(;高保真聚合酶&#M(;b/<聚合酶&限制
性内切酶 ZG4 .和 T(LD.购自宝生物工程"大连#
有限公司!O) b/<连接酶购自美国 7@FK>63公司!
=/<提取试剂盒购自加拿大 /F@6@>C 公司!KD=/<
Ab/<4D9购自北京康为世纪生物科技有限公司!
b/<凝胶回收试剂盒&质粒提取试剂盒&抗生素等
购自上海生工生物工程有限公司!引物由北京世纪
奥科生物技术有限公司合成%其他试剂为国产分
析纯
=VA>引物设计
根据青杨 KD=/<("$% 序列!登陆 k5b% "k>S
5DA@F=/?D6C>@!B9Q$__RKJ%VR>D6>PRF@PJVF@6#!
设计相应的3KD=/<前体的扩增引物
!
"表 $#
前端<引物和末端L引物采用 ;ABR3S等*$#+给出的
序列"表 $#
表 =>引物序列
项目 引物序列"-\(%\#
载体构建
!
63996666A93A3333A3AA939A9A9A996939AA
"
63936696996936AAAA3339A333636339A33963
#
6393369699693AAAAA339A3A3669A69639396
63396666693A3333A3A939A93A39393939AA9
< A96A3366A6393369666933A
L 6A663933A3399A3A3A366333A36
72=鉴定& "$%
"
63936696996936AAAA3339A333636339A33963
3KD=/<表达 "$%
#
6393369699693AAAAA339A3A3669A69639396
内参 -,+;(H A9A66A9A9A6A39A63963
-,+;(= 363A696AAA9A63AA3363
=VD>表达载体的构建
参照 ;ABR3S等的方法*$#+ !首先使用所设计的 &
条引物和 9,M(;聚合酶!以 Q=;%## 质粒为模板扩
增3&S和A片段!凝胶回收!其次用3&S 和 A片段采
用重叠72=的方法获得3KD=/<的前体片段 该片
段经电泳&切胶回收后与 Q8]5(O]3?I载体连接!热
激转化bN-
$
得到重组克隆!命名为 Q8]5(3KD"$%!
用菌液72=和双酶切鉴定!将阳性克隆送上海生工
生物工程有限公司测序 ZG4 .和 T(LD.双酶切
Q8]5(3KD"$% 和 Q2<5"%##(%-;(`A?!分别回收目的
片段进行连接!连接产物转至大肠杆菌 bN-
$
!菌液
72=和双酶切鉴定!表达载体命名为 Q2<5"%##(
3KD"$%"图 $#
图 $!Q9A(KD="$% 的人工KDA@F=/<植物表达载体结构
=VE>拟南芥的转化和筛选
利用电激法将表达载体 Q2<5"%##(3KD"$% 转
入根癌农杆菌 ]N<$#- 感受态细胞!将菌液涂布于
含卡那霉素和利福平的g]7培养基上!"+ ^培养 "
#%
第 $ 期 谢丽华等$Q9A(KD="$% 的人工KDA@F=/<植物表达载体的构建及遗传转化
J!挑单克隆进行农杆菌培养!利用花序浸染法转化
野生型拟南芥 收获 O
#
代种子!将种子播种在含有
卡那霉素"-# K6-ZU$#的 $_"5; 培养基上进行筛
选!培养条件为$) ^&暗培养 " J置于 "" ^!长日照
"$& B光照!+ B黑暗#!$# J左右将筛选得到的幼苗
移栽到营养土上
=V">转基因植物的检测
拟南芥幼苗移栽到营养土 "#J 后用 2O
"
和 "$%
#
!对转基因植株进
行72=检测
=VF>转基因植株人工小6%1!J/L?=A 的表达分析
根据 =/<提取试剂盒说明书分别提取野生型
和72=阳性株系拟南芥叶片"拟南芥幼苗移栽于营
养土 "" J 后#总 =/步骤进行 KD=/<7FPI"<#加尾和修饰后的 KD=/<
Ab/<第一链合成 用 "$%
"
和 "$%
#
对 KD=/<"$%
前体进行=O(72=的扩增检测!7FPI"<#加尾的反应
体系""-
)
Z#$先加 -## C6的总=/<""
)
Z#!",-
)
Z
$# a7FPI"<#7FPIK>@3?>LEG>@!$
)
Z稀释
Z7FPI"<#7FPIK>@3?>!$*
)
ZJJN
"
!`混匀后 % ^!
$- KDC!之后取 )
)
Z7FPI"<#加尾的反应液进行第
一链的合成!反应体系""#
)
Z#$$
)
ZJ/O7?!%
)
Z
=OQ@DK>@!)
)
Z=OLEG>@!"
)
ZbOO!#,-
)
Z;EQ>@(
=O=>T>@?@O@3C?A@DQ93?>!-,-
)
ZJJN
"
!`混匀后 )"
^!-# KDC!最后 +- ^!- KDC 终止反应 取 "
)
Z的
逆转录产物进行 72=反应!"#
)
Z反应体系包含$
#,+
)
Z正向引物 "$%
"
和 #,+
)
Z反向引物 "$%
#
!
#,"
)
Z@O3X!"
)
Z$# a72=SEG>@!"
)
ZJ/O7!补
$","
)
ZJJN
"
`至 "#
)
Z!72=反应程序为 *) ^ -
KDC!*- ^ %# ?!&) ^ %# ?!" ^ %# ?!" ^ KDC!
反应进行 %- 个循环 使用 -,+;(H和 -,+;(;扩增内
参!反应体系和反应程序同上
"!结果与分析
?V=>植物表达载体608S?AYY!7J/?=A 的构建
登陆k5b% 网站!根据 Q9A(KD="$% 的序列设计
扩增 3KD=/<前体片段的
!
引物!以质粒
Q=;%## 为模板!通过巢式72=扩增出 #$SQ大小的
目标 3KD=/<的前体片段 "图 " # 将目标基因
3KD=/<的前体片段克隆到 Q8]5O(>3?I载体上!得
到重组克隆 Q8]5(3KD"$%!经菌液 72=和酶切检测
插入片段大小正确"图 %&)#!阳性克隆送上海生工
生物工程有限公司测序!结果显示插入序列完全正
确! 分 别 将 载 体 Q8]5(3KD"$% 和 表 达 载 体
Q2<5"%##(%-;(`A?用ZG4 .和T(LD.双酶切!分别
回收目的片段和载体片段进行连接!获得了植物表
达载体 Q2<5"%##(3KD"$%!经 ZG4 .和 T(LD.双酶
切检测!插入片段为 )&+SQ"图 -#!表明成功获得了
青杨 Q9A(KD="$% 的人工染色体的植物表达载体
5$b/
图 "!72=扩增人工KD=/<"$% 前体片段的电泳检测
5$b/
图 %!重组克隆 Q8]5(3KD"$% 菌液72=检测
5$b/
图 )!重组克隆 Q8]5(3KD"$% 酶切检测
5$b/
图 -!重组克隆 Q2<5"%##(3KD"$% 酶切检测
$%
林!业!科!学!研!究 第 "& 卷
?V?>转基因植株的获得
利用花序浸染法转化拟南芥!将 O
#
代拟南芥转
基因种子播种在含有卡那霉素"-# K6-ZU$#的 $_
"5;培养基上进行筛选!采用 2O
"
和 "$%
#
进行 72=检测!转基因拟南芥可以扩增
出 $ 条约 $# SQ的特异片段!表明转基因拟南芥植
株中含有目的基因"图 &#
5$b/
kO$野生型拟南芥%质粒$Q2<5"%##(3KD"$%
图 &!部分转化植株的72=检测
?VA>人工J/.L-8?=A 在转基因拟南芥中的表达
用试剂盒提取野生型和 " 个转基因株系拟南芥
叶片总 =/KD=/<7FPI"<#加尾和修饰后的KD=/
Q9A(KD="$% 前体进行检测!同时以引物 -,+;(H和
-,+;(;扩增内参 -,+;!用 $,-0的琼脂糖凝胶电泳!
结果显示转基因植株可以扩增出目的片段!而野生
型拟南芥没有扩增出目的条带!说明本实验构建的
3KD="$% 可以在拟南芥中超量表达"图 #
kO$野生型拟南芥%$ "$转基因拟南芥
图 !人工小=/<"$% 的=O(72=检测
%!结论与讨论
土壤盐渍化严重影响植物的生长发育和产量
我国盐渍化土地面积约占可耕地面积的 "-0!而不
适当的农业生产又造成了大量良田的次生盐渍化
随着人口的快速增长!世界的农林业面临着巨大的
考验!如何有效地利用盐渍化土壤发展农林业成为
亟需解决的难题 随着植物耐盐分子机理研究的深
入!利用基因工程的手段提高植物的耐盐性已经成
为有效且可行的手段 虽然利用转基因技术进行耐
盐育种已经取得了一定的进展!但植物耐盐性是一
个数量性状!涉及基因众多!通过转入单个基因的方
法很难有效地提高植物耐盐性!而在植物体内能通
过KDA@F=/<降解靶基因或抑制靶基因的翻译从而
提高植物抵抗包含盐胁迫在内的各种不利因素的耐
受性!因此利用人工小=/<实现特定基因沉默的技
术以提高植物的耐盐性也越来越受到重视
Q9A(KD="$% 是通过构建盐胁迫条件下青杨的小
=/<文库得到的!软件预测 Q9A(KD="$% 的靶基因为
N+T)&@@"3&蛋白激酶等!研究还发现盐胁迫 " B
后 Q9A(KD="$% 表达显著上调!说明该基因与盐碱胁
迫反应密切相关**+ 本实验利用人工小 =/<技术
构建的真核表达载体 Q2<5"%##(3KD"$%!转化拟南
芥后!转3KD=/<"$% 的拟南芥中3KD=/<"$% 能超量
表达!表明 Q9A(KD="$% 植物表达载体构建成功!这将
为进一步研究其在杨树"@"G2H2%?QQV#耐盐转基因
育种方面的作用奠定基础 目前在得到的转基因
O
$
代植株中发现有表型的突变!但转基因拟南芥在
盐胁迫条件下其靶基因的表达水平及各相关生理指
标和转基因的耐盐性有待后续研究
5gL转录因子可以分为 5gL="=% 型&5g(
L=$="=% 型和类5gL% 个亚家族!N+T) 属于 5g(
L="=% 型!目前关于 N+T) 的研究主要集中在冷胁
迫和干旱胁迫方面!但5gL转录因子家族的另外一
些成员"如 O37.57$*$"+ &O35gL?JE$*$%+ & ;`5gL%=(
"
*$)+
& ;`5gL"
*$-+
&O35gL%"
*$&+等#与盐胁迫的相关
性已被相继证明!且转基因植株对盐碱的耐受性显
著提高!其中mB3C6等*$-+的研究还显示小麦"M#0&0)1
2L($%&0E2LZDCCV#中 $& 个响应盐胁迫的5gL家族
的基因!在高盐胁迫下有 $) 个上调表达!" 个下调
表达!这充分证明了在植物对盐胁迫响应中!5gL
转录因子家族起重要作用
;ABR3S等*$#+设计的人工小=/<"<@9DGDAD3PKD=(
/在一些植物"如水稻*$+ &拟南芥*$+ U$*+ &毛果杨"@F
�)*")(#G( OF@Vq8@3I#
*"#+等#中的应用表明 3KD=(
/<能有效地抑制靶基因的表达 在本实验中以
Q=;%## 模板扩增 Q9A(KD="$% 的前体结构!Q=;%##
"%
第 $ 期 谢丽华等$Q9A(KD="$% 的人工KDA@F=/<植物表达载体的构建及遗传转化
中含有拟南芥前体!这使得新形成的 3KD=/<在结
构上具有拟南芥 KD=%$*3双体错配凸起的典型特
征!这种结构的相似性与能量的稳定性为 b2Z酶准
确加工 Q9A(KD="$% 前体创造了有利条件!同时 73@:
等*"#+和 4B@3DR>?B 等*"$+的研究分别证明了 Q=;%##
这个载体的高效和 3KD=/<的稳定遗传!这些特性
为 Q9A(KD="$% 功能研究奠定了基础
在人工小 =/<构建过程中要注意以下问题!
Q8]5(O载体上的 5$% f_U引物与 ;ABR3S 等给出
的<&L序列差别较小!因此在72=检测时要提高退
火温度以提高其特异性!在测序时不能使用 5$% f_
U引物!另外需重复测序验证!以保证所设计的
3KD=/<序列已正确替换 Q=;%## 的原有序列
参考文献!
*$+ Z>>=2! H>DCS3EK=Z!
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?K3P=/P! "##)! $&"+#$"##$
U"#$*
*&+ 83F7! L3Dr! g3C6Z! $&(HV T`>@(>WQ@>??DFC FG"%(1N:%*&)J>(
A@>3?>?3CJ 3P:3PD?9@>??9FP>@3CA>*c+V7P3C93!"#$#! "%$"-#$**$
U$##$
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*++ 鲍!乾! 徐!涛! 张富春V盐穗木KD=/<)$ 的克隆及对种子萌
发和幼苗成活率的影响 *c+V植物研究! "#$$! %$ ")#$)#+
U)$%
**+ mBFE c! mBEF=g! ZDE 5g! $&F(HF.J>C9DGDA39DFC 3CJ AB3@3A9>@DY3(
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*$#+ ;ABR3S =! ?`?FR?:D;! k3@9BK3CC /! $&(HVbD@>A9>J 6>C>?DP>C(
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$+"* U$+%&
*$++ 韩利慧V利用人工KDA@F=/异沉默*b+V太原$山西大学! "#$#
*$*+ 73@: k! mB3Dcr! Z>>cgVND6BPI>GDAD>C96>C>?DP>CADC6E?DC6
Q>@G>A9AFKQP>K>C93@I3@9DGDAD3PKD=/<93@6>9DC6,@$ F@B>9>@FK>@(
DA3@9DGDAD3PKD=/<93@6>9DC6,@$ 3CJ 3,9 6>C>?*c+V7P3C92>P
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