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林业科学研究　2007, 20 (6) : 872～875
Forest Research
　　文章编号 : 100121498 (2007) 0620872204
地锦叶片正丁醇提取物的抑菌作用
刘华玲 1 , 马欣荣 13 , 孙振元 2
(1. 中国科学院成都生物研究所 ,四川 成都　610041; 2. 中国林业科学研究院林业研究所 ,北京　100091)
关键词 :地锦叶片 ;正丁醇提取液 ;抑菌作用 ;最低抑菌浓度 (M IC)
中图分类号 : R282. 71 文献标识码 : A
收稿日期 : 2006210216
基金项目 : 国家“863”资助项目 (2001AA244031) ;地锦种质资源创新及优良品种培育
作者简介 : 刘华玲 (1982—) ,女 ,山东荷泽人 ,硕士研究生 ,研究方向 :分子遗传及植物资源研究.3 通讯作者 :马欣荣 : Tel: 028285252387; E2mail: maxr@cib. ac. cn
An tim icrob ia l Activ ity of n2butanol Extract
from Pa rthenoc issus tricusp ida ta L eaves
L IU Hua2ling1 , MA X in2rong13 , SUN Zhen2yuan2
(1. Chengdu Institute of B iology, Chinese Academy of Sciences, Chengdu 610041, China;
2. Research Institute of Forestry, CAF, Beijing 100091, China)
Abstract: The n2butanol extract from Pa rthenocissus tricuspida ta leaves were exam ined for antim icrobial activity a2
gainst five m icrobes by using filter paper method. The results showed that the extract restrained the growth of Esche2
rich ia coli, A grobacterium tum efaciens, B acillus subitilis and B acillus pum ilus, while inhibited the growth of yeast at a
certain extent. And the m inimum inhibitory concentrations (M IC) were 0. 25, 0. 3, 0. 25, 0. 3, 1. 0 g·mL - 1 respec2
tively. Moreover the n2butanol extract also could restrained some bacterium strains, which had antibiotic resist2
ances. After heated at 95 ℃ for 2～3 h, the n2butanol extract from P. tricuspida ta leaves still p resented strong bac2
teriostasis to germ s. This result indicated that the substance had heat2stability.
Key words: Parthenocissus tricuspida ta leaves; n2butanol extract; antim icrobial activity; m inimal inhibitory concen2
tration (M IC)
地锦 [ Pa rthenocissus tricuspida ta ( Sieb. et Zucc. )
Planch. ] ,又名爬山虎、爬墙虎、地噤、常春滕、红葡
萄藤、走游藤、枫藤、红葛、三叶茄等 ,为葡萄科 (V ita2
ceae)爬山虎属 ( Pa trhenocissus Planch. )多年生木质
落叶藤本 [ 1 ]。共有 13个种 ,我国有 10种 ,其中 1种
由北美引入栽培 [ 2 ]。地锦枝条粗壮 ,多分支 ,先端具
粘性吸盘 ,具有强大的吸附和攀缘能力 ,能牢固地吸
附在岩石、墙壁等物体向上攀缘伸展 ,因而得名爬山
虎。在没有攀附物时 ,它的茎叶在地面蔓生 ,宛如锦
被盖地 ,故又称地锦。地锦生长迅速 ,集观赏、绿化、
药用价值于一身 ,是一种具有巨大潜在开发利用价
值的优良园林绿化及药用植物。种子含油量高 ,可
达 28 % ,其中含软脂酸、硬脂酸、油酸、棕榈油酸等 ;
冠瘿中含有羧乙基赖氨酸和羧乙基鸟氨酸等重要化
工原料 [ 1～3 ]。其果实可酿酒 ,果实中含有丰富的人
体必需的微量元素 ,具有重要的生理功能、营养作用
和临床医疗意义 [ 4 ]。
传统中医认为 ,地锦的茎、根可入药 ,其味甘性
温 ,具有祛风通络 ,活血解毒等功效 ,可治产后血淤、
腹中有块、赤白带下、风湿关节痛、偏头痛等症 ;外用
可医治跌打损伤、痈疖肿毒 [ 5 ]。在朝鲜民间 ,也利用
地锦的叶片治疗关节炎、黄疸病、牙痛、神经痛等 [ 6 ]。
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第 6期 刘华玲等 :地锦叶片正丁醇提取物的抑菌作用
国外已较早展开了对地锦的研究 ,对其化学成
分、冠瘿组织生长发育以及卷须发育附着特性等多
方面进行了初步探索 [ 7～10 ]。虽然国内研究起步较
晚 ,但在爬山虎属植物资源开发利用方面取得一定
进展 [ 11, 12 ]。然而 ,目前国内外有关地锦的药理研究
及其抑菌方面的研究报道极少 [ 13 ] ,其药用价值没有
得到应有的重视。
本研究以地锦叶片干粉为材料 ,对其提取物进
行抑菌研究 ,探讨其对几种常见菌的抑制效果 ,为地
锦抑菌活性物质的开发利用提供依据。
1　材料与方法
1. 1 材料
1. 1. 1 地锦 本实验所用地锦叶片为三叶地锦
( P. tricuspida ta ) ,于 2005年 11月底采自中国科学
院成都生物研究所外墙 ,洗净 ,烘干粉碎后备用。
1. 1. 2 供试菌
革兰氏阴性菌 :
大肠杆菌 [ Escherich ia coli (M igula) Castellani et
Chalmers] 菌株 JM109,不具有抗生素抗性 ;
大肠杆菌 ( E. coli)菌株 Rosetta2gam i pLyss,具卡
那霉素、氯霉素、四环素抗性 ;
根癌农杆菌 (Ag robacterium tum efaciens Starr et
W eiss) EHA105,具利福平抗性。
革兰氏阳性菌 :
枯草芽孢杆菌 [ B acillus subitilis ( Ehrenberg)
Cohn ] WB600,不具有抗生素抗性 ;
短小芽孢杆菌 (B acillus pum ilus Meyer et Gott2
heil) BA06,不具有抗生素抗性。
真菌 :
巴斯德毕赤酵母菌 [ P ich ia pastoris ( Guillierm. )
Phaff ] X233。
1. 1. 3 培养基 细菌培养用 LB培养基 ,酵母菌培
养用 YPD培养基 [ 14 ]。
1. 1. 4 试剂 　实验试剂均为国产分析纯试剂。
1. 2 方法
1. 2. 1 地锦叶片正丁醇提取物的制备 　取地锦叶
干粉 10 g,用 15倍的 80%乙醇 (质量 :体积 )室温下
浸泡两次 ,每次 24 h,合并滤液得到叶的乙醇浸提
物。此浸提物加适量的水 ,依次经石油醚、乙酸乙酯
萃取 ,取水相 ;再经正丁醇萃取 ,取上层正丁醇萃取
液置于 95 ℃的水浴浓缩 2～3 h至 10 mL,得到地锦
叶片的正丁醇提取物 ,浓度即为 1 g·mL - 1原生药
液 (指 1 g地锦叶片干粉 ,经过提取后获得的物质 ,
全部溶于 1 mL提取液中 ,即 1 mL提取液中所含生
药量为 1 g)。置于 4 ℃冰箱保存备用。
1. 2. 2 提取物的抑菌试验 ———滤纸片法
1. 2. 2. 1 菌种活化 上述供试菌原种从 - 70 ℃冰
箱取出后 ,分别接种于适宜的新鲜培养基平板划线
培养 ,挑取单菌落分别接种于相应的 5 mL液体培养
基中扩大培养。大肠杆菌、短小芽孢杆菌、枯草芽孢
杆菌分别接种于 LB培养基中 , 37 ℃恒温培养过夜。
将农杆菌接种于 LB培养基中 , 28 ℃恒温培养过夜。
将酵母接种于 YPD培养基中 , 28 ℃恒温培养过夜。
用无菌生理盐水配制成 1 ×107 ～108 CFU·mL - 1的
菌液 ,备用。
1. 2. 2. 2 滤纸片的制备 　将新华 1号滤纸用打孔
器制成直径为 6 mm的圆片 ,经高压蒸汽灭菌后 ,分
别置于地锦叶片正丁醇提取物试液、无菌水、正丁醇
试剂中浸泡 6 h,取出晾干备用。
1. 2. 2. 3 抑菌活性测定 　滤纸片直径为 6 mm,抑
菌圈直径 > 15 mm为高度敏感、10～15 mm 为中度
敏感 , 7～9 mm 为低度敏感 [ 15, 16 ]。抑菌圈直径为 7
mm,定义为最低抑菌浓度 (M IC) ,低于 7 mm视为没
有抑菌效果。
1. 2. 2. 4 最低抑菌浓度 (M IC) 的测定 　用正
丁醇稀释地锦叶片正丁醇提取物 ,配成若干不同
的浓度 ,使含生药量分别为 1、0. 75 、0. 5、0. 3 、
0. 25、0. 1 、0. 05 g·mL - 1的药液 ,浸泡无菌滤纸
片。同时设正丁醇和无菌水作阴性对照。将各
浸泡滤纸片置于加有菌液的平板上 ,分别在供试
菌适宜条件下培养。 16 h后取出观察各菌的生
长情况 ,分别找出产生抑菌圈的被浸泡滤纸片 ,
其中的最低浓度即为最低抑菌浓度 (M IC) 。如此
重复 3次 , 取其平均值。
1. 2. 3 提取物对携抗生素抗性菌的抑制作用———
滤纸片法 取大肠杆菌菌株 Rosetta2gam i pLyss的菌
液 0. 1 mL加入冷至 50 ℃的相应培养基中 ,混合均
匀后倒板。用无菌镊子夹取浸有地锦原液 (1. 0 g·
mL - 1 )滤纸片于培养皿中 ,同时用分别浸有卡那霉
素 (50 mg·L - 1 )、氯霉素 (50 mg·L - 1 )、四环素 (50
mg·L - 1 )和正丁醇的滤纸片做空白对照。37 ℃培
养 24 h后 ,取出测量滤纸片抑菌圈的直径大小 ,看
其抑菌效果。如此重复 3次 ,取其平均值。
取根癌农杆菌 EHA105菌液 0. 1 mL加入冷至 50
℃的相应培养基中 ,混合均匀后倒板。用无菌镊子夹
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林 　业 　科 　学 　研 　究 第 20卷
取浸有地锦原液 (1. 0 g·mL - 1 )滤纸片于培养皿中 ,
同时用浸有利福平 (50 mg·L - 1 )的滤纸片做空白对
照。37 ℃培养 24 h后 ,取出测定滤纸片抑菌圈的直
径大小 ,看其抑菌效果。如此重复 3次 ,取其平均值。
2 结果与分析
2. 1 提取物的抑菌作用
滤纸片法测定抑菌作用 ,每种菌 3次重复结果 ,
均值见表 1。
表 1 地锦叶片正丁醇提取物的抑菌效果
(抑菌圈直径 , mm)
供试试剂
实验菌种
大肠
杆菌
根癌
农杆菌
枯草芽孢
杆菌
短小芽孢
杆菌 酵母菌
正丁醇提取物 14. 5 13. 1 14. 0 13. 7 7. 0
无菌水 (对照 ) / / / / /
正丁醇 (对照 ) / / / / /
　　注 :表中数据为抑菌圈直径平均值 ,其中“/”表示无抑菌圈。
由表 1中抑菌圈的大小可以看出 ,地锦叶片正
丁醇提取物对大肠杆菌、根癌农杆菌、枯草芽孢杆
菌、短小芽孢杆菌的抑菌圈直径均值都在 13～15
mm之间 ,说明 4种细菌对该提取物都达到了中度敏
感。表明正丁醇提取物对这几种革兰氏阳性和革兰
氏阴性菌均表现出良好的抑菌效果。但该提取物对
酵母菌仅有微弱抑菌作用。对照浸泡无菌水和正丁
醇的纸片无抑菌作用。
2. 2 提取物的最低抑菌浓度
取每种菌 3次重复结果 ,该提取物对大肠杆
菌、根癌农杆菌、枯草芽孢杆菌、短小芽孢杆菌及
酵母菌的最低抑菌浓度分别为 0. 25 , 0. 3 , 0. 25 ,
0. 3 , 1. 0 g·mL - 1原生药液 (表 2 ) ;随着浓度增
加 ,抑菌圈增大 ,表明抑菌能力强弱与浓度成正
相关。以对大肠杆菌 JM 109的抑制作用为例说
明 ,结果见图 1。
表 2 地锦提取物最低抑菌浓度测定结果
实验菌种 浓度 /
( g·mL - 1 )
1 0. 75 0. 5 0. 3 0. 25 0. 1 0. 05
大肠杆菌 + + + + + - -
根癌农杆菌 + + + + - - -
枯草芽孢杆菌 + + + + + - -
短小芽孢杆菌 + + + + - - -
酵母菌 + - - - - - -
　　注 :“ +、- ”表示抑菌作用的有无。
2. 3 提取物对一些抗性菌的抑制作用
对某些具有抗生素抗性的细菌 ,同样用滤纸片
以不同浓度的原生药液 ,滤纸片法测定对 E. coli
JM109的抑制作用。1～7:浓度分别为 1. 0、0. 75、
0. 5、0. 3、0. 25、0. 1、0. 05 g·mL - 1 ,
8为正丁醇 , 9为无菌水。
图 1 正丁醇提取物的抑菌作用
法 ,检测地锦叶片正丁醇提取物的作用。结果表明
地锦正丁醇提取物对某些抗性菌仍表现出同样的抑
菌效果。
大肠杆菌菌株 Rosetta2gam i pLyss同时具一定的卡
那霉素、氯霉素、四环素抗性 ,根癌农杆菌 EHA105具利
福平抗性。本实验结果表明 ,地锦叶片正丁醇提取物
对这两种菌株表现出良好的抑制作用 ,抑菌圈直径平
均值分别达到了 14. 2 mm和 13. 2 mm。结果见图 2、3。
可见 ,地锦正丁醇提取物的抑菌作用不受细菌
自身的抗性影响。
1. 地锦提取物 ; 2. 卡那霉素 ; 3. 氯霉素 ; 4. 四环素 ; 5. 正丁醇
图 2　地锦提取物对大肠杆菌 Rosetta2gam i pLyss的抑制作用
1. 地锦提取物 ; 2. 利福平
图 3　地锦提取物对根癌农杆菌 EHA105的抑制作用
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第 6期 刘华玲等 :地锦叶片正丁醇提取物的抑菌作用
2. 4 提取物的热稳定性
叶片正丁醇提取物的浓缩过程是在 95 ℃高温
下进行的 ,浓缩后仍表现出同样的抑菌作用 ,表明正
丁醇提取物的抑菌作用有较强的热稳定性。
3 讨论
随着抗生素的广泛应用 ,微生物的耐药性问题
也日趋严重 ,许多抗菌药物失效。由多重耐药菌和
许多新的病原微生物引起的感染对人类健康造成了
极大的威胁 ,因此寻求高效、低残留的天然抗菌物质
逐渐成为研究热点。本试验通过地锦提取物的体外
抑菌试验 ,确定了地锦叶片中含有抑制细菌生长的
活性物质 ,而且该物质的抑菌效果不为菌体自身的
某些抗性所影响 ,为开发利用地锦研制新一代抗菌
剂提供了理论依据。
我国地锦资源丰富 ,北起长白山 ,南至广东、广
西 ,分布广泛。因此 , 如果能将我国丰富的地锦资
源开发成抗菌药 ,既可有效地利用植物资源 ,还能带
来较高的经济效益 ,具有良好的开发前景和应用
价值。
进一步将开展地锦抑菌活性物质的纯化、结构、
性质及其在地锦中的含量研究 ,以及活性物质的作
用机制研究 ,以期为地锦资源综合开发利用打下
基础。
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