全 文 ：林业科学研究摇 圆园员源袁圆苑渊远冤院苑愿远 苑怨猿
云燥则藻泽贼 砸藻泽藻葬则糟澡
摇 摇 文章编号院员园园员鄄员源怨愿渊圆园员源冤园远鄄园苑愿远鄄园愿
泡桐丛枝植原体胸苷酸激酶的原核表达尧
纯化及酶活性测定
宋传生员袁 胡佳续圆袁 林彩丽员袁 任争光员袁 耿显胜猿袁 田国忠员鄢
渊员援中国林业科学研究院森林生态环境与保护研究所袁国家林业局森林保护学重点实验室袁 北京摇 员园园园怨员曰
圆援天津出入境检验检疫局袁 天津摇 猿园园源缘苑曰 猿援中国林业科学研究院亚热带林业研究所袁 浙江 富阳摇 猿员员源园园冤
收稿日期院 圆园员源鄄园猿鄄员员
基金项目院 国家自然科学基金渊猿园愿苑圆园圆缘 和 猿员员苑园远园圆冤
作者简介院 宋传生渊员怨愿源要冤袁男袁在读博士研究生袁研究方向为分子植物病理遥 耘鄄皂葬蚤造院泽糟泽泽泽赠岳 员远猿郾 糟燥皂
鄢 通讯作者院 博士袁研究员遥 耘鄄皂葬蚤造院贼蚤葬灶早扎岳 糟葬枣郾 葬糟郾 糟灶
摘要院胸苷酸激酶是 凿栽栽孕从头合成和补救途径的关键酶袁催化 凿栽酝孕形成 凿栽阅孕袁在 阅晕粤复制和生物的生存中发挥
着必不可少的作用遥 本文在前期研究的基础上袁对从泡桐丛枝渊孕葬宰月冤植原体中获得的的 猿 个同源蛋白 栽酝运鄄葬鄄员尧
栽酝运鄄葬鄄圆 及 栽酝运鄄遭与已报道的小麦蓝矮渊宰月阅冤尧洋葱黄化渊韵再鄄宰冤植原体的 栽酝运鄄葬尧栽酝运鄄遭的氨基酸序列进行了比
对和相似性分析袁结果显示 孕葬宰月孕杂 栽酝运鄄遭 与 宰月阅 栽酝运鄄圆 和 韵再鄄宰 栽酝运鄄遭 之间的相似性分别为 怨缘郾 远缘豫 和
怨怨郾 园猿豫 曰孕葬宰月孕杂 栽酝运鄄葬鄄员 与 孕葬宰月孕杂 栽酝运鄄葬鄄圆 的相似性为 怨园郾 缘苑豫 袁且二者与宰月阅 栽酝运鄄员 和 韵再鄄宰 栽酝运鄄葬之间的
相似性为 愿苑郾 猿圆豫 原怨源郾 圆远豫 曰而 孕葬宰月孕杂尧宰月阅尧韵再鄄宰 三种植原体的 栽酝运鄄葬 与 栽酝运鄄遭 之间的相似性仅为 圆圆郾 圆圆豫
原圆缘郾 怨缘豫 遥 构建了 孕葬宰月孕杂 栽酝运鄄遭尧栽酝运鄄葬鄄员尧栽酝运鄄葬鄄圆 的 责耘栽圆愿葬 原核表达载体袁对 孕葬宰月孕杂 栽酝运鄄遭尧栽酝运鄄葬鄄员尧
栽酝运鄄葬鄄圆 猿 种蛋白进行了原核表达袁经 晕蚤鄄晕栽粤柱纯化后袁利用双酶法进行了胸苷酸激酶催化活性测定袁结果表明袁
孕葬宰月孕杂 栽酝运鄄遭具有较高的胸苷酸激酶活性袁为 愿缘郾 怨远 依 园郾 苑源 哉窑皂早 原员袁而 孕葬宰月孕杂 栽酝运鄄葬鄄员 和 栽酝运鄄葬鄄圆 几乎没有
胸苷酸激酶活性遥 本文为进一步研究胸苷酸激酶在植原体繁殖过程中的作用机理奠定了基础遥
关键词院泡桐丛枝植原体曰胸苷酸激酶曰原核表达曰酶活性
中图分类号院杂苑怨圆郾 源猿 文献标识码院粤
孕则燥噪葬则赠燥贼蚤糟 耘曾责则藻泽泽蚤燥灶袁 孕怎则蚤枣蚤糟葬贼蚤燥灶 葬灶凿 耘灶扎赠皂藻 粤糟贼蚤增蚤贼赠 粤泽泽葬赠 燥枣
栽澡赠皂蚤凿赠造葬贼藻 运蚤灶葬泽藻 燥枣 贼澡藻 孕葬怎造燥憎灶蚤葬 宰蚤贼糟澡藻泽爷 鄄遭则燥燥皂 孕澡赠贼燥责造葬泽皂葬
杂韵晕郧 悦澡怎葬灶鄄泽澡藻灶早员袁 匀哉 允蚤葬鄄曾怎圆袁 蕴陨晕 悦葬蚤鄄造蚤员袁 砸耘晕 在澡藻灶早鄄早怎葬灶早员袁 郧耘晕郧 载蚤葬灶鄄泽澡藻灶早猿袁 栽陨粤晕 郧怎燥鄄扎澡燥灶早员
渊员援 砸藻泽藻葬则糟澡 陨灶泽贼蚤贼怎贼藻 燥枣 云燥则藻泽贼 耘糟燥造燥早赠袁 耘灶增蚤则燥灶皂藻灶贼 葬灶凿 孕则燥贼藻糟贼蚤燥灶袁 悦澡蚤灶藻泽藻 粤糟葬凿藻皂赠 燥枣 云燥则藻泽贼则赠袁 运藻赠 蕴葬遭燥则葬贼燥则赠 燥枣 云燥则藻泽贼 孕则燥贼藻糟贼蚤燥灶袁
杂贼葬贼藻 云燥则藻泽贼则赠 粤凿皂蚤灶蚤泽贼则葬贼蚤燥灶袁 月藻蚤躁蚤灶早摇 员园园园怨员袁 悦澡蚤灶葬曰 圆援 栽蚤葬灶躁蚤灶 耘灶贼则赠鄄耘曾蚤贼 陨灶泽责藻糟贼蚤燥灶 葬灶凿 匝怎葬则葬灶贼蚤灶藻 月怎则藻葬怎袁 栽蚤葬灶躁蚤灶摇 猿园园源缘苑袁 悦澡蚤灶葬曰
猿援 砸藻泽藻葬则糟澡 陨灶泽贼蚤贼怎贼藻 燥枣 杂怎遭贼则燥责蚤糟葬造 云燥则藻泽贼则赠袁 悦澡蚤灶藻泽藻 粤糟葬凿藻皂赠 燥枣 云燥则藻泽贼则赠袁 云怎赠葬灶早摇 猿员员源园园袁 在澡藻躁蚤葬灶早袁 悦澡蚤灶葬冤
粤遭泽贼则葬糟贼院栽澡赠皂蚤凿赠造葬贼藻 噪蚤灶葬泽藻 糟葬贼葬造赠泽藻泽 贼澡藻 责澡燥泽责澡燥则赠造葬贼蚤燥灶 燥枣 凿栽酝孕 贼燥 枣燥则皂 凿栽阅孕 蚤灶 遭燥贼澡 贼澡藻 凿藻 灶燥增燥 葬灶凿 泽葬造增葬早藻
责葬贼澡憎葬赠泽 燥枣 凿栽栽孕 泽赠灶贼澡藻泽蚤泽袁 葬灶凿 蚤贼 蚤泽 糟则怎糟蚤葬造 枣燥则 阅晕粤 则藻责造蚤糟葬贼蚤燥灶 葬灶凿 造蚤枣藻 泽怎则增蚤增葬造援 陨灶 责则藻增蚤燥怎泽 泽贼怎凿赠袁 贼澡藻 贼皂噪鄄葬鄄员袁
贼皂噪鄄葬鄄圆 葬灶凿 贼皂噪鄄遭 早藻灶藻泽 燥枣 孕葬怎造燥憎灶蚤葬 憎蚤贼糟澡藻泽爷鄄遭则燥燥皂 孕蚤灶早泽澡葬灶 泽贼则葬蚤灶 渊孕葬宰月孕杂冤 憎藻则藻 燥遭贼葬蚤灶藻凿援 韵灶 贼澡藻 遭葬泽蚤泽 燥枣
责则藻增蚤燥怎泽 泽贼怎凿赠袁 贼澡藻 葬皂蚤灶燥 葬糟蚤凿 泽藻择怎藻灶糟藻 葬造蚤早灶皂藻灶贼 葬灶凿 泽蚤皂蚤造葬则蚤贼赠 葬灶葬造赠泽蚤泽 憎藻则藻 糟燥灶凿怎糟贼藻凿 葬皂燥灶早 孕葬宰月孕杂 栽酝运鄄葬鄄
员袁 孕葬宰月孕杂 栽酝运鄄葬鄄圆袁 孕葬宰月孕杂 栽酝运鄄遭袁 燥灶蚤燥灶 赠藻造造燥憎 憎蚤造凿鄄贼赠责藻 造蚤灶藻 渊韵再鄄宰冤 栽酝运鄄葬袁 韵再鄄宰 栽酝运鄄遭袁 憎澡蚤贼藻 遭造怎藻
凿憎葬则枣 渊宰月阅冤 栽酝运鄄葬 葬灶凿 宰月阅 栽酝运鄄遭郾 栽澡藻 葬皂蚤灶燥 葬糟蚤凿 泽藻择怎藻灶糟藻 泽蚤皂蚤造葬则蚤贼赠 增葬造怎藻 憎葬泽 怨远郾 远缘豫 遭藻贼憎藻藻灶 孕葬宰月孕杂
栽酝运鄄遭 葬灶凿 宰月阅 栽酝运 原 圆袁 怨怨郾 园猿豫 遭藻贼憎藻藻灶 孕葬宰月孕杂 栽酝运鄄遭 葬灶凿 韵再鄄宰 栽酝运鄄遭袁 怨园郾 缘苑豫 遭藻贼憎藻藻灶 孕葬宰月孕杂
第 远 期 宋传生等院泡桐丛枝植原体胸苷酸激酶的原核表达尧纯化及酶活性测定
栽酝运鄄葬 原 员 葬灶凿 孕葬宰月孕杂 栽酝运鄄葬鄄圆袁 则葬灶早藻凿 枣则燥皂 愿苑郾 猿圆豫 贼燥 怨怨郾 圆远豫 葬皂燥灶早 孕葬宰月孕杂 栽酝运鄄葬鄄员袁 孕葬宰月孕杂 栽酝运鄄葬鄄
圆袁 宰月阅 栽酝运鄄员 葬灶凿 韵再鄄宰 栽酝运鄄葬袁 葬灶凿 枣则燥皂 圆圆郾 圆圆豫 贼燥 圆缘郾 怨缘豫 葬皂燥灶早 栽酝运鄄葬 葬灶凿 栽酝运鄄遭 燥枣 孕葬宰月孕杂袁 韵再鄄宰
葬灶凿 宰月阅 责澡赠贼燥责造葬泽皂葬援 栽澡藻 责耘栽圆愿葬 泽赠泽贼藻皂 憎葬泽 怎泽藻凿 贼燥 早藻灶藻则葬贼藻 葬 责燥造赠澡蚤泽贼蚤凿蚤灶藻 渊责燥造赠匀蚤泽冤鄄贼葬早早藻凿 栽酝运 枣怎泽蚤燥灶 责则燥鄄
贼藻蚤灶援 栽澡藻 责燥造赠匀蚤泽鄄贼葬早早藻凿 栽酝运泽 憎藻则藻 藻曾责则藻泽泽藻凿 蚤灶 耘泽糟澡藻则蚤糟澡蚤葬 糟燥造蚤 月蕴圆员 渊阅耘猿冤 糟藻造造 葬灶凿 责怎则蚤枣蚤藻凿 怎灶凿藻则 灶葬贼蚤增藻 糟燥灶鄄
凿蚤贼蚤燥灶泽 遭赠 晕蚤鄄晕栽粤 糟澡藻造葬贼蚤灶早 糟燥造怎皂灶援 栽澡藻灶袁 贼澡藻 栽酝运 葬糟贼蚤增蚤贼赠 憎葬泽 皂藻葬泽怎则藻凿 怎泽蚤灶早 藻灶扎赠皂藻鄄糟燥怎责造藻凿 葬泽泽葬赠援 砸藻泽怎造贼泽
泽怎早早藻泽贼藻凿 贼澡葬贼 贼澡藻 栽酝运鄄遭 澡葬凿 贼澡赠皂蚤凿赠造葬贼藻 噪蚤灶葬泽藻 葬糟贼蚤增蚤贼赠 渊愿缘郾 怨远 依 园郾 苑源 哉窑皂早 原员冤 葬灶凿 贼澡藻 栽酝运鄄葬鄄员 葬灶凿 栽酝运鄄葬鄄
圆 澡葬凿 澡葬则凿造赠 葬灶赠 葬糟贼蚤增蚤贼赠援
运藻赠 憎燥则凿泽院孕葬怎造燥憎灶蚤葬 憎蚤贼糟澡藻泽爷鄄遭则燥燥皂 责澡赠贼燥责造葬泽皂葬曰贼澡赠皂蚤凿赠造葬贼藻 噪蚤灶葬泽藻曰责则燥噪葬则赠燥贼蚤糟 藻曾责则藻泽泽蚤燥灶曰藻灶扎赠皂藻 葬糟贼蚤增蚤贼赠
泡桐渊孕葬怎造燥憎灶蚤葬 泽责责援 冤为玄参科泡桐属木本植
物袁在中国分布广泛袁分布于北起辽宁南部尧北京一
线袁南至广东尧广西袁东起台湾袁西至云南尧贵州尧四川
等省的广大范围内遥 其木材因纹理通直尧结构均匀尧
不易变形尧声学性好尧容易加工等特点袁成为家具尧建
筑尧乐器等的重要用材曰其根尧果实因性味苦寒可入
中药遥 然而袁在北至山海关尧南至长江流域的广大范
围内袁由泡桐丛枝植原体引起的泡桐丛枝病给泡桐
的生产带来了重大危害咱员暂 遥 植原体隶属柔膜菌纲袁
不具细胞壁尧极难体外培养袁专性寄生于寄主植物韧
皮部的筛管及介体昆虫的唾液腺尧血淋巴尧肠道等组
织细胞内袁能够引起植物丛枝尧矮化尧黄化尧花变绿及
花变叶等症状袁是一类重要的林木病原袁具有重要的
学术研究价值遥
胸苷酸激酶渊 贼澡赠皂蚤凿赠造葬贼藻 噪蚤灶葬泽藻袁栽酝孕 噪蚤灶葬泽藻 燥则
栽酝运曰耘悦 圆郾 苑郾 源郾 怨冤存在于人类渊匀燥皂燥 泽葬责蚤藻灶泽冤尧酿酒
酵母渊 杂葬糟糟澡葬则燥皂赠糟藻泽 糟藻则增蚤泽蚤葬藻冤尧痘病毒渊灾葬糟糟蚤灶蚤葬 增蚤鄄
则怎泽冤尧天花病毒渊灾葬则蚤燥造葬 增蚤则怎泽冤尧结核分枝杆菌渊酝赠糟燥鄄
遭葬糟贼藻则蚤怎皂 贼怎遭藻则糟怎造燥泽蚤泽冤等几乎所有生物中袁可催化磷
酰基从 粤栽孕 转移到 凿栽酝孕 形成 凿栽阅孕袁是 凿栽栽孕 从头
合成和补救途径的关键酶袁在 阅晕粤 复制和生物的生
存中发挥着必不可少的作用咱圆 原 猿暂 遥 如袁在拟南芥
渊粤则葬遭蚤凿燥责泽蚤泽 贼澡葬造蚤葬灶葬冤中袁胸苷酸激酶对合子的第一
次分裂及早期种子的萌发具有重要作用咱源暂 遥 在细胞
中袁胸苷酸激酶的表达受细胞周期转变的调控咱源 原 远暂 遥
鉴于 栽酝运对生物的生存必不可缺袁在医学上袁栽酝运
成为疾病治疗的药物靶标咱苑 原 怨暂 遥
圆园园园 年袁江施幸对丝瓜簇叶植原体胸苷酸激酶
的原核表达及酶动力学研究咱员园暂 遥 随后袁酝蚤赠葬贼葬 首次
从洋葱黄化植原体中克隆测序了胸苷酸激酶基因
渊 贼皂噪冤袁并对胸苷酸激酶进行了原核表达及体外酶活
性的测定袁发现 栽酝运鄄遭 具有较高的酶活性而 栽酝运鄄葬
体外无酶活性咱员员暂 遥 李蓓在小麦蓝矮植原体 栽酝运 的
研究中获得了和 酝蚤赠葬贼葬 相似的结果咱员圆暂 遥 到目前为
止袁除上述研究外袁未有更多关于植原体 栽酝运 功能
研究的相关报导遥
本实验室前期研究发现袁相比于洋葱黄化尧翠菊
黄化丛枝尧小麦蓝矮尧苹果丛簇等植原体咱员园 原 员源暂 袁泡桐
丛枝植原体渊河北平山株系和江西吉安株系冤基因
组中含有更加丰富的 贼皂噪鄄葬 基因多态性曰和其他植
原体相同的是袁泡桐丛枝植原体 贼皂噪鄄遭 基因序列单
一咱员缘暂 遥 本文在前期研究的基础上袁对泡桐丛枝植原
体 贼皂噪鄄葬 的优势序列 贼皂噪鄄葬鄄员 渊孕葬宰月孕泽 贼皂噪鄄葬 糟造燥灶藻
缘袁郧藻灶遭葬灶噪 登录号为院运允源缘圆源怨缘冤尧 贼皂噪鄄葬鄄圆渊孕葬宰月孕泽
贼皂噪鄄葬 糟造燥灶藻 员袁郧藻灶月葬灶噪 登录号为院运允源缘圆源怨圆 冤以及
贼皂噪鄄遭渊郧藻灶月葬灶噪登录号为院运允源缘圆缘源缘冤编码蛋白氨基
酸的序列进行了比对分析袁发现与已报道的宰月阅和
韵再鄄宰 栽酝运既有相似的结构袁又有明显的差异和特
征区域曰为了阐明和比较这些基因的结构与功能袁我
们对这三个能编码完整蛋白的基因都进行了原核表
达载体的构建尧原核表达尧蛋白纯化袁对纯化的蛋白
栽酝运鄄葬鄄员尧栽酝运鄄葬鄄圆尧栽酝运鄄遭进行了体外酶活性测定遥
员摇 材料与方法
员郾 员摇 材料
员郾 员郾 员摇 供试菌株和质粒摇 泡桐丛枝植原体菌株采
自河北平山袁保存在发病的泡桐组织培养苗上袁并表
现典型丛枝症状咱员远暂 遥 耘援 糟燥造蚤 阅匀缘琢 感受态细胞渊天
根公司冤 用于质粒的转化与克隆曰 耘援 糟燥造蚤 月蕴圆员
渊阅耘猿冤 感受态细胞渊天根公司冤用于蛋白的原核表
达曰分别连接有 贼皂噪鄄葬鄄员尧 贼皂噪鄄葬鄄圆尧 贼皂噪鄄遭 基因的
责酝阅员愿鄄栽质粒作为 孕悦砸扩增模板遥
员郾 员郾 圆摇 主要试剂摇 圆 伊 栽葬择 酝蚤曾尧阅晕粤 凝胶回收试剂
盒尧质粒提取试剂盒尧阅晕粤 酝葬则噪藻则 均购买自天根生
物科技公司曰低分子量蛋白 酝葬则噪藻则 陨陨渊 孕孕圆园园员冤尧蓝
色预染 酝葬则噪藻则渊孕孕圆猿园员冤尧碱性磷酸酶底物显色试剂
苑愿苑
林摇 业摇 科摇 学摇 研摇 究 第 圆苑 卷
盒渊月悦陨孕 辕 晕月栽冤均购买自北京博迈德科技发展有限
公司曰远 伊 匀蚤泽单克隆抗体购自上海生工生物工程股
份有限公司曰责酝阅员愿鄄栽 载体购自 栽葬噪葬则葬 公司曰匝陨粤鄄
郧耘晕 晕蚤鄄晕栽粤 云葬泽贼 杂贼葬则贼 运蚤贼渊猿园远园园冤购自上海凯杰生
物技术有限公司曰其它化学试剂为国产分析纯遥
员郾 圆摇 方法
员郾 圆郾 员摇 孕悦砸 扩增及序列测定 摇 孕悦砸 反应体系院圆缘
滋蕴反应体系中含有 圆 伊 栽葬择 酝蚤曾 员圆郾 缘 滋蕴袁阅晕粤 员
滋蕴袁员园 皂皂燥造窑 蕴 原员正反向引物各 园郾 缘 滋蕴袁 凿凿匀圆韵
员园郾 缘 滋蕴遥
孕悦砸反应条件院怨源益预变性 源 皂蚤灶曰怨源益变性 猿园
泽袁缘缘益渊 贼皂噪鄄葬鄄员尧贼皂噪鄄葬鄄圆尧贼皂噪鄄遭冤退火 猿园 泽袁苑圆益延伸
源缘 泽袁猿缘 个循环曰苑圆益 员园 皂蚤灶曰源益保温遥
所有引物均由上海英骏生物技术有限公司
合成遥
序列测定由北京华大基因研究中心尧上海吉美
生物医药科技有限公司完成遥
员郾 圆郾 圆摇 序列分析 摇 利用 阅晕粤酝粤晕 进行序列的拼
接尧比对及序列相似值的计算遥
员郾 圆郾 猿摇 原核表达载体的构建尧蛋白的诱导表达及纯
化摇 设计含有 晕糟燥 陨 和 载澡燥 陨 限制性酶切位点的正
反向引物 孕葬宰月贼皂噪葬云鄄晕糟燥 陨 和 孕葬宰月贼皂噪葬砸鄄载澡燥 陨
渊表 员冤袁从连接有 贼皂噪鄄葬鄄员 和 贼皂噪鄄葬鄄圆 基因的 责酝阅员愿鄄
栽载体上 孕悦砸 扩增 贼皂噪鄄葬鄄员 和 贼皂噪鄄葬鄄圆 片段曰设计含
有 晕糟燥 陨 和 载澡燥 陨 限制性酶切位点的正反向引物
孕葬宰月贼皂噪遭云鄄晕糟燥 陨和 孕葬宰月贼皂噪遭砸鄄载澡燥 陨渊表 员冤袁从连
接有 贼皂噪鄄遭基因的 责酝阅员愿鄄栽 载体中 孕悦砸 扩增 贼皂噪鄄遭
片段遥 将 孕悦砸扩增的 贼皂噪鄄葬鄄员尧贼皂噪鄄葬鄄圆 和 贼皂噪鄄遭片段
切胶纯化回收遥 责耘栽圆愿葬载体和回收的 贼皂噪鄄葬鄄员尧贼皂噪鄄
葬鄄圆尧贼皂噪鄄遭片段经 晕糟燥 陨 和 载澡燥 陨 双酶切后切胶纯化
回收袁然后将 贼皂噪鄄葬鄄员尧贼皂噪鄄葬鄄圆 及 贼皂噪鄄遭 与 责耘栽圆愿葬经
栽源 连接酶连接遥 将连接产物转化到 月蕴圆员渊阅耘猿冤感
受态大肠杆菌中袁在含有 运葬灶 抗生素的 蕴月 固体培
养基上培养袁挑取单菌落摇菌后提取质粒袁通过 晕糟燥
陨和 载澡燥 陨双酶切鉴定连接是否成功袁将连接成功的
载体测序验证遥 由于在设计反向引物 孕葬宰月贼皂噪葬砸鄄
载澡燥 陨和 孕葬宰月贼皂噪遭砸鄄载澡燥 陨时去掉了 贼皂噪鄄葬鄄员尧贼皂噪鄄葬鄄
圆 及 贼皂噪鄄遭 基因的终止密码子袁因此表达的 栽酝运鄄葬鄄
员尧栽酝运鄄葬鄄圆 及 栽酝运鄄遭 能和 远 伊 匀蚤泽 标签形成融合
蛋白遥
表 员摇 本研究所用引物表
引物名称 引物序列 退火温度 延伸时间
孕葬宰月贼皂噪葬云鄄晕糟燥 陨 摇 摇 缘爷鄄悦粤栽郧悦悦粤栽郧郧郧悦粤栽郧粤粤粤栽栽粤粤栽悦郧栽栽栽栽栽郧粤粤郧郧鄄猿爷
孕葬宰月贼皂噪葬砸鄄载澡燥 陨 摇 摇 缘爷鄄悦悦郧悦栽悦郧粤郧郧栽栽粤栽郧粤栽悦郧悦悦粤栽栽栽郧粤栽粤郧栽鄄猿爷
缘缘益 摇 摇 摇 源缘 泽
孕葬宰月贼皂噪遭云鄄晕糟燥 陨 摇 摇 缘爷鄄悦粤栽郧悦悦粤栽郧郧郧悦粤栽郧栽栽栽粤栽栽栽悦栽栽栽栽郧粤粤郧郧鄄猿爷
孕葬宰月贼皂噪遭砸鄄载澡燥 陨 摇 摇 缘爷鄄悦悦郧悦栽悦郧粤郧栽粤粤栽栽悦栽粤栽栽栽郧粤粤粤郧粤悦栽栽悦鄄猿爷
缘缘益 摇 摇 摇 源缘 泽
摇 摇 猿苑益活化含有 贼皂噪鄄葬鄄员尧 贼皂噪鄄葬鄄圆尧 贼皂噪鄄遭 基因的
月蕴圆员渊阅耘猿冤菌株袁加入 陨孕栽郧 至终浓度为 员 皂皂燥造窑
蕴 原员袁圆愿益诱导 贼皂噪鄄葬鄄员尧贼皂噪鄄葬鄄圆尧贼皂噪鄄遭 基因的表达袁远
澡后收集菌体遥 栽酝运鄄葬鄄员尧栽酝运鄄葬鄄圆尧栽酝运鄄遭 蛋白的纯
化参照 匝陨粤郧耘晕 晕蚤鄄晕栽粤 云葬泽贼 杂贼葬则贼 运蚤贼渊猿园远园园冤产品
说明书进行袁收集菌体后加入菌体裂解缓冲液冰浴
猿园 皂蚤灶袁源益 员源 园园园 早 离心 源园 皂蚤灶袁在重力作用下将
上清液流过 晕蚤鄄晕栽粤 柱袁用冲洗缓冲液冲洗两次袁最
后用洗脱缓冲液洗脱蛋白袁用 晕葬灶燥凿则燥责 员 园园园 核酸 辕
蛋白微量测定仪渊栽澡藻则皂燥公司冤测定蛋白浓度渊以蛋
白洗脱液做空白对照冤遥
员郾 圆郾 源摇 栽酝运蛋白的酶催化活性测定摇 采用双酶分
析法对纯化的 栽酝运鄄葬鄄员尧栽酝运鄄葬鄄圆尧栽酝运鄄遭 蛋白进行
酶活性测定咱员苑暂 袁酶反应原理见图 员袁该方法通过监测
晕粤阅匀的含量变化计算 栽酝运 的酶活性遥 员园园 滋蕴 反
应体系包含院员园园 滋皂燥造窑蕴 原员 凿栽酝孕袁员郾 缘 皂皂燥造窑蕴 原员
酝早悦造圆袁员园园 皂皂燥造窑蕴 原员 栽蚤泽鄄匀悦造渊 责匀苑郾 源冤袁缘 皂皂燥造窑
蕴 原员 运悦造袁 园郾 圆 皂皂燥造 窑 蕴 原员 孕耘孕袁 园郾 圆 皂皂燥造 窑 蕴 原员
晕粤阅匀袁责赠则怎增葬贼藻 噪蚤灶葬泽藻 员郾 缘 哉袁 造葬糟贼葬贼藻 凿藻澡赠凿则燥早藻灶葬泽藻
员郾 缘 哉袁员郾 园 皂皂燥造窑蕴 原员 粤栽孕遥 测定纯化的蛋白浓度
后袁取 猿 滋早 纯化的 栽酝运 蛋白于上述反应体系中袁
猿苑益下反应 远园 皂蚤灶袁波长 猿源园 灶皂下测定 晕粤阅匀的浓
度袁以单位时间渊皂蚤灶冤内 晕粤阅匀 的消耗量作为 栽酝运
催化反应的反应速率袁最后于 怨愿益水浴 缘 皂蚤灶 终止
反应遥 将蛋白纯化时的洗脱缓冲液作为阴性对照遥
每个测定样品设置 猿 个重复袁利用 杂孕杂杂员猿郾 园 软件进
行差异显著性检验遥
图 员摇 双酶分析法反应原理
愿愿苑
第 远 期 宋传生等院泡桐丛枝植原体胸苷酸激酶的原核表达尧纯化及酶活性测定
员郾 圆郾 缘摇 大肠杆菌蛋白质的提取摇 大肠杆菌蛋白质
的提取院收集 员 皂蕴菌体袁加入 员园园 滋蕴 栽耘 悬浮菌体袁
加入等体积的 圆 伊 杂阅杂 上样缓冲液渊缘豫 杂阅杂袁员园豫
茁鄄巯基乙醇袁猿园豫 甘油袁园郾 园源豫 溴酚蓝袁员 皂燥造窑蕴 原员
栽蚤泽鄄悦造 责匀 远郾 愿冤混匀袁沸水浴 缘 皂蚤灶袁 原 圆园益 缘 皂蚤灶袁员圆
园园园 则责皂离心 员园 皂蚤灶后取上清遥
员郾 圆郾 远摇 蛋白质电泳分析摇 取 圆园 滋蕴 蛋白质上样液
在分离胶为 员圆豫 的聚丙烯酰胺凝胶中电泳分离袁染
色液渊园郾 员豫 考马斯亮蓝 砸圆缘园袁源缘豫 甲醇袁员园豫 冰
醋酸冤中充分染色袁脱色液渊源缘豫 甲醇袁员园豫 冰醋
酸冤中充分脱色遥
员郾 圆郾 苑摇 免疫印迹分析摇 分离胶为 员圆豫 的聚丙烯酰
胺凝胶中电泳分离蛋白质袁在转移缓冲液渊圆缘 皂皂燥造
窑蕴 原员 栽则蚤泽鄄匀悦造 责匀 愿郾 猿袁员怨圆 皂皂燥造窑蕴 原员甘氨酸袁员园豫
甲醇冤中将蛋白质转移到硝酸纤维素膜上袁在 源益
下袁将膜在封闭缓冲液渊栽月杂栽 垣 缘豫 脱脂奶粉冤中封
闭过夜袁栽月杂栽 中洗膜 猿 次袁每次 员园 皂蚤灶袁在 远 伊 匀蚤泽
标签单克隆抗体渊一抗冤中 猿苑益孵育 员 澡渊利用 栽月杂栽
稀释 圆园园 倍冤袁碱性磷酸酯酶标记的 粤 蛋白渊利用
栽月杂栽稀释 圆 缘园园 倍冤中 猿苑益孵育 员 澡袁栽月杂栽 洗膜 猿
次袁每次 员园 皂蚤灶袁利用碱性磷酸酶底物显色试剂盒显
色袁蒸馏水中终止显色遥
圆摇 结果与分析
圆郾 员摇 孕葬宰月 孕杂 株系 猿 个 贼皂噪基因编码蛋白的氨基
酸序列比对及相似性分析
摇 摇 孕葬宰月孕杂 贼皂噪鄄葬鄄员尧 贼皂噪鄄葬鄄圆 和 贼皂噪鄄遭 基因大小分
别为 远猿怨 遭责尧远圆苑 遭责和 远圆源 遭责袁分别编码 圆员圆尧圆园愿 和
圆园苑 个氨基酸袁栽酝运鄄葬鄄员尧栽酝运鄄葬鄄圆 和 栽酝运鄄遭 预测的
蛋白分子量分别为 圆源郾 缘 运阅葬尧圆源郾 园 运阅葬 和 圆源郾 员
运阅葬袁融合 远 伊 匀蚤泽 标签后则分别为 圆缘郾 源 运阅葬尧圆源郾 怨
运阅葬和 圆缘郾 园 运阅葬遥 对蛋白序列比对分析发现袁和其
他生物体的 栽酝运蛋白类似袁孕葬宰月孕杂 栽酝运鄄葬鄄员尧栽酝运鄄
葬鄄圆 及 栽酝运鄄遭也含有三个保守功能域袁即 晕 端的磷
酸基供体结合区 渊 贼澡藻 责澡燥泽责澡葬贼藻鄄遭蚤灶凿蚤灶早 皂燥贼蚤枣袁 孕鄄
造燥燥责冤尧核苷单磷酸结合区渊栽酝孕 遭蚤灶凿蚤灶早 皂燥贼蚤枣冤和位
于 悦端的磷酸供体结合位点渊 贼澡藻 蕴陨阅 凿燥皂葬蚤灶冤遥 从
图 圆 中还可以看到袁在核苷单磷酸结合区 渊 栽酝孕
遭蚤灶凿蚤灶早 皂燥贼蚤枣 冤 下 游袁 孕葬宰月孕杂 栽酝运鄄葬鄄员尧 孕葬宰月孕杂
栽酝运鄄葬鄄圆尧宰月阅 栽酝运鄄员 渊 栽酝运鄄葬冤和 韵再鄄宰 栽酝运鄄葬 都
比 孕葬宰月孕杂 栽酝运鄄遭尧宰月阅 栽酝运鄄圆渊 栽酝运鄄遭冤和 韵再鄄宰
栽酝运鄄遭多了 远 个连续的氨基酸 运耘运运匝蕴渊图 圆 虚线
框所示 冤曰而在其上游袁 孕葬宰月孕杂 栽酝运鄄葬鄄圆尧 宰月阅
栽酝运鄄员渊栽酝运鄄葬冤尧韵再鄄宰 栽酝运鄄葬 都比 孕葬宰月孕杂 栽酝运鄄
遭尧宰月阅 栽酝运鄄圆渊栽酝运鄄遭冤尧韵再鄄宰 栽酝运鄄遭 少了 源 个连
续的氨基酸 孕粤蕴匝袁而 孕葬宰月孕杂 栽酝运鄄葬鄄员 在此处为
孕匝蕴运遥
图 圆摇 三个植原体的不同 栽酝运蛋白氨基酸序列比对图
利用 阅晕粤酝粤晕软件分析了泡桐丛枝渊孕葬宰月冤尧
小麦蓝矮渊宰月阅冤尧洋葱黄化渊韵再鄄宰冤植原体的 栽酝运鄄
葬尧栽酝运鄄遭 的氨基酸序列相似性值渊表 圆冤遥 结果表
明袁孕葬宰月孕杂 栽酝运鄄遭与 宰月阅 栽酝运鄄圆渊栽酝运鄄遭冤尧韵再鄄宰
栽酝运鄄遭之间的相似性分别为 怨缘郾 远缘豫 和 怨怨郾 园猿豫 曰
孕葬宰月孕杂 栽酝运鄄葬鄄员尧 孕葬宰月孕杂 栽酝运鄄葬鄄圆尧 宰月阅 栽酝运鄄员
渊栽酝运鄄葬冤尧韵再鄄宰 栽酝运鄄葬之间的相似性为 愿苑郾 猿圆豫
怨源郾 圆远豫 曰而 孕葬宰月孕杂尧宰月阅 和 韵再鄄宰 三种植原体的
栽酝运鄄葬 与 栽酝运鄄遭 之间的相似性仅为 圆圆郾 圆圆豫
圆缘郾 怨缘豫 遥
怨愿苑
林摇 业摇 科摇 学摇 研摇 究 第 圆苑 卷
表 圆摇 三种植原体不同 栽酝运蛋白氨基酸序列相似性值矩阵 豫
孕葬宰月孕杂 栽酝运鄄遭 员园园
宰月阅 栽酝运鄄圆渊栽酝运鄄遭冤 怨缘郾 远缘 员园园
韵再鄄宰 栽酝运鄄遭 怨怨郾 园猿 怨缘郾 远缘 员园园
孕葬宰月孕杂 栽酝运鄄葬鄄员 圆缘郾 源远 圆缘郾 怨猿 圆缘郾 源远 员园园
孕葬宰月孕杂 栽酝运鄄葬鄄圆 圆圆郾 圆圆 圆圆郾 远怨 圆圆郾 圆圆 怨园郾 缘苑 员园园
宰月阅 栽酝运鄄员渊栽酝运鄄葬冤 圆圆郾 缘愿 圆猿郾 园源 圆圆郾 缘愿 愿苑郾 猿圆 愿怨郾 怨缘 员园园
韵再鄄宰 栽酝运鄄葬 圆圆郾 缘愿 圆猿郾 园源 圆圆郾 缘愿 怨员郾 缘缘 怨猿郾 苑愿 怨源郾 圆远 员园园
圆郾 圆摇 栽酝运鄄葬鄄员尧栽酝运鄄葬鄄圆 和 栽酝运鄄遭 原核表达载体的
构建
利用含有 晕糟燥 陨 和 载澡燥 陨 酶切位点的引物对
孕葬宰月贼皂噪葬云鄄晕糟燥 陨 和 孕葬宰月贼皂噪葬砸鄄载澡燥 陨 从连接有
贼皂噪鄄葬鄄员 和 贼皂噪鄄葬鄄圆 的 责酝阅员愿鄄栽 的载体上 孕悦砸 扩增
贼皂噪鄄葬鄄员 和 贼皂噪鄄葬鄄圆 的完整基因片段曰同时利用含有
晕糟燥 陨和 载澡燥 陨酶切位点的引物对 孕葬宰月贼皂噪葬云鄄晕糟燥 陨
和 孕葬宰月贼皂噪葬砸鄄载澡燥 陨从连接有 贼皂噪鄄遭的 责酝阅员愿鄄栽的
载体上扩增 贼皂噪鄄遭 的完整基因片段袁孕悦砸 扩增产物
的琼脂糖凝胶电泳检测结果表明渊图 猿冤袁从 责酝阅员愿鄄
栽载体上扩增到了大小约 远猿园 遭责的 贼皂噪鄄葬鄄员尧贼皂噪鄄葬鄄圆
和 贼皂噪鄄遭 基因袁而 凿凿匀圆韵 做模板的阴性对照未扩增
到和 贼皂噪基因类似大小的片段遥
酝院阅晕粤 分子量标准曰员院 凿凿匀圆韵 阴性对照曰圆院 贼皂噪鄄葬鄄员
孕悦砸扩增产物曰猿院 贼皂噪鄄葬鄄圆 孕悦砸 扩增产物曰源院 贼皂噪鄄遭 孕悦砸
扩增产物遥
图 猿摇 孕葬宰月 贼皂噪鄄葬鄄员尧贼皂噪鄄葬鄄圆 和 贼皂噪鄄遭基因的扩增
将 贼皂噪鄄葬鄄员尧贼皂噪鄄葬鄄圆 和 贼皂噪鄄遭的 孕悦砸扩增产物切
胶纯化回收袁经 晕糟燥 陨 和 载澡燥 陨 双酶切后连接到
责耘栽圆愿葬 原核表达载体上袁转化 月蕴圆员渊阅耘猿冤感受态
大肠杆菌遥 挑取单菌落摇菌后提取质粒袁经 晕糟燥 陨和
载澡燥 陨双酶切鉴定表明渊图 源冤袁 贼皂噪鄄葬鄄员尧 贼皂噪鄄葬鄄圆 和
贼皂噪鄄遭 基因均成功的连接到 责耘栽圆愿葬 原核表达载体
上遥 将构建的载体送北京华大基因研究中心和上海
吉美生物医药科技有限公司测序发现袁连接在
责耘栽圆愿葬 载体上的 贼皂噪鄄葬鄄员尧 贼皂噪鄄葬鄄圆 和 贼皂噪鄄遭 基因序
列和原序列完全一致遥 将含有载体的 月蕴圆员渊阅耘猿冤
大肠杆菌保存于 原愿园益冰箱中备用遥
粤院未经酶切的质粒曰月曰质粒经 晕糟燥 陨 和 载澡燥 陨 双酶切遥
酝院阅晕粤 分子量标准曰员院连接有 贼皂噪鄄葬鄄员 基因的 责耘栽圆愿葬
质粒曰圆院连接有 贼皂噪鄄葬鄄圆 基因的 责耘栽圆愿葬 质粒曰猿院连接有
贼皂噪鄄遭基因的 责耘栽圆愿葬质粒曰源院责耘栽圆愿葬空载体质粒遥
图 源摇 晕糟燥 陨和 载澡燥 陨双酶切鉴定
圆郾 猿 摇 孕葬宰月孕杂 栽酝运鄄葬鄄员尧栽酝运鄄葬鄄圆 和 栽酝运鄄遭 蛋
白的表达及纯化
摇 摇 将保存在 原 愿园益冰箱中的 月蕴圆员渊阅耘猿冤大肠杆
菌于含有 运葬灶 抗生素的 蕴月 固体培养基中划线培
养袁挑取单菌落摇菌遥 用新的 蕴月液体培养稀释菌液
员 园园园 倍袁猿苑益摇菌 圆 小时后加入 陨孕栽郧至终浓度为 员
皂皂燥造窑蕴 原员袁员源园 则责皂 圆愿益摇菌 远 小时后收集菌体遥
为了检测 栽酝运鄄葬鄄员尧栽酝运鄄葬鄄圆 和 栽酝运鄄遭 的诱导
表达效果袁利用 远 伊 匀蚤泽 标签单克隆抗体进行了
宰藻泽贼藻则灶 遭造燥贼贼蚤灶早 实验袁结果表明袁在 陨孕栽郧 诱导的条
件下袁栽酝运鄄葬鄄员尧栽酝运鄄葬鄄圆 及 栽酝运鄄遭 蛋白均被大量表
达曰在未加 陨孕栽郧时袁也能检测到 栽酝运鄄葬鄄员 蛋白表达袁
但其明显低于诱导时的表达量袁而在未加 陨孕栽郧诱导
的大肠杆菌中也未检测到 栽酝运鄄葬鄄圆 和 栽酝运鄄遭 的表
达曰在不含外源基因的 责耘栽圆愿葬 空载体对照组中袁未
检测到 猿 种蛋白的表达渊图 缘冤遥
参照 匝陨粤郧耘晕 晕蚤鄄晕栽粤 云葬泽贼 杂贼葬则贼 运蚤贼渊猿园远园园冤产
园怨苑
第 远 期 宋传生等院泡桐丛枝植原体胸苷酸激酶的原核表达尧纯化及酶活性测定
员院陨孕栽郧诱导的 月蕴圆员渊阅耘猿冤菌体总蛋白提取物曰圆院未加
陨孕栽郧诱导的 月蕴圆员渊阅耘猿冤菌体总蛋白提取物曰猿院责耘栽圆愿葬
空载体 月蕴圆员渊阅耘猿冤菌体总蛋白提取物
图 缘摇 利用 远 伊 匀蚤泽标签抗体进行的 宰藻泽贼藻则灶 遭造燥贼贼蚤灶早结果
品说明书裂解收集的菌体袁利用 晕蚤鄄晕栽粤 亲和层析柱
对过量表达的蛋白进行纯化袁结果表明 渊图 远冤袁
栽酝运鄄葬鄄员尧栽酝运鄄葬鄄圆 和 栽酝运鄄遭 蛋白都成功地被纯化
到袁栽酝运鄄葬鄄员 纯化的效率最高袁而 栽酝运鄄葬鄄圆 和 栽酝运鄄遭
的纯化产量较低袁这可能由蛋白的结构不同造成的袁
也有可能是不同的蛋白所需的最适蛋白洗脱液的
责匀值尧咪唑浓度等条件不同导致的咱员愿暂 遥
酝院蛋白分子量 酝葬则噪藻则曰员院未加 陨孕栽郧诱导的菌体蛋白曰圆院加 陨孕栽郧
诱导的菌体蛋白曰猿院不含目的基因的菌体蛋白遥
图 远摇 利用 晕蚤鄄晕栽粤亲和层析柱对 猿 种蛋白的纯化结果
圆郾 源 摇 孕葬宰月孕杂 栽酝运鄄葬鄄员尧栽酝运鄄葬鄄圆 和 栽酝运鄄遭 酶
活性的测定
摇 摇 采用双酶法对纯化后的蛋白 孕葬宰月孕杂 栽酝运鄄葬鄄员尧
栽酝运鄄葬鄄圆 及 栽酝运鄄遭 进行酶活性测定袁结果表明袁
栽酝运鄄遭 具有较高的酶活性袁为 愿缘郾 怨远 依 园郾 苑源 哉窑
皂早 原员曰而 栽酝运鄄葬鄄员尧栽酝运鄄葬鄄圆 以及空白对照渊蛋白洗
脱液冤都几乎没有 栽酝运激酶活性袁酶活性值分别为院
圆郾 怨远 依 园郾 苑源 哉窑皂早 原员尧圆郾 圆猿 依 园郾 园园 哉窑皂早 原员和 圆郾 圆猿
依 员郾 圆愿 哉窑皂早 原员遥 栽酝运鄄遭 与 栽酝运鄄葬鄄员尧栽酝运鄄葬鄄圆 及
空白对照渊蛋白洗脱液冤之间表现为显著性差异渊孕
约 园郾 园园园 员冤袁而 栽酝运鄄葬鄄员尧栽酝运鄄葬鄄圆 和空白对照三者
之间没有显著性差异渊孕 跃园郾 园缘冤渊图 苑冤遥
糟燥灶贼则燥造院蛋白洗脱液作为空白对照遥 图中相同字母间差异不显
著袁不同字母间差异显著遥
图 苑摇 孕葬宰月孕杂 植原体的 栽酝运鄄葬和 栽酝运鄄遭酶活性测定结果
猿摇 结论与讨论
本实验室前期研究发现袁相比于洋葱黄化渊韵再鄄
宰冤尧小麦蓝矮渊宰月阅冤病等其他许多植原体咱员园 原 员源暂 袁
泡桐丛枝植原体渊孕葬宰月冤含有更丰富的 贼皂噪鄄葬 基因
序列多态性曰与其他植原体相似袁贼皂噪鄄遭 基因序列单
一遥 在前期研究的基础上袁本研究首次对 孕葬宰月孕杂
栽酝运鄄葬鄄员尧栽酝运鄄葬鄄圆 和 栽酝运鄄遭 进行了原核表达尧蛋白
纯化及酶活性测定遥 结果表明袁孕葬宰月孕杂 栽酝运鄄遭 蛋
白具有较高的胸苷酸激酶渊栽酝运冤酶活性袁为 愿缘郾 怨远
依 园郾 苑源 哉窑皂早 原员袁而 孕葬宰月孕杂 栽酝运鄄葬鄄员 和 孕葬宰月孕杂孕
栽酝运鄄葬鄄圆 没有明显的 栽酝运 酶活性遥 本研究结果和
酝蚤赠葬贼葬 等对 韵再鄄宰 栽酝运 的研究结果以及李蓓对
宰月阅 栽酝运的研究结果相一致咱员员 原 员圆暂 袁也与我们在实
验初期基于 孕葬宰月尧韵再鄄宰 和 宰月阅 的氨基酸序列相
似性分析的结果做出的预测基本吻合袁因为 孕葬宰月鄄
孕杂 栽酝运鄄遭尧韵再鄄宰 栽酝运鄄遭及宰月阅 栽酝运鄄圆渊栽酝运鄄遭冤氨
基酸序列间的相似性为 怨缘郾 远缘豫 怨怨郾 园猿豫 袁孕葬宰月鄄
孕杂 栽酝运鄄葬鄄员尧孕葬宰月孕杂 栽酝运鄄葬鄄圆尧宰月阅 栽酝运鄄员 渊 栽酝运鄄
葬冤及 韵再鄄宰 栽酝运鄄葬 之间的相似性为 愿苑郾 猿圆豫
怨源郾 圆远豫 袁而 孕葬宰月孕杂尧宰月阅尧 韵再鄄宰 三种植原体的
栽酝运鄄葬 与 栽酝运鄄遭 之间的相似性仅为 圆圆郾 圆圆豫
员怨苑
林摇 业摇 科摇 学摇 研摇 究 第 圆苑 卷
圆缘郾 怨缘豫 遥 虽然植原体 栽酝运鄄葬与 栽酝运鄄遭都含有 晕端
的磷酸基供体结合区渊贼澡藻 责澡燥泽责澡葬贼藻鄄遭蚤灶凿蚤灶早 皂燥贼蚤枣袁孕鄄
造燥燥责冤尧核苷单磷酸结合区渊栽酝孕 遭蚤灶凿蚤灶早 皂燥贼蚤枣冤尧位于
悦端的磷酸供体结合位点渊 贼澡藻 蕴陨阅 凿燥皂葬蚤灶冤三个保
守功能域袁但 栽酝运鄄葬和 栽酝运鄄遭序列间如此低的相似
性可能导致了它们之间功能的差异或改变遥 例如袁
在支原体中咱员怨暂 袁凿粤酝孕激酶不仅可以催化 凿粤酝孕袁还
能够催化 凿悦酝孕和 凿郧酝孕遥
作为基因表达主要产物的各种酶蛋白袁在生命
活动中的重要地位不言而喻遥 凿栽栽孕 是各种生物
阅晕粤合成的基础和前体化合物袁而在细菌和植原体
中缺乏从头合成途径袁所以补救途径成为唯一提供
脱氧嘧啶核苷酸的方式袁用于 阅晕粤 的合成尧修复及
线粒体 阅晕粤 的复制咱缘袁 圆园暂 遥 本研究证明了 孕葬宰月孕杂
栽酝运鄄遭 具有较高的体外测定酶活性袁所以判断其对
植原体的生长和繁殖会产生深远的影响袁进而影响
对寄主植物的致病和适应性遥 所以袁深入了解植原
体 贼皂噪基因表达与调控机理袁不仅有助于揭示植原
体繁殖和代谢规律袁而且也有助于开发针对植原体
病原的新型治疗药剂咱圆员暂 遥
依据对 孕葬宰月孕杂 的三个 栽酝运 蛋白酶活性测定
的结果袁进一步对其氨基酸序列细致的比对分析发
现袁栽酝运鄄葬鄄员 和 栽酝运鄄葬鄄圆 二者的三个功能域完全一
致袁除了有 怨 个不同位点的氨基酸变异外袁栽酝运鄄葬鄄圆
还有一个四联体氨基酸残基缺失遥 而这一位点的四
连体缺失在同样无活性的 宰月阅 栽酝运鄄员 和 韵再鄄宰
栽酝运鄄葬中也缺失遥 酝蚤赠葬贼葬 和李蓓在分析 韵再鄄宰 和
宰月阅植原体的 栽酝运鄄葬 几乎没有酶活性的原因时指
出咱员员 原 员圆暂 袁相比于 栽酝运鄄遭袁栽酝运鄄葬 在核苷单磷酸结合
区渊栽酝孕 遭蚤灶凿蚤灶早 皂燥贼蚤枣冤上游少的四连体氨基酸残基院
脯氨酸 原丙氨酸 原亮氨酸 原谷氨酰胺渊孕粤蕴匝冤可能
导致了 栽酝运鄄葬活性的消弱遥 而 孕葬宰月孕杂 栽酝运鄄葬鄄员 序
列在此位点上出现两个氨基酸的替换袁即第二位氨
基酸由丙氨酸 粤至谷氨酰胺 匝袁第四位由谷氨酰胺
匝至赖氨酸 运袁即由 孕粤蕴匝 替换成了 孕匝蕴运曰 所以我
们据此在实验之初曾假设 栽酝运鄄葬鄄员 会与 韵再鄄宰
栽酝运鄄遭和 宰月阅 栽酝运鄄员 一样具有 栽酝运 活性袁而本研
究的结果否定了该假设遥 然而因该四连体已有两个
氨基酸的替换袁所以也不能排除该替换与酶活性的
丧失有关遥 另外袁在 圆苑尧圆愿 位氨基酸和 缘圆尧缘猿 位氨
基酸的缺失是否影响酶的活性也不得而知遥 另一个
特别值得关注的氨基酸序列变化发生在核苷单磷酸
结合区渊栽酝孕 遭蚤灶凿蚤灶早 皂燥贼蚤枣冤下游袁孕葬宰月孕杂 栽酝运鄄葬鄄员尧
孕葬宰月孕杂 栽酝运鄄葬鄄圆尧韵再鄄宰 栽酝运鄄葬 和 宰月阅 栽酝运鄄员 与
具有活性的三个植原体的 栽酝运鄄遭 相比均多出了连
续的 远 个氨基酸院赖氨酸 原谷氨酸 原赖氨酸 原赖氨
酸 原谷氨酰胺 原亮氨酸渊运耘运运匝蕴冤袁这段多肽的插
入是否影响酶活性也很值得深入探讨袁因而不排除
核苷单磷酸结合区渊栽酝孕 遭蚤灶凿蚤灶早 皂燥贼蚤枣冤上下游序列
的改变共同导致了酶活性的变化遥
许多研究报道表明 栽酝运 蛋白的氨基酸序列的
变异会直接影响到蛋白质的二级和三级结构袁进而
影响酶蛋白活性的有无和强弱咱圆员 原 圆源暂 遥 另外袁细胞是
一个复杂而又精巧的单元袁在体外没有测出植原体
栽酝运鄄葬酶活性并不能说明 栽酝运鄄葬 在植原体细胞内
没有酶活性或功能袁比如大肠杆菌本身的 栽酝运 蛋白
作为一个二聚体在细胞生长过程中处于低水平表达
状态袁表达蛋白仅占菌体总可溶性蛋白的 园郾 园员豫 袁
这比大量存在的核苷单磷酸激酶渊灶怎糟造藻燥泽蚤凿藻 皂燥灶燥鄄
责澡燥泽责澡葬贼藻 噪蚤灶葬泽藻冤低 员园 圆园 倍咱圆缘暂 曰而且也可能存在
与 栽酝运共同发挥作用的蛋白复合体袁它们共同参与
核苷酸前体的合成和 阅晕粤 复制咱缘暂 遥 徐启聪的研究
结果显示咱圆远暂 袁与 孕葬宰月 贼皂噪鄄葬同源的枣疯植原体 贼皂噪
基因存在着与地理环境和品种相关的不同基因型遥
因此袁植原体 栽酝运鄄葬 的功能还有待于深入的研究遥
其中袁通过基因差异位点突变和酶活性测定分析或
通过对不同蛋白结晶体的立体结构的解析尧底物结
合和催化部位的比较分析袁可能是全面揭示不同基
因编码蛋白氨基酸序列变异的本质和意义的重要途
径咱圆苑 原 圆愿暂 遥 虽然本实验室之前也开展过多种植原体
基因的原核表达袁但原核表达蛋白回收和纯化都是
通过切胶方式袁获得蛋白往往纯度较低袁而且这些基
因的原核表达产物皆未完成蛋白功能的准确验
证咱圆怨 原 猿园暂 曰而 栽酝运是迄今泡桐丛枝植原体上唯一被
验证功能的蛋白遥 所以袁本研究所建立起的 栽酝运 蛋
白原核表达尧晕蚤鄄晕栽粤亲和层析蛋白纯化与胸苷酸激
酶活性的测定技术体系袁下一步深入开展这方面的
研究奠定了良好的基础遥
参考文献院
咱员暂 栽蚤葬灶 郧 在袁 砸葬赠糟澡葬怎凿怎则蚤袁 杂 孕援 孕葬怎造燥憎灶蚤葬 憎蚤贼糟澡藻泽鸳 遭则燥燥皂 凿蚤泽藻葬泽藻 蚤灶
悦澡蚤灶葬院 责则藻泽藻灶贼 泽贼葬贼怎泽援 陨灶 云燥则藻泽贼 栽则藻藻泽 葬灶凿 孕葬造皂泽院阅蚤泽藻葬泽藻泽 葬灶凿 悦燥灶鄄
贼则燥造 咱酝暂袁 韵曾枣燥则凿袁 陨月匀袁 员怨怨远院 圆圆苑 原 圆缘员援
咱圆暂 郧藻泽蚤灶早 粤袁 酝燥凿则扎藻躁藻憎泽噪葬 匀袁 运葬贼澡燥憎皂蚤噪 酝袁 藻贼 葬造援 栽澡赠皂蚤凿蚤灶藻 噪蚤灶葬泽藻
葬灶凿 葬凿藻灶燥泽蚤灶藻 噪蚤灶葬泽藻 葬糟贼蚤增蚤贼蚤藻泽 蚤灶 澡燥皂燥早藻灶葬贼藻泽 燥枣 贼澡赠则燥蚤凿 造燥遭藻泽 蚤灶
圆怨苑
第 远 期 宋传生等院泡桐丛枝植原体胸苷酸激酶的原核表达尧纯化及酶活性测定
澡藻皂蚤贼澡赠鄄则燥蚤凿藻糟贼燥皂蚤扎藻凿 则葬贼藻泽 葬枣枣藻糟贼泽 燥枣 皂藻造葬贼燥灶蚤皂 蚤灶 增蚤贼则燥 咱允暂 援 灶藻怎则燥鄄
藻灶凿燥糟则蚤灶燥造燥早赠 造藻贼贼藻则泽袁 圆园园园袁 圆员渊远冤院源缘猿 原 源缘怨援
咱猿暂 孕葬造造葬糟噪 允袁 宰蚤造造蚤葬皂泽 酝袁 酝糟藻造澡葬灶藻赠 砸袁 藻贼 葬造援 栽澡藻 糟燥皂责葬则葬贼蚤增藻 皂藻鄄
贼葬遭燥造蚤泽皂 燥枣 贼澡藻 皂燥造造蚤糟怎贼藻泽院 贼澡藻 怎贼蚤造蚤贼赠 枣燥则 贼葬曾燥灶燥皂蚤糟 糟造葬泽泽蚤枣蚤糟葬贼蚤燥灶 葬灶凿
贼澡藻 则藻造葬贼蚤燥灶泽澡蚤责 燥枣 责怎责葬贼蚤增藻 早藻灶藻 葬灶灶燥贼葬贼蚤燥灶 葬灶凿 澡赠造燥早藻灶赠 贼燥 藻灶扎赠皂葬贼鄄
蚤糟 枣怎灶糟贼蚤燥灶 蚤灶 贼澡藻 泽皂葬造造藻泽贼 枣则蚤蚤鄄造蚤增蚤灶早 糟藻造造泽 咱 允暂 援 悦则蚤贼蚤糟葬造 砸藻增蚤藻憎泽 蚤灶
酝蚤糟则燥遭蚤燥造燥早赠袁 员怨怨苑袁 圆猿院圆远怨 原 猿缘源援
咱源暂 砸燥灶糟藻则藻贼 粤袁 郧葬凿藻葬鄄灾葬糟葬泽 允袁 郧怎蚤造造藻皂蚤灶燥贼 允袁 藻贼 葬造援 栽澡藻 枣蚤则泽贼 扎赠早燥贼蚤糟
凿蚤增蚤泽蚤燥灶 蚤灶 粤则葬遭蚤凿燥责泽蚤泽 则藻择怎蚤则藻泽 凿藻 灶燥增燥 贼则葬灶泽糟则蚤责贼蚤燥灶 燥枣 贼澡赠皂蚤凿赠造葬贼藻
噪蚤灶葬泽藻 咱允暂 援 栽澡藻 孕造葬灶贼 允燥怎则灶葬造袁 圆园园愿袁 缘猿院 苑苑远 原 苑愿怨援
咱缘暂 杂糟造葬枣葬灶蚤 砸 粤袁 云葬灶早皂葬灶 宰 蕴援 再藻葬泽贼 早藻灶藻 悦阅悦愿 藻灶糟燥凿藻泽 贼澡赠皂蚤凿赠造葬贼藻
噪蚤灶葬泽藻 葬灶凿 蚤泽 糟燥皂责造藻皂藻灶贼藻凿 遭赠 澡藻则责藻泽 贼澡赠皂蚤凿蚤灶藻 噪蚤灶葬泽藻 早藻灶藻 栽运
咱允暂 援 孕则燥糟藻藻凿蚤灶早泽 燥枣 贼澡藻 晕葬贼蚤燥灶葬造 粤糟葬凿藻皂赠 燥枣 贼澡藻 杂糟蚤藻灶糟藻泽 燥枣 贼澡藻 哉鄄
灶蚤贼藻凿 杂贼葬贼藻泽 燥枣 粤皂藻则蚤糟葬袁 员怨愿源袁 愿员院 缘愿圆员 原 缘愿圆缘援
咱远暂 宰澡蚤贼藻 允 匀袁 郧则藻藻灶 杂 砸袁 月葬则噪藻则 阅 郧袁 藻贼 葬造援 栽澡藻 悦阅悦愿 贼则葬灶泽糟则蚤责贼 蚤泽
糟藻造造 糟赠糟造藻 则藻早怎造葬贼藻凿 蚤灶 赠藻葬泽贼 葬灶凿 蚤泽 藻曾责则藻泽泽藻凿 糟燥燥则凿蚤灶葬贼藻造赠 憎蚤贼澡 悦阅悦怨
葬灶凿 悦阅悦圆员 葬贼 葬 责燥蚤灶贼 责则藻糟藻凿蚤灶早 澡蚤泽贼燥灶藻 贼则葬灶泽糟则蚤责贼蚤燥灶 咱 允暂 援 耘曾责藻则蚤鄄
皂藻灶贼葬造 悦藻造造 砸藻泽藻葬则糟澡袁 员怨愿苑袁 员苑员院 圆圆猿 原 圆猿员援
咱苑暂 月怎藻灶燥 砸 灾袁 月则葬赠葬 砸 悦袁 杂藻早则藻贼贼蚤 晕 阅袁 藻贼 葬造援 晕藻憎 栽怎遭藻则糟怎造燥泽贼葬贼蚤糟 葬早藻灶贼泽
贼葬则早藻贼蚤灶早 灶怎糟造藻蚤糟 葬糟蚤凿 遭蚤燥泽赠灶贼澡藻泽蚤泽院 凿则怎早 凿藻泽蚤早灶 怎泽蚤灶早 匝杂粤砸 葬责责则燥葬糟澡藻泽
咱允暂援 悦怎则则藻灶贼 孕澡葬则皂葬糟藻怎贼蚤糟葬造 阅藻泽蚤早灶袁 圆园员源袁 圆园院 源源苑源 原 源源愿缘
咱愿暂 阅燥澡葬则藻赠 孕 运袁 杂怎贼澡葬则 酝 运袁 灾藻则皂葬 粤袁 藻贼 葬造援 酝燥造藻糟怎造葬则 糟造燥灶蚤灶早 葬灶凿
糟澡葬则葬糟贼藻则蚤扎葬贼蚤燥灶 燥枣 月则怎赠蚤葬 皂葬造葬赠蚤 贼澡赠皂蚤凿赠造葬贼藻 噪蚤灶葬泽藻 咱允暂 援 粤糟贼葬 栽则燥责鄄
蚤糟葬袁 圆园员源袁 员猿猿院愿猿 原 怨圆援
咱怨暂 郧怎蚤灶葬则葬藻泽 粤 孕袁 砸葬皂燥造澡燥 栽 悦袁 云则葬灶糟葬 栽 耘援 孕则藻增藻灶贼蚤灶早 贼澡藻 则藻贼怎则灶 燥枣
泽皂葬造造责燥曾院 皂燥造藻糟怎造葬则 皂燥凿藻造蚤灶早 泽贼怎凿蚤藻泽 燥灶 贼澡赠皂蚤凿赠造葬贼藻 噪蚤灶葬泽藻 枣则燥皂 灾葬鄄
则蚤燥造葬 增蚤则怎泽 咱 允暂 援 允燥怎则灶葬造 燥枣 月蚤燥皂燥造藻糟怎造葬则 泽贼则怎糟贼怎则藻 驭 阅赠灶葬皂蚤糟泽袁
圆园员猿袁 阅韵陨院 员园援 员园愿园 辕 园苑猿怨员员园圆援 圆园员猿援 愿猿园缘苑愿援
咱员园暂 江施幸援 丝瓜簇叶病植物菌质体胸苷酸激酶基因 渊 贼皂噪冤 之表
现及特性研究 咱阅暂援 国立中央大学硕士论文袁 圆园园员援
咱员员暂 酝蚤赠葬贼葬 杂袁 韵泽澡蚤皂葬 运袁 运葬噪蚤扎葬憎葬 杂袁 藻贼 葬造援 栽憎燥 凿蚤枣枣藻则藻灶贼 贼澡赠皂蚤凿赠造葬贼藻
噪蚤灶葬泽藻 早藻灶藻 澡燥皂燥造燥早怎藻泽袁 蚤灶糟造怎凿蚤灶早 燥灶藻 贼澡葬贼 澡葬泽 糟葬贼葬造赠贼蚤糟 葬糟贼蚤增蚤贼赠袁
葬则藻 藻灶糟燥凿藻凿 蚤蚤灶 贼澡藻 燥灶蚤燥灶 赠藻造造燥憎泽 责澡赠贼燥责造葬泽皂葬 早藻灶燥皂藻 咱允暂 援 酝蚤糟则燥鄄
遭蚤燥造燥早赠袁 圆园园猿袁 员源怨院 圆圆源猿 原 圆圆缘园援
咱员圆暂 李摇 蓓袁 纪玲玲袁 吴云峰袁 等援 小麦蓝矮病植原体胸苷酸激酶
基因的分离尧原核表达及酶活性分析 咱允暂 援 微生物学报袁 圆园园愿袁
源愿渊远冤院苑猿怨 原 苑源源援
咱员猿暂 月葬蚤 载袁 在澡葬灶早 允袁 耘憎蚤灶早 粤援 蕴蚤增蚤灶早 憎蚤贼澡 早藻灶燥皂藻 蚤灶泽贼葬遭蚤造蚤贼赠院 贼澡藻 葬凿葬责鄄
贼葬贼蚤燥灶 燥枣 责澡赠贼燥责造葬泽皂葬泽 贼燥 凿蚤增藻则泽藻 藻灶增蚤则燥灶皂藻灶贼泽 燥枣 贼澡藻蚤则 蚤灶泽藻糟贼 葬灶凿
责造葬灶贼 澡燥泽贼泽 咱 允暂援 允燥怎则灶葬造 燥枣 月葬糟贼藻则蚤燥造燥早赠袁 圆园园远袁 员愿愿 渊员园冤院 猿远愿圆
原猿远怨远援
咱员源暂 允燥皂葬灶贼蚤藻灶藻 砸袁 阅葬增蚤泽 砸 耘援 悦造怎泽贼藻则泽 燥枣 凿蚤增藻则泽藻 早藻灶藻泽 藻曾蚤泽贼蚤灶早 葬泽
皂怎造贼蚤责造藻袁 泽藻择怎藻灶糟藻鄄增葬则蚤葬遭造藻 皂燥泽葬蚤糟泽 蚤灶 葬 责澡赠贼燥责造葬泽皂葬 早藻灶燥皂藻 咱允暂 援
云藻皂泽 酝蚤糟则燥遭蚤燥造燥早赠 蕴藻贼贼藻则泽袁 圆园园远袁 圆缘缘 渊员冤院缘怨 原 远缘援
咱员缘暂 宋传生袁 胡佳续袁 林彩丽袁 等援 泡桐丛枝植原体胸苷酸激酶基
因的克隆及序列分析 咱悦暂 援 中国植物病理学会 圆园员圆 年学术年
会论文集袁 圆园员猿院猿园猿援
咱员远暂 田国忠袁 温秀军袁 李摇 永袁 等援 枣疯病和泡桐丛枝病植原体不
同分离物组织培养保藏和嫁接传病试验比较 咱允暂 援 林业科学研
究袁 圆园园缘袁 员愿渊员冤院员 原 怨援
咱员苑暂 月藻则早澡葬怎泽藻则 允援 粤 则藻葬糟贼蚤增藻 葬则早蚤灶蚤灶藻 蚤灶 葬凿藻灶赠造葬贼藻 噪蚤灶葬泽藻 咱 允暂 援 月蚤燥鄄
糟澡蚤皂蚤糟葬 藻贼 月蚤燥责澡赠泽蚤糟葬 粤糟贼葬 渊月月粤冤 鄄 耘灶扎赠皂燥造燥早赠袁 员怨苑缘袁 猿怨苑院猿苑园
原 猿苑远援
咱员愿暂 李淑娟援 六聚组氨酸融合蛋白纯化方法研究咱阅暂援 西北大学硕
士学位论文袁 圆园园苑援
咱员怨暂 宰葬灶早 蕴袁 宰藻泽贼遭藻则早 允袁 月燥造泽噪藻 郧袁 藻贼 葬造援 晕燥增藻造 凿藻燥曾赠灶怎糟造藻燥泽蚤凿藻鄄
责澡燥泽责澡燥则赠造葬贼蚤灶早 藻灶扎赠皂藻泽 蚤灶 皂赠糟燥责造葬泽皂葬泽院 藻糟蚤凿藻灶糟藻 枣燥则 藻枣枣蚤糟蚤藻灶贼 怎贼蚤鄄
造蚤扎葬贼蚤燥灶 燥枣 凿藻燥曾赠灶怎糟造藻燥泽蚤凿藻泽 咱 允暂 援 酝燥造藻糟怎造葬则 酝蚤糟则燥遭蚤燥造燥早赠袁 圆园园员袁
源圆院员园远缘 原 员园苑猿援
咱圆园暂 悦燥造造蚤灶泽 悦酝袁 韵造泽贼葬凿 运袁 杂贼藻则怎凿 耘袁 藻贼 葬造援 陨泽燥造葬贼蚤燥灶 燥枣 葬 灶燥增藻造 枣蚤泽澡
贼澡赠皂蚤凿赠造葬贼藻 噪蚤灶葬泽藻 早藻灶藻袁 怎责则藻早怎造葬贼藻凿 蚤灶 粤贼造葬灶贼蚤糟 泽葬造皂燥灶 渊 杂葬造皂燥
泽葬造葬则 蕴援 冤 枣燥造造燥憎蚤灶早 蚤灶枣藻糟贼蚤燥灶 憎蚤贼澡 贼澡藻 皂燥灶燥早藻灶藻葬灶 责葬则葬泽蚤贼藻 郧赠则燥鄄
凿葬糟贼赠造怎泽 泽葬造葬则蚤藻泽 咱允暂 援 云蚤泽澡 葬灶凿 杂澡藻造造枣蚤泽澡 陨皂皂怎灶燥造燥早赠袁 圆园园苑袁 圆猿院
苑怨猿 原 愿园苑援
咱圆员暂 酝怎澡蚤藻则鄄蕴藻澡皂葬灶灶 匀袁 悦澡葬枣枣燥贼贼藻 粤袁 孕燥糟澡藻贼 杂袁 藻贼 葬造援 栽澡赠皂蚤凿赠造葬贼藻 噪蚤鄄
灶葬泽藻 燥枣 酝赠糟燥遭葬糟贼藻则蚤怎皂 贼怎遭藻则糟怎造燥泽蚤泽院 葬 糟澡蚤皂藻则葬 泽澡葬则蚤灶早 责则燥责藻则贼蚤藻泽
糟燥皂皂燥灶 贼燥 藻怎噪葬则赠燥贼蚤糟 葬灶凿 遭葬糟贼藻则蚤葬造 藻灶扎赠皂藻泽 咱允暂 援 孕则燥贼藻蚤灶 杂糟蚤藻灶糟藻袁
圆园园员袁 员园院员员怨缘 原 员圆园缘援
咱圆圆暂 月则怎灶凿蚤藻则泽 砸袁 蕴葬增蚤藻 粤袁 灾藻蚤贼 栽袁 藻贼 葬造援 酝燥凿蚤枣赠蚤灶早 澡怎皂葬灶 贼澡赠皂蚤凿赠造葬贼藻
噪蚤灶葬泽藻 贼燥 责燥贼藻灶贼蚤葬贼藻 葬扎蚤凿燥贼澡赠皂蚤凿蚤灶藻 葬糟贼蚤增葬贼蚤燥灶 咱 允暂 援 允燥怎则灶葬造 燥枣 月蚤燥鄄
造燥早蚤糟葬造 悦澡藻皂蚤泽贼则赠袁 员怨怨怨袁 圆苑源院猿缘圆愿怨 原 猿缘圆怨圆援
咱圆猿暂 砸藻赠灶藻泽 允 孕袁 栽蚤则葬遭赠 酝袁 月葬则燥灶 酝袁 藻贼 葬造援 耘泽糟澡藻则蚤糟澡蚤葬 糟燥造蚤 贼澡赠皂蚤凿赠造葬贼藻
运蚤灶葬泽藻院 皂燥造藻糟怎造葬则 糟造燥灶蚤灶早袁 灶怎糟造藻燥贼蚤凿藻 泽藻择怎藻灶糟藻袁 葬灶凿 早藻灶藻贼蚤糟 燥则鄄
早葬灶蚤扎葬贼蚤燥灶 燥枣 贼澡藻 糟燥则则藻泽责燥灶凿蚤灶早 贼皂噪 蕴燥糟怎泽 咱允暂 援 允燥怎则灶葬造 燥枣 月葬糟贼藻则蚤鄄
燥造燥早赠袁 员怨怨远袁 员苑愿院圆愿园源 原 圆愿员圆援
咱圆源暂 月葬造葬泽怎遭则葬皂葬灶蚤葬皂 晕 运袁 灾藻藻则蚤泽藻贼贼赠 灾袁 郧藻灶贼则赠 郧 粤援 匀藻则责藻泽增蚤则葬造 凿藻鄄
燥曾赠贼澡赠皂蚤凿蚤灶藻 噪蚤灶葬泽藻泽 糟燥灶贼葬蚤灶 葬 泽蚤贼藻 葬灶葬造燥早燥怎泽 贼燥 贼澡藻 责澡燥泽责澡燥则赠造鄄
遭蚤灶凿蚤灶早 葬则早蚤灶蚤灶藻鄄则蚤糟澡 则藻早蚤燥灶 燥枣 责燥则糟蚤灶藻 葬凿藻灶赠造葬贼藻 噪蚤灶葬泽藻曰 糟燥皂责葬则蚤鄄
泽燥灶 燥枣 泽藻糟燥灶凿葬则赠 泽贼则怎糟贼怎则藻 责则藻凿蚤糟贼蚤燥灶泽 葬灶凿 糟燥灶泽藻则增葬贼蚤燥灶 咱 允暂 援 允燥怎则鄄
灶葬造 燥枣 郧藻灶藻则葬造 灾蚤则燥造燥早赠袁 员怨怨园袁 苑员院圆怨苑怨 原 圆怨愿苑援
咱圆缘暂 悦澡葬责藻则燥灶 阅 晕援 悦燥灶泽贼则怎糟贼蚤燥灶 葬灶凿 糟燥皂责造藻皂藻灶贼葬贼蚤燥灶 燥枣 蚤灶鄄枣则葬皂藻 凿藻造藻鄄
贼蚤燥灶泽 燥枣 贼澡藻 藻泽泽藻灶贼蚤葬造 耘泽糟澡藻则蚤糟澡蚤葬 糟燥造蚤 贼澡赠皂蚤凿赠造葬贼藻 噪蚤灶葬泽藻 早藻灶藻 咱 允暂 援
粤责责造蚤藻凿 葬灶凿 耘灶增蚤则燥灶皂藻灶贼葬造 酝蚤糟则燥遭蚤燥造燥早赠袁 圆园园远袁 苑圆院员圆愿愿 原 员圆怨源援
咱圆远暂 徐启聪援 中国不同地区不同枣树品种上枣疯病植原体的分子
鉴定及变异分析 咱 阅暂援 中国林业科学研究院硕士学位论
文袁 圆园园怨援
咱圆苑暂 韵泽贼藻则皂葬灶灶 晕袁 杂糟澡造蚤糟澡贼蚤灶早 陨袁 月则怎灶凿蚤藻则 砸袁 藻贼 葬造援 陨灶泽蚤早澡贼泽 蚤灶贼燥 贼澡藻
责澡燥泽责澡燥则赠造贼则葬灶泽枣藻则 皂藻糟澡葬灶蚤泽皂 燥枣 澡怎皂葬灶 贼澡赠皂蚤凿赠造葬贼藻 噪蚤灶葬泽藻 早葬蚤灶藻凿
枣则燥皂 糟则赠泽贼葬造 泽贼则怎糟贼怎则藻泽 燥枣 藻灶扎赠皂藻 糟燥皂责造藻曾憎泽 葬造燥灶早 贼澡藻 则藻葬糟贼蚤燥灶 糟燥燥则鄄
凿蚤灶葬贼藻 咱允暂 援 杂贼则怎糟贼怎则藻袁 圆园园园袁 愿院远圆怨 原 远源圆援
咱圆愿暂 栽燥怎则灶藻怎曾 蕴袁 月怎糟怎则藻灶糟蚤 晕袁 蕴葬泽糟怎 陨袁 藻贼 葬造援 杂怎遭泽贼蚤贼怎贼贼蚤燥灶 燥枣 葬灶 葬造葬鄄
灶蚤灶藻 则藻泽蚤凿怎藻 枣燥则 早造赠糟蚤灶藻 员源远 蚤灶 栽酝孕 噪蚤灶葬泽藻 枣则燥皂 耘泽糟澡藻则蚤糟澡蚤葬 糟燥造蚤 则藻鄄
泽责燥灶泽蚤遭造藻 枣燥则 遭葬糟贼藻则蚤葬造 澡赠责藻则泽藻灶泽蚤贼蚤增蚤贼赠 贼燥 遭则燥皂燥凿藻燥曾赠怎则蚤凿蚤灶藻 咱 允暂 援
允燥怎则灶葬造 燥枣 月葬糟贼藻则蚤燥造燥早赠袁 员怨怨愿袁 员愿园渊员远冤院源圆怨员 原 源圆怨猿援
咱圆怨暂 牟海青袁 周摇 涛袁 赵文军袁 等援 泡桐丛枝植原体抗原膜蛋白抗
血清的制备及应用 咱 允暂 援 植物病理学报袁 圆园员员袁 源员 渊圆冤院员远员
原 员苑园援
咱猿园暂 宰葬灶早 允袁 在澡怎 载 孕袁 郧葬燥 砸袁 藻贼 葬造援 郧藻灶藻贼蚤糟 葬灶凿 泽藻则燥造燥早蚤糟葬造 葬灶葬造赠泽藻泽
燥枣 藻造燥灶早葬贼蚤燥灶 枣葬糟贼燥则 耘云鄄栽怎 燥枣 责葬怎造燥憎灶蚤葬 憎蚤贼糟澡藻泽爷鄄遭则燥燥皂 责澡赠贼燥责造葬泽鄄
皂葬 渊员远杂则陨鄄阅冤 咱允暂 援 孕造葬灶贼 孕葬贼澡燥造燥早赠袁 圆园员园袁 缘怨院怨苑圆 原 怨愿员援
猿怨苑